JP2024519218A - 成熟角膜内皮細胞を作製する方法 - Google Patents

成熟角膜内皮細胞を作製する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、角膜内皮前駆細胞における転写因子の発現を増大させることにより、角膜内皮細胞、例えば成熟角膜内皮細胞を作製する方法、およびその組成物を提供する。

Description

関連出願
本願は、２０２１年５月３日に出願された米国仮出願シリアル番号６３／１８３，５６２、表題「METHODS OF GENERATING MATURE CORNEAL ENDOTHELIAL CELLS」の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下における利益を主張し、当該仮出願の全内容は、本明細書において参考として援用される。
発明の分野
本発明は、成熟角膜内皮細胞を作製する方法、およびその組成物に関する。
背景
角膜は、正常な視覚および眼の健康の維持のために重要な機能を遂行し、これは、眼の光学的な力の約三分の二を提供すること、および眼を傷害または感染から保護することを含む。角膜の疾患および傷害は、世界的な失明の主要な原因である。多くの角膜の疾患および傷害は、ドナー角膜の移植により処置することができる。角膜は、身体において最もよく移植される臓器であり、１５年以上にわたり高い成功率を有する。例えば、米国においては１年間あたり約４０，０００件の角膜移植が行われる。しかし、世界的に、移植のための角膜に対する需要は、現在の供給を大きく上回り、入手可能なドナー組織の限定された質および量が処置を妨げる。提供された角膜の不十分な供給に起因している一要因は、提供された角膜のうちの３０％までが、角膜内皮の質の不良に起因して移植を拒絶されることである。角膜内皮の質は、一般にドナーの年齢と共に低下する。なぜならば、角膜が老化するか傷害された場合、内皮細胞は死に、置き換えられないからである。したがって、個体群が高齢化するにつれて、好適に健康な角膜内皮を有するドナー組織の提供は減少する。さらに、ＬＡＳＩＫ手術の人気が増大するにつれて、提供される角膜の数および質は低下すると予測される（これらの角膜は、移植を拒絶される）。
角膜の疾患は、角膜の５つの層：角膜上皮、ボーマン層、角膜実質（corneal stroma）、デスメ膜、および角膜内皮のうちの１つ以上に関与し得る。角膜上皮、角膜実質および角膜内皮は、細胞の層であり、一方、ボーマン層およびデスメ膜は、主に、コラーゲン原線維を含んでなる。角膜内皮は、角膜の内側表面上の細胞の単層である。それは、角膜と虹彩との間に形成された眼房（chamber）に対面し、液体のレベルを調節することにより角膜を透明に保つ。機能的な角膜内皮なしでは、角膜は混濁し、視力は失われる。正しく機能する角膜内皮細胞は、角膜における正しい液体レベル、例えば、角膜実質中への液体の「漏出」と、液体を角膜実質から眼の前眼房へと移動するように持続的に作動する能動的ポンピングを維持する。
角膜内皮細胞は、in vivoで増殖する能力をほとんどまたは全く有さず、したがって、それらは、傷害を受けるかまたは別途失われた場合に置き換えられないことが報告されている。ヒトにおいては、角膜内皮細胞層は、出生時に最も密に充填されており、その後、眼が成長するにつれて細胞密度は急速に低下する（このことは、同じ数の細胞が、より大きな領域をカバーしていることを反映している）。その後、角膜細胞の密度は、年齢と共に徐々に低下し、このことは、明白に、細胞が徐々に失われ、それらが置き換えられないことを反映している。細胞密度が低下するにつれて、細胞層のバリアおよびポンプ機能を維持するために、各々の細胞は拡散し、より大きな領域をカバーする。しかし、一旦細胞密度があまりに低く低下すると（約５００～１０００細胞／ｍｍ２）、その機能は損なわれ、角膜の混濁、角膜実質の浮腫、視力の喪失および最終的な盲目をもたらす。具体的には、in vivoで緊密に充填された角膜内皮の細胞密度は、生後２か月の乳児においては５６２４細胞／ｍｍ２もの高さであり、生後１年以内に４２５２細胞／ｍｍ２まで低下し、その後、小児期の初めの間に急速に低下する（眼の成長に伴う角膜のサイズの増大に関連する）と報告されている。５歳までに、約３５９１プラスマイナス３９９細胞／ｍｍ２まで低下し、１０歳までに約２６９７プラスマイナス２４６細胞／ｍｍ２までさらに低下し、さらに、成人期を通して毎年約０．６％低下する。Peh et al., Transplantation. 2011 Apr. 27; 91(8):811-9を参照。
角膜内皮に影響を及ぼす原因疾患として、フックスジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、後部多形性ジストロフィー（posterior polymorphous dystrophy）、および先天性遺伝性内皮ジストロフィー（congenital hereditary endotherial dystrophy）が挙げられる。最も有効な処置が角膜内皮の置き換えである二次疾患として、いくつかの角膜ジストロフィー、コンタクトレンズの使用、白内障の手術、および角膜移植における遅発型内皮不全（late endotherial failure）が挙げられる。角膜内皮のみが損なわれた場合に好ましい処置は、デスメ膜剥離角膜内皮移植（ＤＳＥＫ）であり、これは、デスメ膜および角膜内皮の除去と、その後のドナー組織の移植を含む。代替的に、全層角膜移植（ＰＫＰ）においては、角膜全体を取り除き、置き換える。
一般的に、角膜移植は、ドナー角膜を得ること（例えば、死後の遺体提供から）、ドナー角膜が十分な質であり、かつ他の点でも使用のために好適であるか否かを決定すること、および損傷を受けたか罹患した角膜の外科的な置き換えを含む。手順は、角膜全体を置き換える（全層角膜移植）、または患者のデスメ膜および内皮を残して残りの層を提供された組織で置き換える（表層角膜移植）ために、開発されてきた；後者の手順は、移植拒絶のリスクを軽減し得るが、また、移植後に劣る視力をもたらす場合がある。さらに、表層角膜移植は、患者の角膜内皮および／またはデスメ膜の置き換えが指示された処置であり得るいくつかの状態の処置のためには好適ではない場合がある。一般的には、米国特許第５，７５５，７８５号、米国特許第５，６４９，９４４号、米国特許第７，１４７，６４８号、米国特許第７，３００，６５３号、米国特許第５，５８４，８８１号、米国特許第５，６８６，４１４号、米国特許第７，３００，６５４号、Ｕ．Ｓ．特許出願シリアル番号１０／５２５，３９１を参照；これらの各々は、その全体において参考として援用される。角膜内皮の外科的置き換えのさらなる方法は、開発中であり、これは、ドナー組織がデスメ膜および角膜内皮のみからなるデスメ膜内皮角膜移植（Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty：ＤＭＥＫ）を含む。別の潜在的に有望な治療手段は、角膜内皮細胞が、移植に先立ちin vitroで培養される、角膜内皮再建である。例えば、提供されたヒト角膜細胞が、ポリマー上で培養され、生体接着性のゼラチンディスク上へ放出され、次いで、首尾よく剥皮されたウサギ角膜中に組み込まれた（ゼラチンディスクは移植後に溶解する）（Hsiue et al., Transplantation. 2006 Feb. 15; 81(3):473-6；これは、本明細書においてその全体において参考として援用される）。しかし、培養細胞を利用する方法は、前記細胞のソースを前提とし、したがって、上記のような好適な提供された組織の不足により影響を受ける。さらに、提供された細胞の間の差異に起因して、一定の質および効力の角膜内皮細胞の培養物を生成することは困難であることが判明する場合がある。各々のドナーから得られた細胞について安全性および／または効力についての大規模試験が必要とされ得るという可能性に起因して、規制のハードルもまた、かかる方法をラージスケールで行うことをロジスティックに困難にし得る。これらのおよびさらなる治療方法は、Thomas John, Corneal Endothelial Transplant: DSAEK, DMEK & DLEK (JP Medical Ltd, 2010)においてさらに記載され、これは、本明細書においてその全体において参考として援用される。
さらなる開示は、一般に、角膜細胞を得てこれを用いる方法に関し、これは、治療方法、培養方法、保存方法、これを含むかまたはこれと共に用いられ得る組成物を含み、類似のものは、Ｕ．Ｓ．２００７／０２７５３６５、ＵＳ２０１０／０２０９４０２、ＵＳ２０１０／０２３３２４０、ＵＳ２０１１／０００９４８８、ＵＳ２００９／０２３２７７２、米国特許第５，１６６，０４８号、ＵＳ２００７／００９２５５０、ＵＳ２００５／０２１４２５９、ＵＳ２００７／０１４８１３７、米国特許第４，９５９，３１９号、米国特許第５，３１０，７２８号、米国特許第５，５８９，４５１号、ＵＳ２０１０／０２１５７１７、米国特許第５，７０３，０４７号、ＵＳ２００９／０２２２０８６、ＵＳ２００９／０２６３４６５、ＵＳ２００６／０２２８６９３、ＵＳ２００６／０２４０５５２、ＵＳ２００９／０２７０９８２、米国特許第５，２６９，８１２号、米国特許第７，３７１，５１３号、ＵＳ２０１０／００６９９１５、ＵＳ２０１１／０１６６６５０、Ｕ．Ｓ．９，７５２，１１８、ＵＳ２０１８／００７２９８９およびＵ．Ｓ．９，７５２，１１８において包含され、これらの各々は、その全体において本明細書において参考として援用される。
したがって、当該分野において、角膜内皮細胞を生成するための簡便かつ有効な方法についての必要性が存在する。
要旨
本発明は、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞または胚性幹細胞において、ペア様（Paired-Like）ホメオドメイン転写因子２（ＰＩＴＸ２）、フォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）、転写因子ＡＰ－２ベータ（ＴＦＡＰ２Ｂ）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１ベータ（ＬＭＸ１Ｂ）およびＰＯＵ６Ｆ２（ＰＯＵクラス６ホメオボックス２）からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることにより、角膜内皮細胞（ＣＥＣ）、例えば成熟ＣＥＣを生成するための効率的かつ有効な方法を提供することにより、当該分野におけるこの必要性を満たす。一側面において、本発明は、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞または胚性幹細胞において、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることにより、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを作製するための、新規かつ有効な方法を提供する。
本発明の方法は、簡便、効率的かつ有効であり、本明細書において開示される多様な用途、例えば眼の疾患、例えばＣＥＣの疾患の処置のために用いることができる、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの生成をもたらす。
本発明は、角膜内皮細胞を作製する方法を提供し、該方法は、角膜内皮前駆細胞において、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させ、それにより、角膜内皮細胞を作製することを含む。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一態様において、角膜内皮細胞は、成熟角膜内皮細胞である。
別の態様において、転写因子は、ＰＩＴＸ２である。
別の態様において、ＰＩＴＸ２は、ＰＩＴＸ２、アイソフォーム１；ＰＩＴＸ２、アイソフォーム２；ＰＩＴＸ２、アイソフォーム３、ＰＩＴＸ２、アイソフォーム４、およびＰＩＴＸ２、アイソフォーム５からなる群より選択されるＰＩＴＸ２の少なくとも１つのアイソフォームである。
別の態様において、転写因子は、ＦＯＸＣ１である。
別の態様において、転写因子は、ＴＦＡＰ２Ｂである。
別の態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、ＴＦＡＰ２Ｂ、アイソフォーム１、およびＴＦＡＰ２Ｂ、アイソフォーム２からなる群より選択されるＴＦＡＰ２Ｂの少なくとも１つのアイソフォームである。
別の態様において、転写因子は、ＬＭＸ１Ｂである。
別の態様において、ＬＭＸ１Ｂは、ＬＭＸ１Ｂ、アイソフォーム１、ＬＭＸ１Ｂ、アイソフォーム２、およびＬＭＸ１Ｂ、アイソフォーム３からなる群より選択されるＬＭＸ１Ｂの少なくとも１つのアイソフォームである。
別の態様において、転写因子は、ＰＯＵ６Ｆ２である。
別の態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、ＰＯＵ６Ｆ２、アイソフォーム１、およびＰＯＵ６Ｆ２、アイソフォーム２からなる群より選択されるＰＯＵ６Ｆ２の少なくとも１つのアイソフォームである。
別の態様において、方法は、角膜内皮前駆細胞において、ＥＲＧ、ＡＴＦ４、ＡＴＭＩＮ、ＢＨＬＨＥ４０、ＣＥＢＰＤ、ＣＳＲＮＰ１、ＤＲＡＰ１、ＥＧＲ１、ＥＬＦ２、ＥＭＸ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＳ２、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ２、ＧＴＦ３Ａ、ＨＩＦ１Ａ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ９、ＭＢＤ３、ＮＦＥ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ４Ａ１、ＰＡ２Ｇ４、ＰＯＵ３Ｆ３、ＲＥＬＡ、ＴＢＸ２、ＴＦＤＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＵＳＦ２、ＹＢＸ１、ＺＮＦ２０７、ＺＮＦ３５８、およびＺＮＦ３９５からなる群より選択される１つ以上の転写因子の発現を増大させることをさらに含む。
別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＥＲＧである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＢＨＬＨＥ４０である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＣＥＢＰＤである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＣＳＲＮＰ１である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＥＧＲ１である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＥＳＲＲＡである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＥＴＳ２である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＦＯＳである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＦＯＳＢである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＦＯＳＬ２である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＪＵＮである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＪＵＮＢである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＪＵＮＤである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＫＬＦ１０である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＫＬＦ９である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＮＲ１Ｄ１である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＮＲ４Ａ１である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＴＳＣ２２Ｄ１である。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞を少なくとも１つの転写因子と接触させることを含む。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含み、ここで、発現ベクターは、自己切断配列を含む。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含み、ここで、発現ベクターは、ウイルスベクターである。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含み、ここで、発現ベクターは、非ウイルスベクターである。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含み、ここで、発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含み、ここで、発現ベクターは、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
一態様において、プロモーターは、内在性プロモーターである。
一態様において、プロモーターは、人工プロモーターである。
一態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、少なくとも１つの転写因子をコードするウイルスベクターによる角膜内皮前駆細胞の形質導入を含む。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、少なくとも１つの転写因子をコードする発現ベクターによる角膜内皮前駆細胞のトランスフェクションを含む。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２日間にわたり培養される。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させた後に、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間にわたり培養される。
別の態様において、ＰＩＴＸ２の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、ＦＯＸＣ１の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、ＬＭＸ１Ｂの発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、角膜内皮細胞は、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＭＲＧＰＲＸ３からなる群より選択される１つ以上のマーカーの、角膜内皮前駆細胞と比較して増大した発現を示す。
別の態様において、角膜内皮細胞は、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２ＢおよびＬＭＸ１Ｂからなる群より選択される１つ以上のマーカーの、角膜内皮前駆細胞と比較して増大した発現を示す。
別の態様において、角膜内皮細胞は、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＳＬＣ４Ａ１１およびＭＲＧＰＲＸ３からなる群より選択される１つ以上のマーカーの、角膜内皮前駆細胞と比較して増大した発現を示す。
別の態様において、１つ以上のマーカーの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、２，０００倍、５，０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、角膜内皮細胞は、ＮＧＦＲ、ＳＯＸ１０、ＨＮＫ１、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ｖＷＦおよび／またはＣＤ３１の、角膜内皮前駆細胞と比較して低下した発現を示す。
別の態様において、ＮＧＦＲ、ＳＯＸ１０、ＨＮＫ１、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ｖＷＦおよび／またはＣＤ３１の低下した発現は、角膜内皮前駆細胞と比較して少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、または４倍の低下を含む。
別の態様において、角膜内皮細胞は、角膜内皮前駆細胞と比較して、増大したポンプ機能、タイトジャンクションの形成の増強、酸化ストレスへの耐性の増大、および多角形形態の増大のうちの１つ以上を示す。
別の態様において、増大したポンプ機能、タイトジャンクションの形成の増強、酸化ストレスへの耐性の増大、および多角形形態の増大は、角膜内皮前駆細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２５％の増大を含む。
別の態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞のトランスクリプトームを、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％、角膜内皮細胞のトランスクリプトームへとシフトさせる。
別の態様において、角膜内皮細胞の、それを必要とする対象の角膜への投与の後で、角膜は、増大したポンプ活性、タイトジャンクションの形成の増大、酸化ストレスへの耐性の増大、増大した透明性および減少した厚みのうちの１つ以上を示す。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞は、多能性幹細胞から誘導される。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞は、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞である多能性幹細胞から誘導される。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を誘導することは、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトの使用を含む。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を誘導することは、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトの使用を含み、ここで、遺伝子スイッチコンストラクトは、転写遺伝子スイッチコンストラクトである。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を誘導することは、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトの使用を含み、ここで、遺伝子スイッチコンストラクトは、転写後遺伝子スイッチコンストラクトである。
本発明はまた、多能性幹細胞由来の角膜内皮細胞を作製する方法を提供し、該方法は、以下を含む：（ａ）多能性幹細胞を培養すること、および角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞（neural crest stem cell）の形成を誘導すること、ここで、多能性幹細胞は、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、ならびに、（ｂ）角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞において、発現ベクターからの少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることにより、角膜内皮細胞を作製すること。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一態様において、角膜内皮細胞は、成熟角膜内皮細胞である。
別の態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。
別の態様において、多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞である。
別の態様において、転写因子は、ＰＩＴＸ２である。
別の態様において、ＰＩＴＸ２は、ＰＩＴＸ２、アイソフォーム１；ＰＩＴＸ２、アイソフォーム２；ＰＩＴＸ２、アイソフォーム３、ＰＩＴＸ２、アイソフォーム４、およびＰＩＴＸ２、アイソフォーム５からなる群より選択される、ＰＩＴＸ２の少なくとも１つのアイソフォームである。
別の態様において、転写因子は、ＦＯＸＣ１である。
別の態様において、転写因子は、ＴＦＡＰ２Ｂである。
別の態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、ＴＦＡＰ２Ｂ、アイソフォーム１、およびＴＦＡＰ２Ｂ、アイソフォーム２からなる群より選択される、ＴＦＡＰ２Ｂの少なくとも１つのアイソフォームである。
別の態様において、転写因子は、ＬＭＸ１Ｂである。
別の態様において、ＬＭＸ１Ｂは、ＬＭＸ１Ｂ、アイソフォーム１、ＬＭＸ１Ｂ、アイソフォーム２、およびＬＭＸ１Ｂ、アイソフォーム３からなる群より選択される、ＬＭＸ１Ｂの少なくとも１つのアイソフォームである。
別の態様において、転写因子は、ＰＯＵ６Ｆ２である。
別の態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、ＰＯＵ６Ｆ２、アイソフォーム１、およびＰＯＵ６Ｆ２、アイソフォーム２からなる群より選択される、ＰＯＵ６Ｆ２の少なくとも１つのアイソフォームである。
別の態様において、方法は、ＥＲＧ、ＡＴＦ４、ＡＴＭＩＮ、ＢＨＬＨＥ４０、ＣＥＢＰＤ、ＣＳＲＮＰ１、ＤＲＡＰ１、ＥＧＲ１、ＥＬＦ２、ＥＭＸ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＳ２、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ２、ＧＴＦ３Ａ、ＨＩＦ１Ａ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ９、ＭＢＤ３、ＮＦＥ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ４Ａ１、ＰＡ２Ｇ４、ＰＯＵ３Ｆ３、ＲＥＬＡ、ＴＢＸ２、ＴＦＤＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＵＳＦ２、ＹＢＸ１、ＺＮＦ２０７、ＺＮＦ３５８、およびＺＮＦ３９５からなる群より選択される１つ以上の転写因子の発現を増大させることをさらに含む。
別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＥＲＧである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＢＨＬＨＥ４０である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＣＥＢＰＤである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＣＳＲＮＰ１である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＥＧＲ１である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＥＳＲＲＡである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＥＴＳ２である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＦＯＳである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＦＯＳＢである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＦＯＳＬ２である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＪＵＮである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＪＵＮＢである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＪＵＮＤである。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＫＬＦ１０である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＫＬＦ９である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＮＲ１Ｄ１である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＮＲ４Ａ１である。別の態様において、１つ以上の転写因子は、ＴＳＣ２２Ｄ１である。
別の態様において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。
別の態様において、発現ベクターは、非ウイルスベクターである。
別の態様において、発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。
別の態様において、発現ベクターは、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
別の態様において、発現ベクターは、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここで、プロモーターは、内在性プロモーターである。
別の態様において、発現ベクターは、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここで、プロモーターは、人工プロモーターである。
別の態様において、発現ベクターは、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここで、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を誘導することを含む。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を誘導することは、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトの使用を含む。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を誘導することは、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトの使用を含み、ここで、遺伝子スイッチコンストラクトは、転写遺伝子スイッチコンストラクトである。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を誘導することは、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトの使用を含み、ここで、遺伝子スイッチコンストラクトは、転写後遺伝子スイッチコンストラクトである。
別の態様において、多能性幹細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードするウイルスベクターにより形質導入される。
別の態様において、多能性幹細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする発現ベクターによりトランスフェクトされる。
別の態様において、ステップ（ａ）は、多能性幹細胞の、角膜内皮前駆細胞への、または神経堤幹細胞への分化を誘導するために、スモール／マザーズアゲインストデカペンタプレジック（Small/Mothers Against Decapentaplegic：ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と共に多能性幹細胞を培養することを含む。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２日間にわたり培養される。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させた後に、少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間にわたり培養される。
別の態様において、ＰＩＴＸ２の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、ＦＯＸＣ１の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、ＬＭＸ１Ｂの発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、角膜内皮細胞は、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＭＲＧＰＲＸ３からなる群より選択される１つ以上のマーカーの、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞と比較して増大した発現を示す。
別の態様において、角膜内皮細胞は、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２ＢおよびＬＭＸ１Ｂからなる群より選択される１つ以上のマーカーの、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞と比較して、増大した発現を示す。
別の態様において、角膜内皮細胞は、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＳＬＣ４Ａ１１およびＭＲＧＰＲＸ３からなる群より選択される１つ以上のマーカーの、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞と比較して、増大した発現を示す。
別の態様において、マーカーのうちの１つ以上の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、２，０００倍、５，０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、角膜内皮細胞は、ＮＧＦＲ、ＳＯＸ１０、ＨＮＫ１、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ｖＷＦおよび／またはＣＤ３１の、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞と比較して、低下した発現を示す。
別の態様において、ＮＧＦＲ、ＳＯＸ１０、ＨＮＫ１、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ｖＷＦおよび／またはＣＤ３１の低下した発現は、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、または４倍の低下を含む。
別の態様において、角膜内皮細胞は、角膜内皮前駆細胞と比較して、増大したポンプ機能、タイトジャンクションの形成の増強、酸化ストレスへの耐性の増大、および多角形形態の増大のうちの１つ以上を示す。
別の態様において、増大したポンプ機能、タイトジャンクションの形成の増強、酸化ストレスへの耐性の増大、および多角形形態の増大は、角膜内皮前駆細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２５％の増大を含む。
別の態様において、角膜内皮細胞の、それを必要とする対象の角膜への投与の後で、角膜は、増大したポンプ活性、タイトジャンクションの形成の増大、酸化ストレスへの耐性の増大、増大した透明性および減少した厚みのうちの１つ以上を示す。
別の態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞のトランスクリプトームを、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％、角膜内皮細胞のトランスクリプトームへとシフトさせる。
別の態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、神経堤幹細胞のトランスクリプトームを、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％、角膜内皮細胞のトランスクリプトームへとシフトさせる。
本発明はまた、本発明の方法により生成された角膜内皮細胞の集団を提供する。
本発明はまた、角膜内皮前駆細胞においてＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることにより角膜内皮細胞を作製することを含む方法により生成された、角膜内皮細胞の集団を提供する。
本発明はまた、以下を含む方法により生成された角膜内皮細胞の集団を提供する：（ａ）多能性幹細胞を培養することおよび角膜内皮前駆細胞の形成を誘導すること、ここで、多能性幹細胞は、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、ならびに（ｂ）角膜内皮前駆細胞において、発現ベクターからの少なくとも１つの転写因子の発現を増大させ、それにより、角膜内皮細胞を作製すること。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、本発明の方法により生成された角膜内皮細胞の集団および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。
本発明はまた、角膜内皮前駆細胞においてＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることにより角膜内皮細胞を作製することを含む方法により生成された角膜内皮細胞の集団、ならびに薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。
本発明はまた、以下：（ａ）多能性幹細胞を培養することおよび角膜内皮前駆細胞の形成を誘導すること、ここで、多能性幹細胞は、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、ならびに（ｂ）角膜内皮前駆細胞において、発現ベクターからの少なくとも１つの転写因子の発現を増大させ、それにより、角膜内皮細胞を作製すること、を含む方法により生成された角膜内皮細胞の集団、ならびに薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、角膜内皮細胞の集団を提供し、これは、当該角膜内皮細胞の集団において、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の、転写因子の内因的発現レベルと比較して増大した発現レベルを含む。
一態様において、角膜内皮細胞は、成熟角膜内皮細胞である。
別の態様において、角膜内皮細胞は、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＭＲＧＰＲＸ３からなる群より選択される１つ以上のマーカーの、角膜内皮前駆細胞と比較して増大した発現を示す。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の態様において、角膜内皮細胞の集団のうちの角膜内皮細胞は、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２ＢおよびＬＭＸ１Ｂからなる群より選択される１つ以上のマーカーの、角膜内皮前駆細胞と比較して増大した発現を示す。
別の態様において、角膜内皮細胞の集団のうちの角膜内皮細胞は、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＳＬＣ４Ａ１１およびＭＲＧＰＲＸ３からなる群より選択される１つ以上のマーカーの、角膜内皮前駆細胞と比較して増大した発現を示す。
別の態様において、増大した発現は、少なくとも１つの転写因子の外因的発現を含む。
別の態様において、角膜内皮細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。
別の態様において、角膜内皮前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含み、ここで、発現ベクターは、自己切断配列を含む。
別の態様において、角膜内皮細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含み、ここで、発現ベクターは、ウイルスベクターである。
一態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターからなる群より選択される。
別の態様において、角膜内皮細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含み、ここで、発現ベクターは、非ウイルスベクターである。
一態様において、非ウイルスベクターは、プラスミドＤＮＡ、直鎖状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、直鎖状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ナノプラスミド、ミニサークルＤＮＡ、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、ＤＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、および二本鎖ｍＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）からなる群より選択される。
別の態様において、非ウイルスベクターは、ネイキッド核酸、リポソーム、デンドリマー、ナノ粒子、脂質－ポリマー系、固体脂質ナノ粒子、および／またはリポソームプロタミン／ＤＮＡリポプレックス（ＬＰＤ）を含む。
別の態様において、角膜内皮細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含み、ここで、発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。
別の態様において、角膜内皮細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含み、ここで、発現ベクターは、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
別の態様において、プロモーターは、内在性プロモーターである。
別の態様において、プロモーターは、人工プロモーターである。
別の態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
一態様において、転写因子は、ＰＩＴＸ２である。
別の態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮細胞の集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、転写因子は、ＦＯＸＣ１である。
別の態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮細胞の集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、転写因子は、ＴＦＡＰ２Ｂである。
別の態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮細胞の集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、転写因子は、ＬＭＸ１Ｂである。
別の態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮細胞の集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、転写因子は、ＰＯＵ６Ｆ２である。
別の態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮細胞の集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
別の態様において、角膜内皮細胞の集団は、成熟角膜内皮細胞の集団である。
別の態様において、角膜内皮細胞は、多能性幹細胞から誘導される。
別の態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞である。
別の態様において、角膜内皮細胞の集団は、少なくとも１０６個の角膜内皮細胞を含む。
本発明はまた、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、多能性幹細胞を提供する。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一態様において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。
別の態様において、発現ベクターは、非ウイルスベクターである。
別の態様において、発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。
別の態様において、発現ベクターは、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
別の態様において、プロモーターは、内在性プロモーターである。
別の態様において、プロモーターは、人工プロモーターである。
別の態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
別の態様において、多能性幹細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトを含む。
別の態様において、遺伝子スイッチコンストラクトは、転写遺伝子スイッチコンストラクトである。
別の態様において、遺伝子スイッチコンストラクトは、転写後遺伝子スイッチコンストラクトである。
本発明はまた、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、角膜内皮細胞を提供する。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一態様において、角膜内皮細胞は、成熟角膜内皮細胞である。
別の態様において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。
別の態様において、発現ベクターは、非ウイルスベクターである。
別の態様において、発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。
別の態様において、発現ベクターは、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
別の態様において、プロモーターは、内在性プロモーターである。
別の態様において、発現ベクターは、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここで、プロモーターは、人工プロモーターである。
別の態様において、発現ベクターは、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここで、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
別の態様において、多能性幹細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトを含む。
別の態様において、多能性幹細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトを含み、ここで、遺伝子スイッチコンストラクトは、転写遺伝子スイッチコンストラクトである。
別の態様において、多能性幹細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトを含み、ここで、遺伝子スイッチコンストラクトは、転写後遺伝子スイッチコンストラクトである。
本発明はまた、本発明の角膜内皮細胞の集団、角膜内皮細胞の組成物、または角膜内皮細胞を含む、医薬組成物を提供する。
本発明はまた、本発明の方法により調製された角膜内皮細胞の集団、角膜内皮細胞の組成物、または角膜内皮細胞を含む、医薬組成物を提供する。
本発明はまた、疾患を、それを必要とする対象において処置する方法を提供し、該方法は、各々本発明による、角膜内皮細胞の集団、角膜内皮細胞を含む組成物、角膜内皮細胞、または、角膜内皮細胞の集団、角膜内皮細胞を含む組成物もしくは角膜内皮細胞を含む医薬組成物の有効量を、対象に投与することにより、対象において疾患を処置することを含む。
本発明はまた、疾患を、それを必要とする対象において処置する方法を提供し、該方法は、各々本発明の方法により調製された、角膜内皮細胞の集団、角膜内皮細胞を含む組成物、角膜内皮細胞、または、角膜内皮細胞の集団、角膜内皮細胞を含む組成物もしくは角膜内皮細胞を含む医薬組成物の有効量を、対象に投与することにより、対象の角膜において疾患を処置することを含む。
一態様において、疾患は、フックスジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、後部多形性ジストロフィー、先天性遺伝性内皮ジストロフィー、角膜ジストロフィー、および角膜移植における遅発型内皮不全からなる群より選択される。
本発明はまた、それを必要とする対象を処置する方法を提供し、ここで、対象は、水疱性角膜症をもたらす角膜浮腫の症状を示すか、ここで、対象は、コンタクトレンズの使用または白内障手術に起因する眼球の損傷を有するか、またはここで、対象は、持続する手術による外傷を有し、前記方法は、対象に、各々本発明による、角膜内皮細胞の集団、角膜内皮細胞を含む組成物、角膜内皮細胞、または、角膜内皮細胞の集団、角膜内皮細胞を含む組成物もしくは角膜内皮細胞を含む、医薬組成物を投与することにより、対象を処置することを含む。
本発明はまた、それを必要とする対象を処置する方法を提供し、ここで、対象は、水疱性角膜症をもたらす角膜浮腫の症状を示すか、ここで、対象は、コンタクトレンズの使用または白内障手術に起因する眼球の損傷を有するか、またはここで、対象は、持続する手術による外傷を有し、前記方法は、各々本発明の方法により調製された、角膜内皮細胞の集団、角膜内皮細胞を含む組成物、角膜内皮細胞、または、角膜内皮細胞の集団、角膜内皮細胞を含む組成物もしくは角膜内皮細胞を含む医薬組成物の有効量を、対象に投与することにより、対象を処置することを含む。
本発明はまた、各々本発明による、角膜内皮細胞の集団を含む組成物、角膜内皮細胞を含む組成物、角膜内皮細胞、または、角膜内皮細胞の集団を含む組成物、角膜内皮細胞を含む組成物、もしくは角膜内皮細胞を含む、医薬組成物、を含む、キットを提供する。
本発明はまた、各々本発明の方法により調製された、角膜内皮細胞の集団を含む組成物、角膜内皮細胞を含む組成物、角膜内皮細胞、または、角膜内皮細胞の集団を含む組成物、角膜内皮細胞を含む組成物、もしくは角膜内皮細胞を含む、医薬組成物、を含む、キットを提供する。
一態様において、キットは、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、ＴＦＡＰ２Ｂは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子を含む、キットを提供する。
本発明は、以下の詳細な説明および図面により、さらに説明される。
図１は、多能性幹細胞から、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを作製する方法の模式図である。ｈＰＳＣから、６日間にわたり神経堤分化を誘導した。６日後に、培地を、成熟を支持する培地に替えた。第１０日においてレンチウイルス感染を行い、第１４日および第２１日にからの試料（または約ｄ１４～約ｄ２８における試料からのもの）を、導入されたレンチウイルスにより発現された転写因子の発現について、ｑＰＣＲによりアッセイした。
図２は、転写因子を発現するレンチウイルスによる形質導入によるこれらの転写因子のｉＰＳＣ由来角膜内皮前駆細胞への導入の後の、第２１日における転写因子（ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２ＢおよびＬＭＸ１Ｂ）の発現レベルを示す棒グラフのパネルである。形質導入は、ｉＰＳＣ由来ＣＥＣの分化の第１０日に行い、ｑＰＣＲ分析は、分化の第２１日に行った。感染は、ベクター：培養培地の容積比＝１：１０または１：５０のいずれかを用いて達成した。形質導入された細胞における転写因子の発現のレベルは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはポリブレンで処置された対照細胞と比較して増大した。
図３は、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２ＢおよびＬＭＸ１Ｂ、単独で、または多様な組み合わせにおいて発現するレンチウイルスにより形質導入された角膜内皮前駆細胞のＣＥＣ分化の間の、未成熟～成熟ＣＥＣマーカーであるＣＯＬ８Ａ１および成熟ＣＥＣのマーカーであるＳｌｃ４ａ１１の発現レベルを示す棒グラフのパネルである。感染は、ベクター：培養培地の容積比＝１：１０または１：５０のいずれかを用いて達成した。ｑＰＣＲ分析は、ｉＰＳＣ由来ＣＥＣの分化の第２１日において行った。未成熟～成熟（ＣＯＬ８Ａ１）および成熟（ＳＬＣ４Ａ１１）ＣＥＣマーカーは、ＧＦＰまたはポリブレンのみで処置された細胞により上方調節された。発現の増大は、ピューロマイシンの存在下において、より高かった。
図４は、転写因子を発現するベクターにより安定に感染したｈＰＳＣ株における、転写因子ＰＩＴＸ２（Ａ）、ＦＯＸＣ１（Ｂ）およびＴＦＡＰ２Ｂ（Ｃ）の発現を示す棒グラフのパネルである。転写因子を、単独で、または他の転写因子と組み合わせて導入した。感染は、ベクター：培養培地の容積比＝１：１０または１：５０のいずれかと、その後のピューロマイシン選択を用いて達成した。棒グラフＤおよびＥは、安定に感染したｈＰＳＣ株において様々な転写因子の発現を増大させた場合の、未成熟～成熟ＣＥＣマーカーＣＯＬ８Ａ１（Ｄ）および成熟ＣＥＣマーカーＳＬＣ４Ａ１１（Ｅ）の発現を示す。発現は、ｑＰＣＲ分析により決定した。ＣＯＬ８Ａ１（Ｄ）および成熟ＣＥＣマーカーＳＬＣ４Ａ１１の発現のレベルは、１つ以上の転写因子を発現するように操作された細胞において、ＧＦＰのみで処置された対照細胞と比較して増大した。
図５は、ヒト角膜内皮細胞において豊富な転写因子アイソフォームを表す表である。 図６は、本明細書において記載されるとおりの方法により作製されたＣＥＣ細胞内での血管内皮マーカーｖＷＦおよびＣＤ３１のＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフのパネルである。
詳細な説明
本発明は、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを作製する、効率的かつ有効な方法を提供する。方法は、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞もしくは胚性幹細胞において、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることにより、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを作製することを含む。これらの方法により作製された組成物もまた、本発明により提供され、これらの組成物を用いる方法も同様である。ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および体細胞（分化転換された細胞および神経堤幹細胞などの幹細胞を含む）を含む、多能性（pluripotent）または複能性（multipotent）幹細胞の定方向分化を通して作製される。本発明の方法は、効率的かつ有効であり、本明細書において開示される多様な用途、例えば眼の疾患、例えば角膜の疾患の処置のために用いることができる、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの生成をもたらす。これらの細胞は、治療的使用のために提供された角膜の厄介な集合に対する代替物を提供することができることが期待される。
以下の詳細な説明は、どのようにして本発明を行い、これを使用するかを開示する。
本発明がより容易に理解され得るために、特定の用語をまず定義する。また、あるパラメーターの値または値の範囲が列記された場合は常に、列記された値に対して中間となる値および範囲もまた本発明の一部であることが意図されることに、注意すべきである。
以下の記載において、説明を目的として、本発明の徹底的な理解を提供するために、具体的な数、材料、および配置が記載される。しかし、当業者には、本発明がこれらの具体的な詳細なしで実施し得ることが明らかであろう。いくつかの場合において、本発明を不明瞭にしないように、周知の特色を省略するか、または単純化してもよい。さらに、本明細書において、「一態様（one embodiment）」または「１つの態様（an embodiment）」などの句についての言及は、当該態様と関連して記載される特定の特色、構造または特徴が、本発明の少なくとも１つの態様において含まれることを意味する。本明細書における多様な場所における「一態様において」などの句の出現は、必ずしも全てが同じ態様を言及してるものではない。
定義
別段に特定されない限り、以下の用語の各々は、このセクションにおいて記載される意味を有する。
不定冠詞「a」および「an」とは、関連する名詞のうちの少なくとも１つを指し、用語「少なくとも１つ」および「１つ以上」と交換可能に用いられる。
接続詞「または（or）」および「および／または（and/or）」は、非排他的な接離法（disjunction）として、交換可能に用いられる。
本願によれば、用語「約（about）」は、参照値の＋／－５％を意味する。
「角膜内皮細胞」または「ＣＥＣ」とは、一般的に、（生体において）角膜の後方面および眼の前房の表面を裏打ちするミトコンドリアリッチな細胞を指す。ＣＥＣはまた、本明細書において記載される方法を用いて、別の細胞型から、例えば神経堤幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化により、生成することができる。ＮＣＳＣ、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞からのＣＥＣの分化は、それらが、ＣＥＣマーカーの発現、主に六角形の形状を有する均一なサイズの細胞の単層を形成する能力、水性の体液から角膜のより表面側の層への溶質および栄養の漏出を可能にしつつ、同時に、角膜実質から水性の側へ水を反対向きに能動的にポンピングする、「漏出性のポンプ（leaky pump）」を形成する能力などの、内因性ＣＥＣの属性のうちの１つ以上を発揮することにより、同定または認識することができる。例示的なＣＥＣマーカーとして、これらに限定されないが、以下が挙げられる：Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ－１、ＫＬＦ１３、ＡＱＰ１、コラーゲンＶＩＩＩ、ＳＬＣ１６Ａ３、ＣＦＴＲ、ＮＢＣ１、ＣＡ２、ＡＥ２ ＳＣＬ４Ａ２、ＳＣＬ１６Ａ１、ＣＡ１２、ＣＡ４、ＦＯＸＣ１。例えば、ＣＥＣは、典型的には、コラーゲンＶＩＩＩ、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅポンプおよびＺＯ－１を発現し、ｖＷＦおよびＣＤ３１（後者は、血管内皮細胞において存在する）を発現しない。加えて、ＣＥＣは、１つ以上の角膜内皮ポンプマーカー（これは、以下を含む：Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ、ＳＬＣ４Ａ４、ＳＬＣ４Ａ１１、ＡＱＰ１、ＣＡ２、ＣＡ４、ＣＡ１２、ＳＣＬ１４Ａ２、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＳＬＣ１６Ａ７、ＣＦＴＲ、ＮＨＥ１、ＡＤＣＹ１０、電位依存性アニオンチャネルＶＤＡＣ２およびＶＤＡＣ３、クロライドチャネルタンパク質ＣＬＣＮ２およびＣＬＣ）、眼周囲の神経堤のマーカー（これは、ＰＩＴＸ２、およびＦＯＸＣ１を含む）、ならびに／または細胞接着およびマトリックスタンパク質（これは、以下を含む：オクルディン、コネキシン４３、９．３Ｅ抗原、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、Ｎカドヘリン、ＶＥカドヘリン、Ｅカドヘリン、ベータカテニン、ｐ１２０、ｐ１９０ラミニンアルファ４、ナイドジェン－２、およびネトリン４）を発現してもよい。例えば、ＣＥＣは、少なくとも１つ角膜内皮ポンプマーカー、少なくとも１つ眼周囲の神経堤のマーカー、ならびに少なくとも１つの細胞接着およびマトリックスタンパク質を発現してもよい。角膜内皮細胞として、本明細書において定義されるとおりの成熟角膜内皮細胞が挙げられる。
さらに別の態様において、ＣＥＣは、ＣＥＣ成熟の指標である網羅的な遺伝子発現プロフィールを提示する。網羅的遺伝子発現プロフィールは、当該分野において公知の任意の方法、例えばトランスクリプトーム分析またはマイクロアレイ分析により得られる。
用語「成熟角膜内皮細胞」または「成熟ＣＥＣ」とは、本明細書において用いられる場合、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＳＬＣ４Ａ１１およびＭＲＧＰＲＸ３のうちの１つ以上を含む、成熟表現型に関連するマーカーを示すＣＥＣを指す。成熟ＣＥＣは、主に六角形または多角形の形態を有する均一なサイズの細胞の単層を形成し、ここで、細胞は、互いに堅固な接着、および角膜実質の脱水を維持するバリアを形成するタイトジャンクションを形成する能力を示す。成熟ＣＥＣは、部分的に、成熟ＣＥＣの互いに堅固な接着、タイトジャンクションを形成する能力、細胞の間のタイトジャンクションの数、および角膜内皮ポンプを調節するタンパク質の発現に起因して、高レベルのポンプ機能を示す。タイトジャンクションは、角膜実質中への水の流れを減少させるためのバリアを形成し、改善されたポンプ活性は、角膜における正しい液体レベルの維持を増強する。成熟角膜内皮細胞はまた、酸化ストレスに対する耐性を示し得る。成熟角膜内皮細胞は、ポンプ機能と関連するマーカー、例えばＳＬＣ４Ａ１１およびＳＬＣ４Ａ４を発現し得る。成熟角膜内皮細胞において発現され得るポンプ機能と関連するさらなるマーカーとして、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ、ＡＱＰ１、ＣＡ２、ＣＡ４、ＣＡ１２、ＳＣＬ１４Ａ２、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＳＬＣ１６Ａ７、ＣＦＴＲ、ＮＨＥ１、ＡＤＣＹ１０、電位依存性アニオンチャネルＶＤＡＣ２およびＶＤＡＣ３、クロライドチャネルタンパク質ＣＬＣＮ２およびＣＬＣが挙げられる。
成熟ＣＥＣは、例えば角膜の障害を有する対象への成熟角膜内皮細胞の移植の後で、in vivoでの効力を示し得、成熟角膜内皮細胞は、レシピエント角膜上に生着することができ、タイトジャンクションを形成する細胞の単層を形成する。生着は、当業者に公知の方法を用いて達成され得る。例えば、生着は、生体材料を利用する生体工学的角膜移植片の使用により達成され得る（例えば、２０１９年４月１１日に出願されたＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１９８０８６を参照）。タイトジャンクションの形成およびポンプ機能と関連するマーカーの発現により、成熟ＣＥＣは、in vivoで、レシピエント角膜のポンプ機能を改善することができ、これは、角膜の透明性の増大をもたらす。移植された成熟ＣＥＣはまた、レシピエント角膜の厚みを減少させ、およびレシピエント角膜の透明性を増大させることができる。成熟角膜内皮細胞において発現され得るさらなるマーカーとして、これらに限定されないが、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１Ｂ、ＡＱＰ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＴＪＰ１、ＮＣＡＭ１、ＣＤＨ２、ＳＬＣ４Ａ４、ＣＤ１６６、ＰＯＵ６Ｆ２、ＣＤ２４８およびＭＲＧＰＲＸ３が挙げられる。１つの態様において、成熟角膜内皮細胞において発現されるマーカーは、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＭＲＧＰＲＸ３である。１つの態様において、成熟角膜内皮細胞において発現されるマーカーは、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２ＢおよびＬＭＸ１Ｂである。１つの態様において、成熟角膜内皮細胞において発現されるマーカーは、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＳＬＣ４Ａ１１およびＭＲＧＰＲＸ３である。
「神経堤幹細胞」または「ＮＣＳＣ」とは、一般に、メラノサイト、頭蓋顔面、末梢神経系、グリア、平滑筋、角膜実質細胞、および角膜内皮などの多様な細胞型を生成する発達の潜在能力を有する、神経前駆細胞を指す。神経堤幹細胞は、例えば本明細書において記載されるとおりの、またはＷＯ／２０１０／０９６４９６またはＵ．Ｓ．９，７５２，１１８（これらの各々は、その全体において本明細書において参考として援用される）において記載されるとおりの二重ＳＭＡＤ阻害剤を用いて、ｉＰＳＣまたはｈＥＳ細胞から分化し得る。神経堤幹細胞は、Ｗｎｔアゴニスト（例えば、Ｗｎｔ３ａおよび／または（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインディルビン－３’－オキシム（ＢＩＯ）など）とＳＭＡＤ阻害剤（ＳＢ４３１５４２および／またはノギンなど）との組み合わせを用いて、ｈＥＳ細胞またはｉＰＳＣから分化し得る；Menendez et al., PNAS、２０１１年１１月２９日、第１０８巻第４８号、１９２４０－１９２４５を参照。例えば、ＮＣＳＣの効率的誘導は、ｈＥＳＣを、ＳＢ４３１５４２、およびＢＩＯと（ノギンありまたはなしで）、またはＷｎｔ３ａおよびＳＢ４３１５４２と接触させた後で、報告された。ＮＣＳＣはまた、例えばｈＥＳ細胞をＭＳ５間質フィーダー細胞上で培養することにより、神経ロゼット（neural rosettes）の培養物から、入手可能であり得る（Lee, et al., Stem Cells 25 (8), 1931-1393 (2007)を参照；これは、本明細書においてその全体において参考として援用される。ＮＣＳＣはまた、発生中の胚におけるもの、神経管、坐骨神経、腸、および後根神経節におけるもの；ならびに若年および成人におけるもの、後根神経節、骨髄、皮膚、心臓、角膜、歯および頸動脈小体（caratoid body）におけるものを含む、多数の組織から入手可能である。Nagoshi et al., Journal of Cellular Biochemistry 107:1046-1052 (2009)；Crane and Trainor, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2006. 22:267-86；およびBlum, Brain Research Bulletin 83 (2010) 189-193を参照；これらの各々は、その全体において本明細書において参考として援用される。
神経堤幹細胞は、本明細書において同定される、および当該分野において公知のマーカーの発現により同定され得る。例示的な神経堤幹細胞マーカーとして、これらに限定されないが、以下が挙げられる：ＳＯＸ１０、ＡＰ２、ＨＮＫ１、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７およびｐ７５（ＮＧＦＲ）、ならびにＰａｘ６発現が低いかまたは不在であること。眼周囲間充織（ＰＯＭ）は、ＰＩＴＸ２およびＦＯＸＣ１について陽性であり、またＴＦＡＰ２Ｂおよび／またはＬＭＸ１Ｂをも発現し得る、神経堤細胞の亜集団である。
用語「角膜内皮前駆細胞」一般に、初期から中期のＣＥＣマーカー（ＺＯ１、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ、Ｎ－カドヘリン、ＮＣＡＭ１、ＣＤ１６６、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＳＬＣ４Ａ４）の発現、および多角形または六角形の細胞の単層を形成する能力などの、ＣＥＣの一部の特色を獲得し始めている、神経堤期後の細胞を指す。これらの細胞は、必ずしも、成熟ＣＥＣと同等のレベルにおいて、または成熟ＣＥＣと同じ発現の％レベルにおいて、ＣＥＣマーカーを発現しない。
本明細書において用いられる場合、用語「マーカー」または「細胞マーカー」とは、その存在が特定の細胞または細胞型を同定する、遺伝子（例えばＲＮＡ）またはタンパク質を指す。ある細胞についてのマーカーは、１つのマーカーに限定されない場合があり、マーカーは、指定された群のマーカーが、ある細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から同定し得るような、マーカーの「パターン」、例えば、いくつかのマーカーの発現、および他の細胞型の指標である他のマーカーの発現の不在または低い発現を含むパターンを指す場合がある。例えば、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの集団は、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣのマーカーについて陽性であり、他の細胞型の指標であるマーカーについて陰性であってもよく、例えば他の内皮細胞型において発現されるマーカーが不在であるか、ｈＥＳ細胞またはｉＰＳＣにより発現されるマーカーが不在であるか、および／または神経堤幹細胞により発現されるマーカーが不在であってもよい。加えて、マーカーの発現が、細胞染色法（例えば、免疫蛍光など）により検出される場合、ある細胞は、例えばマーカーＺＯ－１のタイトジャンクション局在などの予測される染色パターンを与えられた場合に、特定のマーカーについて陽性であるものと同定されてもよい。マーカーの発現は、当該分野において公知の任意の方法により検出され得、これは、以下を含むがこれらに限定されない：ウェスタンブロッティング、ｍＲＮＡ増幅ベースの方法（例えば、ＰＣＲ、等温増幅など、これらは逆転写を含んでもよく、単一の細胞または複数の細胞からの発現を検出するために適用されてもよい）、ノーザンブロッティング、免疫染色など。加えて、前記マーカーの発現は、前述のマーカーのうちの１つまたはそのフラグメントのプロモーターなどの、細胞型特異的な発現を与える遺伝因子の制御下における、レポーターコンストラクト（例えば、その発現が可視的に検出され得る蛍光タンパク質、その発現が抗生物質の存在下における細胞の生存により検出され得る抗生物質耐性遺伝子、など）の発現により、推測されてもよい。文献からの例示的なレポーターコンストラクトは、ｐＯＣＴ４－ＧＦＰおよびｐＯＣＴ４－ＬＵＣ遺伝子であり、これらは、それぞれＧＦＰおよびルシフェラーゼの発現を駆動し、ＥＳ細胞において、これらのいずれかの発現は、慣用的な方法を用いて容易に検出可能である。マーカーの発現を検出するさらなる方法であって、用いてもよいものは、当該分野において公知である。一般に、Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology（Current Protocols、１９８８年）；Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology（Current Protocols；第５版、２００２年）；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press、第３版、２００１年）；Sambrook et al., The Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press、２００６年）を参照；これらの各々は、その全体において本明細書において参考として援用される。
本明細書において用いられる場合、「増大させる（increase）」または「増大した（increased）」とは、それが発現または活性のレベルを指す場合、発現または活性の対照レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、または１０，０００倍の増大を意味する。「増大した」とは、それが発現または活性のレベルを指す場合、また、発現または活性の対照レベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７９％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増大を意味する。
用語「発現を増大させる（increasing expression）」とは、本明細書において用いられる場合、転写因子の内因性の核酸のレベルおよび／またはタンパク質レベルと比較して、本明細書において開示される転写因子をコードする核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡのレベルおよび／または活性を増大させること、ならびに／あるいは本明細書において開示される転写因子のレベルおよび／または活性を増大させることを指す。いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、細胞（例えば、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞）を、少なくとも１つの転写因子と接触させることを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、少なくとも１つの転写因子をコードするウイルスベクターによる、細胞（例えば、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞）の形質導入を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、少なくとも１つの転写因子をコードする発現ベクターによる、細胞（例えば、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞）のトランスフェクションを含む。
いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、細胞（例えば、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞）における少なくとも１つの転写因子の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、細胞（例えば、角膜内皮細胞、または多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞）における少なくとも１つの転写因子の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、または１０００％の増大を含む。
本明細書において用いられる場合、「減少させる（decrease）」または「減少した（decreased）」とは、それが発現または活性のレベルを指す場合、発現または活性の対照レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、または１０，０００倍の減少を意味する。「減少した」とは、それが発現または活性のレベルを指す場合、また、発現または活性の対照レベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７９％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増大を意味する。
本発明の多様な方法は、ある値、レベル、特色、特徴、および／または特性を、「対照」と比較することを含むステップを含む。「対照」は、当業者が精通している、比較目的のために有用な、任意の対照または標準であってよい。一態様において、「対照」は、細胞、例えば多能性幹細胞、角膜内皮前駆細胞、ＣＥＣ、例えば本明細書において記載されるとおりの成熟ＣＥＣにおいて、転写因子の発現を増大させる前に決定される、値、レベル、特色、特徴、特性などである。例えば、転写因子の発現のレベル、ＣＥＣ系統の細胞、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣ活性のマーカーの発現のレベル、または形態学、例えば、ポンプ機能、酸化ストレスに対する耐性、または細胞の集団におけるタイトジャンクション形成は、細胞において転写因子を発現させる前に、または転写因子の不在下において、決定してもよい。別の態様において、「対照」は、細胞または生物、例えば、例えば通常の遺伝形質を示している、対照または通常の細胞または生物において決定される、値、レベル、特色、特徴、特性などである。さらに別の態様において、「対照」は、転写因子の発現の前に決定される、予め定義された値、レベル、特色、特徴、特性などである。さらに別の態様において、「対照」は、角膜内皮前駆細胞を意味し、これは、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣについての対照となり得る。
「対照細胞」とは、転写因子を発現する細胞がそれに対して比較される細胞を指す。「対照細胞」は、転写因子を発現しなくともよい。「対照細胞」は、それが対照となる相手の細胞と比較して、投与量、時間の長さなどを含む異なる条件下において転写因子を発現する、発現ベクターと接触させられていてもよい。
用語「内因性」とは、本明細書において用いられる場合、細胞における、または細胞のゲノムにおける、その天然の位置における、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、ペプチドまたはポリペプチドのネイティブな形態を指す。
本明細書において用いられる場合、「外因性」とは、細胞の外側、または細胞のゲノムの外側に由来する、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、ペプチドまたはポリペプチドを指す。
用語「成熟」とは、本明細書において用いられる場合、細胞、例えば角膜内皮前駆細胞が、より特化したもの、および／または機能的なもの、例えばin vivoでのその機能的な状態に類似するものとなるために、必要とされるプロセスを指す。一態様において、角膜内皮前駆細胞がＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣとなるプロセスが、成熟として言及される。
本明細書において用いられる場合、用語「多能性幹細胞」、「ＰＳ細胞」、または「ＰＳＣ」は、多能性幹細胞が誘導される方法にかかわりなく、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞および胚由来多能性幹細胞を含む。多能性幹細胞は、（ａ）免疫欠損（ＳＣＩＤ）マウスにおいて移植された場合に奇形腫を誘導することができる；（ｂ）３つ全ての胚葉の細胞型へと分化することができる（例えば、外肺葉性、中胚葉性、および内肺葉性の細胞型へと分化することができる）；（ｃ）胚性幹細胞の１つ以上のマーカーを発現する（例えば、ＯＣＴ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－３表面抗原、ＳＳＥＡ－４表面抗原、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１などを発現する）；および（ｄ）自己再生することができる、幹細胞として、機能的に定義される。用語「多能性」とは、細胞が、身体または細胞体（すなわち、胚固有のもの（embryo proper））の全ての細胞系譜を形成する能力を指す。例えば、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞は、３つの肺葉：外肺葉、中胚葉および内肺葉の各々から細胞を形成することができる多能性幹細胞の型である。多能性は、発生能力の連続体であって、これは、完全な生物を生じることができない不完全にまたは部分的に多能性である細胞から、完全な生物を生じることができる、より原始的な、より多能性の細胞（例えば胚性幹細胞）にわたる。例示的な多能性幹細胞は、例えば、当該分野において公知の方法を用いて作製することができる。例示的な多能性幹細胞として、これらに限定されないが、胚盤胞期の胚の内細胞塊から誘導される胚性幹細胞、卵割期または桑実胚期の胚の１つ以上の卵割球から（任意に、胚の残りを破壊することなく）誘導される胚性幹細胞、体細胞の多能性期へのリプログラミングにより生成される誘導多能性幹細胞、および胚性生殖（ＥＧ）細胞から（例えば、ＦＧＦ－２、ＬＩＦおよびＳＣＦの存在下において培養することにより）生成される多能性細胞が挙げられる。かかる胚性幹細胞は、受精により、または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、および雄核発生を含む無性生殖的手段により生成された、胚の材料から作製することができる。
１つの態様において、多能性幹細胞は、例えば、寿命延長、効力、ホーミングを増大させるため、免疫応答を予防または減少させるため、またはかかる多能性細胞から得られる所望される因子を、細胞において送達するため（例えば、角膜内皮細胞）に、遺伝子操作されていても、または別段に修飾されていてもよい。例えば、多能性幹細胞、およびしたがって結果として生じる分化した細胞は、ベータ２ミクログロブリン、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦおよびＨＬＡ－Ｇを含むクラスＩ遺伝子、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＣＴＩＩＡ、ＲＦＸ５、ＴＲＡＣ、またはＴＲＡＢ遺伝子を欠失するため、またはその発現を低下させるために、操作されていても、または別段に修飾されていてもよい。ＷＯ２０１２１４５３８４およびＷＯ２０１３１５８２９２（これらは、本明細書においてその全体において参考として援用される）において記載されるとおり、いくつかの態様において、多能性幹細胞などの細胞、および結果として生じる分化した細胞、例えば成熟ＣＥＣは、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子において、遺伝子操作による破損を含む。いくつかの態様において、細胞は、ＨＬＡ－１α鎖の少なくとも一部と、直接的に、またはリンカー配列を介して、共有結合により連結された、Ｂ２Ｍタンパク質の少なくとも一部を含む、単鎖融合ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩタンパク質をコードすることができるポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの態様において、ＨＬＡ－１α鎖は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦおよびＨＬＡ－Ｇから選択される。いくつかの態様において、細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ関連遺伝子において、遺伝子操作による破損を含む。いくつかの態様において、ＨＬＡクラスＩＩ関連遺伝子は、制御因子Ｘ関連アンキリン含有タンパク質（ＲＦＸＡＮＫ）、制御因子５（ＲＦＸ５）、制御因子Ｘ関連タンパク質（ＲＦＸＡＰ）、クラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、ＨＬＡ－ＤＰＡ（α鎖）、ＨＬＡ－ＤＰＢ（β鎖）、ＨＬＡ－ＤＱＡ、ＨＬＡ－ＤＱＢ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡおよびＨＬＡ－ＤＯＢから選択される。いくつかの態様において、細胞は、単鎖融合ＨＬＡクラスＩＩタンパク質またはＨＬＡクラスＩＩタンパク質をコードする、１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
多能性幹細胞および結果として生じる分化した細胞は、遺伝子の発現を増大させるために、操作されていても、または別段に修飾されていてもよい。１つの態様において、多能性幹細胞は、本発明の転写因子のうちの１つ以上を発現させるか、またはその発現を増大させるために、操作されていてもよい。１つ以上の遺伝子（またはタンパク質）の発現を調節するために細胞を操作するための、多様な技術が存在し、これは、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクター、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびゲノム操作のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの方法の使用、ならびにアンチセンスおよびＲＮＡ干渉（これは、安定に組み込まれたベクターおよびエピソームベクターを用いて達成することができる）などの転写および翻訳の阻害剤の使用を含む。
用語「胚」または「胚性」は、発生中の細胞塊であって、母性宿主の子宮膜中に移植されていないものを意味する。「胚性細胞」とは、胚から単離された、または胚において含まれる細胞である。これはまた、二細胞期ほどの初期に得られた卵割球、または抽出の後で凝集した卵割球を含む。
用語「胚由来細胞」（ＥＤＣ）とは、本明細書において用いられる場合、広範に、桑実胚由来細胞、内細胞塊のものを含む胚盤胞由来細胞、胚盾（embryonic shield）、またはエピブラスト、または原始内胚葉、外肺葉、および中胚葉およびそれらの誘導体を含む初期胚の他の多能性幹細胞を指す。「ＥＤＣ」はまた、発生の多様なステージからの凝集した単一の卵割球または胚からの卵割球および細胞塊を含むが、細胞株として継代されたヒト胚性幹細胞を除外する。
用語「胚性幹細胞」、「ＥＳ細胞」、または「ＥＳＣ」とは、本明細書において用いられる場合、広範に、胚盤胞の内細胞塊または桑実胚から単離された細胞であって、細胞株として連続継代されたものを指す。当該用語はまた、胚の１つ以上の卵割球から、好ましくは胚の残りを破壊することなく、単離された細胞を含む（例えば、Chung et al., Cell Stem Cell. 2008 Feb 7;2(2): 1 13-7；米国公開番号２００６０２０６９５３；米国公開番号２００８／００５７０４１を参照；これらの各々は、本明細書によりその全体において参考として援用される）。ＥＳ細胞は、精子またはＤＮＡによる卵細胞の受精、核移植、単為生殖から、またはＨＬＡ領域におけるホモ接合性を有するＥＳ細胞を作製するための任意の手段により、誘導され得る。ＥＳ細胞はまた、精子および卵細胞の融合、核移植、単為生殖、またはクロマチンのリプログラミングおよびその後の細胞を生成するためのリプログラミングされたクロマチンの細胞膜への組み込みにより生成された、接合体、卵割球、または胚盤胞期の哺乳動物胚から誘導される細胞を指す場合もある。１つの態様において、胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（または「ｈＥＳ細胞」）であってよい。１つの態様において、ヒト胚性幹細胞は、受精から１４日間を超える胚からは誘導されない。別の態様において、ヒト胚性幹細胞は、in vivoで発生した胚からは誘導されない。別の態様において、ヒト胚性幹細胞は、in vitro受精により生成された着床前胚から誘導される。
「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」または「ｉＰＳＣ」本明細書において用いられる場合、一般に、体細胞をリプログラミングすることにより得られる多能性幹細胞を指す。ｉＰＳ細胞は、体細胞において、因子（「リプログラミング因子」）の組み合わせ、例えば、ＯＣＴ４（時にＯＣＴ３／４として言及される）、ＳＯＸ２、ＭＹＣ（例えば、ｃ－ＭＹＣまたは任意のＭＹＣバリアント）、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８およびＫＬＦ４を発現させること、またはその発現を誘導することにより、作製することができる。１つの態様において、リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣおよびＫＬＦ４を含む。別の態様において、リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を含む。ある態様において、体細胞を首尾よくリプログラミングするために、少なくとも２つのリプログラミング因子が、体細胞において発現される。他の態様において、体細胞を首尾よくリプログラミングするために、少なくとも３つのリプログラミング因子が、体細胞において発現される。他の態様において、体細胞を首尾よくリプログラミングするために、少なくとも４つのリプログラミング因子が、体細胞において発現される。別の態様において、体細胞を首尾よくリプログラミングするために、少なくとも５つのリプログラミング因子が、体細胞において発現される。さらに別の態様において、少なくとも６つのリプログラミング因子、例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８およびＫＬＦ４が、体細胞において発現される。他の態様において、さらなるリプログラミング因子が同定され、単独で、または１つ以上の既知のリプログラミング因子と組み合わせて、体細胞を多能性幹細胞へとリプログラミングするために用いられる。
ｉＰＳ細胞は、胎児、出生後、新生児、若年、または成人の体細胞を用いて作製してもよい。体細胞として、これらに限定されないが、以下が挙げられ得る：線維芽細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、筋肉細胞、臓器および組織の細胞、ならびに造血細胞（例えば造血幹細胞）を含むがこれに限定されない多様な血液細胞。１つの態様において、体細胞は、皮膚線維芽細胞、滑膜線維芽細胞もしくは肺線維芽細胞などの線維芽細胞、または非線維芽細胞性の体細胞である。
ｉＰＳ細胞は、細胞バンクから得てもよい。あるいは、ｉＰＳ細胞は、当該分野において公知の方法により、新たに作製してもよい。ｉＰＳ細胞は、組織に適合した細胞を作製することを目的として、特定の患者または適合したドナーからの材料を用いて、特に作製してもよい。１つの態様において、ｉＰＳ細胞は、実質的に免疫原性ではない、汎用性のドナー細胞であってもよい。
誘導多能性幹細胞は、体細胞において１つ以上のリプログラミング因子を発現させるか、またはその発現を誘導することにより、生成してもよい。リプログラミング因子は、これらに限定されないが、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いる感染、またはＣＲＩＳＰＲ、Ｔａｌｅｎ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）などの他の遺伝子編集技術により、体細胞において発現させてもよい。また、リプログラミング因子は、エピソーマルプラスミド、または合成ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、またはセンダイウイルスなどのＲＮＡウイルスなどの非組み込み型（non-integrative）ベクターを用いて、体細胞において発現させてもよい。リプログラミング因子が非組み込み型ベクターを用いて発現された場合、因子は、細胞において、エレクトロポレーション、トランスフェクション、またはベクターによる体細胞の形質転換を用いて、発現させてもよい。例えば、マウス細胞においては、組み込み型（integrative）ウイルスベクターを用いる４つの因子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣおよびＫＬＦ４）の発現が、体細胞をリプログラミングするために十分である。ヒト細胞においては、組み込み型ウイルスベクターを用いる４つの因子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８）の発現が、体細胞をリプログラミングするために十分である。
リプログラミング因子の発現は、体細胞を、リプログラミング因子の発現を誘導する少なくとも１つの剤、例えば有機小分子剤と接触させることにより、誘導してもよい。
体細胞はまた、リプログラミング因子が発現され（例えば、ウイルスベクター、プラスミドなどを用いて）、リプログラミング因子の発現が誘導される（例えば、有機小分子を用いて）、コンビナトリアルなアプローチを用いて、リプログラミングしてもよい。
リプログラミング因子が細胞において発現または誘導された後で、細胞を培養してもよい。経時的に、ＥＳの特徴を有する細胞が、培養ディッシュ中に現れる。細胞を選択して、例えば、ＥＳ細胞の形態学に基づいて、または選択可能もしくは検出可能なマーカーの発現に基づいて、継代培養してもよい。細胞を培養して、ＥＳ細胞に類似する細胞の培養物を生成してもよい。
ｉＰＳ細胞の多能性を確認するために、細胞を、１つ以上の多能性のアッセイにおいて試験してもよい。例えば、細胞を、ＥＳ細胞マーカーの発現について試験してもよい；細胞を、ＳＣＩＤマウス中に移植された場合に奇形腫を生じる能力について評価してもよい；細胞を、３つ全ての胚葉の細胞型を生じるように分化する能力について評価してもよい。
ｉＰＳ細胞は、任意の種からのものであってよい。これらのｉＰＳ細胞は、マウスおよびヒトの細胞を用いて首尾よく作製されてきた。さらに、ｉＰＳ細胞は、胚、胎児、新生児、および成人の組織を用いて、首尾よく作製されてきた。したがって、ｉＰＳ細胞は、任意の種からのドナー細胞を用いて、容易に作製することができる。したがって、ｉＰＳ細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄動物（ウシ、ヒツジ、など）、イヌ（飼育下および野生のイヌ）、ネコ（飼育下および野生のネコ、例えばライオン、トラ、チータ）、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、アライグマ、ウマ、ゼブラ、海生哺乳類（イルカ、クジラなど）、および類似のものを含むが、これらに限定されない、任意の種から作製することができる。
「有効量」とは、本明細書において用いられる場合、広範に、化合物または細胞の量であって、疾患を処置するために患者に投与された場合に、疾患についてかかる処置をもたらすために十分であるものを指す。有効量は、予防（prophylaxis）のために有効な量であっても、および／または予防（prevention）のために有効な量であってもよい。有効量は、兆候／症状の発生を減少させるために有効な量、これを予防（prevent）するため、兆候／症状の発生の重篤度を低下させるため、兆候／症状の発生を取り除くため、兆候／症状の発生の発達を速度低下させるため、兆候／症状の発生の発達を予防（prevent ）するため、および／または兆候／症状の発生の予防（prophylaxis）をもたらすために有効な量であってよい。「有効量」は、疾患およびその重篤度、ならびに処置されるべき患者の年齢、体重、病歴、易罹患性および既存の状態に依存して変化し得る。用語「有効量」は、本発明の目的のために、「治療有効量」と同義である。
用語「接触させること」（例えば、細胞、例えば角膜内皮前駆細胞、または多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞）を、本発明による転写因子（単数または複数）と接触させること）とは、細胞中に、転写因子（単数または複数）を導入する、および／または転写因子（単数または複数）と細胞とを一緒にin vitroでインキュベートする（例えば、転写因子（単数または複数）を、培養中の細胞に添加すること）、任意の方法を含むことを意図される。いくつかの態様において、用語「接触させること」とは、細胞の、本明細書において開示されるとおりの転写因子（単数または複数）であって、対象において天然に存在するものへの、in vivoでの暴露を含むことは意図されない。細胞を本明細書において開示されるとおりの転写因子（単数または複数）と接触させるステップは、任意の好適な様式において行うことができる。細胞は、接着培養において、または懸濁培養において、処置されてもよく、転写因子（単数または複数）は、実質的に同時に（例えば、カクテル中で一緒に）、または連続的に（例えば、第１の転写因子の添加から１時間以内、１日以内、またはそれより後で）添加することができる。本明細書において開示されるとおりの転写因子（単数または複数）と接触した細胞を、また、同時に、またはその後、細胞を安定化させるため、もしくは細胞をさらに分化させるための、増殖因子または他の分化剤または環境などの別の剤と、接触させることができることが、理解される。１つの態様において、細胞を転写因子と接触させることは、転写因子（単数または複数）をコードする核酸を含むベクターによる細胞の形質導入、または転写因子（単数または複数）をコードする核酸を含む発現ベクターによる細胞のトランスフェクションを含み、細胞を、例えば多能性および／または分化した細胞を培養するための、例えば例においてさらに記載されるとおりの、当該分野において公知の条件下において培養することを含んでもよい。
「接触させること」とは、また、細胞、例えば、多能性幹細胞、角膜内皮前駆細胞、神経堤幹細胞、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを、転写因子を発現する誘導性発現ベクターの発現を調節する剤、例えば、誘導性プロモーターを含むベクターまたは遺伝子スイッチを含むベクターからの転写因子の発現を活性化／誘導する剤、例えば小分子剤と接触させることを指す。
用語「接触させること」（例えば、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞を、本発明による転写因子（単数または複数）と接触させること）は、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞中に、転写因子（単数または複数）を導入し、および／または転写因子（単数または複数）と角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞とを一緒にin vitroでインキュベートする（例えば、転写因子（単数または複数）を培養中の細胞に添加する）、任意の方法を含むことを意図される。いくつかの態様において、用語「接触させること」は、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞の、本明細書において開示されるとおりの転写因子（単数または複数）であって、対象において天然に存在するものへの、in vivoでの暴露を含むことを意図されない。角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞を本明細書において開示されるとおりの転写因子（単数または複数）を接触させるステップは、任意の好適な様式において行うことができる。細胞は、接着培養において、または懸濁培養において、処置されてもよく、転写因子（単数または複数）は、実質的に同時に（例えば、カクテル中で一緒に）、または連続的に（例えば、第１の転写因子の添加から１時間以内、１日以内、またはそれより後で）添加することができる。本明細書において開示されるとおりの転写因子（単数または複数）と接触した細胞を、また、同時に、またはその後、細胞を安定化させるため、もしくは細胞をさらに分化させるための、増殖因子または他の分化剤または環境などの別の剤と、接触させることができることが、理解される。１つの態様において、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞を転写因子と接触させることは、転写因子（単数または複数）をコードする核酸を含むベクターによる角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞の形質導入、あるいは転写因子（単数または複数）をコードする核酸を含む発現ベクターによる角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞のトランスフェクションを含み、細胞を、例えば分化した細胞を培養するための、例えば例においてさらに記載されるとおりの、当該分野において公知の条件下において培養することを含んでもよい。
本明細書において用いられる場合、用語「分化」は、特化していない（「拘束されていない（uncommitted）」か、より低く特化した細胞が、例えばＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣなどの特化された細胞の特色を獲得するプロセスである。分化した細胞とは、ある細胞の系譜内のより特化した位置を取っているものである。例えば、ｉＰＳＣまたはｈＥＳ細胞は、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを含む、多様なより分化した細胞型へと分化させることができる。ある態様において、細胞の分化は、in vitroで行われ、in vivoでの分化を除外する。
本明細書において用いられる場合、用語「培養された」または「培養すること」とは、中でも任意の特化した添加物質を含む、培養される細胞の生命を維持するために必要とされる栄養を含む培地中に、細胞を置くことを指す。細胞は、かかる細胞が維持される培地が特化した物質を含む場合に、かかる特化した物質の「存在下において」培養される。培養することは、限定することなく、ペトリディッシュ、培養ディッシュ、採血バッグ、ローラーボトル、フラスコ、試験管、マイクロタイターウェル、中空繊維カートリッジまたは当該分野において公知の任意の他の装置を含む、任意の容器または装置において行うことができ、この中で、細胞を、培地に暴露した状態で維持することができる。
本明細書において用いられる場合、用語「継代培養すること（subculturing）」または「継代すること（passaging）」、とは、前の培養物からのいくつかの、または全ての細胞を、フレッシュな増殖培地に移すこと、および／または新たな培養ディッシュ上に播種して、さらに細胞を培養することを指す。継代培養することは、例えば、培養中の細胞の寿命を延長するために、それを所望される細胞集団について濃縮するために、および／またはその数を増やすために、行ってもよい。例えば、当該用語は、いくつかの、または全ての細胞を、新たな培養容器に、細胞の増殖を可能にするためにより低い細胞密度で、移すこと、培養すること、または播種することを含む。
本明細書において用いられる場合、「投与」、「投与すること」およびそれらのバリアントは、組成物または剤を、対象中に導入することを指し、組成物または剤の、同時の、および連続的な導入を含む。「投与」は、例えば、治療的、薬物動態学的、診断的、研究、プラセボ、および実験的方法を指し得る。「投与」はまた、in vitroおよびex vivoでの処置を包含する。投与は、自己投与および別人による投与を含む。投与は、任意の好適な経路により、行うことができる。投与の好適な経路は、組成物または剤が、その意図される機能を行うことを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または剤を対象の静脈から導入することにより、投与される。
本明細書において用いられる場合、用語「対象」、「個体」、「宿主」、および「患者」は、本明細書において交換可能に用いられ、診断、処置または治療が所望される任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書において記載される方法は、ヒトの治療および獣医の適用の両方に適用可能である。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物であり、特定の態様においては、対象は、ヒトである。
本明細書において用いられる場合、ある活性剤（例えばＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣ）の「治療的量」、「治療有効量」、「有効な量」、または「薬学的有効量」という用語は、意図される処置の利益を提供するために十分である量を指すように、交換可能に用いられるしかし、投与量のレベルは、傷害の型、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重篤度、投与の経路、期待される細胞の生着、長期生存率、および／または使用される特定の活性剤を含む、多様な要因に基づく。したがって、投与量のレジメンは、広く変化し得るが、医師により標準的な方法を用いて慣用的に決定することができる。加えて、用語「治療的量」、「治療有効量」および「薬学的有効量」は、記載される発明の組成物の、予防的（prophylactic）または予防的（preventative）な量を含む。記載される発明の予防的（prophylactic）または予防的（preventative）適用において、医薬組成物または医薬は、疾患、障害または状態に対して易罹患性である、または別段にこれのリスクがある患者に、当該リスクを取り除くかまたはこれを軽減するため、重篤度を和らげるため、あるいは疾患、障害または状態の生化学的、組織学的および／または行動的症状、その合併症、および疾患、障害または状態の発達の間に現れる中間的病理学的表現型を含む、疾患、障害または状態の発症を遅延させるために十分な量において、投与される。一般に、最大用量、すなわち、ある医学的判断による最も高い安全な用量が用いられることが好ましい。用語「用量」および「投与量」は、本明細書において交換可能に用いられる。
本明細書において用いられる場合、用語「治療効果」とは、処置の結果、望ましく、かつ有益であるものと判断される結果を指す。治療効果は、直接的にまたは間接的に、疾患の徴候（manifestation）の停止、減少、または除去を含み得る。治療効果はまた、直接的にまたは間接的に、疾患の徴候の進行の停止、減少、または除去を含み得る。
本明細書において記載される治療剤（例えばＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣ）について、治療有効量は、初めに、事前にin vitroでの研究および／または動物モデルから決定してもよい。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定してもよい。適用される用量は、投与される化合物の相対的なバイオアベイラビリティおよび力価に基づいて調整してもよい。上記の方法および他の周知の方法に基づいて最大効力を達成するために用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。
薬物動態学的原理は、許容し得ない有害効果を最少にしつつ所望される程度の治療効力を得るために、投与量のレジメンを修飾するための基礎を提供する。剤の血漿濃度を測定して治療ウィンドウに関連付けることができる状況においては、投与量の修飾のためのさらなるガイダンスを得ることができる。
本明細書において用いられる場合、用語「処置する」、「処置すること」および／または「処置」は、状態の進行を抑止すること（abrogating）、実質的に阻害すること、速度低下させること、もしくは逆転させること、状態の臨床的症状を実質的に寛解させること、または状態（例えば病理学的状態）の臨床的症状の出現を実質的に予防すること、有益な、または所望される臨床的結果を得ることを含む。処置することは、さらに、以下の１つ以上を達成することを指す：（ａ）障害の重篤度を低下させること；（ｂ）処置されている障害に特徴的な症状の発達を限定すること；（ｃ）処置されている障害に特徴的な症状の悪化を限定すること；（ｄ）以前にその障害を有した患者における障害の再発を限定すること；および（ｅ）以前はその障害について無症候であった患者における症状の再発を限定すること。
有益または所望される臨床結果、例えば薬理学的および／または生理学的効果として、これらに限定されないが、その疾患、障害または状態に罹患し易い場合があるが、疾患の症状を経験または示したことがない対象において、その疾患、障害または状態が生じることを予防すること（予防的（prophylactic）処置）、疾患、障害または状態の症状の軽減、疾患、障害または状態の程度の減少、疾患、障害または状態の安定化（すなわち、悪化していないこと）、疾患、障害または状態の拡散を予防すること、疾患、障害または状態の進行の遅延または速度低下させること、疾患、障害または状態の寛解または緩和、およびこれらの組み合わせ、ならびに処置を受けていない場合の予測される生存と比較して生存を延長させることが挙げられる。
疾患の「兆候（sign）」とは、本明細書において用いられる場合、広範に、疾患の指標であり、患者の試験において発見可能な、任意の異常性を指す；疾患の客観的な指標であり、疾患の主観的指標である症状とは対照的である。
疾患の「症状」とは、本明細書において用いられる場合、広範に、患者により経験され、疾患の指標である、任意の病的現象、または構造、機能もしくは感覚における正常からの逸脱を指す。
Ｉ．本発明の方法
本発明は、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの成熟化を促進するために、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させること、およびそれにより、成熟した、かつ機能的なＣＥＣの生成を可能にすることを含む方法の発見に基づく。本発明の方法は、効率的かつ有効であり、例えば多能性幹細胞からの、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの生成をもたらし、これは、本明細書において開示される多様な適用、例えば、ＣＥＣに影響を及ぼす疾患または障害（例えば、フックスジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、後部多形性ジストロフィーおよび先天性遺伝性内皮ジストロフィーなどの原発性疾患、ならびに有効な処置が角膜内皮の置き換えである二次疾患（角膜ジストロフィーを含む）、または、水疱性角膜症をもたらす角膜浮腫の症状を示す対象における場合、対象がコンタクトレンズの使用もしくは白内障手術に起因する眼球の損傷を有する場合、または対象が角膜移植を考慮している場合を含む）の処置のために用いることができるか、または移植もしくはその投与による処置に受入可能である。
いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。
いくつかの態様において、角膜内皮前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。
いくつかの態様において、角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を誘導することを含む。
いくつかの態様において、角膜内皮前駆細胞は、多能性幹細胞から誘導される、例えば、誘導多能性幹細胞または胚性幹細胞である。多能性細胞を角膜内皮前駆細胞へと分化させるための任意の方法を用いてもよい。例えば、角膜内皮前駆細胞は、本明細書において記載されるとおりの多能性幹細胞を分化させることにより得てもよい。
いくつかの態様において、多能性幹細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含むように操作してもよい。いくつかの態様において、発現ベクターは、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に対して作動可能に連結された、プロモーター、例えば内在性プロモーター、人工プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む。
角膜内皮細胞を作製するための細胞
本発明のある態様において、角膜内皮前駆細胞においてＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることにより、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを生成するための方法および組成物が開示される。いくつかの態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣ、および角膜内皮前駆細胞は、多能性幹細胞、例えば、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、胎児幹細胞および／または成人幹細胞から誘導される。さらなる態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣ、および角膜内皮前駆細胞は、体細胞から誘導してもよい。
Ａ．幹細胞
発生中の胚において、幹細胞は、特化した胚性組織の全てに分化することができる。成体の生物において、幹細胞および前駆細胞は、身体の修復系として働き、特化した細胞を補充するが、また、血液、皮膚または腸組織などの再生性の臓器の正常なターンオーバーを維持する。
ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞は、角膜内皮前駆細胞を含む身体の全ての細胞型へと分化する潜在能力を保持したままでの、in vitroでの長期増殖が可能である。したがって、これらの細胞は、潜在的に、薬物の開発および移植治療の両方のために、患者特異的な機能的ＣＥＣの無制限の供給を提供することができる。多能性幹細胞の、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣへのin vitroでの分化は、分化の様々な段階における様々な増殖因子の添加を含み得、約１０～３０日間の分化を必要とし得る（例えば図１を参照）。多能性幹細胞は、それらの無制限の増殖能力により、ＣＥＣの分化のための出発細胞集団として、体細胞よりも利点を提供する。
多能性幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞またはｉＰＳ細胞は、開示される方法の出発材料であってもよい。本明細書における態様のうちのいずれかにおいて、、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）であってもよい。多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、当該分野において公知の任意の方法において、例えばフィーダー細胞の存在下または不在下において、培養してもよい。加えて、任意の方法を用いて生成されたＰＳＣを、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを生成するための出発材料として用いることができる。例えば、ｈＥＳ細胞は、卵と精子とのin vitroでの受精の産物であった胚盤胞期の胚から誘導してもよい。あるいは、ｈＥＳ細胞は、任意に胚の残りを破壊することなく、初期の卵割期の胚から取り除かれた１つ以上の卵割球から誘導してもよい。なお他の態様において、ｈＥＳ細胞は、核移植を用いて生成してもよい。さらなる態様において、ｉＰＳＣを用いてもよい。出発材料として、先に凍結保存されたＰＳＣを用いてもよい。別の態様において、凍結保存されたことがないＰＳＣを用いてもよい。
本発明の一側面において、ＰＳＣは、フィーダー条件またはフィーダーフリーの条件下において、細胞外マトリックス上に置かれる。１つの態様において、ＰＳＣは、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、CellStart、コラーゲンまたはゼラチンを含むがこれらに限定されない細胞外マトリックス上で、培養することができる。いくつかの態様において、細胞外マトリックスは、ｅ－カドヘリンを含む、またはこれを含まない、ラミニンである。いくつかの態様において、ラミニンは、ラミニン５２１、ラミニン５１１またはiMatrix511を含む群より選択してもよい。いくつかの態様において、フィーダー細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）などのヒトフィーダー細胞である。他の態様において、フィーダー細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）である。
ある態様において、ＰＳＣを培養する際に用いる培地は、ＰＳＣを培養するために適切な任意の培地から選択してもよい。いくつかの態様において、ＰＳＣ培養物を支持することができる任意の培地を用いてもよい。例えば、当業者は、市販の、または専売の培地の中から選択してもよい。
多能性を支持する培地は、当該分野において公知の任意のかかる培地であってよい。いくつかの態様において、多能性を支持する培地は、Nutristem（商標）である。いくつかの態様において、多能性を支持する培地は、TeSR（商標）である。いくつかの態様において、多能性を支持する培地は、StemFit（商標）である。他の態様において、多能性を支持する培地は、Knockout（商標）ＤＭＥＭ（Gibco）であり、これに、Knockout（商標）血清代替物（Gibco）、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、または任意の他の因子を補充してもよい。これらの例示的な培地の各々は、当該分野において公知であり、市販されている。さらなる態様において、多能性を支持する培地に、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、または任意の他の因子を補充してもよい。１つの態様において、ｂＦＧＦを、低濃度（例えば４ｎｇ／ｍＬ）で補充してもよい。別の態様において、ｂＦＧＦを、高濃度（例えば１００ｎｇ／ｍＬ）で補充してもよく、これは、ＰＳＣを分化についてプライミングし得る。
本発明の生成方法において用いられるべきＰＳＣの濃度は、特に限定されない。例えば、１０ｃｍのディッシュが用いられる場合、ディッシュ１つあたり１×１０４～１×１０８個の細胞、好ましくはディッシュ１つあたり５×１０４～５×１０６個の細胞、より好ましくはディッシュ１つあたり１×１０５～１×１０７個の細胞が用いられる。
いくつかの態様において、ＰＳＣは、約１，０００～１００，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種される。いくつかの態様において、ＰＳＣは、約５０００～１００，０００細胞／ｃｍ２、約５０００～５０，０００細胞／ｃｍ２、または約５０００～１５，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種される。他の態様において、ＰＳＣは、約１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種される。
いくつかの態様において、細胞を神経堤幹細胞または角膜内皮前駆細胞へと分化させるために、多能性を支持する培地、例えばStemFit（商標）または他の類似の培地は、分化培地により置き換えられる。いくつかの態様において、多能性を支持する培地から分化培地への培地の置き換えは、ＰＳＣの細胞培養の間の異なる時点において行ってもよく、これはまた、ＰＳＣの最初の播種密度に依存し得る。いくつかの態様において、培地の置き換えは、多能性培地中でのＰＳＣの培養の２～１４日後に行うことができる。いくつかの態様において、培地の置き換えは、第２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日において行ってもよい。
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法において有用な幹細胞として、これらに限定されないが、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来幹細胞、造血幹細胞、軟骨前駆細胞、表皮（epidermal）幹細胞、消化管幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、膵臓前駆細胞、毛包幹細胞、内皮前駆細胞および平滑筋前駆細胞が挙げられる。
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法のために用いられる幹細胞は、臍帯、胎盤、羊水、絨毛膜の絨毛（chorion villi）、胚盤胞、骨髄、脂肪組織、脳、末梢血、消化管、臍帯血、血管、骨格筋、皮膚、肝臓および経血から単離される。
多様なソースからのヒト幹細胞の単離のための詳細な手順は、Current Protocols in Stem Cell Biology（２００７年）において記載され、これは、その全体において本明細書において参考として援用される。多様なソースから幹細胞を単離して培養する方法はまた、米国特許第５，４８６，３５９号、同第６，９９１，８９７号、同第７，０１５，０３７号、同第７，４２２，７３６号、同第７，４１０，７９８号、同第７，４１０，７７３号、同第７，３９９，６３２号において記載される；これらの各々は、本明細書においてその全体において参考として援用される。
Ｂ．体細胞
本発明のある側面において、分化転換の方法、すなわち、１つの体細胞の型の別のものへの直接的な転換、例えば他の体細胞からＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを駆動する方法がまた提供され得る。分化転換は、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの生成のために、ＣＥＣの分化転写因子遺伝子または遺伝子生成物の使用（体細胞においてかかる遺伝子の発現レベルを増大させるため）を含み得る。
しかし、ヒト体細胞は、供給、特に生きたドナーからのものが限定され得る。ＣＥＣの分化のための出発細胞の無制限の供給を提供するために、体細胞は、ｈＴＥＲＴおよび／または他のがん遺伝子などの不死化遺伝子またはタンパク質の導入により、不死化されてもよい。細胞の不死化は、可逆的であっても（例えば、除去可能な発現カセットを用いて）、または誘導性であってもよい（例えば、誘導性プロモーターを用いて）。
体細胞は、本発明のある側面において、初代細胞（不死化されていない細胞）、例えば動物からフレッシュに単離されたものであってもよく、または、細胞株から誘導されたもの（不死化された細胞）であってもよい。細胞は、対象からのそれらの単離の後で、細胞培養中で維持してもよい。ある態様において、細胞は、本発明の方法におけるそれらの使用の前に、１回、または１回より多く（例えば、２～５回、５～１０回、１０～２０回、２０～５０回、５０～１００回、またはそれより多く）継代される。いくつかの態様において、細胞は、本発明の方法におけるそれらの使用の前に、１回、２回、５回、１０回、２０回または５０回より多くは継代されないであろう。
本明細書において使用または記載される体細胞は、ネイティブな体細胞、または操作された体細胞、すなわち、遺伝子改変された体細胞であってよい。本発明の体細胞は、典型的には、例えばヒト細胞、霊長類細胞またはマウス細胞などの哺乳動物細胞である。それらは、周知の方法により得てもよく、生きた体細胞を含む任意の臓器または組織、例えば、血液、骨髄、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道および他の泌尿器などから得ることができる。
本発明において有用な哺乳動物の体細胞として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒膜上皮細胞、ニューロン、膵島細胞、表皮細胞（epidermal cell）、上皮細胞（epithelial cell）、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、および他の筋肉細胞など。
本明細書において記載される方法は、１つ以上の体細胞、例えば、体細胞のコロニーまたは集団を、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣにプログラムするために用いてもよい。いくつかの態様において、本発明の細胞の集団は、細胞のうちの少なくとも９０％が、目的の表現型または特徴を提示する点において、実質的に単一である。いくつかの態様において、細胞のうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９、９９．９５％またはそれより多くが、目的の表現型または特徴を提示する。本発明のある態様において、体細胞は、分裂する能力を有する、すなわち、体細胞は、有糸分裂後のものではない。
体細胞は、部分的に、または完全に分化していてもよい。本明細書において記載される場合、部分的に分化した体細胞、および完全に分化した体細胞の両方が、分化して角膜内皮細胞を生成することができる。
本発明の方法における使用のための転写因子
ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、角膜内皮前駆細胞における本明細書において記載される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることにより、作製することができる。ＣＥＣの成熟化または機能を促進するために重要な任意の転写因子、例えば表１において記載される転写因子から選択される少なくとも１つの転写因子を用いてもよい。表１において列記される転写因子の全てのアイソフォームおよびバリアントを、本発明において含めてもよい。本発明の転写因子の特定のアイソフォームまたはバリアントについてのアクセッション番号の非限定的な例を、表１において記載する。
表１．成熟角膜内皮細胞を作製するための転写因子
いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子は、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群から選択される。
いくつかの態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、角膜内皮前駆細胞における、本明細書において記載される転写因子の組み合わせの発現を増大させることにより、作製することができる。例えば、いくつかの態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、角膜内皮前駆細胞における、ＰＩＴＸ２および本明細書において記載される少なくとも１つ（例えば、１、２、３、または４つ）のさらなる転写因子の発現を増大させることにより、作製することができる。いくつかの態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、角膜内皮前駆細胞における、ＦＯＸＣ１および本明細書において記載される少なくとも１つ（例えば、１、２、３、または４つ）のさらなる転写因子の発現を増大させることにより、作製することができる。いくつかの態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、角膜内皮前駆細胞における、ＴＦＡＰ２Ｂおよび本明細書において記載される少なくとも１つ（例えば、１、２、３、または４つ）のさらなる転写因子の発現を増大させることにより、作製することができる。いくつかの態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、角膜内皮前駆細胞における、ＬＭＸ１Ｂおよび本明細書において記載される少なくとも１つ（例えば、１、２、３、または４つ）のさらなる転写因子の発現を増大させることにより、作製することができる。いくつかの態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、角膜内皮前駆細胞における、ＰＯＵ６Ｆ２および本明細書において記載される少なくとも１つ（例えば、１、２、３、または４つ）のさらなる転写因子の発現を増大させることにより、作製することができる。
いくつかの態様において、転写因子の組み合わせは、表１Ａにおいて記載される転写因子の組み合わせから選択される：
表１Ａ．転写因子の組み合わせの例．
いくつかの態様において、転写因子は、ペア様ホメオドメイン転写因子２（ＰＩＴＸ２）である。本明細書において用いられる場合、「ＰＩＴＸ２」とは、周知の遺伝子およびタンパク質を指す。用語ＰＩＴＸ２は、タンパク質アイソフォーム、および選択的にスプライシングされたもしくはトランスクリプトのバリアントを含む。ＰＩＴＸ２はまた、下垂体ホメオボックス２、ＡＲＰ１、Ｂｒｘ１、ＩＤＧ２、ＩＧＤＳ、ＩＧＤＳ２、ＩＨＧ２、ＩＲＩＤ２、Ｏｔｌｘ２、ＰＴＸ２、ＲＧＳ、ＲＩＥＧ、ＲＩＥＧ１、ＲＳ、ペア様ホメオドメイン２およびＡＳＧＤ４としても知られる。ＰＩＴＸ２遺伝子によりコードされるタンパク質は、プロコラーゲンリジルヒドロキシラーゼ遺伝子発現を調節する転写因子であって、眼、歯および腹部臓器の発生に関与する。ヒトＰＩＴＸ２ ｍＲＮＡトランスクリプトの配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：ＮＣＢＩ）参照配列アクセッション番号ＮＭ＿１５３４２７（配列番号１）において見出すことができる。ＰＩＴＸ２アイソフォームは、ＰＩＴＸ２アイソフォーム２（ＮＭ＿００１２０４３９７、配列番号２）、ＰＩＴＸ２アイソフォーム３（ＮＭ＿００１２０４３９８、配列番号３）、ＰＩＴＸ２アイソフォーム４（ＮＭ＿００１２０４３９９、配列番号４）、ＰＩＴＸ２アイソフォーム５（ＮＭ＿０００３２５、配列番号５）およびＰＩＴＸ２アイソフォーム６（ＮＭ＿１５３４２６、配列番号６）を含む。
ＰＩＴＸ２ ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、公共に利用可能なデータベース、例えば、GenBank、UniProt、およびOMIMを用いて容易に入手可能である。
ＰＩＴＸ２の例示的な配列は、配列番号１、２、３、４、５もしくは６のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列、またはそれからコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号１、２、３、４、５または６のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２は、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本発明の方法は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍、ＰＩＴＸ２の発現を増大させることに向けられる。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍の増大を含む。いくつかの態様において、Ｐｉｔｘ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０，０００倍の増大を含む。
いくつかの態様において、転写因子は、フォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）である。本明細書において用いられる場合、「ＦＯＸＣ１」とは、周知の遺伝子およびタンパク質を指す。ＦＯＸＣ１という用語は、タンパク質アイソフォーム、または選択的にスプライシングされたもしくはトランスクリプトのバリアントを含む。ＦＯＸＣ１はまた、ＡＲＡ、ＦＫＨＬ７、ＦＲＥＡＣ－３、ＦＲＥＡＣ３、ＩＧＤＡ、ＩＨＧ１、ＩＲＩＤ１、ＲＩＥＧ３、フォークヘッドボックスＣ１、ＡＳＧＤ３としても知られる。ＦＯＸＣ１遺伝子によりコードされるタンパク質は、胚および眼の発生の調節において役割を果たす転写因子である。ヒトＦＯＸＣ１ ｍＲＮＡトランスクリプトの配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００１４５３（配列番号７）において見出すことができる。ＦＯＸＣ１ ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、公共に利用可能なデータベース、例えば、GenBank、UniProt、およびOMIMを用いて、容易に入手可能である。
ＦＯＸＣ１の例示的な配列は、配列番号７のヌクレオチド配列、またはそれからコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号７のヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１は、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本発明の方法は、ＦＯＸＣ１の発現を、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍、増大させることに向けられる。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦｏｘＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、少なくとも５００倍の増大を含む角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０，０００倍の増大を含む。
いくつかの態様において、転写因子は、転写因子ＡＰ－２ベータ（ＴＦＡＰ２Ｂ）である。本明細書において用いられる場合、「ＴＦＡＰ２Ｂ」とは、周知の遺伝子およびタンパク質を指す。ＴＦＡＰ２Ｂはまた、ＡＰ－２Ｂ、ＡＰ２－Ｂ、転写因子ＡＰ－２ベータ、ＰＤＡ２としても知られる。用語ＴＦＡＰ２Ｂは、選択的にスプライシングされた、またはトランスクリプトの、バリアント（例えば、ＴＦＡＰ２ＢトランスクリプトバリアントＸ）およびタンパク質アイソフォームを含む。ＴＦＡＰ２Ｂ遺伝子によりコードされるタンパク質（ＡＰ２－ベータ）は、細胞増殖を刺激し、胚発生の間の特定の細胞型の最終分化を抑制すると考えられる転写因子である。ヒトＴＦＡＰ２Ｂ ｍＲＮＡトランスクリプトの配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００３２２１（配列番号８）において見出すことができる。ＴＦＡＰ２Ｂ ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、公共に利用可能なデータベース、例えば、GenBank、UniProt、およびOMIMを用いて容易に入手可能である。
ＴＦＡＰ２Ｂの例示的な配列は、配列番号８のヌクレオチド配列、またはそれからコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号８のヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂは、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本発明の方法は、ＴＦＡＰ２Ｂの発現を、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍、増大させることに向けられる。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも２０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも５０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも２００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも５００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０，０００倍の増大を含む。
いくつかの態様において、転写因子は、ＬＩＭホメオボックス転写因子１ベータ（ＬＭＸ１Ｂ）である。本明細書において用いられる場合、「ＬＭＸ１Ｂ」とは、周知の遺伝子およびタンパク質を指す。用語ＬＭＸ１Ｂは、タンパク質アイソフォーム、および選択的にスプライシングされたもしくはトランスクリプトのバリアントを含む。ＬＭＸ１Ｂはまた、ＬＭＸ１．２、ＮＰＳ１、ＬＩＭホメオボックス転写因子１ベータ、ＦＳＧＳ１０としても知られる。ＬＭＸ１Ｂ 遺伝子によりコードされるタンパク質は、脊椎動物の四肢の背腹軸パターン形成において重要な役割を果たす転写因子である。ヒトＬＭＸ１Ｂ ｍＲＮＡトランスクリプトの配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００１１７４１４６（配列番号９）において見出すことができる。ＬＭＸ１Ｂ アイソフォームは、ＬＭＸ１Ｂアイソフォーム２（ＮＭ＿００２３１６、配列番号１０）およびＬＭＸ１Ｂアイソフォーム３（ＮＭ＿００１１７、配列番号１１）を含む。ＬＭＸ１Ｂ ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、公共に利用可能なデータベース、例えば、GenBank、UniProt、およびOMIMを用いて容易に入手可能である。。
ＬＭＸ１Ｂの例示的な配列は、配列番号９～１１のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列、およびそれからコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号９～１１のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂは、配列番号９～１１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本発明の方法は、ＬＭＸ１Ｂの発現を、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍、増大させることに向けられる。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも２０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも５０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも２００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも５００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０，０００倍の増大を含む。
いくつかの態様において、転写因子は、ＰＯＵクラス６ホメオボックス２（ＰＯＵ６Ｆ２）である。本明細書において用いられる場合、「ＰＯＵ６Ｆ２」とは、周知の遺伝子およびタンパク質を指す。用語ＰＯＵ６Ｆ２は、選択的にスプライシングされた、またはトランスクリプトの、バリアントおよびタンパク質アイソフォームを含む。ＰＯＵ６Ｆ２遺伝子によりコードされるタンパク質は、細胞の拘束（cell commitment）および分化などの発生プロセスに関与する転写因子である。ヒトＰＯＵ６Ｆ２ ｍＲＮＡトランスクリプトの配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００７２５２（配列番号１２）において見出すことができる。ＰＯＵ６Ｆ２のさらなるアイソフォームとして、ＰＯＵ６Ｆ２アイソフォーム２（ＮＭ＿００１１６６０１８、配列番号１３）が挙げられる。ＰＯＵ６Ｆ２ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、公共に利用可能なデータベース、例えば、GenBank、UniProt、およびOMIMを用いて容易に入手可能である。
ＰＯＵ６Ｆ２の例示的な配列は、配列番号１２～１３のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列またはそれからコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号１２～１３のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２は、配列番号１２～１３のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本発明の方法は、ＰＯＵ６Ｆ２の発現を、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍、増大させることに向けられる。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０，０００倍の増大を含む。
転写因子の発現を増大させること
本発明の転写因子（単数または複数）をコードする核酸の送達のためのベクターは、本開示の細胞、例えば角膜内皮前駆細胞、神経堤幹細胞または多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞において、転写因子（単数または複数）を発現させるように、構築されていてもよい。いくつかの態様において、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの態様において、核酸は、ＲＮＡである。いくつかの態様において、核酸は、修飾されたＤＮＡである。いくつかの態様において、核酸は、修飾されたＲＮＡである。
加えて、タンパク質形質導入の組成物または方法もまた、本発明の方法において転写因子（単数または複数）の発現をもたらすために用いてもよい。
Ａ．核酸送達系
当業者は、標準的な組み換え技術を通してベクターを構築するために十分な能力を備えているであろう（例えば、Sambrookら（２００１年）およびAusubelら（１９９６年）を参照；これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される）。本開示の少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含むベクターとして、これらに限定されないが、ウイルスベクター、非ウイルスベクターおよび／または誘導性発現ベクターが挙げられる。
本明細書において用いられる場合、「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または修飾されたヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖の形態におけるそれらのポリマーを指す。当該用語は、合成、天然に存在する、および天然には存在しない、既知のヌクレオチドアナログまたは修飾された骨格残基もしくは連結を含む核酸を包含し、これは、参照核酸と類似の結合特性を有し、特定の場合においては、参照ヌクレオチドと類似の様式において代謝される。かかるアナログの例として、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホナート、キラル－メチルホスホナート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
本明細書において用いられる場合、「ヌクレオチド」は、当該分野において認識されるとおり、天然の塩基を有するもの（標準）、および当該分野において周知の修飾された塩基を含むように用いられる。かかる塩基は、一般に、ヌクレオチド糖部分のｌ’位に位置する。ヌクレオチドは、一般に、塩基、糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸および／または塩基部分において、未修飾であっても、または修飾されていてもよい（また、ヌクレオチドアナログ、修飾されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドおよびその他としても、交換可能に言及される；例えば、UsmanおよびMcSwiggen、上記：Ecksteinら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０７０６５；Usmanら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１５１８７；Uhlman & Peyman、上記を参照；これらの全ては、本明細書により、本明細書において参考として援用される）。Limbach, et al, Nucleic Acids Res. 22:2183, 1994において要約されるとおり当該分野において公知の修飾された核酸塩基のいくつかの例が存在する。塩基修飾の非限定的な例のうちのいくつかであって、核酸分子中に導入することができるものとして、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６－トリメトキシベンゼン、３－メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５－アルキルシチジン（例えば、５－メチルシチジン）、５－アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５－ハロウリジン（例えば、５－ブロモウリジン）または６－アザピリミジンまたは６－アルキルピリミジン（例えば、６－メチルウリジン）、プロピン、およびその他が挙げられる（Burgin, et al., Biochemistry 35:14090, 1996；Uhlman & Peyman、上記）。この側面における「修飾された塩基」により、ｌ’位におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルまたはそれらの等価物以外のヌクレオチド塩基が意味される。
ベクターはまた、遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節するか、あるいは、別段に標的とされた細胞に有益な特性を提供する、他の構成成分または機能を含んでもよい。かかる他の構成成分として、例えば、細胞に対する結合またはターゲティングに影響を及ぼす構成成分（細胞型または組織に特異的な結合を媒介する構成成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす構成成分；取り込みの後の細胞内でのポリヌクレオチドの局在に影響を及ぼす構成成分（核内移行を媒介する剤など；およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす構成成分が挙げられる。
かかる構成成分はまた、ベクターにより送達された核酸を取り込んで発現している細胞について検出または選択するために用いることができる検出可能マーカーおよび選択マーカーなどのマーカーを含んでもよい。かかる構成成分は、ベクターの天然の特徴として提供してもよく（結合および取り込みを媒介する構成成分または機能を有する特定のウイルスベクターの使用など）、あるいは、ベクターを、かかる機能を提供するために修飾することができる。多種多様なかかるベクターが、当該分野において公知であり、一般に入手可能である。ベクターが宿主細胞において維持される場合、ベクターは、細胞により、有糸分裂の間に、自己構造（autonomous structure）として、宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、または宿主細胞の核もしくは細胞質において維持されて、安定に複製されてもよい。
当業者は、標準的な組み換え技術を通してベクターを構築するために十分な能力を備えているであろう（例えば、Maniatisら（１９８８年）およびAusubelら（１９９４年）を参照；これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される）。
１．ウイルスベクター
少なくとも１つの本発明の転写因子をコードするウイルスベクターが、本開示のある側面において提供され得る。ウイルスベクターは、核酸、および場合によってはタンパク質を、細胞中に導入するために、ウイルスの配列を利用する、発現コンストラクトの種類である。本発明のある側面の核酸を送達するために用いてもよいウイルスベクターの非限定的な例を、以下に記載する。
いくつかの態様において、ウイルスベクターは、非組み込み型ウイルスベクターである。本開示の例示的な非組み込み型ウイルスベクターは、以下からなる群より選択される：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＲｈｌＯ、Ｒｈ７４など；アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（複製適格（replication competent）、複製欠損、およびそのヘルパー依存性（gutless）の形態、例えば、Ａｄ７、Ａｄ４、Ａｄ２、Ａｄ５などを含む）；サルウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、またはラウス肉腫ウイルスベクター。
いくつかの態様において、ウイルスベクターは、組み込み型ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターである。レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノム中に組み込み、大量の外来遺伝子材料を伝達し、広域の種および細胞型に感染し、特別な細胞株中でパッケージングされる、それらの能力に起因して、遺伝子送達ベクターとしての見込みを有する。
いくつかの態様において、組み込み型ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶ、など）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶから誘導されるもの）から誘導されるか、またはこれらから誘導されるベクターである。
組み換えベクターはまた、非分裂中の細胞に感染することができ、本発明の方法において、in vivoおよびex vivoでの遺伝子導入および核酸配列の発現のために用いることができる。例えば、非分裂中の細胞に感染することができる組み換えレンチウイルスであって、ここで、好適な宿主細胞（すなわち、ウイルスを生成する細胞であって、本開示の角膜内皮前駆細胞またはＣＥＣではない）がパッケージング機能を担持する２つ以上のベクター、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔによりトランスフェクトされるものは、米国特許第５，９９４，１３６号において開示される（これは、その全体において本明細書において参考として援用される）。
２．エピソーマルベクターおよび他の非ウイルスベクター
プラスミドまたはリポソームベースの染色体外（すなわち、エピソーマル）ベクターの使用もまた、本発明のある側面において提供されてもよい。かかるエピソーマルベクターとして、例えば、ｏｒｉＰベースのベクター、および／またはＥＢＮＡ－１の誘導体をコードするベクターが挙げられ得る。これらのベクターは、ＤＮＡの大きなフラグメントが細胞に導入され、染色体外に維持され、細胞周期１回あたり１回複製し、娘細胞へと効率的に分割し、実質的に免疫応答を引き起こさないことを可能にし得る。
他の染色体外ベクターとして、他のリンパ増殖性ヘルペスウイルスベースのベクターが挙げられる。例示的なリンパ増殖性のヘルペスウイルスとして、これらに限定されないが、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）およびマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が挙げられる。また、酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０またはＢＰＶなどの、エピソームベースのベクターの他のソースも企図される。
いくつかの態様において、ベクターは、非ウイルスベクターである。いくつかの態様において、非ウイルスベクターは、プラスミドＤＮＡ、直鎖状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、直鎖状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ナノプラスミド、ミニサークルＤＮＡ、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、ＤＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、および二本鎖ｍＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）からなる群より選択される。
いくつかの態様において、非ウイルスベクターは、ネイキッド核酸、リポソーム、デンドリマー、ナノ粒子、脂質－ポリマー系、固体脂質ナノ粒子、および／またはリポソームプロタミン／ＤＮＡリポプレックス（ＬＰＤ）を含む。
いくつかの態様において、非ウイルスベクターは、ｍＲＮＡを含む。いくつかの態様において、ｍＲＮＡは、ネイキッドの修飾されたｍＲＮＡとして、例えば、スクロース－クエン酸バッファーまたは生理食塩水溶液中で送達されてもよい。他の態様において、非ウイルスベクターは、Lipofectamine 2000、jetPEI、RNAiMAX、および／またはInvivofectamineなどのトランスフェクション試薬と複合体化されたｍＲＮＡを含む。ｍＲＮＡをヌクレアーゼによる分解に対して保護し、その負の電荷を遮蔽するために、アミン含有材料もまた、非ウイルスベクターとして一般的に用いられる。ｍＲＮＡ送達のための最もよく開発された方法のうちの一つは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中への共処方である。ＬＮＰ処方物は、典型的には、以下を含んでなる：（１）ポリアニオン性ｍＲＮＡをカプセル化するための第三級または第四級アミンを有するイオン化可能またはカチオン性の脂質またはポリマー性材料；（２）細胞膜における脂質に類似する双性イオン脂質（例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン［ＤＯＰＥ］）；（３）ＬＮＰの脂質二重層を安定化するためのコレステロール；および（４）ナノ粒子に水和層を貸与し、コロイド安定性を改善し、タンパク質吸収を低下させるための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質。ｍＲＮＡを含む例示的な非ウイルスベクターは、Kowalksi et al., 2019, Mol Ther.; 27(4): 710-728において記載される；これは、その全体において本明細書において参考として援用される。
３．トランスポゾンベースの系
特定の態様によれば、核酸の導入は、トランスポゾン－トランスポザーゼ系を用いてもよい。用いられるトランスポゾン－トランスポザーゼ系は、周知のSleeping Beauty、Frog Princeトランスポゾン－トランスポザーゼ系（後者の説明については、例えばＥＰ１５０７８６５を参照）、またはＴＴＡＡ特異的トランスポゾンpiggyBac系であってよい。
トランスポゾンは、単一の細胞のゲノム内の様々な位置を動き回ることができるＤＮＡの配列であって、このプロセスは、転移と呼ばれる。当該プロセスにおいて、それらは、変異を引き起こし得、ゲノムにおけるＤＮＡの量を変化させ得る。多様な可動遺伝因子が存在し、それらは、それらの転移の機序に基づいてグループ化することができる。クラスＩの可動遺伝因子、またはレトロトランスポゾンは、第一にＲＮＡへと転写され、次いで逆転写酵素によりＤＮＡへと逆転写され、そして次いでゲノムにおける別の位置に挿入されることにより、それら自身をコピーする。クラスＩＩの可動遺伝因子は、ゲノム内でそれらを「カットアンドペースト（cut and paste）」するためにトランスポザーゼを用いて、一つの位置から別の位置へと直接的に動く。
４．相同組み換え
相同組み換え（ＨＲ）は、１９８０年代から哺乳動物細胞におけるゲノム操作のための標準的な方法であった、標的化されたゲノム修飾技術である。メガヌクレアーゼ、またはホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばＩ－ＳｃｅＩの使用が、ＨＲの効率を増大するために用いられてきた。天然のメガヌクレアーゼ、ならびに修飾されたターゲティング特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼの両方が、ＨＲの効率を増大させるために利用されてきた。ＨＲの効率を増大させる方向へ向かう別の経路は、プログラム可能なＤＮＡ特異性ドメインを有するキメラエンドヌクレアーゼを操作することであった。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、かかるキメラ分子の一例であり、ここで、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、ＦｏｋＩなどのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合する。かかる特異性分子の別のクラスとして、ＦｏｋＩなどのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合した転写活性化因子様エフェクター（Transcription Activator Like Effector：ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインが挙げられる。かかる分子の別のクラスであって、標的化されたゲノム修飾を促進するものとして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が挙げられ、これは、例えばRan et al., 2013; Nature Protocols 8:2281-2308において記載されるとおりである；これは、その全体において本明細書において参考として援用される。
Ｂ．調節エレメント
ベクターにおいて含まれる真核生物発現カセットは、好ましくは、（５’から３’方向において）、タンパク質コード配列に作動可能に連結された真核生物の転写プロモーター、介在配列を含むスプライシングシグナル、および転写終結／ポリアデニル化配列を含む。
１．プロモーター／エンハンサー
「プロモーター」とは、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である、制御配列である。それは、核酸配列の特異的転写を開始させるために、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節性のタンパク質および分子が結合する遺伝因子を含んでもよい。句「作動的に位置する」、「作動的に連結された」、「作動可能に連結された」、「制御下」、および「転写制御下」とは、プロモーターが、核酸配列に関して、その配列の転写開始および／または発現を制御するために、正しい機能的位置および／または配向にあることを意味する。
プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成のための開始部位を配置するように機能する配列を含む。さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、それらは、開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが示されている。コード配列をプロモーター「の制御下に」置くために、転写の読み枠の転写開始部位の５’末端を、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、その３’）に位置させる。「上流」のプロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
プロモーターエレメントの間の間隔は、エレメントが、互いに対して逆転するか移動する場合に、プロモーターの機能が保存されるように、しばしばフレキシブルである。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーターエレメントの間の間隔は、活性が低下し始める前に、５０ｂｐ間隔まで増大させることができる。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、共作動的に、または独立して、転写を活性化するように機能することができると考えられる。プロモーターは、「エンハンサー」と組み合わせて用いても、これと組み合わせなくともよい。エンハンサーとは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性の調節配列を指す。
プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成により生成することに加えて、配列は、本明細書において開示される組成物と組み合わせて、ＰＣＲ（商標）を含む組み換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を用いて生成してもよい（米国特許第４，６８３，２０２号および同第５，９２８，９０６号を参照；これらの各々は、本明細書においてその全体において参考として援用される）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体および類似のものなどの非核細胞小器官内の配列の転写および／または発現を指揮する制御配列も、同様に用いることができることが企図される。
使用されるプロモーターは、構成的、組織特異的、誘導性、および／または導入されたＤＮＡセグメントの高レベルの発現を指揮するために適切な条件下において（組み換えタンパク質および／またはペプチドの大規模生成において遊離であるものなど）有用であってよい。プロモーターは、人工のものであっても、内在のものであってもよい。
いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。用語「誘導性プロモーター」とは、当該分野において公知であり、刺激に対する応答においてのみ活性であるプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、内因性または外因性の刺激、例えば化学的化合物（化学的誘導因子）の存在に対する応答において、または環境、ホルモン、化学物質、および／または発生シグナルに対する応答において、核酸分子を選択的に発現する。誘導性プロモーターとして、例えば、光、熱、ストレス（例えば、塩ストレス、または浸透圧ストレス）、植物ホルモン、創傷、またはエタノール、アブシジン酸（ＡＢＡ）、ジャスモナート、サリチル酸もしくは毒性緩和剤（safener）などの化学物質により誘導または調節されるプロモーターが挙げられる。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、ＥＦ１ａプロモーターである。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、ＰＧＫプロモーターである。
いくつかの態様において、異種性核酸は、以下からなる群より選択されるプロモーター配列の制御下にある：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギベータ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、伸長因子１－アルファプロモーター（ＥＦ１－アルファ）プロモーター、ヒトベータグルクロニダーゼプロモーター、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、およびｂ－アクチンプロモーター。いくつかの態様において、異種性核酸は、ＣＮＳの１つ以上の細胞における治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現のために好適なプロモーターに、作動可能に連結されている。
別の態様において、転写因子のためのネイティブなプロモーター、またはそのフラグメントが用いられるであろう。ネイティブなプロモーターは、転写因子の発現がネイティブな発現を模倣すべきであることが所望される場合に用いることができる。ネイティブなプロモーターは、転写因子の発現を、時間的にまたは発生的に、または組織特異的な様式において、または特異的転写刺激に対する応答において調節しなければならない場合に、用いてもよい。さらなる態様において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはＫｏｚａｋコンセンサス配列などの他のネイティブな発現制御エレメントもまた、ネイティブな発現を模倣するために用いてもよい。
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給された化合物、温度などの環境因子、または例えば急性期、細胞の特定の分化状態などの特定の生理学的状態の存在により、または複製中の細胞のみにおいて、調節することができる。誘導性プロモーターおよび誘導系は、限定することなくInvitrogen、ClontechおよびAriadを含む多様な商業的なソースから入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者により容易に選択され得る。外因的に供給されたプロモーターにより調節される誘導性プロモーターの例として、以下が挙げられる：亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)）、テトラサイクリンにより抑制可能な系（Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリンにより誘導系（Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)；また、以下を参照：Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)）、ＲＵ４８６により誘導可能な系（Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997）and Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)）およびラパマイシンにより誘導可能な系（Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）。なお他の型の誘導性プロモーターであって、この文脈において有用なものは、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、または複製中の細胞においてのみ調節されるものである。
いくつかの態様において、異種性核酸は、ＣＥＣ細胞系譜のうちの１つ以上の細胞において発現されるプロモーター配列の制御下にある。ＣＥＣ特異的プロモーターは、以下の遺伝子のうちのいずれかについてのプロモーターを含んでもよい：ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１（ＡＴＰａｓｅＨ＋輸送Ｖ１サブユニットＧ１、Ｃ４ｏｒｆ４９（ＭＧＡＲＰ）（ミトコンドリアに局在するグルタミン酸リッチなタンパク質）、ＣＡ１２（炭酸脱水酵素１２）、ＣＯＬ４Ａ３（ＩＶ型コラーゲンアルファ３鎖）、ＣＯＬ８Ａ１（ＶＩＩＩ型コラーゲンアルファ１鎖）、ＣＯＬ８Ａ２（ＶＩＩＩ型コラーゲンアルファ２タンパク質）、ＤＮＡＣ６（ＤＮＡＪ熱ショックタンパク質ファミリー（ＨＳＰ４０）メンバーＣ６）、ＥＮＯ１（エノラーゼ１）、ＥＮＯ１Ｐ１（エノラーゼ１偽遺伝子１）、ＥＮＳＴ０００００３５４５４１、ＥＮＳＴ０００００３５７４０１、ＥＲＧ（ＥＴＳ転写因子）、ＦＧＦ１０（線維芽細胞増殖因子１０）、ＦＧＦ７（線維芽細胞増殖因子７）、ＩＧＦＢＰ２（インスリン様増殖因子結合タンパク質２）、ＩＴＧＢＬ１（インテグリンサブユニットベータ様１）、ＬＭＸ１Ｂ（ＬＩＭホメオボックス転写因子１ベータ）、ＭＩＲ１８４（ＭｉｃｒｏＲＮＡ１８４）、ＭＳＭＰ（前立腺に関連するミクロセミノタンパク質）、ＰＩＴＸ２（ペア様ホメオドメイン２）、ＰＯＵ６Ｆ２（ＰＯＵクラス６ホメオボックス２）、ＰＴＧＤＳ（プロスタグランジンＤ２シンターゼ）、ＳＨＣ４（ＳＨＣアダプタータンパク質４）、ＳＬＣ４Ａ１１（溶質輸送体ファミリー４メンバー１１）、ＳＬＣ４Ａ４（溶質輸送体ファミリー４メンバー４）およびＴＦＡＰ２Ｂ（転写因子ＡＰ－２ベータ）およびＺＦＨＸ４（ジンクフィンガーホメオボックス４）（Yoshihara et al. 2017, EBio Medicine, 25(2017), p.175-186）。いくつかの態様において、プロモーター配列は、生体内においてユビキタスに発現されてもよく、したがって、細胞へのその送達のおかげで、細胞、例えば多能性幹細胞、神経堤幹細胞、角膜内皮前駆細胞またはＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣにおいて、発現してもよい。他の態様において、ＣＥＣ細胞系譜の細胞、例えば、神経堤幹細胞、角膜内皮前駆細胞またはＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣにおいて特異的に発現するプロモーター配列を用いてもよい。
加えて、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、epd.isb-sib.ch/におけるworld wide webを通して、真核生物プロモーターのデータベースであるＥＰＤＢにより）もまた、発現を駆動するために用いることができる。プロモーターの非限定的な例として、以下が挙げられる：構成的ＥＦ１アルファプロモーター；初期または後期ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０の初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；真核細胞プロモーター、例えばベータアクチンプロモーター、ＧＡＤＰＨプロモーター、メタロチオネインプロモーターなど；ならびに連鎖状応答エレメントプロモーター、例えば、サイクリックＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）、およびミニマルＴＡＴＡボックス付近の応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ）。
２．開始シグナルおよび配列内リボソーム結合部位
特異的開始シグナルもまた、コード配列の効率的翻訳のために用いることができる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因的な翻訳制御シグナルが提供される必要がある場合がある。当業者は、これを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。インサート全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望されるコード配列のリーディングフレームにより「インフレーム（in-frame）」でなければならないことは、周知である。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然であっても合成であってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントの包含により増強されてもよい。
本発明のある態様において、多重遺伝子の、またはポリシストロニックなメッセージを作出するために、配列内リボソーム進入部位（internal ribosome entry dite：ＩＲＥＳ）エレメントの使用が用いられる。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルをバイパスして、配列内部位において翻訳を開始することができる。ＩＲＥＳエレメントは、異種性のオープンリーディングフレームに連結させることができる。各々がＩＲＥＳにより分離された複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写して、ポリシストロニックなメッセージを作出することができる。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、効率的翻訳のために、各々のオープンリーディングフレームが、リボソームにアクセス可能である。多重遺伝子は、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを用いて、効率的に発現させることができる（米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号を参照；これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される）。
いくつかの態様において、遺伝子を共発現させるために、自己切断配列を用いることができる。用語「自己切断配列」とは、本明細書において用いられる場合、オープンリーディングフレームを連結して単一のシストロンを形成し、翻訳の間にリボソームスキッピングを誘導する配列を指す。リボソームスキッピングは、自己切断配列により連絡された２つのコード配列を、２つの別々のペプチドへと転写させる。例えば、２Ａ自己切断配列は、本開示において提供されるコンストラクト中の遺伝子の、連結された発現、または共発現を生じさせるために用いることができる。例示的な自己切断配列として、これらに限定されないが、表２において記載されるとおりのＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａが挙げられる。
表２．例示的な２Ａ配列
いくつかの態様において、Ｔ２Ａは、配列番号１８２のアミノ酸配列、またはかかるアミノ酸配列をコードする核酸と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、Ｐ２Ａは、配列番号１８３のアミノ酸配列、またはかかるアミノ酸配列をコードする核酸と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、Ｅ２Ａは、配列番号１８４のアミノ酸配列、またはかかるアミノ酸配列をコードする核酸と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、Ｆ２Ａは、配列番号１８５のアミノ酸配列、またはかかるアミノ酸配列をコードする核酸と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
３．複製起点
宿主細胞においてベクターを増殖させるために、それは、複製が開始される特異的核酸配列である、１つ以上の複製起点部位（しばしば、「ｏｒｉ」と称される）、例えば上記のとおりのＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列、または類似のもしくはより高いプログラミングにおける機能を有する遺伝子操作されたｏｒｉＰを含んでもよい。あるいは、上記のとおりの他の染色体外で複製するウイルスの複製起点または自己複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
４．選択およびスクリーニング可能なマーカー
本発明のある態様において、本発明の核酸コンストラクトを含む細胞は、発現ベクター中のマーカーを含めることにより、in vitroまたはin vivoで同定することができる。かかるマーカーは、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を許容する同定可能な変更を、細胞に付与する。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。正の選択マーカーとは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、一方、負の選択マーカーとは、その存在がその選択を妨げるものである。正の選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
通常は、薬物選択マーカーの包含は、形質転換体のクローニングおよび同定を補助し、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン（zeocin）およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。条件の実装に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色分析に基礎を置くＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含む他の型のマーカーもまた、企図される。
あるいは、負の選択マーカーとしてのスクリーニング可能な酵素を利用してもよい。ある態様において、負の選択マーカーは、１つ以上の自殺遺伝子を含み、これは、プロドラッグの投与により、遺伝子生成物の、その宿主細胞を殺傷する化合物への移行をもたらす。本開示の例示的な自殺遺伝子として、これらに限定されないが、誘導性カスパーゼ９（またはカスパーゼ３もしくは７）、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ＨＥＲ１およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。当該分野において公知のさらなる自殺遺伝子であって、本開示において用いてもよいものとして、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チトクロムｐ４５０酵素（ＣＹＰ）、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、グアニンリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＲＴＰ）、グリコシダーゼ酵素、およびチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）が挙げられる。
当業者はまた、場合によってはＦＡＣＳ分析と組み合わせて、免疫学的マーカーを使用する方法を知っているであろう。用いられるマーカーは、それが遺伝子生成物をコードする核酸と同時に発現されることができる限りは、重要であるとは考えられない。選択およびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。本発明の１つの特色は、転写因子がこれらの細胞における所望される変化をもたらした後で角膜内皮細胞について選択するために、選択およびスクリーニング可能なマーカーを用いることを含む。
本発明のある態様において、本発明の核酸コンストラクトを含む細胞は、発現ベクター中にマーカーを含めることにより、in vitroまたはin vivoで同定してもよい。かかるマーカーは、細胞に、同定可能な変化を付与し、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を許容するであろう。一般に、選択マーカーとは、選択を可能にする特性を付与するものである。正の選択マーカーとは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、一方、負の選択マーカーとは、その存在が、その選択を妨げるものである。正の選択マーカーの一例は、薬物耐性マーカーである。
通常は、薬物選択マーカーの包含は、形質転換体のクローニングおよび同定を補助し、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。条件の実装に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色分析に基礎を置くＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含む他の型のマーカーもまた、企図される。
Ｃ．核酸送達
ある態様において、角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、細胞、例えば、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞を、少なくとも１つの転写因子と接触させることを含む。いくつかの態様において、細胞、例えば、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。
ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾されたＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡなどの核酸の、本発明の細胞、例えば角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞への導入は、本明細書において記載されるとおりの、または当業者に公知であろうとおりの、細胞の形質導入のための核酸送達のための任意の好適な方法を用いてもよい。かかる方法として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：ＤＮＡの直接送達、例えば、ex vivoトランスフェクションによるもの（Wilsonら（１９８９年）、Nabelら（１９８９年）；これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される）、注射によるもの（米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号；これらの各々はその全体において本明細書において参考として援用される）、これは、マイクロインジェクションを含む（Harland and Weintraub、１９８５年；米国特許第５，７８９，２１５号；これらの各々はその全体において本明細書において参考として援用される）；エレクトロポレーションによるもの（米国特許第５，３８４，２５３号；Tur-Kaspaら（１９８６年）；Potterら（１９８４年）；これらの各々はその全体において本明細書において参考として援用される）；リン酸カルシウム沈殿によるもの（GrahamおよびVan Der Eb（１９７３年）；ChenおよびOkayama（１９８７年）；Rippeら（１９９０年）；これらの各々はその全体において本明細書において参考として援用される）；ＤＥＡＥ－デキストランと、その後のポリエチレングリコールを用いることによるもの；直接的な超音波ローディング（direct sonic loading）によるもの（Fechheimer et al., 1987；これは、その全体において本明細書において参考として援用される）；リポソーム媒介性トランスフェクションによるもの（Nicolau and Sene（１９８２年）；Fraleyら（１９７９年）；Nicolauら（１９８７年）；Wongら（１９８０年）；Kanedaら（１９８９年）；Katoら（１９９１年）；これらの各々はその全体において本明細書において参考として援用される）、ならびに受容体媒介性トランスフェクション（WuおよびWu（１９８７年）；WuおよびWu（１９８８年）；これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される）；微粒子銃によるもの（ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９４／０９６９９および９５／０６１２８；米国特許第５，６１０，０４２号；同第５，３２２，７８３号；同第５，５６３，０５５号；同第５，５５０，３１８号；同第５，５３８，８７７号；および同第５，５３８，８８０号；これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される）；シリコンカーバイド線維による撹拌によるもの（Kaepplerら（１９９０年）；米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号；これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される）；アグロバクテリウム媒介性形質導入によるもの（米国特許第５，５９１，６１６号および同第５，５６３，０５５号；これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される）；乾燥／阻害により媒介されるＤＮＡ取り込みによるもの（Potrykusら（１９８５年）；これは、その全体において本明細書において参考として援用される）、ならびにかかる方法の任意の組み合わせ。これらのような技術の適用を通して、細胞内小器官（単数または複数）、細胞（単数または複数）、組織（単数または複数）または生物（単数または複数）は、安定に、または一過性に、形質導入され得る。
本発明のある態様において、核酸は、脂質複合体、例えばリポソーム中に封入されていてもよい。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性の媒質により特徴づけられる小胞的構造である。多重層リポソームは、水性の媒質により分離された多重の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁された場合に、自発的に形成する。脂質構成成分は、閉鎖構造の形成の前に自己再配置を起こし、脂質二重層の間に水および溶解した溶質を封入する。また企図されるのはLIPOFECTAMINE（登録商標）（Gibco BRL）またはSuperfect（登録商標）（Qiagen）と複合体化した核酸である。用いられるリポソームの量は、用いられるリポソームならびに細胞の性質により変化してもよく、例えば、細胞１，０００，０００～１０，０００，０００個あたり、約５～約２０μｇのベクターＤＮＡが、企図され得る。
本発明のある態様において、核酸は、細胞小器官、細胞、組織または生物に、エレクトロポレーションを介して導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液の、高電圧放電への暴露を含む。レシピエント細胞は、機械的創傷により、より形質転換しやすくすることができる。また、用いられるベクターの量は、用いられる細胞の性質により変化してもよく、例えば、細胞１，０００，０００～１０，０００，０００個あたり、約５～約２０μｇのベクターＤＮＡが、企図され得る。
本発明の他の態様において、核酸は、リン酸カルシウム沈殿を用いて、細胞に導入される。
別の態様において、核酸は、ＤＥＡＥ－デキストランと、その後のポリエチレングリコールを用いて、細胞に送達される。
本発明のさらなる態様は、直接的な超音波ローディングによる核酸の導入を含む。
微粒子銃技術もまた、核酸を、少なくとも１つの、細胞小器官、細胞、組織または生物に導入するために用いることができる（米国特許第５，５５０，３１８号；同第５，５３８，８８０号；同第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９；これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。この方法は、ＤＮＡでコートされた微小発射物（microprojectiles）を、高速まで加速させて、それらを細胞膜に貫通させて、細胞を殺傷することなくこれらに侵入させる能力に依存する（Klein et al., 1987；これは、その全体において本明細書において参考として援用される）。本発明の方法における使用のために好適である、当該分野において公知の多種多様な微粒子銃技術が存在する。
Ｄ．遺伝子スイッチ
いくつかの態様において、本開示の細胞、例えば、多能性幹細胞または角膜内皮前駆細胞は、本発明の転写因子（単数または複数）をコードする遺伝子スイッチコンストラクトを含むように操作される。遺伝子スイッチコンストラクトは、細胞を生物医学的適用のために有用な細胞ベースの機械に転換する複雑な遺伝子回路の構築のための、基本的な構成要素を提供する。リガンド応答性遺伝子スイッチコンストラクトは、特異的シグナルを処理して遺伝子生成物応答を生じることができる、細胞のセンサーである。複雑な遺伝子回路におけるそれらの関与は、電子工学を彷彿とさせ、イベントを記憶し、タンパク質の生成を増減させ、複雑な情報処理課題を行うことができる、操作された細胞を提供することができる、洗練された回路トポロジーをもたらす（Auslaender et al., 2016; Cold Spring Harb Perspect Biol.; 8(7): a023895を参照；これは、その全体において本明細書において参考として援用される）。遺伝子スイッチコンストラクトの設計戦略に基づいて、本開示の細胞、例えば多能性幹細胞または角膜内皮前駆細胞は、様々なリガンドのインプットを感知して、これが次いで本開示の転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトの発現を媒介するための、多様な合成系と共に、本開示の転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトを含むように、操作することができる。
１．転写遺伝子スイッチ
いくつかの態様において、遺伝子スイッチコンストラクトは、転写遺伝子スイッチコンストラクトである。いくつかの態様において、転写遺伝子スイッチコンストラクトは、転写レギュレータータンパク質に融合した、原核生物または真核生物のレギュレータータンパク質の使用を含み、これは、リガンド応答性の様式において遺伝子スイッチコンストラクトの発現を制御するために、ＤＮＡオペレーター配列に結合する。いくつかの態様において、転写遺伝子スイッチコンストラクトは、原核生物のレギュレータータンパク質を、リガンドまたは光により誘導される二量体化系（ＤＳ）に組み合わせることの使用を含み、シグナル依存的な転写レギュレータータンパク質の動員を可能にする。いくつかの態様において、転写遺伝子スイッチコンストラクトは、細胞表面に局在するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の使用を含み、これは、細胞外シグナルを感知して、シグナル伝達経路を介して、遺伝子スイッチコンストラクトの発現を制御するためのシグナル伝達を引き起こす。いくつかの態様において、転写遺伝子スイッチコンストラクトは、赤色光応答性の様式においてセカンドメッセンジャーサイクリック－ジ－ＧＭＰを合成し、下流のシグナル伝達経路を引き起こし、遺伝子スイッチコンストラクトの転写活性化をもたらす、操作されたジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣＬ）の使用を含む。いくつかの態様において、転写遺伝子スイッチコンストラクトは、Auslaenderら（２０１６年）において記載される合成系のうちのいずれかの使用を含む；これは、その全体において本明細書において参考として援用される。
２．転写後遺伝子スイッチ
いくつかの態様において、遺伝子スイッチコンストラクトは、転写後遺伝子スイッチコンストラクトである。いくつかの態様において、転写後遺伝子スイッチコンストラクトは、プライマリーｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）分子に融合したアプタザイム（aptazyme）の使用を含み、これは、リガンド応答性のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡのプロセッシングの制御および転写後の標的遺伝子制御を可能にする。いくつかの態様において、転写後遺伝子スイッチコンストラクトは、タンパク質リガンドの存在または不在に依存してそれらの安定性を調節するために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に組み込まれたタンパク質応答性アプタザイムの使用を含む。いくつかの態様において、転写後遺伝子スイッチコンストラクトは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）に組み込まれ、ｓｈＲＮＡのプロセッシングを阻害し、タンパク質により制御された遺伝子スイッチコンストラクトの発現を可能にする、タンパク質結合アプタマーに結合するタンパク質の使用を含む。いくつかの態様において、転写後遺伝子スイッチコンストラクトは、翻訳開始をタンパク質依存性の様式に置いて制御するために、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に組み込まれたタンパク質結合アプタマーの使用を含む。いくつかの態様において、転写後遺伝子スイッチコンストラクトは、タンパク質応答性の選択的スプライシングの調節を可能にするために、スプライシング部位のごく近傍へのタンパク質結合アプタマーの組み込みの使用を含む。いくつかの態様において、転写後遺伝子スイッチコンストラクトは、ＴｅｔＲに結合するアプタマーのテオフィリン依存性のフォールディングを可能にするために、テオフィリン応答性アプタマーと組み合わせた、ＡＴｅｔＲに結合するアプタマーの使用を含む。そのコグネートなアプタマーに結合した場合、ＴｅｔＲタンパク質は、そのＤＮＡオペレーター結合能力を失い、転写レベルにおいて遺伝子発現に影響を及ぼす。
インテグラーゼもまた、真核細胞においてオンになるように設計されたコード配列またはプロモータースイッチを活性化する、機能的遺伝子スイッチコントローラーとして作用することができる。インテグラーゼは、それらの部位認識および組み換えプロセスにおいて正確性を示し、細胞傷害性ではない。いくつかの態様において、遺伝子スイッチコンストラクトは、Gomide et al., 2020, Commun Biol.;3(1):255において記載されるとおりのセリンインテグラーゼにより制御される遺伝子スイッチの使用を含む；これは、その全体において本明細書において参考として援用される。
Ｅ．タンパク質形質導入
ある態様において、本開示の細胞、例えば角膜内皮前駆細胞は、成熟角膜内皮細胞を作製するために十分な量においてポリペプチドを含む転写因子（単数または複数）と接触させてもよい。タンパク質形質導入は、巨大分子の細胞への送達を増強するための方法として用いられてきた。タンパク質形質導入ドメインは、転写因子ポリペプチドまたはその機能的フラグメントを細胞に直接的に導入するために用いてもよい。
「タンパク質形質導入ドメイン」または「ＰＴＤ」は、生体膜、特に細胞膜を越えることができるアミノ酸配列である。異種性ポリペプチドに付着した場合、ＰＴＤは、生体膜を越えての異種性ポリペプチドの移行を増強することができる。ＰＴＤは、典型的には、共有結合により（例えば、ペプチド結合により）異種性ＤＮＡ結合ドメインに付着する。例えば、ＰＴＤおよび異種性ＤＮＡ結合ドメインは、単一の核酸により、例えば、共通のオープンリーディングフレームにおいて、または共通の遺伝子の１つ以上のエクソンにおいて、コードされることができる。例示的なＰＴＤは、１０～３０アミノ酸を含むことができ、両親媒性のらせん体を形成してもよい。多くのＰＴＤは、特徴において塩基性である。例えば、塩基性ＰＴＤは、少なくとも４、５、６または８個の塩基性残基（例えば、アルギニンまたはリジン）を含むことができる。ＰＴＤは、細胞壁を欠く細胞、または特定の種からの細胞、例えば、ヒト、サル、マウス、ウシ、ウマ、ネコまたはヒツジの細胞などの哺乳動物細胞への、ポリペプチドの移行を増強することができる場合がある。
ＰＴＤは、例えば可動性リンカーなどを用いて、人工の転写因子に連結させることができる。可動性リンカーは、自由な回転を可能にするために、１つ以上のグリシン残基を含むことができる。例えば、ＰＴＤは、転写因子のＤＮＡ結合ドメインから、少なくとも１０、２０または５０アミノ酸、間隔を空けることができる。ＰＴＤは、ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端またはＣ末端に位置することができる。特定のドメインに対してＮ末端またはＣ末端に位置することは、その特定のドメインに隣接することを必要としない。例えば、ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端のＰＴＤは、スペーサーおよび／または他の型のドメインにより、ＤＮＡ結合ドメインから離れていてもよい。ＰＴＤは、化学的に合成して、次いで、別に調製されたＤＮＡ結合ドメインに、リンカーペプチドを用いて、またはこれを用いずに、化学的に共役させることができる。人工の転写因子もまた、複数のＰＴＤ、例えば、複数の異なるＰＴＤまたは１つのＰＴＤの少なくとも２つのコピーを含むことができる。
いくつかのタンパク質および小分子ペプチドは、古典的な受容体またはエンドサイトーシスにより媒介される経路に非依存的に、生体膜を通って形質導入または移動する能力を有する。これらのタンパク質の例として、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）ＤＮＡ結合タンパク質ＶＰ２２、およびDrosophila Antennapedia（Ａｎｔｐ）ホメオティック転写因子が挙げられる。これらのタンパク質からの小分子タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、他の巨大分子、ペプチドまたはタンパク質を細胞中に首尾よく輸送するために、これらと融合させることができる。これらのタンパク質からの形質導入ドメインの配列アライメントは、高い塩基性アミノ酸含有量（ＬｙｓおよびＡｒｇ）を示し、これは、これらの領域の、膜中の負に荷電された脂質との相互作用を促進し得る。二次構造の分析は、３つのドメインの全ての間に、一致する構造を示さない。
これらの形質導入ドメインの融合を用いることの利点は、タンパク質侵入が迅速で濃度依存的であり、様々な細胞型により作用すると考えられることである。ＰＴＤは、Ｕ．Ｓ．２００３／００８２５６１；Ｕ．Ｓ．２００２／０１０２２６５；Ｕ．Ｓ．２００３／００４００３８においてさらに記載される；これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される。
ＰＴＤに加えて、細胞取り込みシグナルを用いることができる。かかるシグナルは、細胞受容体または他の表面タンパク質により特異的に認識されるアミノ酸配列を含む。細胞取り込みシグナルと細胞との相互作用は、細胞取り込みシグナルを含む人工の転写因子の内部移行を引き起こす。いくつかのＰＴＤもまた、細胞受容体または他の表面タンパク質との相互作用により機能する場合がある。
細胞培養
一般に、本発明の細胞は、細胞増殖を維持することができる栄養豊富な緩衝化溶液である、培養培地中で培養される。
本発明のＣＥＣは、多能性幹細胞または他の細胞、例えば角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞を、培地中で、本明細書において記載される転写因子の細胞内レベルが、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの作製を促進するために十分となる増大する条件下において培養することにより、作ることができる。培地はまた、多様な種類の増殖因子のような、１つ以上のＣＥＣの分化剤を含んでもよい。これらの剤は、細胞が、より成熟した表現型に拘束されることを誘導することを補助しても、もしくは成熟細胞の生存を優先的に促進してもよく、または、これらの効果の両方の組み合わせを有してもよい。
本開示において説明されるＣＥＣの分化剤として、以下が挙げられ得る：ＣＥＣ細胞系譜の細胞の増殖を促進することができる、可溶性の増殖因子（ペプチドホルモン、サイトカイン、リガンド－受容体複合体、およびコンドロイチン硫酸Ａ、下垂体抽出物およびアスコルビン酸などの他の化合物）。かかる剤の非限定的な例として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：ノギン、ＳＢ４３１５４２、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、Ｒｏｃｋ阻害剤、および神経増殖因子（ＮＧＦ）。さらなる因子として、以下が挙げられ得る：白血病阻害因子（ＬＩＦ）、GSK3阻害剤、レチノイン酸、ガンマセクレターゼ阻害剤、ドルソモルフィン（dorsomorphin）、コーディンおよびフォリスタチンを含むＴＧＦｂ／Activin／NodalのＢＭＰ阻害剤、ＩＬ－１、インスリン、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ヘパリン、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－２）、血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦＢ）およびＰＤＧＦＢアゴニスト、ＤＫＫ２およびＤＫＫ２アゴニスト、アンジオポエチン様タンパク質７（ＡＮＧＰＬ７）、Ｂ２７サプリメントおよびグルカゴン。
多能性細胞または他の細胞、例えば、角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞は、ノギン（例えばヒトノギンポリペプチド、例えばＮＰ＿００５４４１．１もしくはそれに含まれる成熟ポリペプチド）および／またはＳＢ４３１５４２もしくは誘導体（集合的に、「二重ＳＭＡＤ阻害剤」）の存在下において、分化させてもよい。多能性細胞または他の細胞、例えば、角膜前駆細胞または神経堤細胞は、天然で分泌されるＢＭＰ阻害剤であるコーディンおよびフォリスタチン、ならびにそれらのアナログまたは模倣物、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４および／またはＢＭＰ７を隔離するであろうドミナントネガティブ受容体またはブロッキング抗体、および／またはドルソモルフィン（またはCompound C）の存在下において分化させてもよい。ＳＭＡＤタンパク質の阻害はまた、ＳＩＳ３（６，７－ジメトキシ－２－（（２Ｅ）－３－（１－メチル－２－フェニル－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル－プロパ－２－エノイル））－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリンなどの可溶性阻害剤、Ｓｍａｄ３、ＳＩＳ３の特異的阻害剤、阻害剤ＳＭＡＤ（例えば、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＤ１０）のうちの１つ以上の過剰発現、または受容体ＳＭＡＤ（ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ８／９）のうちの１つに対するＲＮＡｉを用いて引き起こしてもよい。多能性細胞または他の細胞、例えば角膜前駆細胞または神経堤幹細胞の分化のための他の剤は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＧＳＫ３阻害剤（CHIR 99021）、Compound E（ｇセクレターゼ阻害剤ＸＸＩ）および／またはＴＧＦｂ阻害剤ＳＢ４３１５４２（Li et al., Proc Natl Acad Sci USA.２０１１年５月１７日；108(20):8299-304）であってもよい。
角膜前駆細胞または神経堤の誘導を受けている多能性幹細胞は、ＳＢ４３１５４２の存在下において培養してもよく、これは、培養培地中に、わずか１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、０．１ｍＭ、またはこれより低い、または２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、またはそれより高い、例えば１０ｎＭ～１００ｍＭ、０．１ｍＭ～５０ｍＭ、０．１～２０ｍＭ、または１～２０ｍＭ、または約１０ｍＭもの濃度において、存在してもよい。
多能性細胞、例えば角膜前駆細胞または神経堤の誘導を受けている多能性細胞は、ノギンの存在下において培養してもよく、これは、培養培地中に、わずか１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、またはこれより低い、または７００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、１５００ｎｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌ、３０００ｎｇ／ｍｌ、４０００ｎｇ／ｍｌ、５０００ｎｇ／ｍｌ、またはそれより高い、例えば１０ｎｇ／ｍｌ～５，０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ～７００ｎｇ／ｍｌ、または４００ｎｇ／ｍｌ～６００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約５００ｎｇ／ｍｌもの濃度において、存在してもよい。多能性細胞は、ＳＢ４３１５４２およびノギンの組み合わせ、例えば前述の濃度の組み合わせと共に、培養してもよい。
塩基性ＦＧＦは、例えば角膜前駆細胞または神経堤の誘導の間の、多能性細胞の培養物において、存在してもよく、これは、培養培地中に、わずか１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、またはこれより低い、または１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌまで、例えば１ｎｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、または約６ｎｇ／ｍｌの濃度において、存在してもよい。
塩基性ＦＧＦは、例えば角膜前駆細胞または神経堤幹細胞からのＣＥＣの分化の間の、角膜前駆細胞、神経堤幹細胞またはＣＥＣの培養物において、または、ＣＥＣを含む培養物において、存在してもよく、これは、培養培地中に、わずか０．１ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、またはこれより低い、または１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌまで、例えば０．１ｎｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ～４００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、または約６ｎｇ／ｍｌの濃度において、存在してもよい。
ＥＧＦは、例えば角膜前駆細胞または神経堤幹細胞からのＣＥＣの分化の間の、角膜前駆細胞、神経堤幹細胞またはＣＥＣの培養物において、または、ＣＥＣを含む培養物において、存在してもよく、これは、培養培地中に、わずか０．１ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、またはこれより低い、または１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌまで、例えば０．１ｎｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ～４００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌの濃度において、存在してもよい。
ＮＧＦは、例えば角膜前駆細胞または神経堤幹細胞からのＣＥＣの分化の間の、角膜前駆細胞、神経堤幹細胞またはＣＥＣの培養物において、または、ＣＥＣを含む培養物において、存在してもよく、これは、培養培地中に、わずか０．１ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、またはこれより低い、または１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌまで、例えば０．１ｎｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ～４００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、または約２０ｎｇ／ｍｌの濃度において、存在してもよい。
ＲＯＣＫ阻害剤は、多能性幹細胞の培養物中に、、またはＣＥＣの分化の間に存在してもよい。「ＲＯＣＫ阻害剤」とは、細胞におけるＲｈｏ関連キナーゼの機能またはそのシグナル伝達経路を阻害するかまたはこれを低下させる任意の物質、例えば小分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、または類似のものを指す。「ＲＯＣＫシグナル伝達経路」とは、本明細書において用いられる場合、ＲＯＣＫに関連するシグナル伝達経路に関与する任意のシグナルプロセッサー、例えば、細胞におけるＲｈｏ－ＲＯＣＫ－ミオシンＩＩシグナル伝達経路、その上流のシグナル伝達経路またはその下流のシグナル伝達経路を含んでもよい。用いてもよい例示的なＲＯＣＫ阻害剤は、StemgentのStemolecule Y-27632、ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（Watanabe et al., Nat Biotechnol. 2007 June; 25(6):681-6を参照）である。他のＲＯＣＫ阻害剤として、例えば、Ｈ－１１５２、Ｙ－３０１４１、Ｗｆ－５３６、ＨＡ－１０７７、ヒドロキシル－ＨＡ－１０７７、ＧＳＫ２６９９６２ＡおよびＳＢ－７７２０７７－Ｂが挙げられる。Doe et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 32:89-98, 2007；Ishizaki, et al., Mol. Pharmacol., 57:976-983, 2000；Nakajima et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 52:319-324, 2003；およびSasaki et al., Pharmacol. Ther., 93:225-232, 2002；これらの各々は、本明細書においてその全体において記載されるものとして参考として援用される。ＲＯＣＫ阻害剤は、例えば本明細書によりその全体において参考として援用される米国ＰＧＰｕｂ番号２０１２／０２７６０６３において記載されるとおり、当該分野において公知であるとおりの濃度および／または培養条件により利用してもよい。Ｒｈｏ関連キナーゼ阻害剤のさらなる例として、以下の参考文献において開示される化合物が挙げられる：米国特許第４，６７８，７８３号、米国特許第３，４２１，２１７号、ＷＯ９９／２０６２０、ＷＯ９９／６１４０３、ＷＯ０２０７６９７６、ＷＯ０２／０７６９７７、ＷＯ０２／１００８３３、ＷＯ０３／０５９９１３、ＷＯ０３／０６２２２７、ＷＯ２００４／００９５５５、ＷＯ２００４／０２２５４１、ＷＯ２００４／１０８７２４、ＷＯ２００５／００３１０１、ＷＯ２００５／０３９５６４、ＷＯ２００５／０３４８６６、ＷＯ２００５／０３７１９７、ＷＯ２００５／０３７１９８、ＷＯ２００５／０３５５０１、ＷＯ２００５／０３５５０３、ＷＯ２００５／０３５５０６、ＷＯ２００５／０８０３９４、ＷＯ２００５／１０３０５０、ＷＯ２００６／０５７２７０、ＷＯ２００７／０２６６６４および類似のもの。かかる化合物は、それぞれの参考文献の各々において記載される方法に従って生成することができる。具体例として、１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン（ファスジル）、（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－１－（４－ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン（Ｙ－２７６３２）および類似のもの、ならびにそれらの塩、好ましくは塩酸塩などの薬学的に許容し得る塩が挙げられる。例示的な態様において、ＲＯＣＫ阻害剤は、約０．０５～約５０マイクロＭ、例えば、少なくともまたは約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．８、１、１．５、２、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０マイクロＭの濃度（これらにおいて誘導可能な任意の範囲、または細胞の増殖もしくは生存を促進するために有効な任意の濃度を含む）を有してもよい。
角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞は、ＰＤＧＦＢ（例えば、ＮＰ＿００２５９９．１などのヒトＰＤＧＦＢポリペプチド、またはそれに含まれる成熟ポリペプチド）、およびＰＤＧＦＢを含む培養培地、および／またはＰＤＧＦＡＡもしくはＰＤＧＦＡＢ、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の存在下において培養してもよい。角膜内皮前駆細胞または神経堤幹細胞を含む培養物、例えば、神経堤誘導を開始させた後もしくは神経堤誘導の間の多能性細胞を含む培養物中におけるもの、または角膜内皮前駆細胞は、ＰＤＧＦＢの存在下において培養してもよく、これは、培養培地中に、わずか０．１ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、またはこれより低い、または１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、またはそれより高い、例えば０．１ｎｇ／ｍｌ～２５０ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌ、１～５０ｎｇ／ｍｌ、２～２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌもの濃度において、存在してもよい。
多能性細胞または他の細胞、例えば角膜前駆細胞または神経堤細胞は、ＤＫＫ２（例えば、ＮＰ＿０５５２３６．１などのヒトＤＫＫ２ポリペプチド、またはそれに含まれる成熟ポリペプチド）、およびＤＫＫ２を含む培養培地の存在下において培養してもよい。神経堤幹細胞（分化中の多能性細胞から得られるか、または他のソースから得られるかにかかわらず）、および／または神経堤幹細胞（例えば、二重ＳＭＡＤ阻害剤の存在下における培養物）もしくは角膜内皮前駆細胞を生じる条件下において培養された分化中の多能性細胞は、ＤＫＫ２またはＤＫＫ２アゴニストの存在下において培養してもよい。ＤＫＫ２アゴニストは、Ｗｎｔ経路の活性化因子および／または阻害剤を含んでもよく、これは、ＣＥＣの分化においてＤＫＫ２を機能的に置き換え得る。ＤＫＫ２に加えて、またはこれの代わりに、ＬＲＰ５／６またはKremenを標的としてその発現をノックダウンするＲＮＡｉを用いてもよい。ＤＫＫ１、３、４およびSoggy、分泌型frizzled関連タンパク質（Ｆｒｚｂ）などのＷｎｔ経路阻害剤、およびＷｎｔ阻害因子（ＷＩＦ）またはカゼインキナーゼ１～７、またはｂ－カテニンを安定化または不安定化する他の因子もまた、ＤＫＫ２に加えて、またはこれの代わりに、用いてもよい。加えて、ＬＥＦ／ＴＣＦ転写因子のメンバーを調節することもまた、ＤＫＫ２に加えて、またはこれの代わりに、用いてもよい。例示的なＷｎｔ経路の活性化因子として、Ｗｎｔタンパク質、Ｗｎｔタンパク質をコードする核酸、ＬｉＣｌ、Ｗｎｔ経路の負の調節因子の阻害剤（例えば、Ａｘｉｎおよび／またはＡＰＣを標的とするＲＮＡｉまたは他の阻害剤）、norrin、R-spondin2が挙げられる。小分子Ｗｎｔ経路の活性化因子として、以下が挙げられる：（ヘテロ）アリールピリミジン、ＩＱ１、ＢＩＯ（６－ブロモインディルビン－３’－オキシム）、２－アミノ－４－［３，４－（メチレンジオキシ）ベンジル－アミノ］－６－（３－メトキシフェニル）ピリミジン、ＷＡＹ－３１６６０６、ＱＳ１１、ＳＢ－２１６７６３、ＳＢ－２１６７６３、およびＤＣＡ。小分子Ｗｎｔ経路阻害剤として以下が挙げられる：ＩＷＲ、ピルビニウム、ＩＣＧ－００１、ＰＫＦ１１５－５８４（およびいくつかの他の化合物）、ＩＷＰ、Ａｎｔ１．４Ｂｒ／Ａｎｔ１．４Ｃｌ、ニクロサミド、アピキュラレン（apicularen）およびバフィロマイシン、ＸＡＶ９３９、ＮＳＣ６６８０３６、２，４－ジアミノ－キナゾリン、およびケルセチン。利用してもよいさらなる例示的なＷＮＴ経路阻害剤として、以下が挙げられる：ＩＤ８（Hasagawa et al., Stem Cells Transl Med. 2012 January; 1(1):18-28）、ＷｎｔＣ５９（Proffitt Cancer Res Published OnlineFirst Nov. 27, 2012; DOI:10.1158/0008-5472.CAN-12-2258）、ＣＧＫ０６２（Gwak et al., PLoS ONE. 2012; 7(10):e46697）、ＩＷＰ２（Blauwkamp et al., Nat Commun. 2012; 3:1070）、ＦＨ５３５（Iida et al., PLoS One. 2012; 7(9):e44418）、およびリルゾール（Zhao et al., J Biomol Screen. 2012 October; 17(9):1252-63）。前述の因子の組み合わせ、例えば、１つより多いＷｎｔ経路活性化因子、１つより多いＷｎｔ経路阻害剤、または少なくとも１つのＷｎｔ経路活性化因子および少なくとも１つのＷｎｔ経路阻害剤を含む組み合わせもまた、ＤＫＫ２に加えて、またはこれの代わりに、用いてもよい。
角膜前駆細胞または神経堤幹細胞、例えば神経堤誘導を開始させた後または神経堤誘導の間の多能性細胞を含む培養物におけるものは、ＤＫＫ２の存在下において培養してもよく、これは、培養培地中に、わずか１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、またはこれより低い、または１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、またはそれより高い、例えば１ｎｇ／ｍｌ～１５ｍｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ～１５ｍｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、または５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌもの濃度において、存在してもよい。
多能性細胞または他の細胞、例えば、角膜前駆細胞または神経堤細胞は、ＣＥＣの増殖を促進する１つ以上の因子と共に培養してもよい。かかる因子は、角膜内皮細胞の形成の間および／またはその後に細胞の培養物中に含まれてもよく、インスリンおよび／またはトランスフェリンを含むＥＧＦ、ＮＧＦおよびＩＴＳサプリメントを含んでもよい。
いくつかの態様において、本発明の方法は、角膜内皮前駆細胞細胞において、ＡＴＦ４、ＡＴＭＩＮ、ＢＨＬＨＥ４０、ＣＥＢＰＤ、ＣＳＲＮＰ１、ＤＲＡＰ１、ＥＧＲ１、ＥＬＦ２、ＥＭＸ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＳ２、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ２、ＧＴＦ３Ａ、ＨＩＦ１Ａ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ９、ＭＢＤ３、ＮＦＥ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ４Ａ１、ＰＡ２Ｇ４、ＰＯＵ３Ｆ３、ＲＥＬＡ、ＴＢＸ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＴＦＤＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＵＳＦ２、ＹＢＸ１、ＺＮＦ２０７、ＺＮＦ３５８、およびＺＮＦ３９５からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させること、ならびに培養培地中で角膜前駆細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、本発明の方法は、多能性幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞または胚性幹細胞において、ＡＴＦ４、ＡＴＭＩＮ、ＢＨＬＨＥ４０、ＣＥＢＰＤ、ＣＳＲＮＰ１、ＤＲＡＰ１、ＥＧＲ１、ＥＬＦ２、ＥＭＸ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＳ２、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ２、ＧＴＦ３Ａ、ＨＩＦ１Ａ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ９、ＭＢＤ３、ＮＦＥ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ４Ａ１、ＰＡ２Ｇ４、ＰＯＵ３Ｆ３、ＲＥＬＡ、ＴＢＸ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＴＦＤＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＵＳＦ２、ＹＢＸ１、ＺＮＦ２０７、ＺＮＦ３５８、およびＺＮＦ３９５からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させること、ならびに培養培地中で多能性幹細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、本明細書において開示される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２日間、またはそれより長くにわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、少なくとも８日間にわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、少なくとも１０日間にわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、少なくとも１２日間にわたり、培養される。
いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、本明細書において開示される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させた後に、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４日間、またはそれより長くにわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させた後に、少なくとも２日間にわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させた後に、少なくとも４日間、少なくとも１０日間、少なくとも１８日間または少なくとも２４日間にわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させた後に、少なくとも１８日間にわたり、培養される。
いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、多能性幹細胞から誘導される。本明細書において記載される方法により多能性幹細胞を単離し、増殖させ、角膜前駆細胞へと分化させるために好適な培養培地として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：StemFit Basic03培地（Ajinomoto）、ｍＴｅＳＲ１培地、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ－１５（Thermo Fisher＃11330-032）、Liebovitz L-15、RPMI 1640、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）およびOpti-MEM SFM（Invitrogen Inc.）。既知組成培地は、ヒト血清アルブミン、ヒトEx Cyteリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須および非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミンを補充された、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Gibco）などの最小必須培地を含み、マイトジェンもまた好適である。本明細書において用いられる場合、マイトジェンとは、細胞の細胞分裂を刺激する剤を指す。剤は、細胞を、細胞分裂を開始するように促し、有糸分裂を引き起こす、化学物質、通常は何らかの形態のタンパク質であってよい。一態様において、無血清培地（米国出願番号０８／４６４，５９９およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３９４８７；これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される）および完全培地（米国特許第５，４８６，３５９；これは、その全体において本明細書において参考として援用される）が、本明細書において記載される方法による使用のために企図される。いくつかの態様において、培養培地は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒト自家血清、ヒトＡＢ血清またはヘパリン（２Ｕ／ｍｌ）を補充された多血小板血清を補充される。細胞培養は、培養液のｐＨを維持するためにＣＯ２雰囲気化において、例えば５％～１２％で維持してもよく、３７℃で加湿大気中でインキュベートして、角膜内皮前駆細胞分化の間、１００％のコンフルエンスを維持するために継代してもよい。
角膜前駆細胞または神経堤幹細胞に分化させるべき多能性幹細胞は、多能性を維持するために十分な培地中で培養してもよい。本発明のある側面において作製された誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養は、霊長類多能性幹細胞、より具体的には、胚性幹細胞を培養するために開発された、多様な培地および技術を用いることができる（米国特許出願番号２００７０２３８１７０および米国特許出願番号２００３０２１１６０３；これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される）。例えば、ＰＳＣは、StemFit（登録商標）培地中で、ＲＯＣＫ阻害剤を用いてまたはこれを用いずに、またはｍＴｅＳＲ１培地中で維持することができる。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞のように、ｉＰＳ細胞は、８０％のＤＭＥＭ（Gibco＃10829-018または＃11965-092）、熱により不活化されていない２０％の限定（defined）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ－グルタミン、および０．１ｍＭのｂ－メルカプトエタノール中で維持することができる。あるいは、ＥＳ細胞は、８０％のKnock-Out ＤＭＥＭ（Gibco＃10829-018）、２０％の血清置換物（Gibco＃10828-028）、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ－グルタミン、および０．１ｍＭのｂ－メルカプトエタノールで作られた、無血清培地中で維持することができる。
いくつかの態様において、多能性幹細胞を培養して角膜前駆細胞または神経堤幹細胞（neural stem crest cell）の形成を誘導する方法は、塩基性ＦＧＦ、ＳＢ４３１５４２およびノギンを含む分化培地中で多能性幹細胞を培養することにより、角膜内皮前駆細胞、例えば神経堤細胞を作製することを含む。
いくつかの態様において、多能性幹細胞を培養する方法は、好適なマトリックス、例えばiMatrix 511（Takara Bio、T304）上での培養を含む。
いくつかの態様において、多能性幹細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１２日間にわたり培養される。
いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、本明細書において開示される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２にわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、少なくとも８日間にわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、少なくとも１０日間にわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、少なくとも１２日間にわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜内皮前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、ＲＯＣＫ阻害剤、例えば、Ｙ２７６３２、ヒトＦＧＦ－塩基性ＳＢ４３１５４２、ノギン、ＥＧＦおよび／またはＮＧＦを含む培養培地中で培養される。
いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、本明細書において開示される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させた後に、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４日間、またはそれより長くにわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させた後に、少なくとも２日間にわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させた後に、少なくとも４日間、少なくとも１０日間、少なくとも１８日間または少なくとも２４日間にわたり、培養される。いくつかの態様において、角膜前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させた後に、少なくとも１８日間にわたり、培養される。
いくつかの態様において、角膜内皮前駆細胞は、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前、またはこれを増大させた後に、ＥＧＦおよび／またはＮＧＦを含む培養培地中で培養される。
多能性幹細胞由来の角膜内皮前駆細胞を作製するために、いくつかの態様において、多能性細胞の単層を採取して、例えば２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で、播種する。分化プロセスのステップ１は、多能性幹細胞を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日間にわたり培養培地中で、１、２または３日間またはそれより長くにわたりＲＯＣＫ阻害剤と共にまたはこれを用いずに培養することにより開始される。この後に、ステップ１において得られた細胞を、培養培地中で、ＦＧＦ－２、ＳＢ４３１５４２およびノギンのうちの１つ以上と共に、少なくとも４、６、８または１０日間にわたり培養する、ステップ２が続く。この後に、ステップ２において得られた細胞を、ＥＧＦを含む培養培地中で、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下または不在下において少なくとも１、２、３、４または５日間にわたり培養する、ステップ３が続く。この後に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間にわたり、１つのＥＧＦおよびＮＧＦを含む培養培地中で培養する。
多能性幹細胞由来の角膜内皮前駆細胞を調製するために有用な培地として、以下が挙げられる：
表３：成熟化培地１
表４：成熟化培地２
表５：成熟化培地３
角膜内皮細胞マーカー
ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、多数の表現型の分類に従って特徴づけることができる。分類として、これらに限定されないが、発現された細胞マーカーの検出または定量、ポンプ活性、in vivoでの角膜の修復に関する効力、およびin vivoでの角膜機能の改善、ならびにin vitroでの形態学的特色の特徴づけおよびその後のin vivoでの生着が挙げられる。
本発明のある側面において例示されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、天然でのＣＥＣ（例えば角膜から誘導されるもの）の特徴である形態学的特色を有する。特色は、当業者により容易に理解され、以下のうちのいずれかまたは全てを含む：（生体において）角膜の後方表面を裏打ちし、眼の前房に相対する、ミトコンドリアリッチな細胞、主に多角形または六角形の形状を有する均一なサイズの細胞の単層を形成する能力、水性の体液から角膜のより表面側の層への溶質および栄養の漏出を可能にしつつ、同時に、角膜実質から水性へと反対方向に水を能動的にポンピングする、「漏出性のポンプ」を形成する能力、および酸化ストレスに対する耐性。単一の細胞において存在する多数のこれらの特色は、当該細胞がＣＥＣ細胞系譜のメンバーであることと一致する。
本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣはまた、ＣＥＣ細胞系譜の細胞の特徴である表現型のマーカーを発現するか否かに従って分類することもできる。例示的な角膜内皮細胞マーカーとして、これらに限定されないが、以下が挙げられる：ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１Ｂ、ＡＱＰ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＴＪＰ１、ＮＣＡＭ１、ＣＤＨ２、ＳＬＣ４Ａ４、ＣＤ１６６、ＰＯＵ６Ｆ２、ＣＤ２４８、ＭＲＧＰＲＸ３、ＫＬＦ１３、ＣＡ２、ＮＢＣ１、Ｎ－カドヘリン、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ－１、ＫＬＦ１３、コラーゲンＶＩＩＩ、ＳＬＣ１６Ａ３、ＣＦＴＲ、ＮＢＣ１、ＣＡ２、ＡＥ２、ＳＣＬ４Ａ２、ＳＣＬ１６Ａ１、ＣＡ１２およびＣＡ４。ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、ＮＧＦＲ、ＳＯＸ１０、ＨＮＫ１、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ｖＷＦおよびＣＤ３１（後者は、血管内皮細胞において存在する）を発現しなくともよい。ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、１つ以上の角膜内皮ポンプマーカー（これは、以下を含む：ＡＱＰ１、ＣＡ２、ＣＡ４、ＣＡ１２、ＳＣＬ１４Ａ２、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＳＬＣ１６Ａ７、ＣＦＴＲ、ＮＨＥ１、ＡＤＣＹ１０、電位依存性アニオンチャネルＶＤＡＣ２およびＶＤＡＣ３、クロライドチャネルタンパク質ＣＬＣＮ２およびＣＬＣ）、眼周囲の神経堤のマーカー（これは、ＰＩＴＸ２、およびＦＯＸＣ１を含む）、ならびに／または細胞接着およびマトリックスタンパク質（これは、以下を含む：オクルディン、コネキシン４３、９．３Ｅ抗原、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、Ｎカドヘリン、ＶＥカドヘリン、Ｅカドヘリン、ベータカテニン、ｐ１２０、ｐ１９０ラミニンアルファ４、ナイドジェン－２、およびネトリン４）を発現してもよい。ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、少なくとも１つ角膜内皮ポンプマーカー、少なくとも１つ眼周囲の神経堤のマーカー、ならびに少なくとも１つ細胞接着およびマトリックスタンパク質を発現してもよい。
ＣＥＣマーカーは、表６において提供されるマーカーのうちのいずれか１つを含んでもよい（配列番号９８～１４０として提供されるｍＲＮＡ配列、および配列番号１４１～１８１として提供されるアミノ酸配列）。
表６
ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣはまた、ＣＥＣの成熟化の指標である網羅的遺伝子発現プロフィールを提示してもよい。網羅的遺伝子発現プロフィールは、初代ＣＥＣまたは既知の成熟ＣＥＣのものと比較されてもよく、当該分野において公知の任意の方法、例えばトランスクリプトーム分析またはマイクロアレイ分析により得られてもよい。いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞のトランスクリプトームを、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣのトランスクリプトームに向かって、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％、シフトさせる。いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞のトランスクリプトームを、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣのトランスクリプトームに向かって、少なくとも１％シフトさせる。いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞のトランスクリプトームを、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣのトランスクリプトームに向かって、少なくとも５％シフトさせる。いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞のトランスクリプトームを、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣのトランスクリプトームに向かって、少なくとも１０％シフトさせる。いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞のトランスクリプトームを、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣのトランスクリプトームに向かって、少なくとも２０％シフトさせる。いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞のトランスクリプトームを、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣのトランスクリプトームに向かって、少なくとも３０％シフトさせる。いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮前駆細胞のトランスクリプトームを、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣのトランスクリプトームに向かって、少なくとも４０％シフトさせる。いくつかの態様において、少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることは、角膜内皮細胞のトランスクリプトームを、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣのトランスクリプトームに向かって、少なくとも５０％シフトさせる。
ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣにおけるかかるマーカーの発現のレベルの評価は、他の細胞、例えば、初代ＣＥＣ、角膜内皮前駆細胞、神経堤細胞および血管内皮細胞と比較して、決定することができる。ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣのマーカーについての陽性対照は、目的の種の成体の角膜内皮細胞、例えば、初代ヒト角膜内皮細胞を含む。
本開示において列記される組織特異的（例えば、角膜内皮細胞特異的）なタンパク質およびオリゴ糖の決定因子は、任意の好適な免疫学的技術（細胞表面マーカーについてのフローイムノサイトケミストリー（flow immunocytochemistry）、細胞内または細胞表面マーカーについての（例えば固定された細胞または組織切片の）免疫組織化学、細胞抽出物のウェスタンブロット分析、および細胞抽出物または培地中に分泌された生成物についての酵素結合免疫アッセイなど）を用いて検出することができる。標準的な免疫細胞化学またはフローサイトメトリーアッセイにおいて、任意に細胞の固定後に、および任意に標識を増幅するために標識された二次抗体または他の抱合体（ビオチン－アビジン抱合体など）を用いて、顕著に検出可能な量の抗体が抗原に結合するであろう場合に、細胞による抗原の発現が「抗体により検出可能」であると称される。
組織特異的（例えばＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣ特異的）マーカーの発現はまた、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析により、または標準的な増幅方法において配列特異的プライマーを用いるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）により、ｍＲＮＡレベルにおいても検出することができる（米国特許第５，８４３，７８０）。本開示において列記される特定のマーカーについての配列データは、GenBankなどの公共のデータベースから得ることができる。典型的な対照実験における標準的な手順に従う、細胞試料に対するアッセイの実施が、標準的な時間ウィンドウ内に、明らかに識別可能なハイブリダイゼーションまたは増幅の生成物をもたらす場合に、ｍＲＮＡレベルにおける発現は、本開示において記載されるアッセイのうちの１つに従って「検出可能」であると称される。別段に要求されない限り、対応するｍＲＮＡがＲＴ－ＰＣＲにより検出可能である場合、特定のマーカーの発現が示される。組織特異的マーカーの発現は、タンパク質またはｍＲＮＡレベルにおいて検出される場合、そのレベルが、未分化の多能性幹細胞、線維芽細胞、または他の無関係な細胞型などの対照細胞のものよりも、少なくとも２倍、および好ましくは１０倍または５０倍より高い場合に、陽性であるとみなされる。
ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣはまた、それらが、水性の体液から角膜のより表面側の層への溶質および栄養の漏出を可能にしつつ、同時に、角膜実質から水性へと反対方向に水を能動的にポンピングする、「漏出性のポンプ」を形成する能力を提示するか否かに従って、特徴づけることができる。ＣＥＣのポンプ機能は、例えばMimuara et al., 2004 Investigative Opthamology and Visual Science, 45:9, pp. 2992-2997において記載されるとおりの当該分野において公知の方法により、評価することができる。多能性幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞もしくは胚性幹細胞、または本発明の転写因子を発現する角膜内皮前駆細胞から誘導されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣにおけるポンプ機能の変化を決定するために、ポンプ機能を、培養された初代ＣＥＣ（例えば、ヒト）、未修飾の角膜内皮前駆細胞、および／または未分化の細胞（多能性幹細胞、神経堤幹細胞など）と比較することができる。ウアバイン（Ｎａ／Ｋ ＡＴＰａｓｅ阻害剤）の添加は、ポンプ機能を除去し、ポンプ機能の存在／不在の評価を可能にするであろう。
ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣはまた、酸化ストレスに対する耐性のレベルによっても特徴づけることができる。酸化ストレスに対する耐性は、酸化ストレス経路の遺伝子（ＮＲＦ２、ＮＯＳ２など）の発現のレベルの決定に対するｑＰＣＲにより、およびニトロチロシンおよびCellRox（酸化ストレス検出のためのCellROX（商標）Reagent Variety Pack、Thermofisher、C1044）などのＲＯＳの生体マーカーを用いて細胞における反応性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを測定することにより、測定することができる。酸化ストレスに対する応答は、例えばGuha et al. 2017, Nature Scientific Reports, 4:4074（| DOI:10.1038/s41598-017-03654-4）において記載されるとおりの、当該分野において公知の方法により評価することができる。多能性幹細胞、例えば、誘導多能性幹細胞もしくは胚性幹細胞、または本発明の転写因子を発現する角膜内皮前駆細胞から誘導されるＣＥＣにおける酸化ストレスに対する耐性の変化を決定するために、酸化ストレスに対する耐性のレベルを、培養された初代ＣＥＣ（例えば、ヒト）、未修飾の角膜内皮前駆細胞、および／または未分化の細胞（多能性幹細胞、神経堤幹細胞など）と比較することができる。
ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣのさらなる特色は、それらの主に多角形または六角形の形状である。
なお別の側面において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、それらが対象において生着し、および／または長期生存を示す能力について評価することができる。１つの態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣが、in vivoで生存してそれらの表現型を維持するか否かを決定するために、ＣＥＣを、適切な動物（本明細書において記載されるとおりのもの）の角膜に投与する。投与された細胞の存在および表現型を、例えばヒト特異的抗体を用いる免疫組織化学またはＥＬＩＳＡによりまたはＲＴ－ＰＣＲ分析により評価するために、角膜組織を、数日間～数週間、またはそれより長い期間の後で採取する。遺伝子発現をｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで評価するために好適なマーカーは、本開示において提供される。角膜機能の効果はまた、ポンプ機能またはタイトジャンクションのマーカーを評価することによっても、決定することができる。
いくつかの態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、レシピエント対象の角膜中に生着する。いくつかの態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの集団を含み、ここで、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣのうちの少なくとも０．１％、０．２％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、レシピエント対象の角膜中に生着する。
ＩＩ．本発明の細胞および組成物
本発明のさらなる側面は、例えば本明細書において記載される方法のうちのいずれかに従って生成された、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの集団を含む、組成物を提供する。本発明はまた、外因性の転写因子または転写因子をコードする核酸を含む、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの集団を含む、組成物を提供する。本発明はまた、外因性の転写因子または転写因子をコードする核酸を含む、多能性幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞または胚性幹細胞の集団、神経堤幹細胞の集団、または角膜内皮前駆細胞の集団を含む、組成物を提供する。
いくつかの態様において、組成物は、例えば本明細書において記載される方法のうちのいずれかに従って生成された、ＣＥＣ、神経堤幹細胞、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞の、濃縮、精製、または単離された集団である。ＣＥＣ、神経堤幹細胞、角膜内皮前駆細胞または多能性幹細胞の、濃縮、精製、または単離された集団は、シングルセルの懸濁液、凝集物、キメラ凝集体、および／または構造であってよく、これは、分枝状の構造および／または被覆体（cyst）を含む。
いくつかの態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの集団は、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群から選択される少なくとも１つの転写因子の、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの集団における転写因子の内因的発現レベルと比較して、増大した発現レベルを含む。
いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＩＴＸ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰｉｔｘ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０，０００倍の増大を含む。上の態様のいずれかにおいて、ＣＥＣは、成熟ＣＥＣであってよい。
いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＦＯＸＣ１の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０，０００倍の増大を含む。上の態様のいずれかにおいて、ＣＥＣは、成熟ＣＥＣであってよい。
いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも２０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも５０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも２００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも５００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０，０００倍の増大を含む。上の態様のいずれかにおいて、ＣＥＣは、成熟ＣＥＣであってよい。
いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも２０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも５０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも２００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも５００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＬＭＸ１Ｂの増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０，０００倍の増大を含む。上の態様のいずれかにおいて、ＣＥＣは、成熟ＣＥＣであってよい。
いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５０倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも２００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも５００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１，０００倍の増大を含む。いくつかの態様において、ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現は、ＣＥＣの集団におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも１０，０００倍の増大を含む。上の態様のいずれかにおいて、ＣＥＣは、成熟ＣＥＣであってよい。
いくつかの態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの集団は、ＥＲＧ、ＡＴＦ４、ＡＴＭＩＮ、ＢＨＬＨＥ４０、ＣＥＢＰＤ、ＣＳＲＮＰ１、ＤＲＡＰ１、ＥＧＲ１、ＥＬＦ２、ＥＭＸ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＳ２、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ２、ＧＴＦ３Ａ、ＨＩＦ１Ａ、ＪＵＮ、ＪＵＮ Ｂ、ＪＵＮ Ｄ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ９、ＭＢＤ３、ＮＦＥ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ４Ａ１、ＰＡ２Ｇ４、ＰＯＵ３Ｆ３、ＲＥＬＡ、ＴＢＸ２、ＴＦＤＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＵＳＦ２、ＹＢＸ１、ＺＮＦ２０７、ＺＮＦ３５８およびＺＮＦ３９５からなる群より選択される１つ以上の転写因子の、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの集団における内因的発現レベルと比較して増大した発現レベルの、当該１つ以上の転写因子をさらに含む。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＥＲＧである。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＢＨＬＨＥ４０である。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＣＥＢＰＤである。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＣＳＲＮＰ１である。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＥＧＲ１である。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＥＳＲＲＡである。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＥＴＳ２である。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＦＯＳである。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＦＯＳＢである。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＦＯＳＬ２である。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＪＵＮである。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＪＵＮＢである。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＪＵＮＤである。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＫＬＦ１０である。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＫＬＦ９である。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＮＲ１Ｄ１である。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＮＲ４Ａ１である。いくつかの態様において、１つ以上の転写因子は、ＴＳＣ２２Ｄ１である。
いくつかの態様において、ＣＥＣの集団は、角膜内皮前駆細胞の集団である。いくつかの態様において、ＣＥＣの集団は、成熟ＣＥＣの集団である。いくつかの態様において、ＣＥＣの集団は、成熟ＣＥＣおよび角膜内皮前駆細胞の両方を含む。
いくつかの態様において、ＣＥＣの集団の組成物は、約１×１０６個のＣＥＣ～約１×１０１２個のＣＥＣを含む。いくつかの態様において、ＣＥＣの集団の組成物は、少なくとも１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、または１×１０１２個のＣＥＣを含む。
また本明細書において提供されるのは、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣまたは角膜内皮前駆細胞、および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物および処方物である。
いくつかの態様において、医薬組成物は、約１×１０６個のＣＥＣ～約１×１０１２個のＣＥＣの範囲の用量を含む。いくつかの態様において、用量は、約１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、または１×１０１２個のＣＥＣである。いくつかの態様において、医薬組成物は、約１×１０６個のＣＥＣ～約１×１０１２個のＣＥＣの範囲の用量を含む。
本発明のさらなる側面は、発現ベクターを含む多能性肝細胞の集団を含む組成物を提供し、ここで、発現ベクターは、本開示の少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む。
いくつかの態様において、転写因子は、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２のうちの１つ以上である。いくつかの態様において、転写因子は、ＰＩＴＸ２である。いくつかの態様において、転写因子は、ＦＯＸＣ１である。いくつかの態様において、転写因子は、ＴＦＡＰ２Ｂである。いくつかの態様において、転写因子は、ＬＭＸ１Ｂである。いくつかの態様において、転写因子は、ＰＯＵ６Ｆ２である。
いくつかの態様において、多能性幹細胞の集団は、ＥＲＧ、ＡＴＦ４、ＡＴＭＩＮ、ＢＨＬＨＥ４０、ＣＥＢＰＤ、ＣＳＲＮＰ１、ＤＲＡＰ１、ＥＧＲ１、ＥＬＦ２、ＥＭＸ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＳ ２、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ２、ＧＴＦ３Ａ、ＨＩＦ１Ａ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ９、ＭＢＤ３、ＮＦＥ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ４Ａ１、ＰＡ２Ｇ４、ＰＯＵ３Ｆ３、ＲＥＬＡ、ＴＢＸ２、ＴＦＤＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＵＳＦ２、ＹＢＸ１、ＺＮＦ２０７、ＺＮＦ３５８およびＺＮＦ３９５からなる群より選択される１つ以上の転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターをさらに含む。
いくつかの態様において、多能性幹細胞の集団を含む組成物は、約１×１０６個の多能性幹細胞～約１×１０１２個の多能性幹細胞を含む。いくつかの態様において、多能性幹細胞の集団を含む組成物は、少なくとも１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、または１×１０１２個の多能性幹細胞を含む。
いくつかの態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの態様において、多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞である。
本発明のさらなる側面は、発現ベクターを含む角膜内皮前駆細胞の集団を含む組成物を提供し、ここで、発現ベクターは、本開示の少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む。
いくつかの態様において、転写因子は、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２のうちの１つ以上である。いくつかの態様において、転写因子は、ＰＩＴＸ２である。いくつかの態様において、転写因子は、ＦＯＸＣ１である。いくつかの態様において、転写因子は、ＴＦＡＰ２Ｂである。いくつかの態様において、転写因子は、ＬＭＸ１Ｂである。いくつかの態様において、転写因子は、ＰＯＵ６Ｆ２である。
いくつかの態様において、角膜内皮前駆細胞の集団は、ＥＲＧ、ＡＴＦ４、ＡＴＭＩＮ、ＢＨＬＨＥ４０、ＣＥＢＰＤ、ＣＳＲＮＰ１、ＤＲＡＰ１、ＥＧＲ１、ＥＬＦ２、ＥＭＸ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＳ２、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ２、ＧＴＦ３Ａ、ＨＩＦ１Ａ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ９、ＭＢＤ３、ＮＦＥ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ４Ａ１、ＰＡ２Ｇ４、ＰＯＵ３Ｆ３、ＲＥＬＡ、ＴＢＸ２、ＴＦＤＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＵＳＦ２、ＹＢＸ１、ＺＮＦ２０７、ＺＮＦ３５８およびＺＮＦ３９５からなる群より選択される１つ以上の転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターをさらに含む。
いくつかの態様において、角膜内皮前駆細胞の集団を含む組成物は、約１×１０６個の角膜内皮前駆細胞～約１×１０１２個の角膜内皮前駆細胞を含む。いくつかの態様において、角膜内皮前駆細胞の集団を含む組成物は、少なくとも１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、または１×１０１２個の角膜内皮前駆細胞を含む。
また本明細書において提供されるのは、角膜内皮前駆細胞、および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物および処方物である。
いくつかの態様において、医薬組成物は、約１×１０６個の角膜内皮前駆細胞～約１×１０１２個の角膜内皮前駆細胞の範囲の用量を含む。いくつかの態様において、用量は、約１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、または１×１０１２個の角膜内皮前駆細胞である。いくつかの態様において、医薬組成物は、約１×１０６個の角膜内皮前駆細胞～約１×１０１２個の角膜内皮前駆細胞の範囲の用量を含む。
本明細書において記載されるとおりの医薬組成物および処方物は、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを、１つ以上の任意の薬学的に許容し得る担体（Remington's Pharmaceutical Sciences、第２２版、２０１２年；その全体において本明細書において参考として援用される）と混合することにより、水溶液の形態において調製することができる。薬学的に許容し得る担体は、一般に、使用される投与量および濃度において、レシピエントにとって非毒性であり、これらに限定されないが、以下を含む：リン酸、クエン酸および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。本明細書における例示的な薬学的に許容し得る担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの、間質性薬物分散剤をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用の方法は、米国特許公開番号２００５／０２６０１８６および同２００６／０１０４９６８において記載される；これらの各々は、その全体において本明細書において参考として援用される。一側面において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
ある態様において、ＣＥＣを含む組成物および医薬組成物は、実質的に精製されたＣＥＣの集団を含む。例えば、ＣＥＣの組成物は、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満の、ＣＥＣ以外の細胞を含んでもよい。いくつかの態様において、ＣＥＣの組成物は、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満の多能性幹細胞を含む。別の態様において、ＣＥＣの組成物は、多能性幹細胞を含まないか、またはこれについて検出不可能である。いくつかの態様において、ＣＥＣの組成物は、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満の角膜内皮前駆細胞を含む。別の態様において、ＣＥＣの組成物は、角膜内皮前駆細胞を含まないか、またはこれについて検出不可能である。いくつかの態様において、実質的に精製されたＣＥＣの集団を含む組成物とは、ＣＥＣが組成物中の細胞のうちの少なくとも約７５％を含むものである。他の態様において、実質的に精製されたＣＥＣの集団とは、ＣＥＣが、集団中の細胞のうちの少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９９％、またはさらには９９％よりも多くを含むものである。態様のうちのいずれかにおいて、実質的に精製されたＣＥＣの集団は、実質的に精製された成熟ＣＥＣの集団であってよい。
ＩＩＩ．角膜内皮細胞の使用の方法
本明細書において記載される方法により生成されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣおよび医薬組成物は、角膜の障害を含む眼の障害であって、角膜内皮細胞が必要とされるか、またはこれが処置を改善するもののための。細胞ベースの処置のために用いてもよい。角膜内皮細胞ベースの治療から受益し得る多様な状態を処置するために、本発明により生成されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを用いる方法は、本明細書において記載される。特定の処置レジメン、投与の経路、および任意のアジュバント治療は、特定の状態に、状態の重篤度、および患者の全体的な健康に基づいて、個別対応されるであろう。加えて、ある態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの投与は、角膜の機能の喪失または他の症状を完全に修復するために、有効であり得る。他の態様において、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの投与は、症状の重篤度を軽減するため、および／または患者の状態におけるさらなる変性症を予防するために、有効であり得る。本発明は、本明細書において記載される状態のうちのいずれかを処置する（症状の重篤度を完全にまたは部分的に軽減することを含む）ために、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを含む組成物の投与を用いることができることを企図する。
本発明は、本明細書において記載される適応症のうちのいずれかの処置において、本明細書において記載される方法のうちのいずれかを用いて誘導されたＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを含む組成物を含む、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを用いることができることを企図する。さらに、本発明は、本明細書において記載される適応症のうちのいずれかの処置において、本明細書において記載されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを含む組成物のうちのいずれかを用いることができることを企図する。
１つの態様において、本開示は、疾患、好ましくは、角膜内皮細胞に影響を及ぼすか、またはその移植もしくは投与による処置を受け入れられる疾患、例えば、フックスジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、後部多形性ジストロフィーおよび先天性遺伝性内皮ジストロフィーなどの原疾患、ならびに、それについての有効な処置が角膜内皮の置き換えである二次疾患（角膜ジストロフィーを含む）、または対象が水疱性角膜症をもたらす角膜浮腫の症状を示す二次疾患、対象がコンタクトレンズの使用もしくは白内障手術に起因する眼球の損傷を有する二次疾患、または対象が角膜移植を考慮している二次疾患、角膜移植における遅発型内皮不全の、予防（prevention）および／または処置のための治療方法を提供する。
別の態様において、本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、他の治療用の細胞または剤と共に投与されてもよい。ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、組み合わされたもしくは別々の処方物において同時に投与しても、または連続的に投与されてもよい。治療方法は、免疫抑制剤の投与を含んでもよい。用いてもよい免疫抑制剤として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、BASILIXIMAB（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒ．アルファ．受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、DACLIZUMAB（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒ．アルファ．受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、RITUXIMAB（登録商標）（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、副腎皮質ステロイドおよび間葉系幹細胞。免疫抑制剤は、少なくとも約１、２、４、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／ｋｇで投与されてもよい。免疫抑制剤が用いられる場合、それらは、全身的に、または局所的に投与してもよく、それらは、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの投与の前、これと同時に、またはこれの後に、投与されてもよい。免疫抑制治療は、細胞の投与の後、数週間、数か月間、数年間にわたり、または無期限に続けてもよい。例えば、患者は、５ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンを、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの投与の後、６週間にわたり投与されてもよい。さらに、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの組成物は、免疫抑制剤、例えば前述のもののうちのいずれかを含んでもよい。
本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、細胞の付着、生着および／または生存を促進する剤と共に投与されてもよい。本発明のＣＥＣは、ＲＯＣＫ阻害剤、例えば、Ｙ２７６３２、および細胞外マトリックスタンパク質、例えばフィブロネクチンと共に投与されてもよい。本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、１つ以上の抗アポトーシス剤、抗炎症剤、抗酸化剤、および細胞外マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、ラミニンの切断型Ｅ８フラグメント（例えば、iMatrix 511）、コラーゲン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩＩ型など）、その他と共に投与されてもよい。
本発明の方法により提供されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣおよび組成物はまた、多様な適用において用いることができる。これらは、in vivoでの角膜内皮細胞移植またはインプラント術；in vitroでの細胞傷害性化合物、発がん物質、変異原、増殖／調節因子、または医薬化合物についてのスクリーニング；角膜の疾患および感染症の機序を解明すること；薬物および／または増殖因子が作動する機序を研究すること；患者におけるがんを診断およびモニタリングすること；遺伝子治療；ならびに生物活性生成物の生成を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、角膜内皮細胞は、成熟角膜内皮細胞、神経堤幹細胞、角膜内皮前駆細胞、またはこれらの組み合わせを含む。
試験化合物スクリーニング
本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、本明細書において提供される角膜内皮細胞の特徴に影響を及ぼす因子（溶媒、小分子薬物、ペプチド、およびポリヌクレオチドなど）または環境条件（培養の条件もしくは操作など）についてスクリーニングするために用いることができる。
いくつかの適用において、幹細胞（分化している、または未分化のもの）は、角膜内皮細胞の細胞系譜の沿った細胞の成熟化を促進するか、またはかかる細胞の長期培養中での増殖および維持を促進する因子をスクリーニングするために用いられる。例えば、候補である角膜内皮細胞成熟化因子または増殖因子は、それらを異なるウェル中で幹細胞に添加して、次いで、生じる任意の表現型の変化を、望ましい基準に従って決定することにより、細胞のさらなる培養および使用のために試験される。
本発明の特定のスクリーニングの適用は、例えばIn vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997および米国特許第５，０３０，０１５において記載されるとおりの薬物研究における医薬化合物の試験に関する；これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される。候補医薬化合物の活性の評価は、一般に、本発明のある側面において提供されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを、候補化合物と組み合わせて、化合物に起因し得る細胞の形態学、マーカー表現型または代謝活性の任意の変化を決定し（未処置の細胞または不活性な化合物で処置された細胞と比較して）、および次いで、化合物の効果を観察された変化と相関させることを含む。スクリーニングは、化合物が角膜内皮細胞に対して医薬的効果を有するように設計されるという理由で行っても、または、別途の効果を有するように設計された化合物が、意図されない角膜での副作用を有し得るという理由で行ってもよい。起こり得る薬物－薬物相互作用効果を検出するために、２つ以上の薬物を組み合わせて（細胞と、同時にまたは連続的に組み合わせることにより）試験することができる。
角膜治療および移植
本発明はまた、眼の機能の程度を修復するための、それを必要とする対象に対しての、本明細書において記載されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの使用を提供する。
本明細書において提供されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの治療的適用のための好適性を決定するために、細胞を、第１に、好適な動物モデルにおいて試験することができる。好適な動物モデルとして、ウサギＣＥＣ擦過（scraping）モデル（Okumura et al., 2017 Am. J. Pathol., 2012, 181(1): 268-277）またはサルＣＥＣ擦過モデル（Okumura et al, 2016, Nature Scientific Reports, 6:26113, DOI: 10.1038/srep26113）が挙げられる。本発明のために有用なさらなるモデルとして、フックス角膜内皮ジストロフィーのＬ４５０ＷおよびＱ４５５Ｋ Ｃｏｌ８ａ２ノックインマウスモデル（Meng et al., 2013, Invest. Opthamol. Vis. Sci. 54(3):1887-189）およびマウスＳＬＣ４Ａ１１ノックアウトモデル（Groger et al. 2010, J. Biol. Chem., 285(19): 14467）などのげっ歯類モデルが挙げられる。かかるモデルは、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣがin vivoで生存してそれらの表現型を維持する能力を評価するために有用である。本明細書において提供されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、動物に投与される。数日間～数週間、またはそれより長い期間の後で、組織を採取して評価する。このことは、投与された細胞に検出可能な標識（緑色蛍光タンパク質、またはβ－ガラクトシダーゼなど）を提供することにより；または投与された細胞について特異的な構成的マーカーを測定することにより、行うことができる。げっ歯類に投与されたヒトＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの存在および表現型は、ヒト特異的抗体を用いる免疫組織化学またはＥＬＩＳＡにより、またはヒトポリヌクレオチド配列について特異的であるべき増幅を引き起こすプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を用いるＲＴ－ＰＣＲ分析により、評価することができる。遺伝子発現をｍＲＮＡまたはタンパク質レベルにおいて評価するために好適なマーカーは、本明細書において提供される。
本発明のある側面において提供されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣであって、本明細書において記載される望ましい機能的特徴または動物モデルにおける効力を示すものはまた、角膜機能障害を有するヒト対象への直接投与のためにも好適であり得る。一側面において、本開示は、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣまたはその前駆体の培養されたシートまたは単層または球状体の、それを必要とする対象、例えば角膜内皮細胞の疾患を罹患する個体の眼への移植を含む、治療方法を提供する。例えば、対象の眼は、デスメ膜の除去により準備されてもよく、前記のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの培養されたシートまたは単層または球状体は、前記眼の前房中に、例えば後方の角膜実質と接触させて（および好ましくはこれに付着またははり付けられて）、置かれてもよい。任意に、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣまたはその前駆体のシートまたは単層または球状体は、担体上に提供されて、患者の眼に投与されてもよい。
角膜内皮のみが損なわれている場合に臨床的に好ましい場合がある１つの処置は、デスメ膜剥離角膜内皮移植（ＤＳＥＫ）であり、これは、罹患したデスメ膜および角膜内皮の除去、およびその後のドナー組織の移植を含む。角膜全体を置き換える（全層角膜移植またはＰＫ）ため、または患者のデスメ膜および内皮を残して、残りの層を提供された組織で置き換える（表層角膜移植）ための手順が開発されてきた。一般に、米国特許第５，７５５，７８５号、米国特許第５，６４９，９４４号、米国特許第７，１４７，６４８号、米国特許第７，３００，６５３号、米国特許第５，５８４，８８１号、米国特許第５，６８６，４１４号、米国特許第７，３００，６５４号、米国特許出願シリアル番号１０／５２５，３９１を参照；これらの各々は、その全体において参考として援用される。角膜内皮の外科的置き換えのさらなる方法は、開発中であり、これは、ドナー組織がデスメ膜および角膜内皮のみからなるデスメ膜角膜内皮移植（ＤＭＥＫ）を含む。角膜内皮の外科的置き換え治療は、適切な動物モデル、例えば本明細書において記載されるモデルのうちのいずれかを用いて評価することができる。本発明のある側面において提供されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、角膜内皮再構築のために用いてもよく、ここで、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、移植の前にin vitroで培養される。例えば、提供されたヒト角膜細胞は、ポリマー上で培養され、生体接着性ゼラチンディスク上に放出され、次いで剥皮されたウサギ角膜中に首尾よく組み込まれ、ゼラチンディスクは移植後に溶解する（Hsiue et al., Transplantation. 2006 Feb. 15; 81(3):473-6；これは、本明細書においてその全体において参考として援用される）。しかし、培養された細胞を利用する方法は、前記細胞のソースを前提とし、したがって、前記のとおりの好適な提供された組織の不足により影響を受ける。加えて、提供された細胞の間の差異に起因して、一定の質および効力の角膜内皮細胞培養物を生成することは困難であることが判明する場合がある。各々のドナーから得られた細胞について安全性および／または効率についての大規模試験が必要とされ得るという可能性に起因して、規制のハードルもまた、かかる方法をラージスケールで行うことをロジスティックに困難にし得る。これらの、およびさらなる治療方法は、Thomas John, Corneal Endothelial Transplant: DSAEK, DMEK & DLEK（JP Medical Ltd, 2010）においてさらに記載され、これは、本明細書においてその全体において参考として援用される。
本発明のある側面において提供されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、眼の機能を修復または補充することが必要な、任意の対象の治療のために用いることができる。かかる治療のために適切であり得るヒトの状態として、フックスジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、後部多形性ジストロフィーおよび先天性遺伝性内皮ジストロフィーなどの原疾患、ならびにそれについての有効な処置が角膜内皮の置き換えである二次疾患（角膜ジストロフィーを含む）、または対象が水疱性角膜症をもたらす角膜浮腫の症状を示す二次疾患、対象がコンタクトレンズの使用もしくは白内障手術に起因する眼球の損傷を有する二次疾患、または対象が角膜移植を考慮している二次疾患が挙げられる。
ヒトの治療のために、用量は、一般に、約１０９～１０１２個の細胞、典型的には約５×１０９～５×１０１０個の細胞であり、対象の体重、苦痛の性質および重篤度、ならびに投与された細胞の複製能力により、調整が行われる。
本発明はまた、例えばオルガノイドなどの他の細胞型と組み合わせた、本明細書において開示されるＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの使用の方法を提供する。オルガノイドは、ＣＥＣから確立させて、数か月にわたり増殖させつつ、重要な形態学的、機能的および遺伝子発現の特色を維持することができる。
さらに、製造、流通および使用の目的のために、本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、細胞培養または懸濁物の形態において、等張性の賦形剤または培養培地中で、任意に輸送または貯蔵を容易にするために凍結されて、供給されてもよい。
本開示の組成物は、パイロジェンフリーまたは本質的にパイロジェンフリーであり、病原体フリーであるなどの、ヒト患者を処置することにおける使用ために好適な処方におけるものであってよい。投与された場合、本開示における使用のための医薬調製物は、パイロジェンフリー、病原体フリー、生理学的に許容し得る形態におけるものであってよい。本開示の組成物は、イヌ、ネコまたはウシなどの非ヒト獣医学的哺乳動物への投与のために好適な処方におけるものであってよい。
本発明はまた、製造、流通または使用の間の任意の時点において存在する、細胞のセットまたは組み合わせを含む、様々な試薬系を含む。細胞のセットは、未分化の幹細胞、体細胞由来角膜内皮細胞、または他の分化した細胞型と組み合わせた、本開示において記載される２つ以上の細胞集団、例えばＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣ、それらの前駆体およびサブタイプの、任意の組み合わせを含む。セット中の細胞集団は、時に、同じゲノムまたはその遺伝子修飾された形態を共有する。
本発明は、例えばヒト多能性幹細胞（例えば、誘導多能性幹細胞、ヒト胚性幹細胞または他の多能性幹細胞）から得られたＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの組成物を、前述の疾患または状態のうちのいずれかを処置するために用いてもよいことを企図する。これらの疾患は、多様な成熟度のレベルのＣＥＣを含むＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの組成物で、ならびに、成熟ＣＥＣについて濃縮されたＣＥＣの組成物で、処置することができる。
ＩＶ．角膜内皮細胞の投与の方法
本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、処置されている疾患または障害のために適切な、任意の投与の経路により投与されてもよい。１つの態様において、本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、局所的に（topically）、全身的に、または局所的に（locally）、例えば注射により、またはデバイスもしくはインプラント（例えば持続放出インプラント）の一部として、投与されてもよい。例えば、本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、
フックスジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、後部多形性ジストロフィー、および先天性遺伝性内皮ジストロフィー、ならびにそれについての有効な処置が角膜内皮の置き換えである二次疾患（角膜ジストロフィーを含む）、または対象が水疱性角膜症をもたらす角膜浮腫の症状を示す二次疾患、対象がコンタクトレンズの使用もしくは白内障手術に起因する眼球の損傷を有する二次疾患、または対象が角膜移植を考慮している二次疾患、または黄斑変性、シュタルガルト病、および網膜色素変性などの障害または疾患を有する患者を処置している場合に、手術を用いることにより、眼に移植されてもよい。当業者は、処置されている疾患または障害のための投与の経路を決定することができるであろう。
本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、薬学的に許容し得る処方物中で、注射により送達してもよい。注射のための濃度は、本明細書において記載される要因に依存して、有効かつ非毒性である任意の量におけるものであってよい。１つの態様において、少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、１×１０８、または１×１０１０個のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを、それを必要とする患者に投与されてもよい。
本発明の剤を含む生成物および系、例えば送達ビヒクル、特に医薬組成物として処方されたもの、ならびにかかる送達ビヒクルおよび／または系を含むキットはまた、本発明の一部であるものとして想起される。
ある態様において、本発明の治療方法は、本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを、インプラントまたはデバイスにより投与するステップを含む。ある態様において、デバイスは、本明細書において記載される疾患または状態を処置するための、生体分解可能なインプラントである。
本明細書において記載される方法により投与される組成物の容積はまた、投与の様式、角膜内皮細胞の数、患者の年齢、ならびに処置されている疾患の型および重篤度などの要因に依存する。
ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、典型的には、患者に、一回、送達される。ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、患者の生涯にわたり一回より多く、送達してもよい。ある態様において、患者はまた、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの投与の前、これと同時に、またはこれの後に、免疫抑制治療を投与される。免疫抑制治療は、患者の生涯にわたり必要であっても、またはより短い期間にわたり必要であってもよい。免疫抑制治療の例として、これらに限定されないが、以下のうちの１つ以上が挙げられる：抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、BASILIXIMAB（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒａ受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、DACLIZUMAB（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒａ受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、RITUX1MAB（登録商標）（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス、タクロリムス（Prograf（商標））、およびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）。
ある態様において、本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、薬学的に許容し得る担体と共に、処方される。例えば、ＣＥＣは、単独で、または医薬処方物の構成成分として投与されてもよい。ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、ヒト医薬における使用のための任意の便利な手段における投与のために処方されてもよい。ある態様において、非経口投与のために好適な医薬組成物は、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣを、１つ以上の薬学的に許容し得る無菌の等張性の水性もしくは非水性の溶液、分散、懸濁液、もしくはエマルジョン、または使用の直前に無菌の注射可能な溶液または分散に再構成してもよい無菌の粉末と組み合わせて含んでもよく、これは、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、処方物を意図されるレシピエント血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含んでもよい。本発明の医薬組成物において使用してもよい好適な水性および非水性の担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび類似のものなど）、ならびにこれらの好適な混合物が挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散の場合には要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
Ｖ．キット
ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの集団、例えば成熟ＣＥＣの集団および／または本開示の医薬組成物を含む製品またはキットもまた、本明細書において提供される。製品またはキットは、例えば本明細書において開示される任意の疾患を処置するかまたはその進行を遅延させるために、本発明の角膜内皮細胞の集団または医薬組成物を使用するための、取扱説明書を含むパッケージ挿入物を、さらに含むことができる。製品またはキットは、他のバッファー、希釈剤、充填剤、針、シリンジ、および使用のための取扱説明書を有するパッケージ挿入物を含む、商業的な、およびユーザーの立場から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、製品は、別の剤（例えば、化学療法剤）のうちの１つ以上をさらに含む。本発明の角膜内皮細胞は、細胞の付着、生着および／または生存を促進する剤と共に投与されてもよい。本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、ＲＯＣＫ阻害剤、例えば、Ｙ２７６３２、および細胞外マトリックスタンパク質、例えばフィブロネクチンと共に投与されてもよい。本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、１つ以上の抗アポトーシス剤、抗炎症剤、抗酸化剤および細胞外マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、ラミニンの切断型Ｅ８フラグメント（例えば、iMatrix 511）、コラーゲン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩＩ型など）などと共に投与されてもよい。本発明のＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣは、ＣＥＣ、例えば成熟ＣＥＣの送達を容易にするために、磁性ビーズまたはナノ粒子と組み合わせて投与されてもよい。
１つ以上の剤のための好適な容器として、例えば、ボトル、バイアル、バッグおよびシリンジが挙げられる。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本明細書においてその全体において参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配するであろう。加えて、材料、方法および例は、単に説明的なものであり、限定することを意図されない。
例
例１：材料および方法
レンチウイルス生成：
pReceiver-Lv156（GeneCopoeia）を、目的の遺伝子をＥＦ１αプロモーター下において発現させるためのレンチウイルスベクターとして用いた。レンチウイルス粒子を、TakaraBio（www.takarabio.com）により開発された一連の製品を用いて生成した。ウイルスのパッケージングは、Lenti-X 293T細胞（Takarabio、カタログ番号６３２１８０）およびLenti-X Packaging Single Shots（Takarabio、カタログ番号６３１２７５＆６３１２７６）からなる第４世代レンチウイルスパッケージング系を用いて行った。ウイルスの濃度および量は、それぞれ、Lenti-X（商標）Concentrator（Takarabio、カタログ番号６３１２３１＆６３１２３２）およびLenti-X qRT-PCR滴定キット（Takarabio、カタログ番号６３１２３５）を用いて決定した。Lenti-X（商標）Concentratorは、ウイルスと混合して、遠心分離の後で濃縮されたウイルスストックを作製する試薬であり、その後、Lenti-X qRT-PCRキットを用いて実際のレンチウイルスゲノムのコピー数（量）を決定し、それから濃度を計算する。全ての手順は、製造者により推奨されたプロトコルを用いて行った。ウイルスを、一定分量に分け、使用するまで－８０℃で貯蔵した。
幹細胞培養：
ヒトｉＰＳＣを、iMatrix 511（Takara T304）でコートされた６ウェルプレート上で、StemFit Basic03培地（Ajinomoto）中で維持した。細胞を、２０％Ｏ２／５％ＣＯ２の条件下において培養し、４～７日間ごとに、TrypLE-Select酵素（１×）（Thermo Fisher Scientific、１２５６３０１１）でシングルセルに分離することにより継代した。
角膜内皮細胞（ＣＥＣ）分化プロトコル：
多能性幹細胞由来の角膜内皮細胞は、培養ディッシュから３つのステップにおいて誘導した。第１のステップにおいて、ヒトｉＰＳＣを、TrypLE-Select酵素（１×）（Thermo Fisher Scientific、１２５６３０１１）を用いて採取し、iMatrix511でプレコートされた６ウェルプレートにおいて、２×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、１０ｍＭのＹ２７６３２を補充されたStemFit Basic03培地を用いて２４時間にわたり培養し、その後、Ｙ２７６３２なしで、StemFit Basic03培地中で、さらなる２日間にわたり培養した。第２のステップにおいて、以下を含んでなる培地中での培養により、神経堤細胞を誘導した：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Thermo Fisher Scientific、１１３３０－０３２）、２０％のKnockOut（商標）血清代替物（Thermo Fisher Scientific、１０８２８－０２８）、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Thermo Fisher Scientific、１１１４０－０５０）、１％のＬ－グルタミン（Thermo Fisher Scientific、２５０３０－０８１）、６ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＦＧＦ－塩基性（Peprotech、１００－１８Ｂ）、０．００７％の２－メルカプトエタノール、１ｍＭのＳＢ４３１５４２（Stemgent、０４－００１０－１０）、０．５ｍｇ／ｍｌの組み換えヒトノギン（Peprotech、１２０－１０Ｃ－１００ＵＧ）、および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific、１５１４０－１２２）。培地を、一日おきに、６日間の期間にわたり補充した。第３のステップにおいて、細胞を、２４時間にわたり、以下を含んでなる成熟化培地中で培養した：Opti-MEM I少血清（Reduced-Serum）培地（Thermo Fisher Scientific、３１９８５－０７０）、８％ウシ胎仔血清（Hyclone、ＳＨ３００７０．０３）、２００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム（Sigma-Aldrich、Ｃ５６７０－１００Ｇ）、０．０８％コンドロイチン硫酸Ａ（Sigma-Aldrich、Ｃ９８１９－５Ｇ）、１０％のウシ下垂体抽出物（Alfa Aesar、Ｊ６４４１７）、５ｎｇ／ｍｌの表皮増殖因子（Sigma-Aldrich、Ｅ９６４４－．２ＭＧ）、２０ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Sigma-Aldrich、Ａ４４０３－１００ＭＧ）、１０ｍＭのＹ２７６３２、および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific、１５１４０－１２２）。細胞を、同じ培地中で、ＩＶ型コラゲナーゼ（Stem Cell Technologies、０７９０９）による処置により、１：９の比で継代した。継代の２４時間後に、以下を含んでなる培地で培地を置き換えた：Opti-MEM I小血清培地（Thermo Fisher Scientific、３１９８５－０７０）、ＩＴＳサプリメント（Sigma-Aldrich、Ｉ３１４６）、２００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム（Sigma-Aldrich、Ｃ５６７０－１００Ｇ）、０．０８％コンドロイチン硫酸Ａ（Sigma-Aldrich、Ｃ９８１９－５Ｇ）、５ｎｇ／ｍｌの表皮増殖因子（Sigma-Aldrich、Ｅ９６４４－．２ＭＧ）、２０ｍｇ／ｍｌのＮＧＦ（Peprotech、４５０－０１）、２０ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Sigma-Aldrich、Ａ４４０３－１００ＭＧ）、および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific、１５１４０－１２２）（成熟化培地３）。培地を、２１日間の期間にわたり１日おきに置き換えて、ｉＰＳＣ由来ＣＥＣを形成させた。図１は、分化プロトコルの模式図である。角膜内皮前駆細胞のレンチウイルス感染は、ｄ１０において行われ、その後、本明細書において、および例えば図１において記載されるとおりの様々な時点において、ｑＰＣＲ分析のために試料を得た。Ｄ１０における細胞は、神経堤細胞分化の誘導後であった。理論に拘束されることなく、形質導入は、ｄ１０において行われることに限定されないと考えらえる。したがって、形質導入は、代替的な時点において行ってもよい。非限定的な例として、ＣＥＣの分化および成熟化を首尾よく駆動するために、形質導入は、Ｄ７～Ｄ２０、例えばＤ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、Ｄ１６、Ｄ１７、Ｄ１８、Ｄ１９およびＤ２０、またはＤ７～Ｄ１８もしくはＤ７～Ｄ１７もしくはＤ７～Ｄ１６もしくはＤ７～Ｄ１５もしくはＤ７～Ｄ１４もしくはＤ７～Ｄ１３もしくはＤ７～Ｄ１２もしくはＤ７～Ｄ１１もしくはＤ７～Ｄ１０もしくはＤ７～Ｄ９、またはＤ７より前、例えば、Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５もしくはＤ６の時点において行ってもよい。
ｉＰＳＣ由来角膜内皮前駆細胞の形質導入：
転写因子をコードするレンチウイルス粒子によるｉＰＳＣ由来角膜内皮前駆細胞の形質導入は、分化プロセスのｄ１０において、ポリブレン（６μｇ／μｌ）の存在下において、成熟化培地３中で行われた。形質導入の２日後に、培養培地を、ピューロマイシン（０．５μｇ／μｌ）を含むまたはこれを含まない培地で置き換えた。全ＲＮＡの単離のための細胞ライセートの回収まで、培地を１日おきに置き換えた。
成熟角膜内皮細胞マーカーのリアルタイムＰＣＲ分析：
iＰＳＣ由来ＣＥＣからの全ＲＮＡを、RNeasy Microキット（Qiagen、カタログ番号７４００４）を用いて単離し、SuperScript VILO cDNA合成キット（Thermo Fisher Scientific、１１７５４０５０）を用いてｃＤＮＡを作製した。リアルタイム定量ＰＣＲ反応は、QuantStudio 7 Flexマシン（ThermoFisher）において、Taqmanプローブ（表７）およびTaqMan Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific、Ａ４４３６０）を用いて行われた。デルタＣｔ法により、発現レベルを計算し、Ｐｇｋ１に対して正規化した（２－ΔＣｔ）。
表７
Periocular Mesenchyme（POM）とは、Pitx2およびFoxC1について陽性である神経堤細胞の亜集団である。
例２：初代ヒトＣＥＣにおいて豊富な転写因子アイソフォームの同定．
初代ヒトＣＥＣにおいて豊富な転写因子の特異的アイソフォームを同定するために、トランスクリプトーム分析により作製されたバルクRNAseqデータを、Gene Expression Omnibus（ＧＥＯ）データベースのハイスループット遺伝子発現データのリポジトリ（ＧＳＥ４１４１６）からダウンロードして分析した。FastQファイルを、DolphinNextサーバー上のヒトゲノムｈｇ１９に対してアラインメントした。アラインメントおよび読みとりデータの作表は、STAR-RSEMパイプラインを用いるバイオインフォマティクスプロトコルを用いて行った。STAR mapperは、読みとりデータを参照ゲノム上にアラインメントすることができ、RSEMは、遺伝子およびトランスクリプトの発現レベルを定量することができる。各々のアイソフォームについての予測される配列カウント、ならびにＴＰＭ（transcripts per million：ｔｐｍ）が得られ、アイソフォームレベルが得られた。試料を、次いで、転写因子の発現レベルに関して調べるように要求した。
EBSeqソフトウェアを用いる第２の分析のランにおいて、全ての成人試料および全ての胎児試料をそれぞれ「Adult」および「Fetal」群にグループ化した後、かつ配列決定の深度について正規化した後で、アイソフォームを分析した。図５は、初代ヒトＣＥＣ（バルクRNAseq）において豊富な本発明の特定の転写因子についての、全ての既知のアイソフォームを提供する。各々の細胞における淡青色のバーの長さが、発現レベルを示す。
例３：分化中のｉＰＳＣ由来ＣＥＣにおける導入された転写因子の発現．
上で例１において記載されたとおりに作製されたｉＰＳＣ－ＣＥＣを、レンチウイルス（培地に対して１：１０または１：５０のいずれかの容積比において添加された）で、選択された転写因子アイソフォームについて、分化のｄ１０において形質導入した。ＰＩＴＸ２（Ｐ）：ＮＭ＿００１２０４３９８および／またはＮＭ＿０００３２５、ＦＯＸＣ１（Ｆ）：ＮＭ＿００１４５３、ＴＦＡＰ２Ｂ（Ｔ）：ＮＭ＿００３２２１、ＬＭＸ１Ｂ（Ｌ）：ＮＭ＿００２３１６。ピューロマイシン（Puro）選択は、分化のｄ１２（形質導入の２日後）から行った。ｑＰＣＲ分析は、典型的には、ｉＰＳＣ由来ＣＥＣの分化のｄ２１において行った；しかし、分析は、約ｄ１４～約ｄ２８、例えば、ｄ１４、ｄ１５、ｄ１６、ｄ１７、ｄ１８、ｄ１９、ｄ２０またはｄ２１に行ってもよかった。導入された転写因子（ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１Ｂ）は、添加された転写因子の不在下においてＧＦＰおよびポリブレンで処置された対照細胞と比較して、上方調節された。上方調節は、ピューロマイシンの存在下において、より顕著であった（図２を参照）。
例４：転写因子の導入の後の中期／後期ＣＥＣマーカーの誘導．
上で例１において記載されたとおりに作製されたｉＰＳＣ由来角膜内皮細胞を、例１において記載されるとおりにレンチウイルスで、選択された転写因子アイソフォームについて、分化のｄ１０において形質導入した。ｑＰＣＲ分析は、ｉＰＳＣ由来ＣＥＣの分化のｄ２１において行った；しかし、分析は、約ｄ１４～約ｄ２８に行ってもよかった。未成熟（例えば角膜内皮前駆細胞）および成熟ＣＥＣ上に存在するマーカーであるＣｏｌ８ａ１、および成熟ＣＥＣのマーカーであるＳｌｃ４ａ１１は、添加された転写因子の不在下においてＧＦＰおよびポリブレンで処置された対照細胞と比較して、上方調節され、ピューロマイシンの存在下において、上方調節の増大が起こった（図３）。転写因子の組み合わせにかかわらず、匹敵する上方調節が観察された。ＰＩＴＸ２は、試験された全ての転写因子の組み合わせにおいて含まれた唯一の転写因子であり、このことは、ＰＩＴＸ２が、Ｃｏｌ８ａ１およびＳｌｃ４ａ１１などの中期～後期のＣＥＣマーカーを上方調節してＣＥＣの成熟化を促進するするために、重要な転写因子であったことを示唆する。
例５：増大した転写因子の発現を含む多能性幹細胞由来角膜内皮細胞の機能的および形態学的分析
多能性幹細胞由来角膜内皮前駆細胞は、例１において詳細に記載されるとおり、分化プロセスを用いて作製される。多能性幹細胞由来ＣＥＣは、例１において記載されるとおり、レンチウイルス粒子で、成熟ＣＥＣへ向かう分化の第１０日において形質導入される。細胞は、その後、例１において記載されるとおり、１０日間にわたり成熟化培地中で培養される。細胞は、細胞培養の第１４日および第２１日において、および任意に第２８日において採取される。ポンプ機能、バリア機能および酸化ストレスに対する耐性についての機能的活性アッセイは、本明細書において記載されるとおり、当該分野において公知の方法に従って行われる。
ＣＥＣ（例えば成熟ＣＥＣ）のポンプ機能は、当該分野において公知の方法により、例えばMimuara et al., 2004 Investigative Opthamology and Visual Science, 45:9, pp. 2992-2997において記載されるとおり、評価することができる。各々が本発明の転写因子を発現する、多能性幹細胞または角膜内皮前駆細胞から誘導される成熟ＣＥＣにおける、ポンプ機能の変化を決定するために、ポンプ機能を、培養された初代ＣＥＣ（例えば、ヒト）、未修飾の角膜内皮前駆細胞、および／または未分化の細胞（多能性幹細胞、神経堤幹細胞など）と比較する。ウアバイン（Ｎａ／Ｋ ＡＴＰａｓｅ阻害剤）の添加は、ポンプ機能を除去し、ポンプ機能の存在／不在の評価を可能にするであろう。
成熟ＣＥＣはまた、酸化ストレスに対する耐性のレベルにより、特徴づけることができる。酸化ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷のレベルは、以下のうちの１つ以上の量を測定することにより検出し得る：核ＤＮＡ損傷巣（damage foci）；ｐ２１Ｃｉｐ１の発現のレベル。ｐ１６ＩＮＫ４ａの発現のレベル；サイトグロビンタンパク質の発現のレベル、ＧＰＸ－１タンパク質の発現のレベル、および８－ヒドロキシ－２－デオキシグアノシン（８－ＯＨｄＧ）のレベル。
酸化ストレスに対する耐性はまた、酸化ストレス経路遺伝子（ＮＲＦ２、ＮＯＳ２など）の発現のレベルを決定するためのｑＰＣＲにより、ならびにニトロチロシンおよびCellRox（酸化ストレス検出のためのCellROX（商標）Reagent Variety Pack（Thermofisher、C1044）などのＲＯＳの生体マーカーを用いて細胞における反応性酸素種（ＲＯＳ）レベルを測定することにより、測定される。酸化ストレスに対する応答は、例えばGuha et al. 2017, Nature Scientific Reports, 4:4074（DOI:10.1038/s41598-017-03654-4）において記載されるとおりの、当該分野において公知の方法により評価される。各々が本発明の転写因子を発現する、多能性幹細胞または角膜内皮前駆細胞から誘導されるＣＥＣ（例えば成熟ＣＥＣ）における、酸化ストレスに対する耐性の変化を決定するために、酸化ストレスに対する耐性のレベルを、培養された初代ＣＥＣ（例えば、ヒト）、未修飾の角膜内皮前駆細胞、および／または未分化の細胞（多能性幹細胞、神経堤幹細胞など）と比較する。
さらに、ＣＥＣ（例えば成熟ＣＥＣ）が、角膜内皮細胞の指標であるマーカー（Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅポンプ、ＺＯ－１およびＫＬＦ１３を含む）を発現するか否かを決定するために、ｑＰＣＲおよび免疫染色による分析を行う。さらに、ＣＥＣ細胞を血管内皮細胞と区別するために、例１において記載されるとおりの方法を用いて作製されたＣＥＣを、血管内皮細胞のマーカーであるｖＷＦおよびＰＥＣＡＭ－１（ＣＤ３１）の発現について分析してもよい（ｑＰＣＲおよび免疫染色によりアッセイされる）。図６において示されるとおり、ｖＷＦおよびＣＤ３１のＲＮＡは、限界量においてのみ存在した。
例１および本明細書において上で記載されるとおりの方法を用いて作製されたＣＥＣは、位相差顕微鏡を用いる観察により、特徴的なＣＥＣ形態学（六角形または多角形の形状および互いに対する緊密な接着）について分析される。
例６：成熟ＣＥＣのin vivoでの効力
例は、移植されたＰＳＣ由来成熟角膜内皮細胞のin vivoでの効力を確立するための実験を記載する。ＧＭＰに準拠した臨床製造施設において、臨床グレードの成熟多能性幹細胞由来角膜内皮細胞を作製する。成熟ＣＥＣを、移植のための成熟ＣＥＣ懸濁液の最終的なリリースの前に、厳格な検査および品質管理に供する。成熟ＣＥＣの各々のロットは、無菌性、マイコプラズマの存在、エンドトキシンの存在、多能性幹細胞の不在、および核型分析についての試験を含む、一連の品質管理安全性試験を経験する。ＣＥＣと一致するＤＮＡフィンガープリンティング、適切な内皮形態学、およびマーカー発現により、同一性を確認する。特異的タンパク質を含む成熟ＣＥＣマーカー（Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅポンプ、ＺＯ－１およびＫＬＦ１３を含む）の、許容し得るレベルおよび分布についての免疫組織化学染色により、純度を決定する。加えて、各々のロットは、有効な仕様書に従って、ｈＥＳＣマーカー（ＯＣＴ－４、ＮＡＮＯＧ、およびＳＯＸ２）の下方調節、および成熟細胞マーカー遺伝子、例えば、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＭＲＧＰＲＸ３の上方調節を示す、ｑＲＴ－ＰＣＲにより特徴づけられる。
本明細書において記載される方法に従って生成された成熟角膜内皮細胞は、例えばヒトの使用のための潜在的な安全性および／または効力を確立するために、非ヒト動物モデルにおいて用いられる。細胞の医薬組成物は、ＣＥＣの機能を評価する非ヒト動物モデルにおいて用いられる。好適な動物モデルとして、ウサギＣＥＣ擦過モデル（Okumura et al., Am. J. Pathol., 2012, 181(1): 268-277）またはサルＣＥＣ擦過モデル（Okumura et al, 2016, Scientific Reports, 6:26113, DOI: 10.1038/srep26113）が挙げられる。本発明のために有用なさらなるモデルとして、フックス角膜内皮ジストロフィーのＬ４５０ＷおよびＱ４５５Ｋ Ｃｏｌ８ａ２ノックインマウスモデル（Meng et al., 2013, Invest. Opthamol. Vis. Sci. 54(3):1887-189）およびマウスＳＬＣ４Ａ１１ノックアウトモデル（Groger et al. 2010, J. Biol. Chem., 285(19): 14467）などの、げっ歯類モデルが挙げられる。
細胞（例えば、シートまたは懸濁液）は、非ヒト動物の眼に外科的に投与されてもよい。細胞はまた、球状体の形態におけるものであってもよく、球状体として投与されるものであってもよい。例えば、成熟ＣＥＣ組成物は、Honda et al., Arch Ophthalmol. 2009 October; 127(10):1321-6；Hitani et al., Mol Vis. 2008 Jan. 3; 14:1-9；Mimura et al.,（Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005; 46:3637-3644；Hsuie et al., Transplantation 2006; 81: 473-476；Lai et al., Transplantation 2007; 84: 1222-1232；Shimmura et al., Br J Ophthalmol 2005; 89:134-137；Chen et al., Molecular Vision 2011; 17:2148-2156；およびGospodrowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 76, No. 1, pp. 464-468, January 1979の１つ以上において記載されるとおりのウサギモデルにおいて用いてもよく；ならびに／または、上記およびHayashi et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, July 2009, Vol. 50, No. 7, pg. 3151-3158；Mimura et al., Experimental Eye Research 79 (2004) 231-237；Tchah, J Korean Med Sci. 1992 December; 7(4):337-42において記載されるとおりのげっ歯類（例えば、マウス／ラット）モデルにおいて用いてもよく；ならびに／または、Koizumi et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007; 48:4519-4526）；Koizumi et al., Cornea 2008; 27(Suppl. 1):S48-S55において記載されるとおりの非ヒト霊長類モデルにおいて；ならびに／または、Peh et al., Transplantation. 2011 Apr. 27; 91(8):811-9において記載されるとおり、ヒトもしくは非ヒトにおいて用いてもよい。各々の前述の刊行物は、本明細書においてその全体において参考として援用される。
外科的に投与された、検出可能なマーカータンパク質、例えばＧＦＰを発現するように形質導入されている成熟ヒトＣＥＣの、in vivoでの効力を、レシピエント角膜上への生着について、例えばＧＦＰの発現を確認すること、およびヒト核マーカーについて免疫染色することにより、評価する。ドナー成熟ＣＥＣを、タイトジャンクション形成の機能的マーカー、例えばＺＯ－１について、生着の後で評価する。成熟ＣＥＣの投与の後の角膜の厚みは、当該分野において公知の方法により、例えば超音波パキメーター（SP-3000；Tomey, Nagoya, Japan）を用いて、評価することができる（Xia et al. Investigative Opthamology and Visual Scienceを参照）。ポンプ機能は、ポンプ機能のマーカー、例えば、ＳＬＣ４Ａ１１、ＮＡ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅおよびＳＬＣ４Ａ４の検出により、評価することができる。角膜内皮細胞（例えば、成熟角膜内皮細胞）において発現し得る、ポンプ機能と関連するさらなるマーカーとして、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ、ＡＱＰ１、ＣＡ２、ＣＡ４、ＣＡ１２、ＳＣＬ１４Ａ２、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＳＬＣ１６Ａ７、ＣＦＴＲ、ＮＨＥ１、ＡＤＣＹ１０、電位依存性アニオンチャネルＶＤＡＣ２およびＶＤＡＣ３、クロライドチャネルタンパク質ＣＬＣＮ２およびＣＬＣ）が挙げられる。ＣＥＣ（例えば成熟ＣＥＣ）のポンプ機能はまた、例えばMimuara et al., 2004 Investigative Opthamology and Visual Science, 45:9, pp. 2992-2997において記載されるとおりの、当該分野において公知の方法により、評価することができる。
本明細書において記載される方法により生成された成熟角膜内皮細胞は、患者の治療のために、例えば以下のとおりに用いられる：（ｉ）患者は、初めに、免疫抑制処置（例えばステロイド）を受ける；（ｉｉ）患者は、任意に、処置コホート（例えば、各々３人の患者の４つのコホート）に割り当てられる；（ｉｉｉ）段階的に増大する用量の細胞を、コホートに投与する（好ましくは一側性に、すなわち、各々の患者の眼のうちの一方に）。各々の患者の臨床経過を、移植後に、例えば移植後の初めの６週間にわたり、および任意にさらなる（事前または事後の）時点において、好ましくは少なくとも１年間にわたり、モニタリングする。患者の主な評価は、有害事象（ＡＥ）および用量制限毒性（ＤＴＬ）についてのモニタリングを含み、これは、免疫により媒介される病態学、奇形腫の形成、および／または異常な血管増殖の検出のためのアッセイを含む。患者は、眼内圧（ＩＯＰ）、視力、および／または移植片の内皮細胞カウントに関する効力を含む二次エンドポイントについてさらに評価される。好ましくは、長期の影響を評価するために、１５年間またはそれより長くまでの長期の追跡調査を続ける。最初の患者コホートから満足な安全性のデータが得られた場合には、さらなる患者の一側性または両側性の処置が行われる。加えて、最初の一側性のコホートにおける患者は、先に処置されなかった角膜における治療を受ける機会を提供されてもよい。

Claims (224)

  1. 角膜内皮細胞を作製する方法であって、角膜内皮前駆細胞において、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の発現を増大させ、それにより、角膜内皮細胞を作製することを含む、前記方法。
  2. 角膜内皮細胞が、成熟角膜内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 転写因子が、ＰＩＴＸ２である、請求項１または２に記載の方法。
  4. ＰＩＴＸ２が、ＰＩＴＸ２、アイソフォーム１、ＰＩＴＸ２、アイソフォーム２、ＰＩＴＸ２、アイソフォーム３、ＰＩＴＸ２、アイソフォーム４、およびＰＩＴＸ２、アイソフォーム５からなる群より選択されるＰＩＴＸ２の少なくとも１つのアイソフォームである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 転写因子が、ＦＯＸＣ１である、請求項１または２に記載の方法。
  6. 転写因子が、ＴＦＡＰ２Ｂである、請求項１または２に記載の方法。
  7. ＴＦＡＰ２Ｂが、ＴＦＡＰ２Ｂ、アイソフォーム１、およびＴＦＡＰ２Ｂ、アイソフォーム２からなる群より選択されるＴＦＡＰ２Ｂの少なくとも１つのアイソフォームである、請求項１、２または６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 転写因子が、ＬＭＸ１Ｂである、請求項１または２に記載の方法。
  9. ＬＭＸ１Ｂが、ＬＭＸ１Ｂ、アイソフォーム１、ＬＭＸ１Ｂ、アイソフォーム２、およびＬＭＸ１Ｂ、アイソフォーム３からなる群より選択されるＬＭＸ１Ｂの少なくとも１つのアイソフォームである、請求項１、２または８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 転写因子が、ＰＯＵ６Ｆ２である、請求項１または２に記載の方法。
  11. ＰＯＵ６Ｆ２が、ＰＯＵ６Ｆ２、アイソフォーム１、およびＰＯＵ６Ｆ２、アイソフォーム２からなる群より選択されるＰＯＵ６Ｆ２の少なくとも１つのアイソフォームである、請求項１、２または９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 角膜内皮前駆細胞において、ＡＴＦ４、ＡＴＭＩＮ、ＢＨＬＨＥ４０、ＣＥＢＰＤ、ＣＳＲＮＰ１、ＤＲＡＰ１、ＥＧＲ１、ＥＬＦ２、ＥＭＸ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＳ２、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ２、ＧＴＦ３Ａ、ＨＩＦ１Ａ、ＪＵＮ、ＪＵＮ Ｂ、ＪＵＮ Ｄ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ９、ＭＢＤ３、ＮＦＥ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ４Ａ１、ＰＡ２Ｇ４、ＰＯＵ３Ｆ３、ＲＥＬＡ、ＴＢＸ２、ＴＦＤＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＵＳＦ２、ＹＢＸ１、ＺＮＦ２０７、ＺＮＦ３５８、およびＺＮＦ３９５からなる群から選択される１つ以上の転写因子の発現を増大させることをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞を少なくとも１つの転写因子と接触させることを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 角膜内皮前駆細胞が、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
  16. 発現ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
  17. 発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項１４に記載の方法。
  18. 発現ベクターが、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. プロモーターが、内在性プロモーターである、請求項１８に記載の方法。
  20. プロモーターが、人工プロモーターである、請求項１８に記載の方法。
  21. プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることが、少なくとも１つの転写因子をコードするウイルスベクターによる角膜内皮前駆細胞の形質導入を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  23. 角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることが、少なくとも１つの転写因子をコードする発現ベクターによる角膜内皮前駆細胞のトランスフェクションを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  24. 少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、角膜内皮前駆細胞が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２日間にわたり培養される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 少なくとも１つの転写因子の発現を増大させた後に、角膜内皮前駆細胞が、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間にわたり培養される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. ＰＩＴＸ２の発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項１～４または１２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. ＦＯＸＣ１の発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項１、２、５または１２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  28. ＴＦＡＰ２Ｂの発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項１、２、６、７または１２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  29. ＬＭＸ１Ｂの発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項１、２、８、９または１２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  30. ＰＯＵ６Ｆ２の発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項１、２、１０、１１または１２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  31. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＭＲＧＰＲＸ３からなる群より選択される１つ以上のマーカーの増大した発現を示す、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２ＢおよびＬＭＸ１Ｂからなる群より選択される１つ以上のマーカーの増大した発現を示す、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＳＬＣ４Ａ１１およびＭＲＧＰＲＸ３からなる群より選択される１つ以上のマーカーの増大した発現を示す、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. １つ以上のマーカーの増大した発現が、角膜内皮前駆細胞と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、２，０００倍、５，０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、ＮＧＦＲ、ＳＯＸ１０、ＨＮＫ１、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ｖＷＦおよび／またはＣＤ３１の低下した発現を示す、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. ＮＧＦＲ、ＳＯＸ１０、ＨＮＫ１、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ｖＷＦおよび／またはＣＤ３１の低下した発現が、角膜内皮前駆細胞と比較して少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、または４倍の低下を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、増大したポンプ機能、タイトジャンクションの形成の増強、酸化ストレスへの耐性の増大、および多角形形態の増大のうちの１つ以上を示す、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 増大したポンプ機能、タイトジャンクションの形成の増強、酸化ストレスへの耐性の増大および多角形形態の増大が、角膜内皮前駆細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２５％の増大を含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞のトランスクリプトームを、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％、角膜内皮細胞のトランスクリプトームへとシフトさせる、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 角膜内皮前駆細胞が、多能性幹細胞から誘導される、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 多能性幹細胞が、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞である、請求項４０に記載の方法。
  42. 角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を誘導することが、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトの使用を含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 遺伝子スイッチコンストラクトが、転写遺伝子スイッチコンストラクトである、請求項４２に記載の方法。
  44. 遺伝子スイッチコンストラクトが、転写後遺伝子スイッチコンストラクトである、請求項４３に記載の方法。
  45. 多能性幹細胞由来の角膜内皮細胞を作製する方法であって：
    （ａ）多能性幹細胞を培養することおよび角膜内皮前駆細胞の形成を誘導すること、ここで、多能性幹細胞は、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、ならびに
    （ｂ）角膜内皮前駆細胞において、発現ベクターからの少なくとも１つの転写因子の発現を増大させ、それにより、角膜内皮細胞を作製すること
    を含む、前記方法。
  46. 角膜内皮細胞が、成熟角膜内皮細胞である、請求項４５に記載の方法。
  47. 多能性幹細胞が、胚性幹細胞である、請求項４５に記載の方法。
  48. 多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、請求項４５に記載の方法。
  49. 転写因子が、ＰＩＴＸ２である、請求項４５または４６に記載の方法。
  50. ＰＩＴＸ２が、ＰＩＴＸ２、アイソフォーム１、ＰＩＴＸ２、アイソフォーム２、ＰＩＴＸ２、アイソフォーム３、ＰＩＴＸ２、アイソフォーム４、およびＰＩＴＸ２、アイソフォーム５からなる群より選択されるＰＩＴＸ２の少なくとも１つのアイソフォームである、請求項４５、４６または４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 転写因子が、ＦＯＸＣ１である、請求項４５または４６に記載の方法。
  52. 転写因子が、ＴＦＡＰ２Ｂである、請求項４５または４６に記載の方法。
  53. ＴＦＡＰ２Ｂが、ＴＦＡＰ２Ｂ、アイソフォーム１、およびＴＦＡＰ２Ｂ、アイソフォーム２からなる群より選択されるＴＦＡＰ２Ｂの少なくとも１つのアイソフォームである、請求項４５、４６または５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 転写因子が、ＬＭＸ１Ｂである、請求項４５または４６に記載の方法。
  55. ＬＭＸ１Ｂが、ＬＭＸ１Ｂ、アイソフォーム１、ＬＭＸ１Ｂ、アイソフォーム２、およびＬＭＸ１Ｂ、アイソフォーム３からなる群より選択されるＬＭＸ１Ｂの少なくとも１つのアイソフォームである、請求項４５、４６または５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 転写因子が、ＰＯＵ６Ｆ２である、請求項４５または４６に記載の方法。
  57. ＰＯＵ６Ｆ２が、ＰＯＵ６Ｆ２、アイソフォーム１、およびＰＯＵ６Ｆ２、アイソフォーム２からなる群より選択されるＰＯＵ６Ｆ２の少なくとも１つのアイソフォームである、請求項４５、４６または５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. ＥＲＧ、ＡＴＦ４、ＡＴＭＩＮ、ＢＨＬＨＥ４０、ＣＥＢＰＤ、ＣＳＲＮＰ１、ＤＲＡＰ１、ＥＧＲ１、ＥＬＦ２、ＥＭＸ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＳ２、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ２、ＧＴＦ３Ａ、ＨＩＦ１Ａ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ９、ＭＢＤ３、ＮＦＥ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ４Ａ１、ＰＡ２Ｇ４、ＰＯＵ３Ｆ３、ＲＥＬＡ、ＴＢＸ２、ＴＦＤＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＵＳＦ２、ＹＢＸ１、ＺＮＦ２０７、ＺＮＦ３５８、およびＺＮＦ３９５からなる群より選択される１つ以上の転写因子の発現を増大させることをさらに含む、請求項４５～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 発現ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。
  61. 発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項４５～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 発現ベクターが、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項４５～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. プロモーターが、内在性プロモーターである、請求項６２に記載の方法。
  64. プロモーターが、人工プロモーターである、請求項６２に記載の方法。
  65. プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項６２～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を誘導することを含む、請求項４５～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 角膜内皮前駆細胞において少なくとも１つの転写因子の発現を誘導することが、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトの使用を含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 遺伝子スイッチコンストラクトが、転写遺伝子スイッチコンストラクトである、請求項６７に記載の方法。
  69. 遺伝子スイッチコンストラクトが、転写後遺伝子スイッチコンストラクトである、請求項６７に記載の方法。
  70. 多能性幹細胞が、少なくとも１つの転写因子をコードするウイルスベクターで形質導入される、請求項４５～５９および６１～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 多能性幹細胞が、少なくとも１つの転写因子をコードする発現ベクターでトランスフェクトされる、請求項４５～５８および６０～６９のいずれか一項に記載の方法。
  72. ステップ（ａ）が、多能性幹細胞をスモール／マザーズアゲインストデカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と共に培養して、多能性幹細胞の角膜内皮前駆細胞への分化を誘導することを含む、請求項４５のいずれか一項に記載の方法。
  73. 少なくとも１つの転写因子の発現を増大させる前に、角膜内皮前駆細胞が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２日間にわたり培養される、請求項４２～６８のいずれか一項に記載の方法。
  74. 少なくとも１つの転写因子の発現を増大させた後に、角膜内皮前駆細胞が、少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間にわたり培養される、請求項４５～７２のいずれか一項に記載の方法。
  75. ＰＩＴＸ２の発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項４５～５０および５８～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. ＦＯＸＣ１の発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項４５～４８、５１および５８～７４のいずれか一項に記載の方法。
  77. ＴＦＡＰ２Ｂの発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項４５～４８、５２、５３および５８～７４のいずれか一項に記載の方法。
  78. ＬＭＸ１Ｂの発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項４５～４８、５４、５５および５８～７４のいずれか一項に記載の方法。
  79. ＰＯＵ６Ｆ２の発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞におけるＰＯＵ６Ｆ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項４５～４８および５６～７４のいずれか一項に記載の方法。
  80. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＭＲＧＰＲＸ３からなる群より選択される１つ以上のマーカーの増大した発現を示す、請求項４５～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２ＢおよびＬＭＸ１Ｂからなる群より選択される１つ以上のマーカーの増大した発現を示す、請求項４５～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＳＬＣ４Ａ１１およびＭＲＧＰＲＸ３からなる群より選択される１つ以上のマーカーの増大した発現を示す、請求項４５～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. マーカーのうちの１つ以上の増大した発現が、角膜内皮前駆細胞と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、２，０００倍、５，０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、ＮＧＦＲ、ＳＯＸ１０、ＨＮＫ１、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ｖＷＦおよび／またはＣＤ３１の低下した発現を示す、請求項４５～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. ＮＧＦＲ、ＳＯＸ１０、ＨＮＫ１、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ｖＷＦおよび／またはＣＤ３１の低下した発現が、角膜内皮前駆細胞と比較して少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、または４倍の低下を含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、増大したポンプ機能、タイトジャンクションの形成の増強、酸化ストレスへの耐性の増大、および多角形形態の増大のうちの１つ以上を示す、請求項４５～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 増大したポンプ機能、タイトジャンクションの形成の増強、酸化ストレスへの耐性の増大、および多角形形態の増大が、角膜内皮前駆細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２５％の増大を含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることが、角膜内皮前駆細胞のトランスクリプトームを、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％、角膜内皮細胞のトランスクリプトームへとシフトさせる、請求項４５～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 請求項４５～８８のいずれか一項に記載の方法により作製された、角膜内皮細胞の集団。
  90. 請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法により作製された角膜内皮細胞の集団、および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
  91. 角膜内皮細胞の集団であって、該角膜内皮細胞の集団において、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子の、転写因子の内因的発現レベルと比較して増大した発現レベルを含む、前記角膜内皮細胞の集団。
  92. 角膜内皮細胞が、成熟角膜内皮細胞である、請求項９１に記載の角膜内皮細胞の集団。
  93. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＭＲＧＰＲＸ３からなる群より選択される１つ以上のマーカーの増大した発現を示す、請求項９１または９２に記載の角膜内皮細胞の集団。
  94. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、ＰＩＴＸ２、ＳＬＣ４Ａ１１、ＦＯＸＣ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＴＦＡＰ２ＢおよびＬＭＸ１Ｂからなる群より選択される１つ以上のマーカーの増大した発現を示す、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  95. 角膜内皮細胞が、角膜内皮前駆細胞と比較して、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＳＬＣ４Ａ１１およびＭＲＧＰＲＸ３からなる群より選択される１つ以上のマーカーの増大した発現を示す、請求項９１～９４のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  96. 増大した発現が、少なくとも１つの転写因子の外因的発現を含む、請求項９１～９５のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  97. 角膜内皮細胞が、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、請求項９１～９６のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  98. 発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項９７に記載の角膜内皮細胞の集団。
  99. ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターからなる群より選択される、請求項９８に記載の角膜内皮細胞の集団。
  100. 発現ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項９７に記載の角膜内皮細胞の集団。
  101. 非ウイルスベクターが、プラスミドＤＮＡ、直鎖状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、直鎖状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ナノプラスミド、ミニサークルＤＮＡ、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、ＤＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、および二本鎖ｍＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）からなる群より選択される、請求項１００に記載の角膜内皮細胞の集団。
  102. 非ウイルスベクターが、ネイキッド核酸、リポソーム、デンドリマー、ナノ粒子、脂質－ポリマー系、固体脂質ナノ粒子、および／またはリポソームプロタミン／ＤＮＡリポプレックス（ＬＰＤ）を含む、請求項１００または１０１に記載の角膜内皮細胞の集団。
  103. 発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項９７に記載の角膜内皮細胞の集団。
  104. 発現ベクターが、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項９７～１０３のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  105. プロモーターが、内在性プロモーターである、請求項１０４に記載の角膜内皮細胞の集団。
  106. プロモーターが、人工プロモーターである、請求項１０４に記載の角膜内皮細胞の集団。
  107. プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  108. 転写因子が、ＰＩＴＸ２である、請求項９１～１０７のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  109. ＰＩＴＸ２の増大した発現が、角膜内皮細胞の集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項１０８に記載の角膜内皮細胞の集団。
  110. 転写因子が、ＦＯＸＣ１である、請求項９１～１０７のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  111. ＦＯＸＣ１の増大した発現が、角膜内皮細胞の集団におけるＦＯＸＣ１の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項１１０に記載の角膜内皮細胞の集団。
  112. 転写因子が、ＴＦＡＰ２Ｂである、請求項９１～１０７のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  113. ＴＦＡＰ２Ｂの増大した発現が、角膜内皮細胞の集団におけるＴＦＡＰ２Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項１１２に記載の角膜内皮細胞の集団。
  114. 転写因子が、ＬＭＸ１Ｂである、請求項９１～１０７のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  115. ＬＭＸ１Ｂの増大した発現が、角膜内皮細胞の集団におけるＬＭＸ１Ｂの内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項１１４に記載の角膜内皮細胞の集団。
  116. 転写因子が、ＰＯＵ６Ｆ２である、請求項９１～１０７のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  117. ＰＯＵ６Ｆ２の増大した発現が、角膜内皮細胞の集団におけるＰＩＴＸ２の内因的発現レベルと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍の増大を含む、請求項１１６に記載の角膜内皮細胞の集団。
  118. 角膜内皮細胞の集団が、成熟角膜内皮細胞の集団である、請求項９１～１１７のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  119. 角膜内皮細胞が、多能性幹細胞から誘導される、請求項９１～１１７のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  120. 多能性幹細胞が、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞である、請求項１１９に記載の角膜内皮細胞の集団。
  121. 角膜内皮細胞の集団が、少なくとも１０６個の角膜内皮細胞を含む、請求項９１～１２０のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団。
  122. ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、多能性幹細胞。
  123. 発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  124. 発現ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  125. 発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  126. 発現ベクターが、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１２２～１２５のいずれか一項に記載の多能性幹細胞。
  127. プロモーターが、内在性プロモーターである、請求項１２６に記載の多能性幹細胞。
  128. プロモーターが、人工プロモーターである、請求項１２６に記載の多能性幹細胞。
  129. プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１２６～１２８のいずれか一項に記載の多能性幹細胞。
  130. 多能性幹細胞が、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトを含む、請求項１２２～１２９のいずれか一項に記載の多能性幹細胞。
  131. 遺伝子スイッチコンストラクトが、転写遺伝子スイッチコンストラクトである、請求項１３０に記載の角膜内皮細胞の多能性幹細胞。
  132. 遺伝子スイッチコンストラクトが、転写後遺伝子スイッチコンストラクトである、請求項１３０に記載の多能性幹細胞。
  133. ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、角膜内皮細胞。
  134. 角膜内皮細胞が、成熟角膜内皮細胞である、請求項１３３に記載の角膜内皮細胞。
  135. 発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１３３または１３４のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞。
  136. 発現ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項１３３または１３４のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞。
  137. 発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項１３３または１３４のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞。
  138. 発現ベクターが、少なくとも１つの転写因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１３３～１３７のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞。
  139. プロモーターが、内在性プロモーターである、請求項１３８に記載の角膜内皮細胞。
  140. プロモーターが、人工プロモーターである、請求項１３８に記載の角膜内皮細胞。
  141. プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１３８～１４０のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞。
  142. 多能性幹細胞が、少なくとも１つの転写因子をコードする遺伝子スイッチコンストラクトを含む、請求項１３３～１４１のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞。
  143. 遺伝子スイッチコンストラクトが、転写遺伝子スイッチコンストラクトである、請求項１４２に記載の角膜内皮細胞のうちの角膜内皮細胞。
  144. 遺伝子スイッチコンストラクトが、転写後遺伝子スイッチコンストラクトである、請求項１４２に記載の角膜内皮細胞。
  145. 請求項８９に記載の角膜内皮細胞の集団、請求項９１～１２１のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団または請求項１３３～１４４のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞、および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
  146. 疾患を処置することを必要とする対象において疾患を処置する方法であって、対象に、請求項８９に記載の角膜内皮細胞の集団、請求項９１～１２１のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団、請求項１３３～１４４のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞、または請求項１４５に記載の医薬組成物の有効量を投与することにより、対象において疾患を処置することを含む、前記方法。
  147. 疾患が、フックスジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、後部多形性ジストロフィー、先天性遺伝性内皮ジストロフィー、角膜ジストロフィー、および角膜移植における遅発型内皮不全からなる群より選択される、請求項１４４に記載の方法。
  148. 処置を必要とする対象を処置する方法であって、ここで、対象は、水疱性角膜症をもたらす角膜浮腫の症状を示すか、ここで、対象は、コンタクトレンズの使用または白内障手術に起因する眼球の損傷を有するか、またはここで、対象は、持続する手術による外傷を有し、前記方法は、対象に、請求項８９に記載の成熟角膜内皮細胞の集団、請求項９２～１２１のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団、請求項１３３～１４４のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞、または請求項１４５に記載の医薬組成物の有効量を投与することにより、対象において疾患を処置することを含む、前記方法。
  149. 請求項８９に記載の成熟角膜内皮細胞の集団、請求項９１～１２１のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞の集団、請求項１３３～１４４のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞、または請求項１４５に記載の医薬組成物を含む、キット。
  150. ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、キット。
  151. ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群から選択される少なくとも１つの転写因子を含む、キット。
  152. 発現ベクターが、自己切断配列を含む、請求項１４に記載の方法。
  153. 発現ベクターが、自己切断配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  154. 多能性幹細胞由来の角膜内皮細胞を作製する方法であって：
    （ａ）多能性幹細胞を培養することおよび神経堤幹細胞の形成を誘導すること、ここで、多能性幹細胞は、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＬＭＸ１ＢおよびＰＯＵ６Ｆ２からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、ならびに、
    （ｂ）神経堤幹細胞において、発現ベクターからの少なくとも１つの転写因子の発現を増大させることにより、角膜内皮細胞を作製すること
    を含む、前記方法。
  155. ＰＩＴＸ２が、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  156. ＦＯＸＣ１が、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  157. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  158. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  159. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  160. ＰＩＴＸ２が、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  161. ＦＯＸＣ１が、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  162. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  163. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  164. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  165. ＰＩＴＸ２が、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の集団。
  166. ＦＯＸＣ１が、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の集団。
  167. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の集団。
  168. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の集団。
  169. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の集団。
  170. ＰＩＴＸ２が、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  171. ＦＯＸＣ１が、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  172. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  173. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  174. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  175. ＰＩＴＸ２が、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３３に記載の角膜内皮細胞。
  176. ＦＯＸＣ１が、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３３に記載の角膜内皮細胞。
  177. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３３に記載の角膜内皮細胞。
  178. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３３に記載の角膜内皮細胞。
  179. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３３に記載の角膜内皮細胞。
  180. ＰＩＴＸ２が、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５０に記載のキット。
  181. ＦＯＸＣ１が、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５０に記載のキット。
  182. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５０に記載のキット。
  183. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５０に記載のキット。
  184. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５０に記載のキット。
  185. ＰＩＴＸ２が、配列番号１～配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５４に記載の方法。
  186. ＦＯＸＣ１が、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５４に記載の方法。
  187. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５４に記載の方法。
  188. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号９～配列番号１１のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５４に記載の方法。
  189. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号１２～配列番号１３のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５４に記載の方法。
  190. ＰＩＴＸ２が、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  191. ＦＯＸＣ１が、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  192. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  193. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  194. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  195. ＰＩＴＸ２が、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  196. ＦＯＸＣ１が、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  197. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  198. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  199. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  200. ＰＩＴＸ２が、配列番号５１または配列番号５２において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の集団。
  201. ＦＯＸＣ１が、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の集団。
  202. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の集団。
  203. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の集団。
  204. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の集団。
  205. ＰＩＴＸ２が、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  206. ＦＯＸＣ１が、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  207. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  208. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  209. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２２に記載の多能性幹細胞。
  210. ＰＩＴＸ２が、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３３に記載の角膜内皮細胞。
  211. ＦＯＸＣ１が、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３３に記載の角膜内皮細胞。
  212. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３３に記載の角膜内皮細胞。
  213. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３３に記載の角膜内皮細胞。
  214. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３３に記載の角膜内皮細胞。
  215. ＰＩＴＸ２が、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５０に記載のキット。
  216. ＦＯＸＣ１が、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５０に記載のキット。
  217. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５０に記載のキット。
  218. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５０に記載のキット。
  219. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５０に記載のキット。
  220. ＰＩＴＸ２が、配列番号５１～配列番号５３において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５４に記載の方法。
  221. ＦＯＸＣ１が、配列番号５４において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５４に記載の方法。
  222. ＴＦＡＰ２Ｂが、配列番号５５において記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５４に記載の方法。
  223. ＬＭＸ１Ｂが、配列番号５６～配列番号５８において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５４に記載の方法。
  224. ＰＯＵ６Ｆ２が、配列番号５９または配列番号６０において記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５４に記載の方法。
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