JP2024517810A - 不整脈を抑制するための電気生理学的改変 - Google Patents

不整脈を抑制するための電気生理学的改変 Download PDF

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Abstract

心血管疾患または障害の処置に関連する組成物および方法が本明細書に記載されている。細胞、幹細胞（胚性および多能性幹細胞を含む）およびインビトロで分化したヒト心筋細胞も、本明細書に記載されており、ここで、そのような細胞においてHCN4（HCN4）、Cav3.2（CACNA1H）およびNCX1（SLC8A1）活性が少なくとも部分的に阻害され、Kir2.1（KCNJ2）活性が少なくとも部分的に刺激される。例えば疾患または障害の処置または予防のための、そのような細胞の送達のためのおよび心筋細胞を移植する方法も本明細書に記載されている。TIFF2024517810000020.tif69170

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2021年12月21日に出願された米国仮出願第63/292,046号、2021年6月17日に出願された米国仮出願第63/211,843号および2021年5月3日に出願された米国仮出願第63/183,528号の米国特許法第119条（e）の下での恩典を主張し、これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
技術分野
本明細書に記載されている技術は、心臓における電気的な乱れを処置および予防し、インビトロで分化した心筋細胞の生着を促進するための組成物および方法ならびにそれらの使用に関する。
背景
心血管疾患は、世界中で男性および女性の両方の主な死因であり続けており、発展途上国への影響が急速に増大している。心筋細胞補充療法は、心血管疾患の処置のための活発な開発の分野であり、心筋梗塞を含むがこれに限定されない損傷後に心機能を回復させることができる。インビトロで培養されたヒト幹細胞は、損傷した心臓内への生着のためのヒト心筋細胞を生産するための出発材料としての役割を果たすことができる。しかしながら、心臓再生のためのヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（hPSC-CM）の使用は、移植後の一時的な不整脈の発生によって妨げられる。心筋細胞補充療法後の患者の転帰を改善するために、心臓移植片によって引き起こされる不整脈を予防および/または処置するための組成物および方法が必要とされている。
概要
本明細書に記載されている技術は、心臓における電気的な乱れを処置および/または予防し、インビトロで分化した心筋細胞の生着を促進する組成物および方法の発見に関する。心臓組織への生着のために投与された心筋細胞のインパルス生成活性を弱めることによって、心拍数および調律における移植物誘発性の乱れが排除または劇的に低下されることが見出された。より具体的には、移植片心筋細胞における電気生理学的機能を調節する一連のイオンチャネルの活性の改変が、移植された心筋細胞によって引き起こされる心拍数および/または調律の電気的な乱れを制限または防止することが発見された。心筋細胞を心臓組織に移植した後、解消するまで数週間続くことがあり得るこれらの乱れは、致命的な結果をもたらすことがあり、本明細書では「移植不整脈（engraftment arrhythmia）」または「EA」と総称され、本明細書の以下でさらに説明される。特定のイオンチャネルの個々の操作、2つごとの操作または3つごとの操作は、移植不整脈に利益がないか、または実際には移植不整脈を悪化させるかのいずれかであったが、イオンチャネルポリペプチドHCN4（遺伝子HCN4によってコードされる）、Cav3.2（遺伝子CACNA1Hによってコードされる）、NCX1（遺伝子SLC8A1によってコードされる）およびKir2.1（遺伝子KCNJ2によってコードされる）の4メンバーの組の操作は、移植不整脈を劇的に改善させるか、または排除することが見出された。より具体的には、KCNJ2（Kir2.1）ポリペプチドの活性化または過剰発現と組み合わされた、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の活性または発現の阻害またはノックアウトは、このような乱れを明確に低減または排除することが見出された。
したがって、一局面において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも部分的に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、インビトロで分化したヒト心筋細胞が本明細書において提供される。
本明細書において提供される別の局面は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現と、内在性HCN4制御配列によって調節される、KCNJ2をコードする導入遺伝子の発現とを含む、インビトロで分化したヒト心筋細胞に関する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は、心筋細胞または他の対照細胞と比較して少なくとも部分的に阻害される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2活性は、心筋細胞または他の対照細胞と比較して少なくとも部分的に刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の少なくとも部分的な阻害は、心筋細胞を1つもしくは複数のインヒビター薬物と接触させることを介した阻害を含み、かつ/または遺伝子操作を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2活性の少なくとも部分的な刺激は、心筋細胞を1つもしくは複数の活性化薬物と接触させることを含み、かつ/または遺伝子操作を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の低下した発現は遺伝子操作によるものである。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2の少なくとも部分的に刺激された活性は遺伝子操作によるものである。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つまたは複数は不活性化される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の各々は不活性化される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は完全に阻害され、KCNJ2活性は少なくとも部分的に刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、前記1つまたは複数のインヒビター薬物、活性化薬物および/または遺伝子操作は、HCN4、CACNA1H、SLC8A1および/またはKCNJ2の発現を変化させない。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない心筋細胞または他の対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性は少なくとも10％または1倍刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作によって操作されていない心筋細胞または他の対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性は少なくとも10％または1倍刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は遺伝子操作によって完全に阻害され、KCNJ2活性は少なくとも部分的に刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、心筋細胞または他の対照細胞は、野生型心筋細胞、初代心筋細胞、PSCもしくはESC由来のインビトロで分化した心筋細胞、または出発材料である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、対照細胞は、1つまたは複数のインヒビター薬物、活性化薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、前記1つまたは複数のインヒビター薬物、活性化薬物および/または遺伝子操作は、HCN4、CACNA1H、SLC8A1および/またはKCNJ2の発現を変化させない。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、対照細胞は、PSCまたはESCに由来するインビトロで分化した心筋細胞であり、対照細胞、PSCまたはESCは、1つ、2つまたは3つの編集を含むが4つ全ては含まず、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は少なくとも部分的に阻害され、KCNJ2活性は少なくとも部分的に刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、PSCはiPSCである。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は遺伝子操作によって少なくとも10％または1倍阻害され、KCNJ2活性は少なくとも10％または1倍刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作方法は遺伝子ノックダウンであり、任意で、遺伝子ノックダウンは、RNAサイレンシングまたは、siRNA、piRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群より任意で選択されるRNAiによるものである。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作方法は遺伝子ノックアウトであり、任意で、遺伝子ノックアウトは、遺伝子編集システムを使用して遺伝子中に挿入または欠失を誘導することによるものであり、遺伝子編集システムは、ZFN、TALEN、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、CRISPR/Casシステム、ニッカーゼシステム、塩基編集システム、プライム編集システム、および遺伝子書き込みシステムからなる群より任意で選択される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の遺伝子ノックアウトは、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の1つまたは複数の対立遺伝子に導入される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の遺伝子ノックアウトは、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の両方の対立遺伝子に導入される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の遺伝子ノックアウトは、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現をもたらす。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化は、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化は、RNA誘導型ヌクレアーゼ、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、RNA誘導型ヌクレアーゼは、Casヌクレアーゼを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトは、RNAi、アンチセンス、またはRNAを標的とするCasヌクレアーゼを介して行われる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトは、CRISPR/Casシステムを使用して行われる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、インビトロで分化した心筋細胞は、少なくとも1つの外因性核酸配列をさらに含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、インビトロで分化した心筋細胞は、少なくとも1つの外因性核酸配列からポリペプチドを発現する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、インビトロで分化した心筋細胞は、少なくとも1つのさらなる遺伝子の低下した発現をさらに含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2は導入遺伝子から過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、導入遺伝子は、HCN4またはCACNA1H発現調節配列によって駆動される外因性KCNJ2コード配列を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、置き換えられたHCN4またはCACNA1Hコード配列が発現されずかつ置き換えられたKCNJ2が内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列の調節下で発現されるように、KCNJ2コード配列がHCN4またはCACNA1Hのコード配列と置き換わる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2コード配列は、CRISPR/Casシステムを使用して置き換えられている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、CRISPR/Casシステムが使用されて、HCN4のコード配列をKCNJ2コード配列で置き換える。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、CRISPR/Casシステムが使用されて、CACNA1Hのコード配列をKCNJ2コード配列で置き換える。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子は不活性化され、KCNJ2ポリペプチドは過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子は、少なくとも1つの対立遺伝子中にインデルを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子は、2つの対立遺伝子中にインデルを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、インビトロで分化したヒト心筋細胞は、HCN4インデル/インデル、CACNA1Hインデル/インデル、およびSCL8A1インデル/インデル細胞である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、インデルは、CRISPR/Casシステムを使用して作成される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは導入遺伝子によってコードされ、内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列に機能的に連結されている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子はCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつKCNJ2ポリペプチドは内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、内在性HCN4制御配列に機能的に連結された導入遺伝子によってコードされている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、HCN4遺伝子座において内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子はCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつKCNJ2ポリペプチドは内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、内在性CACNA1H制御配列に機能的に連結された導入遺伝子によってコードされている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、CACNA1H遺伝子座において内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性は、心筋細胞を薬物と接触させることによって操作され、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性は遺伝子操作される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、心筋細胞は、多能性幹細胞からインビトロで分化している。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC）である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、心筋細胞は、インビトロで分化したヒト心筋細胞が移植される対象に由来するiPSCからインビトロで分化している。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、心筋細胞は、健康な対象に由来するiPSCからインビトロで分化している。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、心筋細胞は出発材料からインビトロで分化している。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、出発材料は、ドナーから収集された初代細胞を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、健康な対象、出発材料、および/またはドナーの各々は、インビトロで分化したヒト心筋細胞が移植される対象と同じ個体に由来しない。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、ドナーから収集された初代細胞は幹細胞である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、幹細胞はESCである。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、出発材料は幹細胞株である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、幹細胞株はESC株またはiPSC株である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、幹細胞株はiPSC株である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、インビトロで分化したヒト心筋細胞は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性の少なくとも部分的な阻害ならびにKCNJ2活性の少なくとも部分的な刺激を含まないインビトロで分化したヒト心筋細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を促進する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、対象は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性の少なくとも部分的な阻害ならびにKCNJ2活性の少なくとも部分的な刺激を含まないインビトロで分化したヒト心筋細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を経験する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、インビトロで分化した心筋細胞は、凍結保存剤と混合されている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、インビトロで分化した心筋細胞は、凍結保存剤と混合されて凍結されている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、インビトロで分化したヒト心筋細胞は、NKX2-5、MYH6、MYL7、TBX5、ATP2a2、RYR2、およびcTnTからなる群より選択される1つまたは複数のマーカーを発現する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞活性および成熟は、電気的成熟度、代謝的成熟度、および収縮的成熟度からなる群より選択される数値パラメータによって決定可能である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、インビトロで分化した心筋細胞の代謝的成熟度は、基準レベルと比較した、
ミトコンドリア機能の増加した活性、増加した脂肪酸代謝、増加した酸素消費速度（OCR）、増加したリン酸化ACCレベルまたは活性、脂肪酸結合タンパク質（FABP）の増加したレベルまたは活性、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ-4（PDK4）の増加したレベルまたは活性、増加したミトコンドリア呼吸能力、増加したミトコンドリア体積、およびミトコンドリアDNAの増加したレベル
からなる群より選択されるマーカーの1つまたは複数によって決定される。
本明細書において提供される別の局面は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現ならびにKCNJ2の増加した発現を含む、多能性幹細胞に関する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の各々についての低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2の増加した発現は、増加したタンパク質発現および/または増加した遺伝子発現を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現と、内在性HCN4制御配列によって調節される、KCNJ2をコードする導入遺伝子の発現とを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の阻害は、心筋細胞を1つもしくは複数のインヒビター薬物と接触させることを介した阻害を含み、かつ/または遺伝子操作を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2活性の刺激は、多能性幹細胞を1つもしくは複数の活性化薬物と接触させることを含み、かつ/または遺伝子操作を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の低下した発現は遺伝子操作によるものである。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つまたは複数は多能性幹細胞において不活性化される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の各々は多能性幹細胞において不活性化される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は完全に阻害され、KCNJ2活性は少なくとも部分的に刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性は少なくとも10％または1倍刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性は少なくとも10％または1倍刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は遺伝子操作によって完全に阻害され、KCNJ2活性は少なくとも部分的に刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、対照細胞は、野生型心筋細胞、初代心筋細胞、PSCもしくはESC由来のインビトロで分化した心筋細胞、または出発材料である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、対照細胞は、PSCまたはESCに由来するインビトロで分化した心筋細胞であり、対照細胞、PSC、ESCは、1つ、2つまたは3つの編集を含むが4つ全ては含まず、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は少なくとも部分的に阻害され、KCNJ2活性は少なくとも部分的に刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は遺伝子操作によって少なくとも10％または1倍阻害され、KCNJ2活性は少なくとも10％または1倍刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作方法は遺伝子ノックダウンであり、任意で、遺伝子ノックダウンは、RNAサイレンシングまたは、siRNA、piRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群より任意で選択されるRNAiによるものである。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作方法は遺伝子ノックアウトであり、任意で、遺伝子ノックアウトは、遺伝子編集システムを使用して遺伝子中に挿入または欠失を誘導することによるものであり、遺伝子編集システムは、ZFN、TALEN、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、CRISPR/Casシステム、ニッカーゼシステム、塩基編集システム、プライム編集システム、および遺伝子書き込みシステムからなる群より任意で選択される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の遺伝子ノックアウトは、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の1つまたは複数の対立遺伝子に導入される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の遺伝子ノックアウトは、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の両方の対立遺伝子に導入される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の遺伝子ノックアウトは、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現をもたらす。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化は、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化は、RNA誘導型ヌクレアーゼ、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、RNA誘導型ヌクレアーゼは、Casヌクレアーゼを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトは、RNAi、アンチセンス、またはRNAを標的とするCasヌクレアーゼを介して行われる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトは、CRISPR/Casシステムを使用して行われる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、少なくとも1つの外因性核酸配列をさらに含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、少なくとも1つの外因性核酸配列からポリペプチドを発現する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、少なくとも1つのさらなる遺伝子の低下した発現をさらに含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2は導入遺伝子から過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、導入遺伝子は、HCN4またはCACNA1H発現調節配列によって駆動される外因性KCNJ2コード配列を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、置き換えられたHCN4またはCACNA1Hコード配列が発現されずかつ置き換えられたKCNJ2が内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列の調節下で発現されるように、KCNJ2コード配列がHCN4またはCACNA1Hのコード配列と置き換わる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2コード配列は、CRISPR/Casシステムを使用して置き換えられている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、CRISPR/Casシステムが使用されて、HCN4のコード配列をKCNJ2コード配列で置き換える。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、CRISPR/Casシステムが使用されて、CACNA1Hのコード配列をKCNJ2コード配列で置き換える。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子は不活性化され、KCNJ2ポリペプチドは過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子は、少なくとも1つの対立遺伝子中にインデルを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子は、2つの対立遺伝子中にインデルを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、HCN4インデル/インデル、CACNA1Hインデル/インデル、およびSCL8Aインデル/インデル細胞である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、インデルは、CRISPR/Casシステムを使用して作成される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは導入遺伝子によってコードされ、内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列に機能的に連結されている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子はCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつKCNJ2ポリペプチドは内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、内在性HCN4制御配列に機能的に連結された導入遺伝子によってコードされている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、HCN4遺伝子座において内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子はCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつKCNJ2ポリペプチドは内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、内在性CACNA1H制御配列に機能的に連結された導入遺伝子によってコードされている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、CACNA1H遺伝子座において内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性は、心筋細胞を薬物と接触させることによって操作され、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性は遺伝子操作される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ESC）である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（iPSC）である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、多能性幹細胞が移植される対象に由来するiPSCに由来する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、健康な対象に由来するiPSCに由来する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、出発材料からインビトロで分化する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、出発材料は、ドナーから収集された初代細胞を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、健康な対象、出発材料、および/またはドナーの各々は、多能性幹細胞が移植される対象と同じ個体に由来しない。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、ドナーから収集された初代細胞は幹細胞である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、幹細胞はESCである。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、出発材料は幹細胞株である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、幹細胞株はESC株またはiPSC株である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、幹細胞株はiPSC株である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、多能性幹細胞は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性の阻害ならびにKCNJ2活性の刺激を含まない多能性幹細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を促進する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、凍結保存剤と混合されている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、凍結保存剤と混合されて凍結されている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞は、NKX2-5、MYH6、MYL7、TBX5、ATP2a2、RYR2、およびcTnTからなる群より選択される1つまたは複数のマーカーを発現する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞の細胞活性および成熟は、電気的成熟度、代謝的成熟度、および収縮的成熟度からなる群より選択される数値パラメータによって決定可能である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞の代謝的成熟度は、基準レベルと比較した、
ミトコンドリア機能の増加した活性、増加した脂肪酸代謝、増加した酸素消費速度（OCR）、増加したリン酸化ACCレベルまたは活性、脂肪酸結合タンパク質（FABP）の増加したレベルまたは活性、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ-4（PDK4）の増加したレベルまたは活性、増加したミトコンドリア呼吸能力、増加したミトコンドリア体積、およびミトコンドリアDNAの増加したレベル
からなる群より選択されるマーカーの1つまたは複数によって決定される。
本明細書において提供される別の局面は、任意の態様において本明細書に記載されている多能性幹細胞を含む細胞バンクに関する。
本明細書において提供される別の局面は、任意の態様において本明細書に記載されている多能性幹細胞に由来するインビトロで分化した心筋細胞に関する。
別の局面において、出発材料と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現ならびにKCNJ2の増加した発現を含む細胞も本明細書において提供される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様において、出発材料は、ドナーから収集された初代細胞を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下したタンパク質発現は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の各々についての低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2の増加した発現は、増加したタンパク質発現および/または増加した遺伝子発現を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現と、内在性HCN4制御配列によって調節される、KCNJ2をコードする導入遺伝子の発現とを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の阻害は、細胞を1つもしくは複数のインヒビター薬物と接触させることを介した阻害を含み、かつ/または遺伝子操作を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2活性の刺激は、細胞を1つもしくは複数の活性化薬物と接触させることを含み、かつ/または遺伝子操作を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の低下した発現は遺伝子操作によるものである。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つまたは複数が、細胞中で不活性化される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の各々が、細胞中で不活性化される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は完全に阻害され、KCNJ2活性は少なくとも部分的に刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性は少なくとも10％または1倍刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性は少なくとも10％または1倍刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は遺伝子操作によって完全に阻害され、KCNJ2活性は少なくとも部分的に刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、対照細胞は、野生型心筋細胞、初代心筋細胞、PSCもしくはESC由来のインビトロで分化した心筋細胞、または出発材料である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、対照細胞は、PSCまたはESCに由来するインビトロで分化した心筋細胞であり、対照細胞、PSC、ESCは、1つ、2つまたは3つの編集を含むが4つ全ては含まず、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は少なくとも部分的に阻害され、KCNJ2活性は少なくとも部分的に刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性は遺伝子操作によって少なくとも10％または1倍阻害され、KCNJ2活性は少なくとも10％または1倍刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作方法は遺伝子ノックダウンであり、任意で、遺伝子ノックダウンは、RNAサイレンシングまたは、siRNA、piRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群より任意で選択されるRNAiによるものである。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子操作方法は遺伝子ノックアウトであり、任意で、遺伝子ノックアウトは、遺伝子編集システムを使用して遺伝子中に挿入または欠失を誘導することによるものであり、遺伝子編集システムは、ZFN、TALEN、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、CRISPR/Casシステム、ニッカーゼシステム、塩基編集システム、プライム編集システム、および遺伝子書き込みシステムからなる群より任意で選択される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の遺伝子ノックアウトは、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の1つまたは複数の対立遺伝子に導入される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の遺伝子ノックアウトは、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の両方の対立遺伝子に導入される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の遺伝子ノックアウトは、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現をもたらす。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化は、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化は、RNA誘導型ヌクレアーゼ、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、RNA誘導型ヌクレアーゼは、Casヌクレアーゼを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトは、RNAi、アンチセンス、またはRNAを標的とするCasヌクレアーゼを介して行われる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトは、CRISPR/Casシステムを使用して行われる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞は、少なくとも1つの外因性核酸配列をさらに含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞は、少なくとも1つの外因性核酸配列からポリペプチドを発現する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞は、少なくとも1つのさらなる遺伝子の低下した発現をさらに含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2は導入遺伝子から過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、導入遺伝子は、HCN4またはCACNA1H発現調節配列によって駆動される外因性KCNJ2コード配列を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、置き換えられたHCN4またはCACNA1Hコード配列が発現されずかつ置き換えられたKCNJ2が内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列の調節下で発現されるように、KCNJ2コード配列がHCN4またはCACNA1Hのコード配列と置き換わる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2コード配列は、CRISPR/Casシステムを使用して置き換えられている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、CRISPR/Casシステムが使用されて、HCN4のコード配列をKCNJ2コード配列で置き換える。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、CRISPR/Casシステムが使用されて、CACNA1Hのコード配列をKCNJ2コード配列で置き換える。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子は不活性化され、KCNJ2ポリペプチドは過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子は、少なくとも1つの対立遺伝子中にインデルを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子は、2つの対立遺伝子中にインデルを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞は、HCN4インデル/インデル、CACNA1Hインデル/インデル、およびSCL8A1インデル/インデル細胞である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、インデルは、CRISPR/Casシステムを使用して作成される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは導入遺伝子によってコードされ、内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列に機能的に連結されている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子はCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつKCNJ2ポリペプチドは内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、内在性HCN4制御配列に機能的に連結された導入遺伝子によってコードされている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、HCN4遺伝子座において内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子はCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつKCNJ2ポリペプチドは内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、内在性CACNA1H制御配列に機能的に連結された導入遺伝子によってコードされている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、CACNA1H遺伝子座において内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性は、細胞を薬物と接触させることによって操作され、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性は遺伝子操作される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞は、多能性幹細胞からインビトロで分化している。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC）である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞は、インビトロで分化したヒト心筋細胞が移植される対象に由来するiPSCからインビトロで分化している。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞は、健康な対象に由来するiPSCからインビトロで分化している。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞は出発材料からインビトロで分化している。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、出発材料は、ドナーから収集された初代細胞を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、健康な対象、出発材料、および/またはドナーの各々は、細胞が移植される対象と同じ個体に由来しない。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、ドナーから収集された初代細胞は幹細胞である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、幹細胞はESCである。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、出発材料は幹細胞株である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、幹細胞株はESC株またはiPSC株である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、幹細胞株はiPSC株である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、細胞は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性の阻害ならびにKCNJ2活性の刺激を含まない細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を促進する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞は、凍結保存剤と混合されている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞は、凍結保存剤と混合されて凍結されている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞は、NKX2-5、MYH6、MYL7、TBX5、ATP2a2、RYR2、およびcTnTからなる群より選択される1つまたは複数のマーカーを発現する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞の細胞活性および成熟は、電気的成熟度、代謝的成熟度、および収縮的成熟度からなる群より選択される数値パラメータによって決定可能である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞の代謝的成熟度は、基準レベルと比較した、
ミトコンドリア機能の増加した活性、増加した脂肪酸代謝、増加した酸素消費速度（OCR）、増加したリン酸化ACCレベルまたは活性、脂肪酸結合タンパク質（FABP）の増加したレベルまたは活性、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ-4（PDK4）の増加したレベルまたは活性、増加したミトコンドリア呼吸能力、増加したミトコンドリア体積、およびミトコンドリアDNAの増加したレベル
からなる群より選択されるマーカーの1つまたは複数によって決定される。
本明細書において提供される別の局面は、任意の態様において本明細書に記載されている細胞を含む細胞バンクに関する。
別の局面において、任意の態様において本明細書に記載されている細胞に由来するインビトロで分化した心筋細胞も本明細書において提供される。
本明細書において提供される別の局面は、任意の態様において本明細書に記載されている出発材料細胞に由来するインビトロで分化した心筋細胞に関する。
本明細書において提供される別の局面は、本明細書に記載されているインビトロで分化したヒト心筋細胞と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様において、薬学的組成物は、細胞外マトリックスまたは足場組成物を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1つのさらなる細胞型をさらに含む。
本明細書において提供される別の局面は、本明細書に記載されている細胞の任意の1つのもしくは本明細書に記載されている細胞の任意の1つに由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞または本明細書に記載されている薬学的組成物を含む移植組成物に関する。
本明細書において提供される別の局面は、本明細書に記載されている薬学的組成物または移植組成物を含む心臓送達装置またはシステムに関する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様において、心臓送達装置は、薬学的組成物または移植組成物を含むシリンジを備える。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、心臓送達装置は、薬学的組成物または移植組成物の通過に十分な管腔を備える針を備える。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、針はシリンジと流体連通している。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、心臓送達装置は心臓カテーテルをさらに備える。
本明細書において提供される別の局面は、薬学的組成物を調製する方法であって、心筋細胞の単離された集団において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の活性を阻害しかつKCNJ2の活性を刺激する工程を含む、方法に関する。
本明細書において提供される別の局面は、薬学的組成物を調製する方法であって、PSCの集団において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の活性を阻害しかつKCNJ2の活性を刺激する工程と、PSCの該集団をインビトロで心筋細胞に分化させる工程とを含む、方法に関する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様において、PSCは、本明細書に記載されている任意の態様に従って改変される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、方法は、心筋細胞の集団を薬学的に許容される担体と混合する工程をさらに含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1の1つまたは複数は、心筋細胞を1つもしくは複数のインヒビター薬物と接触させることによって、および/または遺伝子操作によって阻害される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2は、心筋細胞を1つもしくは複数の活性化薬物と接触させることによって、および/または遺伝子操作によって刺激される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つまたは複数は不活性化される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化は、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化は、RNA誘導型ヌクレアーゼ、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、RNA誘導型ヌクレアーゼは、Casヌクレアーゼを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、遺伝子不活性化は、RNAi、アンチセンス、またはRNAを標的とするCasヌクレアーゼを介して行われる。
本明細書において提供される別の局面は、インビトロで分化した心筋細胞を移植する方法であって、本明細書に記載されている任意の態様のもしくは本明細書に記載されている任意の態様に由来するインビトロで分化した心筋細胞、本明細書に記載されている薬学的組成物、本明細書に記載されている移植組成物、または本明細書に記載されている心臓送達装置もしくはシステムを、その必要がある対象の心臓組織と接触させる工程を含む、方法に関する。
本明細書において提供される別の局面は、インビトロで分化した心筋細胞を移植する方法であって、本明細書に記載されている細胞のいずれかのもしくは本明細書に記載されている細胞のいずれかに由来するインビトロで分化した心筋細胞、本明細書に記載されている薬学的組成物、本明細書に記載されている移植組成物、または本明細書に記載されている心臓送達装置もしくはシステムを、その必要がある対象の心臓組織に送達する工程を含む、方法に関する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、移植することは、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の阻害を欠きかつKCNJ2の刺激を欠くインビトロで分化した心筋細胞の移植と比較して、低下した移植不整脈をもたらす。
本明細書において提供される別の局面は、その必要がある対象における心臓組織の損傷または機能障害を伴う疾患または障害を処置する方法であって、前記対象の心臓組織を、本明細書に記載されている細胞、本明細書に記載されている薬学的組成物、本明細書に記載されている移植組成物、または本明細書に記載されている心臓送達装置もしくはシステムと接触させる工程を含む、方法に関する。
本明細書において提供される別の局面は、その必要がある対象における心臓組織の損傷または機能障害を伴う疾患または障害を処置する方法であって、本明細書に記載されている任意の細胞のもしくは本明細書に記載されている任意の細胞に由来するインビトロで分化した心筋細胞、本明細書に記載されている薬学的組成物、本明細書に記載されている移植組成物、または本明細書に記載されている心臓送達装置もしくはシステムを、その必要がある対象の心臓組織に送達する工程を含む、方法に関する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様において、接触させることまたは送達することは、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の阻害を欠きかつKCNJ2の刺激を欠くインビトロで分化した心筋細胞の移植と比較して、低下した移植不整脈をもたらす。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、方法は、アミオダロンおよびイバブラジンを対象に投与する工程をさらに含む。
本明細書において提供される別の局面は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のうち2つ以上についてのインヒビターを含む組成物に関する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、組成物は、インビトロで分化した心筋細胞の集団と混合されている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、組成物は、KCNJ2についてのアクチベータをさらに含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、組成物は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の各々についてのインヒビターを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、組成物は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の各々についてのインヒビターならびにKCNJ2についてのアクチベータを含む。
本明細書において提供される別の局面は、HCN4遺伝子、CACNA1H遺伝子、およびSLC8A1遺伝子の発現が、有害な変異によってまたは挿入によって部分的にまたは完全に不活性化され、かつKCNJ2遺伝子の発現が少なくとも部分的に増加される、単離されたヒト心筋細胞に関する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、不活性化は、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、不活性化は、RNA誘導型ヌクレアーゼ、RNAi、アンチセンス、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、RNA誘導型ヌクレアーゼは、Casヌクレアーゼを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、単離されたヒト心筋細胞は、少なくとも1つの外因性核酸配列をさらに含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、ポリペプチドは、少なくとも1つの外因性核酸配列から発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、単離されたヒト心筋細胞は、少なくとも1つのさらなる遺伝子の低下した発現をさらに含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2は導入遺伝子から過剰発現される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、導入遺伝子は、HCN4またはCACNA1H発現調節配列によって駆動される外因性KCNJ2コード配列を含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、置き換えられたHCN4またはCACNA1Hコード配列が発現されずかつKCNJ2が内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列の調節下で発現されるように、KCNJ2コード配列がHCN4またはCACNA1Hのコード配列と置き換わる。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2コード配列は、CRISPR/Casシステムを使用して置き換えられている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、CRISPR/Casシステムが使用されて、HCN4のコード配列をKCNJ2コード配列で置き換える。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、CRISPR/Casシステムが使用されて、CACNA1Hのコード配列をKCNJ2コード配列で置き換える。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、心筋細胞は、多能性幹細胞からインビトロで分化している。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC）である。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、心筋細胞は、インビトロで分化したヒト心筋細胞が移植される第2の対象とは異なる第1の対象に由来するiPSCからインビトロで分化している。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、単離されたヒト心筋細胞は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1遺伝子発現の部分的または完全な不活性化ならびにKCNJ2遺伝子の少なくとも部分的に増加した発現を含まない単離されたヒト心筋細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を促進する。
本明細書において提供される別の局面は、対象における心臓組織の損傷または機能障害を伴う疾患または障害の処置において使用するための組成物であって、その必要がある対象の心臓組織に送達するための、本明細書に記載されている細胞のもしくは本明細書に記載されている細胞に由来するインビトロで分化した心筋細胞、本明細書に記載されている薬学的組成物、本明細書に記載されている移植組成物、または本明細書に記載されている任意の態様の心臓送達装置もしくはシステムを含む組成物に関する。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、組成物の送達は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の阻害を欠きかつKCNJ2の刺激を欠くインビトロで分化した心筋細胞の移植と比較して、低下した移植不整脈をもたらす。
別の局面において、対象における心臓移植不整脈の処置または予防の方法において使用するための、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のうち2つ以上についてのインヒビターを含む組成物も本明細書において提供される。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、組成物は、インビトロで分化した心筋細胞の集団と混合されている。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、組成物は、KCNJ2についてのアクチベータをさらに含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、組成物は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の各々についてのインヒビターを含む。
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、組成物は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の各々についてのインヒビターならびにKCNJ2についてのアクチベータを含む。
図1A～1Cは、hPSC-CMの自動性に関与するイオンチャネルの発現を実証する。（図1A）相対的な相番号を付したhPSC-CMおよび成体CMの活動電位トレース。点線は、プルキンエ系からの成体CMに対してのみ第4相を示す。（図1B）ラット心臓内で成熟中のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞（hiPSC-CM）のインビボ移植中のイオンチャネル遺伝子発現のRNA-seq分析。実線は、2つの独立した実験の平均を表す。赤色の陰影が付された領域は、移植不整脈（EA）の発症を表す。（図1C）ヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞（hESC-CM）自動性の遺伝子編集操作。KO、ノックアウト; OE、過剰発現。遺伝子編集の各回は、異なる色で描かれている。記号は、EAを引き起こした（赤色星印）または洞調律とよく統合された（緑色丸）、インビボで試験された細胞株を示す。記号が存在しないことは、インビボでまだ試験されていない細胞を示す。 図1Aの説明を参照されたい。 図1Aの説明を参照されたい。 図2A～2B。MEDUSA-CMインビトロ電気的活動。MEDUSAは、Modulation of Electrophysiological DNA to Understand and Suppress Arrhythmias（不整脈を理解し、抑制するための電気生理学的DNAの調節）の略である。ここで、細胞は、HCN4/SLC8A1/CACNA1Hのノックアウトおよび内在性HCN4遺伝子座からのKCNJ2の過剰発現を含む4重のゲノム編集を含有する。RUES2 hESC親細胞株から、多能性MEDUSA細胞（CMへの分化前）を作製した。（図2A）心臓分化中の自動性の開始: 左パネル、拍動/分で表した拍動数の定量; 右パネル、細胞株当たり合計12ウェルからの拍動するウェルのパーセンテージ。データは、1バッチの分化の平均として示される。ES＝胚状態、MS＝中胚葉状態、CP＝心筋前駆細胞、CM＝心筋細胞状態。（図2B）MEDUSA CMの代表的なMEA分析。MEDUSA CMの周波数が、8ウェル/細胞株の平均±SEMとして示されている。 図2Aの説明を参照されたい。 図3A～3C。ブタにおける遺伝子編集されたhESC-CMの移植およびEAの負荷。（図3A、3B）対照と比較した、異なる遺伝子編集されたhESC-CM（図3A）およびMEDUSA-CM（図3B）レシピエントの心拍数（右パネル）および不整脈負荷（左パネル）。データは、平均±SEMまたは平均のみとして示されている。レシピエントの数は、グラフ内に記されている。（図3C）遅骨格トロポニンI染色によって検出されたMEDUSA-CM移植片。スケールバー＝200μm。 図3A-1の説明を参照されたい。 図3A-1の説明を参照されたい。 図3A-1の説明を参照されたい。 図3A-1の説明を参照されたい。 図4A～4C。HCN4/CACNA1H/SLC8A1-3KO＋KCNJ2-OE MEDUSA-CMの電気的ペーシング研究。（図4A）MEDUSA心筋細胞が、野生型心筋細胞と同一の、電場刺激に応答したカルシウムトランジェントを示すことを実証するカルシウムイメージング研究。（図4B）カルシウムイメージングのキモグラムは、編集されていないhESC-CMまたは野生型CMの別の源およびMEDUSA-CMにおける同一のカルシウムトランジェントを示す。（図4C）定量分析は、MEDUSA-CMおよび野生型細胞における、電場刺激に対する類似の周波数応答を示す。 図4Aの説明を参照されたい。 図4Aの説明を参照されたい。 図5A～5F。2D培養と比較した、インビボ移植中のhiPSC-CMの遺伝子発現分析。（図5A）成体CMと比較した、hESC-CMからの代表的な活動電位トレース。（図5B）hiPSC-CMを用いたRNA-seq実験の実験レイアウト。（図5C）レーザー捕捉微細解剖（LCM）の前および後における、注射後84日目のhiPSC-CMを移植されたラット心臓の代表的な組織学的分析。H＆E＝ヘマトキシリンおよびエオシン染色。スケールバー＝a、dについては200μM、b、cについては50μM。（図5D）図5Bに記載されているRNA-seqデータセットの主成分分析（PCA）。各PCによって表される遺伝子発現分散のパーセンテージが示されている。（図5E）hiPSC-CMにおける成熟関連遺伝子のヒートマップ。（図5F）hiPSC-CMのインビボ移植中のイオンチャネル遺伝子の時間経過分析。陰影は、移植不整脈のおよそのウィンドウを示す。 図5Aの説明を参照されたい。 図5Aの説明を参照されたい。 図5Aの説明を参照されたい。 図5Aの説明を参照されたい。 図5Aの説明を参照されたい。 図6A～6F。インビトロでのRUES2 hESC-CM野生型自動性の薬理学的阻害。（図6A、6C、6E）MEAシステムでの、イバブラジン（If、HCN4インヒビター、図6A）、ML-218（ICaTインヒビター、図6C）およびSEA0400/KB-R7943（INCX1インヒビター、図6E）の用量反応曲線。データは、それぞれ6回の技術的反復（ウェル）を伴う2回の独立した実験の平均±SEMとして示されており、実験のベースラインに対して正規化され、DMSO対照に対する％として表されている。線は、正規化された応答Y＝100/（1＋10＾（（LogIC50-X）＊ヒル勾配））の非線形回帰を表す。（図6B、6D、6F）実験の対応するDMSO処理された対照と比較した、イバブラジン（図6B）、ML-218（図6D）およびSEA0400/KB-R7943（図6F）で処理されたRUES2 hESC-CM野生型の代表的なMEA記録。 図6Aの説明を参照されたい。 図6Aの説明を参照されたい。 図6Aの説明を参照されたい。 図6Aの説明を参照されたい。 図6Aの説明を参照されたい。 図7A～7E。HCN4およびCACNA1Hの切断は、hESC-CMの自動性を妨げるのに十分ではない。（図7A）遺伝子編集された細胞株の作製、心臓分化およびインビトロ/インビボ特性決定のための実験レイアウト。SpCas9＝化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9、sgRNA＝シングルガイドRNA。（図7B）KO後の過分極誘導性Ifの欠如を示す、HCN4ノックアウトおよびRUES2 hESC-CM野生型からのファニー電流（If）のパッチクランプ分析。クローン1の代表的な電流トレースが示されている。定量化については図14Cを参照されたい。（図7C、7D）MEAシステムでの、遺伝子編集されたRUES2 hESC-CMの自発的活動およびスパイク振幅。データは、それぞれ8回の技術的反復を伴う2～3回の独立した実験の平均±SEMとして示されており、RUES2 hESC-CM野生型周波数に対して正規化されている。統計的な差は、多重比較のためのSidak補正を伴う二元配置ANOVAによって、RUES2 hESC-CM野生型と比較して報告されている（＊p＜0.05、＊＊p＜0.01および＊＊＊p＜0.001）。（図7E）RUES2 hESC-CM野生型と比較したHCN4 KO RUES2 hESC-CM移植後の移植不整脈負荷（それぞれの日における時間の％）および心拍数の定量。データは、RUES2 hESC-CM野生型についてはN＝3、HCN4 KOについてはN＝2の平均±SEMとして示されている。黒色の記号は安楽死させた動物を表す。右パネルは、EA中の、HCN4 KOを受けた動物の代表的なECGトレースを示す。 図7Aの説明を参照されたい。 図7Aの説明を参照されたい。 図7Aの説明を参照されたい。 図7Aの説明を参照されたい。 図8A～8E。HCN4およびKCNJ2の擾乱は、hESC-CMの自動性を妨げるのに十分ではない。（図8A）RUES2 hESCにおいてHCN4プロモーターの転写調節下でKCNJ2をノックインするための遺伝子編集アプローチ。オンターゲットおよびオフターゲット挿入のための遺伝子型決定PCR戦略が示されている。補足の図5Aを参照されたい。（図8B）RUES2 hESC-CM野生型および遺伝子編集されたhESCの心臓分化中のHCN4、KCNJ2およびTNNT2発現の時間経過分析。（図8C）野生型と比較した、HCN4 KO/KCNJ2 KIクローンからのhESC-CM分化中の自発的な拍動の代表的な定量。（図8D）MEAによって定量されたHCN4 KO/KCNJ2 KIクローンの自発的活動および代表的なトレース。これらの系統における自動性の顕著な不規則性を考慮して、データは、5分間の記録の平均拍動（左パネル）および対応する％拍動不規則性（右パネル）として報告されており、％拍動不規則性は、100秒での拍動間隔記録の標準偏差をその同じ期間での拍動間隔の平均で割ったものとして計算される。データは、それぞれ8回の技術的反復を伴う3回の独立した実験の平均値±SEMとしてプロットされている。（図8E）RUES2 hESC-CM野生型と比較した、HCN4 KO/KCNJ2 KI hESC-CM RUES2 hESC-CMを移植された動物のEA負荷、左パネル、および心拍数を示すインビボデータ、右側は代表的なECGトレースである。データは、図7Eに記載されているように示されている。 図8Aの説明を参照されたい。 図8Aの説明を参照されたい。 図8Aの説明を参照されたい。 図8Aの説明を参照されたい。 図9A～9I。三重の遺伝子編集の組み合わせは、RUES2 hESC-CMの自動性を減少させるが、EAを防がない。（図9A）分化の14日目のRUES2 hESC-CM野生型と比較した、HCN4/CACNA1H 2KO/KCNJ2 KIにおけるHCN、T型イオンチャネル遺伝子およびKCNJ2のRT-qPCR遺伝子発現分析。データは、WTに対して正規化された3つの独立した実験の平均±SEMとして示されている。多重比較のためのSidak補正を伴う二元配置ANOVAによるWTに対する差（＊＊＊p＜0.001）。（図9B）HCN4/CACNA1H 2KO/KCNJ2 KI CMにおける心臓分化中の代表的な拍動の開始。（図9C）RUES2 hESC-CM野生型と比較したHCN4/CACNA1H 2KO/KCNJ2 KIクローンのMEA分析。データは、それぞれ8回の反復を伴う2回の独立した実験の5分で記録された平均拍動/分±SEMとして示されている。図15Fも参照されたい。（図9D）RUES2 hESC-CM野生型（n＝3）と比較した、HCN4/CACNA1H 2KO/KCNJ2 KI hESC-CMを移植された1匹のブタの不整脈負荷および心拍数ならびにEA中の代表的なEKGトレース。データは、図3E、Fに記載されているように示されている。（図9E）RUES2 hESC-CM野生型と比較したNCX1 KOクローンのウエスタンブロット。cTnT＝心筋トロポニン（cardiac troponin）T。（図9F）WTと比較した、SLC8A1 KOクローンの心臓分化中の拍動の開始の代表的な時間経過分析。（図9G）MEAプレート上の2週間培養物の異なる時点でのSLC8A1 KOクローンの代表的な電場電位トレースおよび拍動挙動の定量。データは、3つの独立した実験の5分で記録された平均拍動/分±SEMとして示されている（N＝3、n＝4）。（図9H）WT（n＝3）と比較した、HCN4/NCX1 2KO/KCNJ2 KI hESC-CMを移植されたブタ（n＝3）のEA負荷およびそれぞれの心拍数。データは、WTおよびHCN4/SLC8A1 2KO_KCNJ2 KIの個々の動物についての平均±SEMとして示されている。（図9I）注射4週間後のHCN4/NCX1 2KO/KCNJ2 KI移植片の代表的な組織学的分析。スケールバー＝200μm。 図9Aの説明を参照されたい。 図9Aの説明を参照されたい。 図9Aの説明を参照されたい。 図9Aの説明を参照されたい。 図9Aの説明を参照されたい。 図9Aの説明を参照されたい。 図9Aの説明を参照されたい。 図9Aの説明を参照されたい。 図10A～10C。MEDUSA-CMのインビトロ特性決定。（図10A）hESC-CM野生型対照と比較した、MEDUSA-CM中のIf、ICaTおよびINCXを担う遺伝子のqRT-PCR。データは、2つの独立した実験の平均±SEMとして示されている。統計的な差は、多重比較のためのSidak補正を伴う二元配置ANOVAによって、hESC-CM野生型対照と比較して報告されている（＊p＜0.05および＊＊p＜0.01）。（図10B）MEDUSA-CMの心臓分化中の拍動の開始および拍動数。データは、分化の2つの独立したバッチの平均±SEMとして示されている。（図10C）Fluo-4を使用したhESC-CM野生型対照と比較した、単一細胞MEDUSA-CMに対する代表的なカルシウムトランジェント分析。データは、hESC-CM野生型対照細胞およびMEDUSA-CMの両方について、12個の単一細胞の平均±SEMとして示されている。 図10Aの説明を参照されたい。 図10Aの説明を参照されたい。 図11A～11F。MEDUSA-CMのインビボ特性決定。（図11A）EA中にhESC-CM野生型対照細胞を注射されたユカタンミニブタおよび移植後の同じ時点で正常な洞調律の状態にあるMEDUSA-CMを注射されたユカタンミニブタの代表的な心電図トレース。（図11B）インビボ移植後のMEDUSA-CMのEA負荷および心拍数。データは、図6Eに記載されているように示されている。（図11C）注射4週間後のMEDUSA-CM移植片の代表的な画像。スケールバー＝200μM。（図11D）MEDUSA-CM移植片におけるMLC2v/MLC2aおよびssTnI/cTnIの免疫蛍光画像。スケールバー＝10μM。図17Fも参照されたい。（図11E、11F）宿主と一体化したMEDUSA-CM移植片の代表的な免疫蛍光画像。スケールバー＝10μM。 図11Aの説明を参照されたい。 図11Aの説明を参照されたい。 図11Aの説明を参照されたい。 図11Aの説明を参照されたい。 図11Aの説明を参照されたい。 図12A～12D。インビボ移植されたhiPSC-CMのRNAseq分析（図12A）LCM後のインビボ試料中のヒト/ラットリードのパーセンテージ。（図12B）hiPSC-CM移植後3ヶ月での選択された上方制御および下方制御された経路のGOターム解析。表4A～4Bも参照されたい。hiPSC-CMのインビボ成熟中の（図12C）HCNおよび（図12D）T型イオンチャネルアイソフォームの発現速度論。 図12Aの説明を参照されたい。 図12Aの説明を参照されたい。 図12Aの説明を参照されたい。 図13A～13C。RUES2 hESC-CM野生型対照細胞のインビトロ自動性の薬理学的阻害。（図13A、13B、13C）MEAシステムでの、ミベフラジル（ICaT、図13A）、ザコプリド（IK1アゴニスト、図13B）およびベラパミル（L型カルシウムチャネルインヒビター、図13C）の用量反応曲線。データは、2つの独立した実験の平均±SEMとして示され、ベースラインに対して正規化されており、DMSO対照に対する％として表された（N＝2、n＝6）。線は、正規化された応答Y＝100/（1＋10＾（（LogIC50-X）＊ヒル勾配））の非線形回帰を表す。 図14A～14E。活動電位の第4相を標的とする遺伝子編集された細胞株の特性決定。（図14A）MEDUSA-CMプロジェクトに記載されている異なる細胞株の作製のための遺伝子編集アプローチ。（図14B）HCN4 KOクローン（HCN4 KO cl.1＝-1bpホモ接合性欠失; HCN4 KO cl.2＝-5bpホモ接合欠失）、CACNA1H KOクローン（CACNA1H KO cl.1＝-20bp欠失、CACNA1H KO cl.2＝異なる対立遺伝子上の2bpのヘテロ接合挿入）および二重編集された細胞（HCN4/CACNA1H KO cl.1＝＋1bpホモ接合挿入、HCN4/CACNA1H KO cl.2＝-1bpホモ接合欠失）のサンガー配列決定。（図14C）hESC-CM野生型対照細胞およびHCN4 KO hESC-CMにおけるIfの電圧/電流プロット。データは、n＝3細胞（WT）、HCN4 KO cl.1についてはn＝6、HCN4 KO cl.2についてはn＝4の平均値±標準誤差として示されている。（図14D、14E）hESC-CM野生型対照細胞と比較した、HCN4 KOクローン（図14D）ならびにCACNA1H KOおよびHCN/CACNA1H 2KO（図14S）におけるHCNおよびT型アイソフォームのRTqPCRによる遺伝子発現分析。多重比較のためのSidak補正を伴う二元配置ANOVAによって定量された差（＊＊＊p＜0.001）。 図14Aの説明を参照されたい。 図14Aの説明を参照されたい。 図14Aの説明を参照されたい。 図14Aの説明を参照されたい。 図15A～15F。PIEZO1 KO細胞株の特性決定。（図15A）インビボで0日目と7日目を比較して最も異なって制御されたイオンチャネル遺伝子（左パネル）およびインビボ移植後の対応する発現動態。（図15B）異なる時点でのインビボおよびインビトロでのPIEZO1遺伝子発現。（図15C）PIEZO1 KO hESC RUES2細胞株のサンガー配列決定。（PIEZO1 KO cl.1 5bpのホモ接合欠失、PIEZO1 KO cl.2 2つの対立遺伝子上の-5bpおよび-1bpのヘテロ接合欠失）。（図15D）hESC-CM野生型対照細胞と比較したPIEZO1 KO CMのウエスタンブロッティング分析。（図15E）PIEZO1 KO CMの自発的電気的活動のMEA分析。データは、2つの独立した実験の平均±SEMとして表された、hESC-CM野生型対照細胞に対して正規化された拍動数として示されている（N＝2、n＝8）。（図15F）PIEZO1 KO CMを移植されたブタのEA負荷および心拍数ならびにβ-ミオシン重鎖陽性移植片を用いた代表的な染色。 図15Aの説明を参照されたい。 図15Aの説明を参照されたい。 図15Aの説明を参照されたい。 図15Aの説明を参照されたい。 図15Aの説明を参照されたい。 図16A～16H。三重編集された細胞株の遺伝子型決定および特性決定。（図16A）図4Aに記載されたプラスミドを使用してCRISPR/Cas9相同性修復により作製されたHCN4 KO/KCNJ2 KIクローンの遺伝子型決定。（図16B）Nkx2.5（心室CMマーカー）および心筋トロポニンT（汎CMマーカー）について染色された、分化14日目のHCN4 KO/KCNJ2 KIクローンの代表的なフローサイトメトリーデータ。（図16C）図4Aに示された同じベクターで作製されたHCN4/CACNA1H 2KO/KCNJ2 KIクローンの遺伝子型決定。遺伝子編集アプローチについては、図15Aも参照されたい。（図16D）分化の14日目のHCN4/CACNA1H 2KO/KCNJ2 KI CMの代表的なフローサイトメトリー分析。（図16E）HCN4/CACNA1H 2KO/KCNJ2 KIクローンの核型分析。（図16F）100秒での拍動間隔記録の標準偏差をその同じ期間での拍動間隔の平均で割って定量化された拍動間隔の不規則性。データは、2つの独立した実験の平均値±標準誤差として示されている（自発的活動の欠如のために遺伝子編集されたクローンについてはN＝1）。（図16G）3つのgRNAの組み合わせを介して生成されたSLC8A1 KOクローンの遺伝子型。左パネルは、SLC8A1エクソン2配列上のSLC8A1 KO cl.1および2に対するサンガー配列決定のアラインメントを示す。（図16H）図8Aに記載されている同じアプローチで作製されたHCN4/SLC8A1 2KO/KCNJ2 KIクローンの遺伝子型。 図16Aの説明を参照されたい。 図16Aの説明を参照されたい。 図16Aの説明を参照されたい。 図16Aの説明を参照されたい。 図16Aの説明を参照されたい。 図16Aの説明を参照されたい。 図16Aの説明を参照されたい。 図17A～17E。MEDUSA細胞株の特性決定。（図17A）MEDUSA hESCの核型分析。（図17B）多能性マーカーとしてのOct3/4およびSSEA4で染色されたMEDUSA hESCおよびhESC-CM野生型対照細胞の代表的なフローサイトメトリー分析。（図17C）MEDUSA-CMにおけるNCX1のウエスタンブロッティング分析。（図17D）hESC-CM野生型対照細胞および同じバッチからのMEDUSA hESCにおける心臓分化中の分化マーカーの代表的なフローサイトメトリー分析。（図17E）MLC2v/2aおよびssTnI/cTnI MEDUSA移植片の単一チャネル画像。 図17Aの説明を参照されたい。 図17Aの説明を参照されたい。 図17Aの説明を参照されたい。 図17Aの説明を参照されたい。 図18。HCN4 KO hESC-CMに対するML-218処理。データは、2つの独立した実験においてMEAシステムで記録された自発周波数の平均±SEMとして示されている。実線は、4パラメータロジスティック曲線を表す（Y＝下限値＋（上限値-下限値）/（1＋10＾（（LogIC 50-X）＊ヒル勾配））; 変数は、以下の表に記載されている。この実験では、HCN4発現を防ぐようにhESCを遺伝子改変した。次いで、HCN4 hESC KOクローンおよびhESC野生型対照細胞をインビトロで心筋細胞に分化させた（hESC-CM）。次いで、14日目に、ICaT電流を担うT型イオンチャネル（Cav3.2）を標的とするML-218の漸増用量で、hPSC-CMを処理した。ML-218効果をMEAシステムで評価した。
詳細な説明
本明細書に記載されている組成物および方法は、部分的に、その機能の調節により、幹細胞由来心筋細胞を含むがこれに限定されない心筋細胞の生着に起因する不整脈を低減または防止する、一連のイオンチャネルの発見に関連する。したがって、心筋細胞移植から利益を得ることができる心疾患の処置および/または予防のための組成物および方法が本明細書に記載されている。以下は、心筋細胞の移植物または移植片製剤の調製のための考察、心筋細胞移植または生着におけるそれらの使用、ならびにこのような移植から通常生じる不整脈を低減または排除するための追加のアプローチおよび考察を提供する。
インビトロ分化を介して幹細胞から誘導される心筋細胞（CM）を含むがこれに限定されない外因性心筋細胞は、生着のために心臓組織に投与された場合、不整脈を促進する。理論に拘束されることを望むものではないが、導入された細胞は、事実上、内在性の心臓ペースメーカー機構または細胞とは異なる自律的なインパルス生成中心として振る舞うことによって、心臓の正常な電気生理学的制御を破壊すると考えることができる。このシナリオでは、心筋細胞表現型を維持しながらこの自律的インパルス生成を低下させることにより、生着された細胞は、内在性電気生理学的プログラムの破壊を抑えながら心臓組織と一体化することを可能にすることができる。
具体的には、ESCおよびiPS細胞（iPSC）からインビトロ分化によって調製された心筋細胞は、移植不整脈を促進する。したがって、本明細書に記載されているアプローチは、これらの幹細胞型のいずれかに由来する心筋細胞に直接適用可能である。iPSCが、iPSCから分化した細胞が投与される対象に由来し得る場合-すなわち、自己幹細胞-iPSアプローチは、免疫移植片拒絶のリスクを回避または最小化するという利点を有する。ESCおよびiPSCは明確な利点を有するが、その他の外因性または内在性源から生成された心筋細胞も、移植不整脈（例えば、外因性細胞の移植なしに生成された新たに生成された心筋細胞も不整脈を引き起こし得るという限りにおいて、「再生不整脈」という用語も用いることができる）を回避または制限するために、本明細書に記載されている電気生理学的操作から利益を得ることも想定される。例えば、別の体細胞型からの分化転換を介して調製され、本明細書に記載されている電気生理学的遺伝子の一式の全部または一部を発現する（例えば、KCNJ2の低発現または無発現ありまたはなしでの、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1発現）心筋細胞も、本明細書に記載されている操作/アプローチから利益を得ると予想される。実際、細胞周期を活性化することによって催不整脈性である内在性心筋細胞、または損傷に応答して脱分化し、例えば心筋梗塞、ウイルス性心筋炎などの後にこの一式の遺伝子が発現された内在性心筋細胞は、これらの遺伝子またはそれらのコードされるタンパク質の発現または活性の操作から利益を得ることができることが特に想定される。すなわち、本明細書に記載されているアプローチは、インビトロで分化した細胞が関与しない過程または病態によって引き起こされる不整脈を処置し、低減し、または制限するためにも適用できる可能性がある。
移植された細胞において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1によってコードされるイオンチャネルの発現を遺伝的にノックアウトすることならびにKCNJ2によってコードされるイオンチャネルの発現を遺伝的に増強することを合わせると、自動性および移植不整脈を抑制することができることが発見されたので、生着のための細胞において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の発現または活性を低下させ、ならびにKCNJ2の発現または活性を増加させる異なるアプローチが治療上の利益を提供することができると考えられる。したがって、例えば、対象イオンチャネルの遺伝子操作および/または薬理学的操作の任意の組み合わせは、移植不整脈を抑制または抑止することができると考えられる。したがって、非限定的な例として、生着のためのインビトロで分化した心筋細胞における、HCN4チャネルの薬理学的阻害とCACNA1HおよびSLC8A1の遺伝子ノックアウトならびにKCNJ2発現の遺伝的増強との組み合わせは、移植不整脈を抑止することができ、HCN4、CACNA1H、およびSLC81阻害とKCNJ2活性化との任意の他の組み合わせも、移植不整脈を抑制する上で有益な可能性があることが特に想定される。様々なチャネルを操作するのに有用な薬理的作用物質の他、必要に応じて遺伝子ノックダウン、ノックアウトおよびノックインアプローチ、ならびにそれぞれを使用するための考察（例えば、ノックアウトまたは過剰発現のための適切なタイミングおよび/または量）が本明細書で以下にさらに記載されている。
定義
便宜のため、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語および語句の意味が、以下に提供されている。別段の記載がなければ、または文脈上黙示されていなければ、以下の用語および語句は、以下に提供される意味を含む。定義は、特定の態様を記載することを補助するために提供されており、技術の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、特許請求の範囲に記載された技術を限定することは意図されていない。別段の定義がなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本技術が属する分野において通常の技術を有する者によって一般に理解されているものと同一の意味を有する。本分野における用語の用法と本明細書において提供されるその定義との間に明らかな齟齬が存在する場合には、本明細書において提供された定義が優越するものとする。
細胞生物学および分子生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,19th Edition,Merck Sharp＆Dohme Corp.出版,2011（ISBN 978-0-911910-19-3）;Robert S.Porter et al.（eds.）,The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine,Blackwell Science Ltd.出版,1999-2012（ISBN 9783527600908）;およびRobert A.Meyers（ed.）,Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.出版,1995（ISBN 1-56081-569-8）;Immunology by Werner Luttmann,Elsevier出版,2006;Janeway's Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver（eds.）,Taylor＆Francis Limited,2014（ISBN 0815345305,9780815345305）;Lewin's Genes XI,Jones＆Bartlett Publishers出版,2014（ISBN-1449659055）;Michael Richard Green and Joseph Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA（2012）（ISBN 1936113414）;Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA（2012）（ISBN 044460149X）;Laboratory Methods in Enzymology:DNA,Jon Lorsch（ed.）Elsevier,2013（ISBN 0124199542）;Current Protocols in Molecular Biology（CPMB）,Frederick M.Ausubel（ed.）,John Wiley and Sons,2014（ISBN 047150338X,9780471503385）,Current Protocols in Protein Science（CPPS）,John E.Coligan（ed.）,John Wiley and Sons,Inc.,2005;およびCurrent Protocols in Immunology（CPI）（John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe,（eds.）John Wiley and Sons,Inc.,2003（ISBN 0471142735、9780471142737）に見出すことができ、これらの内容は全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書で使用される場合、「心筋細胞」または「CM」という用語は心臓の筋肉細胞を指す。心筋細胞（CM）は、一般に、心筋に伴う表現型および/または構造的特徴（例えば、電気的表現型、筋節、アクチン、ミオシンおよび心筋トロポニンT発現など）を含む。心筋細胞は、生物から単離された天然の心筋細胞または幹細胞もしくは心臓前駆体から分化した心筋細胞（例えば、インビトロで分化した心筋細胞）であり得る。
本明細書で使用される場合、「ヒト幹細胞」という用語は、自己再生し、少なくとも1つの細胞型に分化することができるヒト細胞を指す。「ヒト幹細胞」という用語は、ヒト幹細胞株、ヒト由来人工多能性幹（iPS）細胞（またはiPSC）、ヒト胚性幹細胞、ヒト多能性細胞、ヒト複能性幹細胞、羊膜幹細胞、胎盤幹細胞またはヒト成人幹細胞を包含する。
本明細書で使用される場合、「インビトロで分化した心筋細胞」とは、必ずではないが、典型的には、幹細胞または多能性幹細胞などの前駆細胞からの段階的分化を介して、培養中に生成される心筋細胞を指す。幹細胞型の例には、ヒト胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、初期中胚葉細胞、側板中胚葉細胞または心筋前駆細胞が含まれるが、これらに限定されない。したがって、インビボでの心筋細胞は究極的には幹細胞に由来する、すなわち組織または生物の発生中に、が、本明細書に記載されている幹細胞由来の心筋細胞は、幹細胞からインビトロ分化によって作出された。本明細書で使用される場合、幹細胞、例えば人工多能性幹（iPS）細胞または胚性幹細胞（「ES細胞」または「ESC」）からインビトロで分化した細胞は、心筋トロポニンT（cTnT）の発現を有せば、「幹細胞由来心筋細胞」または「インビトロで分化した心筋細胞」である。心筋細胞を生成するために使用される分化アプローチにかかわらず、移植不整脈の電気生理学的乱れが発生すると予想される場合には、本明細書に記載されているように遺伝子改変され、cTnTを発現する心筋細胞表現型へのインビトロ分化が可能な心筋前駆細胞が特に想定される。幹細胞をインビトロで心筋細胞に分化させるための方法は、当該分野で公知であり、本明細書の他の箇所に記載されている。
本明細書で使用される「多能性」という用語は、異なる条件下で、3つの全ての胚細胞葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）に特徴的な細胞型に分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、主に、例えば、ヌードマウスおよび奇形腫形成アッセイを使用して、3つの全ての胚葉に分化する能力を特徴とする。多能性は、胚性幹（ES）細胞マーカーの発現によっても証明されるが、多能性についての好ましい試験は、3つの胚葉の各々の細胞に分化する能力の実証である。いくつかの態様において、多能性幹細胞は、多能性細胞ではない細胞から産生または生成され、本明細書では「人工多能性幹細胞」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」、「iPS細胞」、「iPSC」、「hiPSC」および「ヒト人工多能性幹細胞」という用語は、本明細書で互換的に使用され、分化した体細胞などの親細胞から人工的に誘導された多能性細胞を指す。iPSCは、心臓系統の細胞の他、様々な型の成熟細胞を含む、自己複製および細胞運命が拘束された幹細胞への分化が可能である。人工多能性幹細胞の作製に有用な親細胞の例としては、線維芽細胞、心筋前駆細胞、骨格筋細胞などの体細胞が挙げられるが、これらに限定されない。このような「iPS」または「iPSC」細胞は、ある制御遺伝子の発現を誘導することによって、またはあるタンパク質の外因性適用によって作製することができる。iPSCの誘導の方法は当技術分野で公知であり、以下にさらに記載されている（例えば、Zhou et al.,Stem Cells,27（11）:2667-74（2009）;Huangfu et al.,Nature Biotechnol.26（7）:795（2008）;Woltjen et al.,Nature 458（7239）:766-770（2009）;およびZhou et al.,Cell Stem Cell 8:381-384（2009）を参照されたい; これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。）本明細書で使用される場合、「hiPSC」はヒト人工多能性幹細胞である。親細胞には、様々な手段によって多能性未分化表現型を誘導するように再プログラムされた体細胞が含まれ得る。
幹細胞に関して使用される「由来する」という用語は、分化した細胞の、幹細胞表現型への再プログラム化によって幹細胞が生成されたことを意味する。分化した細胞に関して使用される「由来する」という用語は、その細胞が幹細胞の分化、例えばインビトロ分化の結果であることを意味する。本明細書で使用される場合、「iPSC-CM」または「人工多能性幹細胞由来心筋細胞」は、人工多能性幹細胞に由来する心筋細胞を指すために互換的に使用される。本明細書で使用される場合、細胞に言及する場合の「由来する」という用語は、生成される最初の細胞およびその任意のその後の子孫も包含することができる。
本明細書で使用される場合、「子孫」という用語は、例えば、第1世代の子孫を包含する、すなわち、子孫は、例えば伝統的な増殖方法によって、最初の細胞に直接由来する、最初の細胞から直接得られる、最初の細胞から直接取得可能である、または最初の細胞から直接誘導可能である。「子孫」という用語は、第2、第3、第4、第5、第6、第7またはさらに後の世代、すなわち、例えば伝統的な増殖方法によって、前の世代に由来する、前の世代から得られる、前の世代から取得可能である、または前の世代から誘導可能である細胞の世代などのさらなる世代も包含する。「子孫」という用語は、最初の細胞またはその子孫の改変または変更から生じる改変された細胞も包含する。いくつかの態様において、野生型細胞または対照細胞が出発材料である。いくつかの態様において、出発材料は、胚性幹細胞（ESC）および人工多能性幹細胞（iPSC）を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞（PSC）などの幹細胞である。例えば、ドナーから得られた非改変幹細胞は、本明細書で想定される野生型または対照細胞と考えられる出発材料である。別の例では、ESC株、PSC株またはiPSC株などの幹細胞株出発材料は、本明細書で想定される野生型または対照細胞と考えられる出発材料である。いくつかの態様において、出発材料は、操作された細胞を作製するために、1つまたは複数の遺伝子の発現が変更されるようにその他に改変または操作される。例えば、1つまたは複数の遺伝子は、HCN4、CACNA1H、KCNJ2およびSLC8A1からなる遺伝子の群から選択される。当業者によって理解されるように、iPCSを作製するための様々な異なる方法が存在する。4つの転写因子Oct3/4、Sox2、c-MycおよびKlf4のウイルス導入を使用して、マウス胚線維芽細胞または成体線維芽細胞から最初の誘導が行われた。その全体が、特にその中に概説されている技術について、参照により本明細書に組み入れられるTakahashi and YamanakaCell 126:663-676（2006）を参照されたい。それ以来、多数の方法が開発されてきた。総説としてSeki et al,World J.Stem Cells 7（1）:116-125（2015）、およびLakshmipathy and Vermuri,editors,Methods in Molecular Biology:Pluripotent Stem Cells,Methods and Protocols,Springer 2013を参照されたい。これらのいずれもが、特にhiPSCを作製する方法について（例えば、後者の参考文献の第3章を参照）、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み入れられる。一般に、iPSCは、通常エピソームベクターを使用して導入される、宿主細胞中での1つまたは複数の再プログラミング因子」の一過性発現によって生成される。これらの条件下では、少量の細胞が誘導されてiPSCになる（一般に、選択マーカーが使用されないので、この工程の効率は低い）。細胞が「再プログラム」され、多能性になると、細胞はエピソームベクターを失い、内在性遺伝子を使用してこれらの因子を産生する。同じく当業者によって理解されるように、使用され得るまたは使用される再プログラミング因子の数は変化し得る。一般に、より少ない再プログラミング因子が使用されると、多能性状態への細胞の形質転換の効率が低下するとともに、「多能性」も低下し、例えば、より少ない再プログラミング因子は、完全には多能性ではないが、より少ない細胞型に分化することのみが可能であり得る細胞をもたらし得る。
本明細書で使用される「単離された細胞」という用語は、その中でその細胞が最初に見出された生物から取り出された細胞またはこのような細胞の子孫を指す。任意で、細胞はインビトロで、例えば他の細胞の存在下で培養されている。任意で、細胞は、その後に第2の生物に導入されるか、または細胞（または細胞の先祖である細胞）がそこから単離された生物に再導入される。
本明細書で使用される場合、イオンチャネルの活性に関して「活性が刺激される」という用語は、イオンチャネルの活性に影響を及ぼすための薬理学的または遺伝的手段によって操作されていない心筋細胞（例えば、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC-CM）、ヒト多能性幹細胞（hPSC-CM）またはヒト胚性幹細胞（hESC-CM）由来の心筋細胞、単離された初代心筋細胞など）と比較して、「増加した」という用語が本明細書で使用される場合、イオンチャネルの発現が増加されることを意味する。これに代えてまたはこれに加えて、「活性が刺激される」とは、例えばパッチクランプアッセイによって測定される、薬理学的または遺伝的手段によって誘導されるイオンチャネル活性の増加を指すことができる。本明細書で使用される場合、「刺激された」は、イオンチャネルの活性に影響を及ぼすための薬理学的または遺伝的手段によって操作されていない心筋細胞と比較して増加を引き起こす任意の刺激を含み、部分的刺激を含む。例えば、増加は、イオンチャネルの活性に影響を及ぼすための薬理学的または遺伝的手段によって操作されていない心筋細胞と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも125％、少なくとも150％、少なくとも175％、少なくとも200％、少なくとも250％、少なくとも300％、少なくとも350％、少なくとも400％、少なくとも450％、少なくとも500％、少なくとも550％、少なくとも600％、少なくとも650％、少なくとも700％、少なくとも750％、少なくとも800％、少なくとも850％、少なくとも900％、少なくとも950％、少なくとも1000％またはそれを超える活性の増加を含み得る。増加は、イオンチャネルの活性に影響を及ぼすための薬理学的または遺伝的手段によって操作されていない心筋細胞と比較して、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、少なくとも100倍の活性の増加も含み得る。
本明細書で使用される場合、イオンチャネルの活性に関して「活性が阻害される」という用語は、イオンチャネルの活性に影響を及ぼすための薬理学的または遺伝的手段によって操作されていない心筋細胞（例えば、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC-CM）、ヒト多能性幹細胞（hPSC-CM）またはヒト胚性幹細胞（hESC-CM）由来の心筋細胞、単離された初代心筋細胞など）と比較して、「減少した」という用語が本明細書で使用される場合、イオンチャネルの発現が減少されることを意味する。これに代えてまたはこれに加えて、「活性が阻害される」とは、例えばホールセルパッチクランプによって測定される、薬理学的または遺伝的手段によって誘導されるイオンチャネル活性の減少を指すことができる。本明細書で使用される場合、「阻害された」は、イオンチャネルの活性に影響を及ぼすための薬理学的または遺伝的手段によって操作されていない心筋細胞と比較して減少を引き起こす任意の阻害を含み、部分的阻害を含むことができる。例えば、減少は、イオンチャネルの活性に影響を及ぼすための薬理学的または遺伝的手段によって操作されていない心筋細胞と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも125％、少なくとも150％、少なくとも175％、少なくとも200％、少なくとも250％、少なくとも300％、少なくとも350％、少なくとも400％、少なくとも450％、少なくとも500％、少なくとも550％、少なくとも600％、少なくとも650％、少なくとも700％、少なくとも750％、少なくとも800％、少なくとも850％、少なくとも900％、少なくとも950％、少なくとも1000％またはそれを超える活性の減少を含み得る。減少は、イオンチャネルの活性に影響を及ぼすための薬理学的または遺伝的手段によって操作されていない心筋細胞と比較して、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、少なくとも100倍の活性の減少も含み得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子操作」または「遺伝子改変」は、ヒトの手によって導入される細胞の遺伝的なおよび/またはエピジェネティックな構成の変化を指すために互換的に使用され、例えば、細胞の染色体DNAを変化させる遺伝子編集、例えば核酸構築物またはベクター（組み込みか、またはエピソームかを問わない）を介した1つもしくは複数の導入遺伝子の導入またはこれらの組み合わせを含む。染色体DNAの改変のための任意の部位特異的突然変異誘発アプローチを使用することができるが、遺伝子編集の非限定的な例としては、相同組換え鋳型の使用ありまたはなしでのCRISPR-Cas媒介性染色体切断、同じく相同組換えまたは置き換え鋳型の使用ありまたはなしでの、遺伝性エピジェネティックサイレンシング（いわゆる「CRISPRoff」）、塩基編集、プライム編集およびジンクフィンガーヌクレアーゼまたは1つもしくは複数の標的配列のTALEN媒介性切断の他、本明細書に記載されている他の遺伝子編集システムが挙げられる。「遺伝子操作」の意味には、RNAまたはタンパク質レベルのいずれかで細胞内の1つまたは複数の遺伝子の発現を一過性に改変するアプローチも含まれる。これらには、例えば、標的遺伝子の発現を阻害するためにRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）を介して機能するsiRNA、shRNA、miRNAを含むがこれらに限定されない二本鎖または一本鎖RNAを含む遺伝子調節アプローチの1クラスであるRNA干渉（RNAi）が含まれる。RNAi作用物質の導入は、細胞の染色体構成を必ずしも改変しないにもかかわらず、本明細書で定義される遺伝子操作である。同様に、例えばアンチセンスRNAの導入も、この用語が本明細書で使用される場合、標的RNAを切断するRNA誘導型ヌクレアーゼ、例えばCasヌクレアーゼの導入と同様に、遺伝子操作である。遺伝子「不活性化」は、標的遺伝子が発現されないように染色体DNAを改変する遺伝子操作の一部である。このような不活性化は、とりわけ、遺伝子またはそのコード配列の全部または一部の欠失、標的遺伝子の発現を破壊する配列の挿入および別のポリペプチドをコードする配列でのコード配列の置き換えを含み得る。本明細書で使用される「遺伝子操作」または「遺伝子改変」という用語は、核酸、例えば生物のゲノム内の核酸の1つまたは複数の変更を指すこともできる。例えば、遺伝子改変は、遺伝子または遺伝子の一部または他の核酸配列の変更、付加および/または欠失を指すことができる。遺伝子改変細胞は、遺伝子または遺伝子の一部が付加、欠失および/または改変された細胞を指すこともできる。遺伝子改変細胞は、遺伝子または遺伝子の一部ではない付加された核酸配列を有する細胞を指すこともできる。遺伝子改変には、例えば、一過性のノックインまたはノックダウン機構および標的の遺伝子または遺伝子の一部または核酸配列の恒常的なノックイン、ノックダウンまたはノックアウトをもたらす機構の両方が含まれる。遺伝子改変には、例えば、一過性のノックインおよび核酸配列の恒常的なノックインをもたらす機構の両方が含まれる。
いくつかの態様において、遺伝子操作は、心筋細胞のゲノムの恒常的な改変である必要はない。例えば、RNAiまたは別の一過性遺伝子操作（例えば、RNA特異的Casヌクレアーゼ、アンチセンス発現など）を介してHCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の1つまたは複数の発現をノックダウンすることが有益であり得る。RNAiまたは他の阻害性分子は、（例えば、送達選択肢の中でも特に、多数の異なる脂質複合体のいずれかの中の）心筋細胞に投与され得、または心筋細胞に投与されるかもしくは心筋細胞と接触される構築物から発現され得る。一態様において、心筋細胞は、（例えば、shRNAの発現をコードする）RNAi分子または他の標的化された遺伝子インヒビターをコードする1つまたは複数の構築物で一過性に形質移入され得る。このような場合には、時間が経過するにつれて、構築物に対する能動的選択がない限り、形質移入された構築物は失われ、インヒビターの一過性発現を与えることが予想される。KCNJ2発現をコードする構築物からの同様の一過性発現も、KCNJ2活性を刺激するために使用することができる。移植不整脈が一般に数週間にわたって解消する場合（当然であるが、対象が不整脈またはその続発症に屈しなければ）、場合によっては、イオンチャネル活性のこのような一過性のノックダウンまたは増加は、治療的利益を提供するのに十分であり得る。
本明細書で使用される場合、「ノックアウト」、「ノックダウン（knock down）」または「ノックダウン（knockdown）」は、それぞれ編集された遺伝子の無発現および低下した発現をもたらす遺伝子改変を指す。本明細書で使用される場合、「ノックダウン」は、標的mRNAまたは対応する標的タンパク質の発現の低下を指す。ノックダウンは、一般に、RNAの発現レベルの低下を媒介しない対照分子（例えば、非標的化shRNA、siRNA、ガイドRNAまたはmiRNA）の投与または発現後に存在するレベルと比較して報告される。いくつかの態様において、標的遺伝子のノックダウンは、shRNA、siRNA、miRNAまたはCRISPR干渉（CRISPRi）によって達成される。いくつかの態様において、標的遺伝子のノックダウンは、デグロン法などのタンパク質ベースの方法によって達成される。いくつかの態様において、標的遺伝子のノックダウンは、shRNA、siRNA、miRNAを含む遺伝子改変または遺伝子編集システム（例えば、CRISPR/Cas）の使用によって達成される。ノックダウンは、一般に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）増幅を用いてmRNAレベルを測定することによって、またはウエスタンブロットもしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によってタンパク質レベルを測定することによって評価される。タンパク質レベルを分析することは、mRNA切断および翻訳阻害の両方の評価を提供する。ノックダウンを測定するためのさらなる技術としては、RNA溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、ラジオイムノアッセイおよび蛍光活性化細胞分析が挙げられる。当業者は、本明細書中に記載される詳細に基づいて、例示的な遺伝子編集システム（例えば、CRISPR/Cas）をどのように使用して標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトするかを容易に理解するであろう。
本明細書で使用される場合、「インデル」は、挿入、欠失またはそれらの組み合わせから生じる変異を指す。当業者によって理解されるように、ゲノム配列のコード領域中のインデルは、インデルの長さが3の倍数でなければ、フレームシフト突然変異をもたらす。いくつかの態様において、変更は、点変異である。本明細書で使用される場合、「点変異」は、ヌクレオチドの1つを置き換える置換を指す。例えば、遺伝子編集、塩基編集またはプライム編集を使用して、標的ポリヌクレオチド配列中に任意の長さのインデルまたは点変異を誘導するために、CRISPR/Casシステムを使用することができる。「塩基編集」という用語は、いくつかの事例では二本鎖DNA切断を行わずに、他の事例では一本鎖DNA切断を行わずに、標的とされた遺伝子座において、ある塩基対を別の塩基対にプログラム可能に変換する方法を指す。いくつかの態様において、塩基編集は、標的DNA部位を認識するための、およびプロトスペーサー配列内および/またはプロトスペーサー配列外のベースド編集のウィンドウである広範なPAM配列認識を有する触媒能が損なわれたCas9を利用する。「プライム編集」という用語は、プログラム可能なポリメラーゼ（国際公開第2020191242号に記載されているようなnapDNAbpsなどであるがこれに限定されない）および特定のガイドRNAを利用する遺伝子編集のための方法を指す。いくつかの態様において、ガイドRNAは、標的DNA配列中に組み込まれる遺伝情報をコードするための（または遺伝情報を欠失させるための）DNA合成鋳型を含む。当業者によって認識されるとおり、塩基編集およびプライム編集は、記載されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現を調節する（例えば、低減する、排除する、増大させる、および増強させる）のに有用である。
いくつかの態様において、「ノックアウト（knock out）」、「ノックアウト（knock-out）」または「ノックアウト（knockout）」という用語は、標的ポリヌクレオチド配列の翻訳または機能を妨げるように標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部を欠失させることを含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能的ドメイン（例えば、DNA結合ドメイン）中を含む標的ポリヌクレオチド配列中に挿入または欠失（「インデル」）を誘導することによって標的ポリヌクレオチド配列を変化させることによって達成され得る。当業者は、本明細書中に記載される詳細に基づいて、本開示の遺伝子編集システム（例えば、CRISPR/Cas）をどのように使用して標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトするかを容易に理解するであろう。
いくつかの態様において、遺伝子改変または変更は、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部のノックアウトまたはノックダウンをもたらす。遺伝子編集システム（例えば、CRISPR/Cas）を使用して標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトすることは、様々な用途に有用であり得る。例えば、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、研究目的のためにインビトロで行われ得る。エクスビボ目的のために、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、（例えば、細胞中の変異対立遺伝子をエクスビボでノックアウトし、ノックアウトされた変異対立遺伝子を含むそれらの細胞を対象中に導入することによって）標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置もしくは予防するためにまたは細胞の遺伝子型もしくは表現型を変化させるために有用であり得る。いくつかの事例において、本明細書で使用される場合、「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチド配列の機能を妨げるように標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部を欠失させることを含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能的ドメイン（例えば、DNA結合ドメイン）中、標的ポリヌクレオチド配列中にインデルを誘導することによって標的ポリヌクレオチド配列を変化させることによって達成され得る。当業者は、本明細書中に記載される詳細に基づいて、遺伝子編集システム（例えば、CRISPR/Casシステム）をどのように使用して標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトするかを容易に理解するであろう。いくつかの態様において、変更は、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部のノックアウトをもたらす。本開示のCRISPR/Casシステムを使用して標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトすることは、様々な用途に有用であり得る。例えば、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、研究目的のためにインビトロで行われ得る。エクスビボ目的のために、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、（例えば、細胞中の変異対立遺伝子をエクスビボでノックアウトし、ノックアウトされた変異対立遺伝子を含むそれらの細胞を対象中に導入することによって）標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置もしくは予防するために有用であり得る。
本明細書における「ノックイン（knock in）」、「ノックイン（knock-in）」」または「ノックイン（knockin）」」とは、宿主細胞中の染色体遺伝子座内へのDNA配列の挿入によって生じる遺伝子改変を意味する。これは、ノックインされた遺伝子、遺伝子の一部、または核酸配列を挿入された産物の発現の増加したレベル、例えばRNA転写物レベルおよび/またはコードされるタンパク質レベルの増加を引き起こす。当業者によって理解されるように、これは、遺伝子もしくはその一部の1つもしくは複数の追加のコピーを宿主細胞に挿入もしくは追加すること、または内在性遺伝子の制御成分を変化させてタンパク質の発現を増加させること、またはその発現が所望される特定の核酸配列を挿入することを含む、いくつかの方法で達成され得る。これは、プロモーターを改変すること、異なるプロモーターを追加すること、エンハンサーを追加すること、他の調節エレメントを追加すること、または他の遺伝子発現配列を改変することによって達成され得る。CRISPR/Casシステムは、ホモロジーアームを有する鋳型を使用する相同DNA修復またはプライム編集または特定の配列が編集される遺伝子書き込みによるかを問わず、配列をノックインするために使用され得る。いくつかの事例では、「ノックイン」という用語は、宿主細胞に遺伝的機能を追加する過程を意味する。これは、ノックインされた遺伝子の産物、例えばRNAまたはコードされたタンパク質のレベルの増加を引き起こす。当業者によって理解されるように、これは、遺伝子の1つまたは複数の追加のコピーを宿主細胞に加えること、またはタンパク質の発現を増加させる内在性遺伝子の制御成分を変化させることを含む、いくつかの方法で達成され得る。これは、プロモーターを改変すること、異なるプロモーターを追加すること、エンハンサーを追加すること、または他の遺伝子発現配列を改変することによって達成され得る。
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の発現レベルの変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。調節はまた、完全であり得る、すなわち、遺伝子発現は完全に不活性化されるか、もしくは野生型レベルもしくはそれを超えて活性化され、または調節は部分的であり得、遺伝子発現は部分的に低減されるか、もしくは野生型レベルのある割合まで部分的に活性化される。
さらなる局面または代替の局面において、本明細書に記載されている方法および組成物は、当業者に利用可能である任意の様式で、例えば、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）システムなどのヌクレアーゼシステムを利用して、標的ポリヌクレオチド配列を変化させることを含むことができる。CRISPR/Cas（例えば、Cas9およびCpf1）およびTALENを利用する方法の例が本明細書に詳細に記載されているが、技術はこれらの方法/システムの使用に限定されないことを理解されたい。当業者に公知の標的細胞における発現を低減または消失させるための他の標的化の方法が、本明細書において利用され得る。本明細書において提供される方法は、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変化させるために使用され得る。改変された細胞を作製するための方法は、任意の目的のために細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を変化させることを想定する。いくつかの態様において、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列は、変異細胞を産生するように変更される。本明細書で使用される場合、「変異細胞」は、その元の遺伝子型とは異なるもたらされた遺伝子型を有する細胞を指す。いくつかの例において、「変異細胞」は、例えば、正常に機能する遺伝子が遺伝子編集システム（例えば、CRISPR/Cas）を使用して変更されると、変異表現型を示す。
「機能的に連結された（operatively linked）」または「機能的に連結された（operably linked）」という用語は、両構成要素が正常に機能し、構成要素のうち少なくとも1つが他の構成要素の少なくとも1つに対して及ぼされる機能を媒介することができる可能性を許容するように構成要素が配置されている、2つ以上の構成要素（配列要素など）の並置を指して互換的に使用される。例示として、プロモーターなどの転写制御配列は、転写制御配列が1つまたは複数の転写制御因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを調節すれば、コード配列に機能的に連結されている。転写制御配列は、一般に、コード配列とシスで機能的に連結されているが、コード配列に直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、エンハンサーとコード配列が連続していなくても、コード配列に機能的に連結された転写制御配列である。
本明細書に記載されている場合、「遺伝子改変細胞」は、異種遺伝物質もしくは構築物を保有するか、または例えば部位特異的変異を含むがこれに限定されない変異によって操作されたゲノムを含む細胞である。異種遺伝物質の導入は、一般に、非改変細胞と比較して遺伝子またはタンパク質発現の変化をもたらす。RNAの導入は、細胞内で組み込まれないまたは複製しないベクターの導入と同様に、外来産物または異種産物の発現を一過性に促進することができる。細胞のゲノム中に組み込まれるかまたは細胞の核酸とともに複製する構築物の導入は、連続的な細胞分裂を通じてより安定であろう。一態様において、遺伝子改変は、体細胞をiPS細胞表現型などの幹細胞表現型に再プログラムする1つの構築物または複数の構築物の導入に追加されるか、またはそれとは別個である。遺伝子改変は、当業者に公知であり、ウイルスベクターを介した遺伝物質の導入、またはCRISPR/Casもしくは部位特異的組換えもしくはランダムな組み込みのための類似のシステムを使用した改変を含むことができるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「過剰発現された」という用語は、その標的に関して遺伝子操作されていない細胞において生じるレベルを上回るレベルでの標的遺伝子産物またはポリペプチドの発現を指す。標的遺伝子またはポリペプチドの過剰発現は、その標的遺伝子またはポリペプチドの発現の増加をもたらし、「増加」という用語は本明細書で使用されるとおりである。
本明細書において使用される「ベクター」または「構築物」という用語は、宿主細胞への送達のためにまたは異なる宿主細胞間での転移のために設計された核酸構築物を表す。本明細書において使用される場合、ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性とすることができる。「ベクター」という用語は、適切な調節要素と会合したときに複製することができ、遺伝子配列を細胞に導入することができる任意の遺伝的要素を包含する。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、関心対象の遺伝子の発現を指示することが可能であり、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを含む。ベクターまたは構築物を細胞内に導入する方法は当業者に公知であり、脂質媒介性移入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注射、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈殿、DEAE-デキストラン媒介性移入および/またはウイルスベクター媒介性移入が含まれるが、これらに限定されない。
特定の細胞集団に関する「実質的に純粋な」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約75％、好ましくは少なくとも約85％、より好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約95％純粋である細胞の集団を指す。すなわち、心筋細胞の集団に関して「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」という用語は、それぞれ約20％未満、より好ましくは約15％未満、約10％未満、約8％未満、約7％未満、最も好ましくは約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満または1％未満の心筋細胞ではない細胞を含有する細胞の集団を指す。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド（polypeptide）」および複数の「ポリペプチド（polypeptides）」を包含することが意図され、2つ以上のアミノ酸の任意の1つの鎖または複数の鎖を含む。したがって、本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」、「アミノ酸鎖」および「隣接アミノ酸配列」を含むがこれらに限定されない用語は全て「ポリペプチド」の定義に包含され、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれの代わりにも、またはこれらの用語のいずれとも互換的に使用され得る。この用語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解切断、翻訳後プロセシングまたは1つもしくは複数の天然に存在しないアミノ酸を含めることによる修飾を含むがこれらに限定されない、1つまたは複数の翻訳後修飾を受けたポリペプチドをさらに含む。慣用の命名法が、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド構造について当技術分野に存在する。例えば、アミノ酸を記載するために一文字および三文字の略語が広く使用されている: アラニン（A; Ala）、アルギニン（R; Arg）、アスパラギン（N; Asn）、アスパラギン酸（D; Asp）、システイン（C; Cys）、グルタミン（Q; Gln）、グルタミン酸（E; Glu）、グリシン（G; Gly）、ヒスチジン（H; His）、イソロイシン（I; Ile）、ロイシン（L; Leu）、メチオニン（M; Met）、フェニルアラニン（F; Phe）、プロリン（P; Pro）、セリン（S; Ser）、スレオニン（T; Thr）、トリプトファン（W; Trp）、チロシン（Y; Tyr）、バリン（V; Val）およびリジン（K; Lys）。本明細書において提供されるアミノ酸残基は、「「L」」異性体形態であることが好ましい。しかしながら、ポリペプチドの所望の特性が保持されていれば、任意のL-アミノ酸残基を「D」異性体形態の残基で置換し得る。
本明細書で使用される場合、「発現」または「発現された」または「に関して陽性」という用語は、検出可能なレベルの核酸、ベクターまたはポリペプチドを有する細胞（例えば、心筋細胞）を指す。核酸、ベクターまたはポリペプチドは、当業者に利用可能な任意の方法によって検出され得る。例えば、本明細書に記載されているポリペプチドは、そのポリペプチドの発現を誘導するベクターまたは作用因子と接触させた後に心筋細胞によって発現させることができる。発現は、心筋細胞による一過性のまたは安定な発現であり得る。
本明細書で使用される「マーカー」という用語は、細胞の特徴および/または表現型を記載するために使用される。マーカーは、例えば、関心対象の特徴を含む細胞を選択するために使用することができ、具体的な細胞によって変化し得る。マーカーは、特定の細胞型の細胞、または細胞型によって発現される分子の形態的、構造的、機能的または生化学的（酵素的）特徴を問わない、特徴である。一局面において、このようなマーカーはタンパク質である。このようなタンパク質は、当技術分野で利用可能な抗体または他の結合分子のためのエピトープを有することができる。しかしながら、マーカーは、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖類、核酸およびステロイドを含むがこれらに限定されない、細胞内または細胞上に見られる任意の分子からなることができる。形態学的特徴または形質の例としては、形状、サイズおよび核対細胞質比が挙げられるが、これらに限定されない。機能的特徴または特質の例としては、特定の基材に付着する能力、特定の色素を取り込むまたは排除する能力、特定の条件下で移動する能力および特定の系統に沿って分化する能力が挙げられるが、これらに限定されない。マーカーは、当業者に利用可能な任意の方法によって検出され得る。マーカーは、形態学的特徴の非存在またはタンパク質、脂質などの非存在でもあり得る。マーカーは、ポリペプチドの存在および/または非存在の固有の特徴のパネルと、他の形態学的または構造的特徴との組み合わせであり得る。一態様において、マーカーは細胞表面マーカーである。
「分化する」または「分化している」という用語は、「分化した細胞」がその前駆細胞よりも発達経路をさらに下って進行した細胞であることを示す相対的な用語である。したがって、いくつかの態様において、本明細書で定義されているとおりの幹細胞は、続いて経路をさらに下って他の種類の前駆細胞（心筋細胞前駆体などの組織特異的前駆体など）に分化することができる系統限定された前駆細胞（例えば、ヒト心筋前駆細胞または中期原条心原性中胚葉前駆細胞）に分化することができ、次いで、ある組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持していることもありまたは保持していないこともある最終段階の分化細胞に分化することができる。幹細胞の、心筋細胞へのインビトロ分化のための方法は、当技術分野で公知であり、および/または本明細書で以下に記載される。
本明細書で使用される場合、用語「成熟」または「成熟表現型」または「成熟心筋細胞」は、心筋細胞に適用される場合には、成体心筋細胞に類似した表現型を含み、胎児心筋細胞の少なくとも1つの特徴を含まない細胞の表現型を指す。いくつかの態様において、インビトロで分化した細胞の増加した成熟度を示すマーカーとしては、電気的成熟度、代謝的成熟度、遺伝的マーカー成熟度、および収縮的成熟度が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「処置すること」、「処置」または「投与すること」は、所望の効果が生じるように、心臓またはその領域などの所望の部位で本明細書に記載されている組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、本明細書に記載されている組成物を対象に配置する文脈において互換的に使用される。本明細書に記載されている作用因子、心筋細胞または組成物は、対象の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。対象への投与後の作用因子の半減期は、数分、数時間または数日という短期、例えば24時間～数日から数年の長さ、すなわち長期であり得る。任意の局面のいくつかの態様において、「処置」という用語は、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が阻害されかつKCNJ2活性が刺激される心筋細胞を含む本明細書に記載されている組成物の投与を指す。投与は、その必要がある対象への直接注射（例えば、標的細胞または組織に直接投与される）または心臓内注射によって心筋細胞を接触させることによって行うことができる。投与は、一過性、局所性または全身性であり得る。これらの用語はまた、対象が疾患の少なくとも1つの症候の軽減または疾患の改善、例えば有益なまたは所望される臨床結果を有するように、有効量の本明細書に記載されている細胞を対象に投与することを含むことができる。本技術において、有益なまたは所望される臨床的結果としては、1つもしくは複数の症候の緩和、疾患の程度の減弱、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延もしくは減速、疾患状態の軽減もしくは軽快および寛解（部分的かまたは完全かを問わない）が挙げられるが、これらに限定されず、検出可能かまたは検出不能かを問わない。処置することは、処置を受けない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを指すことができる。したがって、当業者は、処置は疾患症状を改善することができるが、疾患の完全な治癒ではないことがあり得ることを認識する。いくつかの態様において、疾患または障害の1つまたは複数の症候は、疾患の処置時に少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％または少なくとも50％緩和される。
いくつかの態様において、本明細書で言及される心障害、心疾患または心臓損傷（例えば、心筋梗塞）の「処置をする」および「処置」という用語は、心機能を増強し、および/または心筋細胞生着を増強し、および/または処置された領域の心筋細胞移植もしくは移植片血管新生化を増強し、したがって例えば心臓の機能を改善する治療的介入を指す。すなわち、心臓の「処置」は、心臓の機能（例えば、梗塞巣内の増強された機能）および/または本明細書に記載されている組成物で処置された他の部位に向けられる。例えば、左室収縮末期径（LVESD））または心拍出量を測定することによって評価される場合に、以下のような治療前の以下のような機能と比較して、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも90％、少なくとも100％またはそれを超えて、例えば、2倍、5倍、10倍またはそれを超えて、最大で完全機能までおよび完全機能を含んで、心臓の機能を改善する治療アプローチは、有効な処置と考えられる。有効な処置は、有効な処置と考えられるために、心疾患または障害の基礎を成す原因を治癒するか、または直接影響を及ぼす必要はない。
いくつかの態様において、「処置」は、例えば、1つもしくは複数の症候の緩和、疾患の程度の減弱、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延もしくは減速、疾患状態の軽減もしくは軽快および寛解（部分的かまたは完全かを問わない）を含むが、これらに限定されず、検出可能かまたは検出不能かを問わない有益なまたは所望される臨床的結果を評価することによって、有効性に関して評価され得る。処置することは、処置を受けない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを指すことができる。したがって、当業者は、処置は心障害、心疾患または心臓損傷を改善し得るが、疾患の完全な治癒ではないことがあり得ることを認識する。いくつかの態様において、疾患または障害の1つまたは複数の症候は、心障害、心疾患または心臓損傷の処置時に、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％または少なくとも50％緩和される。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、損傷、疾患または障害を含むがこれらに限定されない疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症候を緩和するために必要とされる心筋細胞の集団の量を指す。「有効量」は、所望の効果を提供するのに、例えば、心筋梗塞後に梗塞領域を有する対象を処置する、心筋細胞の生着を改善する、心臓損傷後の心不全の発症を予防する、移植片の血管新生化を増強するなどに十分な組成物の量に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、心臓疾患もしくは障害を有するか、または心疾患もしくは障害のリスクがある者などの典型的な対象に投与された場合に特定の効果を促進するのに十分である、ヒト心筋細胞またはこのような細胞の組成物の量を指す。本明細書で使用される有効量はまた、疾患の症候の発症を予防もしくは遅延するのに、疾患症候の経過を変化させる（例えば、限定されないが、疾患の症候の進行を遅らせる）のに、または疾患の症候を逆転させるのに十分な量を含む。任意の与えられた症例に対しては、適切な「有効量」は、日常的な実験操作を用いて、当業者によって決定され得ることが理解される。
本技術の目的に関して、疾患処置の有益なまたは所望される臨床的結果としては、1つもしくは複数の症候の緩和、疾患の程度の減弱、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延もしくは減速、疾患状態の軽減もしくは軽快および寛解（部分的かまたは完全かを問わない）が挙げられるが、これらに限定されず、検出可能かまたは検出不能かを問わない。
本明細書で使用される場合、「移植不整脈」または「EA」という語句は、心臓細胞または心筋細胞の移植片の投与後に生じる新規かつ異常な心調律または心拍数であり、心臓再筋肉化療法の重篤な合併症であり得る。移植不整脈は、心臓移植片移植後に観察され、一般に、数日から数週間にわたって一過性に持続する。移植不整脈は、対象における心臓突然死および心不全を引き起こし得る。
本明細書中で使用される場合、用語「接触させる」は、細胞に関して使用されるときには、作用物質、表面、ホルモンなどを、細胞と作用物質、表面、ホルモンなどとの物理的接触を可能にする様式で細胞に導入すること、および細胞においてmiRNA、ポリペプチドまたはその他の発現産物などの作用物質の発現を可能にする、遺伝子構築物またはベクターなどの要素を導入することの両方を包含する。作用物質を発現するように遺伝子改変された細胞はその作用物質と「接触され」ており、その作用物質を発現するその細胞の子孫も同様であることを理解されたい。
本明細書で使用される場合、「疾患」または「障害」という用語は、対象のゲノム、生理学または挙動または健康における1つまたは複数の異常によって部分的にまたは完全に、直接的にまたは間接的に引き起こされる疾患、症候群または障害を指す。疾患または障害は、心疾患または障害であり得る。
本明細書で使用される場合、「心疾患」という用語は、対象の心臓組織に影響を及ぼす疾患を指す。心疾患の非限定的な例としては、心筋症、心不整脈、心筋梗塞、心不全、心肥大、QT延長症候群、不整脈源性右室異形成（ARVD）、カテコールアミン誘発性多形性心室性頻拍（CPVT）、バース症候群およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「移植不整脈」という用語は、対象における新しい心筋の導入もしくは生成によって引き起こされる、または対象における新しい心筋の導入もしくは生成に関連する心拍数または調律の乱れを指す。移植不整脈の重要な特徴は、洞房結節または房室結節からではなく、生着部位から刺激が発生することである。調律の乱れは、正常な洞調律からの任意の反復的または長期的な逸脱である。心拍数の乱れには、新たな心筋細胞を対象の心臓組織に誘導または導入した際の、対象の正常な安静時心拍数の少なくとも10％の（例えば、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％またはそれを超える）上または下への逸脱を含む。一態様において、移植不整脈は、例えば、例えば梗塞の修復を促進するためにまたは例えば心筋症において心機能を増強するために投与される心筋細胞の移植物におけるように、インビトロで分化した心筋細胞を含むがこれに限定されない外因性心筋細胞の心臓組織への導入によって引き起こされるか、またはそれに関連する。別の態様において、移植不整脈は、100拍/分を上回る心拍数である。別の態様において、心拍数または調律の乱れは長く、例えば、1日または観察期間の5％を超えて持続する。いくつかの態様において、本明細書に記載されている心筋細胞（インビトロで分化したヒト心筋細胞を含む）の移植後の移植不整脈の低下は、移植前と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、またはそれを超える低下を含む。移植不整脈の低下はまた、移植前と比較して、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、少なくとも100倍以上またはそれを超える低下を含み得る。いくつかの態様において、移植前とは、任意の細胞移植の前である。いくつかの態様において、移植前には、以前の細胞移植物が、（本明細書に記載されているように）少なくとも部分的に阻害されたHCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性ならびに少なくとも部分的に刺激されたKCNJ2活性の全てを有しているわけではない細胞を含んだ場合が含まれる。
「患者」、「対象」または「個体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、動物、特にヒト、例えばそこから細胞を得ることができるヒト、および/または本明細書に記載されている細胞を用いた、予防的処置を含む処置が提供されるヒトを指す。本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」という用語は、本明細書では互換的に使用され、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシなどの哺乳動物、およびニワトリ、両生類、爬虫類などの非哺乳動物を含む。任意の局面の一態様において、対象はヒトである。任意の局面の別の態様において、対象は、疾患モデルとしての実験動物または動物代替物である。任意の局面の別の態様において、対象は愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、ラット、モルモット、ハムスターなど）を含む家畜である。対象は、疾患に対する処置を以前に受けたことがあり得るか、または疾患に対する処置を受けたことがないことがあり得る。対象は、疾患を有すると以前に診断されたことがあり得るか、または疾患と診断されたことがないことがあり得る。しかしながら、有利には、対象は、ヒト、または家畜哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなどまたは畜産哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタなどのその他の哺乳動物などの哺乳動物である。
本明細書で使用される場合、「移植物」、「移植」、「移植する」、「生着する」、「生着」、「移植片」、「移植術」、「投与する」、「導入する」または「植え付ける」という用語は、所望の効果が生じるように、損傷または修復の部位などの所望の部位に、導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、本明細書に記載されている細胞、例えば幹細胞由来心筋細胞の対象への配置の文脈で使用される。細胞、例えば心筋細胞またはそれらの分化した子孫（例えば、心臓線維芽細胞など）および心筋細胞は、心臓に直接植え付けることができ、または対象中の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができ、植え付けられた細胞または細胞の成分の少なくとも一部は生存している。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば24時間～数日という短期から数年、すなわち長期の生着であり得る。当業者が理解するように、心筋細胞は、心臓が細胞死を含む急性損傷から治癒することができる程度まで増殖しないので、心筋細胞の長期生着が心筋細胞として所望される。他の態様において、細胞は、腹腔内または静脈内経路などの間接的な全身投与経路を介して投与され得る。
本明細書で使用される場合、「足場」という用語は、細胞の接着および増殖に適した表面を提供する生体適合性材料を含む構造を指す。足場は、機械的安定性および支持をさらに提供することができる。足場は、増殖している細胞の集団によって取られる三次元形状または形態に影響を与えるかまたはその範囲を定めるように、特定の形状または形態であり得る。このような形状または形態としては、限定されないが、薄膜（例えば、第3の寸法よりも実質的に大きい2つの寸法を有する形態）、リボン、コード、シート、平板ディスク、円柱（cylinders）、球体、3次元無定形形状などが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「基材」は、細胞の接着および増殖に適した表面を提供する生体適合性材料を含む構造を指す。ナノパターン化またはマイクロパターン化された基材は、機械的安定性および支持をさらに提供することができる。基材は、増殖している細胞の集団によって取られる三次元形状または形態に影響を与えるかまたはその範囲を定めるように、特定の形状または形態であり得る。このような形状または形態としては、限定されないが、薄膜（例えば、第3の寸法よりも実質的に大きい2つの寸法を有する形態）、リボン、コード、シート、平板ディスク、円柱、球体、3次元無定形形状などが挙げられる。基材は、基材上での操作された組織の形成を可能にするためにナノパターン化またはマイクロパターン化され得る。
本明細書で使用される場合、「対象において植え込み可能」という用語は、植え込み時に宿主生物において認識可能な免疫応答を生成しない任意の非生物（例えば、無細胞）の植え込み可能な構造を指す。したがって、植え込み可能な構造は、例えば、刺激物であるべきではないか、もしくは刺激物を含有するべきではなく、またはLPSなどを含有するべきではない。
本明細書で使用される「作用物質」という用語は、限定するものではないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどの任意の化合物または物質を意味する。「作用物質」は、限定するものではないが、合成のおよび天然に存在するタンパク質性および非タンパク質性の実体を含む、任意の化学物質、実体または部分であり得る。任意の局面のいくつかの態様において、作用物質は、核酸、核酸類縁体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、DNAザイム、糖タンパク質、siRNA、リポタンパク質、アプタマーを含むがこれらに限定されない核酸、アミノ酸または炭水化物のオリゴマー、ならびにこれらの修飾および組み合わせなどである。ある態様において、作用物質は、化学的部分を有する小分子である。例えば、化学的部分としては、置換されていないまたは置換された、アルキル、芳香族またはヘテロシクリル部分が挙げられ、マクロライド、レプトマイシンならびにこれらの関連する天然生成物または類縁体が含まれる。化合物は、所望の活性および/もしくは特性を有することが公知であり得、または多様な化合物のライブラリーから選択することができる。
作用物質は、有機金属分子、無機分子、遺伝子配列などを含み得る1つまたは複数の化学クラス、例えば有機分子からの分子であり得る。作用物質は、1もしくはそれを超えるタンパク質からの融合タンパク質、キメラタンパク質（例えば、関連する分子または異なる分子の機能的に重要な領域のドメイン交換または相同的組換え）、合成タンパク質または置換、欠失、挿入およびその他のバリアントを含むその他のタンパク質変異形でもあり得る。
「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範疇で、合理的な利益/リスク比に相応して、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答またはその他の問題もしくは課題なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適している化合物、材料、組成物、担体および/または剤形を表すために、本明細書において使用される。
「減少する」、「低下した」、「低下」または「阻害する」という用語は全て、統計学的に有意な量での、特性、レベルまたは他のパラメータの減少または低減を意味するために、本明細書において使用される。いくつかの態様において、「低下する」、「低下」または「減少する」または「阻害する」は、典型的には、基準レベル（例えば、所定の処置の非存在）と比較して少なくとも10％の減少を意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％またはそれを超える減少を含むことができる。本明細書において使用される「低下」または「阻害」は、基準レベルと比較して完全な阻害または低下を包含しない。「完全な阻害」は、基準レベルと比較して100％の阻害である。減少は、好ましくは、所定の障害のない個体について正常範囲内として受容されるレベルまで低下し得る。
「増加した」、「増加する（increase）」、「増加する（increases）」、「増強する」または「活性化する」という用語は全て、統計学的に有意な量での、特性、レベルまたは他のパラメータの増加を一般的に意味するために本明細書で使用される。誤解を避けるために、「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語は、基準レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増加、または最大100％かつ100％を含む増加、または10～100％の任意の増加、または基準レベルと比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、少なくとも約20倍の増加、少なくとも約50倍の増加、少なくとも約100倍の増加、少なくとも約1000倍の増加もしくはそれを超える増加を意味する。本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、増加または減少させるという用語が本明細書で定義されているとおりに、所与のパラメータを増加または減少させることを含む効果を指す。
本明細書において使用される場合、「基準レベル」は、正常な、その他影響を受けていない細胞集団または組織（例えば、健康な対象から得られた生物学的試料または事前の時点で対象から得られた生物学的試料、例えば、疾患と診断される前の患者から得られた生物学的試料、または本明細書に開示された組成物、ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードする核酸と接触されていない生物学的試料）を指す。
本明細書で使用される場合、「適切な対照」または「適切な対照細胞」または「他の対照」または「他の対照細胞」は、未処理の、その他同一の細胞または集団（例えば、本明細書中に記載される作用物質または組成物によって接触されなかったか、または非対照細胞と比較して、同じように接触されなかった、例えば、異なる期間接触された生物学的試料）を指す。これには、1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない心筋細胞または他の細胞が含まれ得る。
本明細書で使用される場合、インビトロで分化した細胞（例えば、心筋細胞）またはインビトロ分化細胞の培養物に対して適用される「表現型の特徴」という用語は、細胞機能の尺度としての、本明細書に記載されているパラメータのいずれをも指す。本明細書に記載されている「表現型の特徴の変化」は、基準レベルまたは適切な対照に対する機能的特性の統計学的に有意な増加または減少によって示される。
「統計学的に有意な」または「有意に」という用語は、統計学的有意性を表し、一般的には、2標準偏差（2SD）またはそれより大きい差を意味する。
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、提示された定義された要素に加えて他の要素も存在することができることを意味する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
「～からなる」という用語は、態様のその記述中に記載されていない任意の要素を除外する、本明細書に記載されている組成物、方法およびそれらのそれぞれの構成要素を指す。
本明細書で使用される場合、「～から本質的になる」という用語は、所与の態様に対して必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその態様の基本的および新規なまたは機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。
単数形の用語「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に反対を表さなければ、複数表記を含む。同様に、「または」という用語は、文脈が明確に反対を表さなければ、「および」を含むものとする。本開示の実施または試験において、本明細書に記載されているものと類似のまたは同等の方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料が以下に記載されている。「e.g.」という略号は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書において、非限定的な例を表すために使用される。したがって、「e.g.」という略号は、「例えば」という用語と同義である。
さらに、文脈上別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
実施例または別段の指示がある場合以外、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。「約」という用語は、百分率に関連して使用される場合、±1％を意味することができる。
添付の特許請求の範囲は、一切の任意の要素を除外するように起草され得ることに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の記載に関連した「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用または「否定的な」限定の使用のための先行詞としての役割を果たすことを意図している。本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載および例示された個々の態様の各々は、本技術の範囲または精神から逸脱することなく、任意の他のいくつかの態様の特徴から容易に分離されるかまたは任意の他のいくつかの態様の特徴と組み合わせられる個別の構成要素および特徴を有する。任意の記載された方法は、記載された事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料も、本技術の実施または試験において使用され得るが、代表的な例示的な方法および材料がここで記載される。
別段の定義がなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本技術が属する分野において通常の技術を有する者によって一般に理解されているものと同一の意味を有する。値の範囲が提供される場合、文脈上明確に反対の指示がない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の10分の1までの各介在する値、およびその記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在する値は、本技術内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、そのより小さな範囲に独立して含まれ得、表記された範囲内の任意の具体的に除外された限界に服して、本技術内にも包含される。表記された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方または両方を除外した範囲も、本技術に含まれる。ある種の範囲は、本明細書では、「約」という用語が先行する数値で示されている。「約」という用語は、本明細書において、「約」という用語が前に置かれた正確な数、およびその用語が前に置かれた数に近い数またはおよそその用語が前に置かれた数である数に対する文言上のサポートを提供するために使用される。ある数が具体的に記載された数に近いか、またはおよそ具体的に記載された数であるかどうかを判定する際には、この記載されていない近い数またはおよその数は、示された文脈において、具体的に記載された数の実質的同等物を与える数であり得る。
本明細書で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。さらに、引用された各刊行物、特許または特許出願は、それに関して刊行物が引用されている主題を開示および説明するために参照により本明細書に組み入れられる。いずれの刊行物の引用も、出願日より前のその開示に対するものであり、本明細書に記載されている技術が先行技術を理由にそのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供されている公開日は実際の公開日とは異なることがあり得、これは独立して確認する必要があり得る。
本技術をさらに記載する前に、本技術は、記載されている特定の態様に限定されず、したがって当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本技術の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の態様を記載することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本明細書で使用される見出しは限定ではなく、単に読み手を導くことを意図しているが、主題は、一般に、本明細書に開示されている技術に適用されることも理解されたい。
心血管疾患
いくつかの局面において、その必要がある対象における心臓損傷または心疾患もしくは障害の処置および/または予防のための方法が本明細書において提供される。本明細書に記載されている方法は、心臓の構造および/または機能に対する病理学的損傷をもたらすものなどの多数の疾患またはそれらの症候を処置し、改善し、予防し、またはその進行を遅らせるために使用され得る。
心血管疾患は、対象の心臓および/または循環系に影響を及ぼす疾患である。そのような心疾患または心臓関連疾患には、心筋梗塞、心不整脈、心不全、アテローム性心疾患、心筋症、先天性心臓欠陥（例えば、緻密化障害心筋症、中隔欠損、左心低形成）、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心肥大、心筋炎、不整脈源性右室異形成（ARVD）、QT延長症候群、カテコールアミン誘発性多形性心室性頻拍（CPVT）、バース症候群、弁狭窄、逆流、虚血、細動、多形性心室性頻拍およびデュシェンヌ型または関連心疾患などの筋ジストロフィーおよび心肥大が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、本明細書に記載されている方法は、心血管疾患を処置し、改善し、予防し、またはその進行を遅らせるために使用することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載されている方法は、心筋梗塞、心不整脈、心不全、アテローム性心疾患、心筋症、先天性心臓欠陥（例えば、緻密化障害心筋症、中隔欠損、左心低形成）、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心肥大、心筋炎、ARVD、QT延長症候群、CPVT、バース症候群、弁狭窄、逆流、虚血、細動、多形性心室性頻拍およびデュシェンヌ型または関連心疾患などの筋ジストロフィーおよび心肥大を処置し、改善し、予防し、またはその進行を遅らせるために使用することができる。
「心イベント」という用語は、心筋損傷、心筋梗塞、心室細動、狭窄、不整脈などの発生を指す。いくつかの態様において、本明細書に記載されている方法は、心イベントを処置し、改善し、予防し、または心イベントの進行を遅らせるために使用することができる。
心血管疾患の症候には、失神、疲労、息切れ、胸痛および動悸が含まれ得るが、これらに限定されない。心血管疾患は、一般に、身体検査、血液検査、および/または心電図（EKG）によって診断される。異常なEKGは、対象が異常な心調律または心不整脈を有するという指標である。不整脈を診断する方法は、当技術分野で公知である。いくつかの態様において、本明細書に記載されている方法は、心血管疾患を処置し、改善し、予防し、またはその症候の進行を遅らせるために使用することができる。
心臓の電気生理学的機能および収縮機能は、厳密に制御されたプロセスである。イオンチャネルの調節または収縮機能が心臓細胞または組織において破壊されると、時として致命的となり得る心不整脈をもたらし得る。心疾患は依然として世界中で主要な死因である。
ヒト幹細胞由来の心筋細胞は、心筋梗塞に起因する心血管疾患および心臓損傷のための有望な処置として浮上している。しかしながら、既存のモデルにおけるインビトロで分化した心筋細胞の機能的成熟度は一般に不足しており、これらの心筋細胞は生着後に不整脈を引き起こすことがあり得る。理論に束縛されることを望むものではないが、独自のインパルス生成活性を有する外因性心筋細胞の導入は、心臓の厳密に調節された電気生理学的機能を妨害し、不整脈を引き起こす可能性を有し、インビトロで分化した心筋細胞移植片でとりわけ知られているが、この効果は、例えば、他の供給源に由来する心筋細胞が心臓組織に移植される場合にも起こり得る。
一局面において、心血管疾患を処置する組成物および方法が本明細書に記載されている。別の局面において、心筋細胞の心臓移植片の対象レシピエントにおける移植不整脈を回避し、予防し、処置し、または改善する方法が本明細書に記載されており、この方法は、本明細書に記載されているインビトロで分化したヒト心筋細胞、本明細書に記載されている薬学的組成物、本明細書に記載されている移植組成物を対象に投与する工程、または本明細書に記載されている心臓送達装置を介して送達される薬理学的に操作されたもしくは遺伝子操作された心筋細胞もしくはそれらの任意の組み合わせと心臓組織を接触させる工程を含む。この局面および本明細書において提供される全ての他の局面のいくつかの態様において、方法は、1つまたは複数の遺伝子改変を含むインビトロで分化したヒト心筋細胞と組み合わせた1つまたは複数の薬学的組成物の組み合わせを対象に投与することを含む。この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様において、対象は、イバブラジンなどのHCN4チャネルインヒビターが投与される。この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、対象は、ミブレファジルまたはML-218からなる群より選択されるCACNA1Hチャネルインヒビターが投与される。
任意の局面のいくつかの態様において、対象は、心血管疾患または心イベントを有するか、または有するリスクがある。
任意の局面のいくつかの態様において、心血管疾患を有する対象は、心臓細胞移植片を必要としているか、心臓細胞移植片を受けているか、または心臓細胞移植片を受けたことがある。いくつかの態様において、対象は、移植不整脈のリスクがあるか、移植不整脈を有するか、または移植不整脈と診断されている。
心臓のイオンチャネル
単一の心筋細胞による活動電位（AP）の伝播は、イオンチャネルの電気化学的勾配に従う、イオンチャネルの調律的な開放と閉鎖を介して起こる。APは、イオンチャネルの多く存在する種類およびその相に存在する電流に応じて異なる相に分割される（0から4まで、実施例中の図1Aも参照）。成体心室心筋細胞と比較して、hPSC-CMのAPの特徴としては、より脱分極した第4相（静止膜電位に対応する）およびより短いAP持続時間（第2/3相）が挙げられ（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるKarbassi E,et al.”Cardiomyocyte maturation:advances in knowledge and implications for regenerative medicine.Nat Rev Cardiol.2020 Jun;17（6）:341-359を参照されたい）、これらは自発的活動電位（すなわち、自動性）の増加した生成をもたらす。
活動電位の脱分極および再分極の相は、心電図（ECG）に反映される。ECGは、ある期間にわたって心臓の電気的活動を測定する。平均心房脱分極（P波）および心室再分極（QT間隔）持続時間は、ECG上で明らかである。心調律の異常は、ECGによって検出され得、心筋の低下したポンピング効率をもたらし得る。心臓の活動電位生成の分子的機序は当技術分野で周知であり、例えば、Roden,D.M.et al.”Cardiac ion channels.”Annu.Rev.Physiol.64,431-475（2002）;Grant,A.O.”Cardiac Ion Channels.”Circ.Arrhythm.Electrophysiol.2,185-194（2009）によって記載されている。心臓のインパルス伝播および関連する不整脈の分子的機序は、例えば、その各々の内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるAndre G.Kleber and Yoram Rudy et al.,”Basic Mechanisms of Cardiac Impulse Propagation and Associated Arrhythmias”Physiological Reviews.2004 84:2,431-488に概説されている。
一般に、成体哺乳動物の心筋細胞では、第4相は、内向き整流性カリウムチャネルによって安定化される心臓細胞の静止膜電位である。内向き整流性カリウムチャネル（Kir2.x）サブファミリーメンバーは、主に心臓IK1電流を媒介するが、他の内向き整流器も心臓の興奮性に関与し得る。静止膜電位は、典型的には、健康な成体心室筋細胞では-90mVである。活動電位の初期相である第0相は、電位開口型ナトリウムチャネル、主にNaV1.5（SCN5Aによってコードされる）を介したナトリウムイオンの流入によって引き起こされる急速な脱分極相である。第1相は、ナトリウムチャネルが不活性化され、一過性の外向きカリウム電流（Ito）、例えばKV4.2（KCND2によってコードされる）の活性化が存在する急速な再分極の相である。第2相は、外向きカリウム電流と釣り合ったL型カルシウムチャネルCav1.2（CACNA1Cによってコードされる）によるカルシウムイオンの流入を原因とするプラトー相である。ナトリウム-カルシウム交換体（NCX1、SLC8A1によってコードされる）は、細胞内カルシウムを細胞外ナトリウムイオンと交換することによって細胞内カルシウムを制御し、ITPR2は小胞体からのカルシウム放出を制御する。活動電位の第3の相である第3相は、膜電圧を静止電位に復活させる急速な再分極である。この相は、主に、hERG（IKr）としても知られる電位開口型カリウムチャネルKV11.1（KCNH2によってコードされる）およびKVLQT1（IKs）としても知られる、KCNQ1によってコードされるKV7.1によって引き起こされる。
発現および機能イオンチャネルおよびイオン電流を測定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ホールセルパッチクランプまたはマイクロ電極アレイである。例えば、Liang P,et al.,”Patient-Specific and Genome-Edited Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Elucidate Single-Cell Phenotype of Brugada Syndrome.”J Am Coll Cardiol.Nov 8;68（19）:2086-2096（2016）;Germanguz,I.et al.,”Molecular characterization and functional properties of cardiomyocytes derived from human inducible pluripotent stem cells.”J.Cell.Mol.Med.15,38-51（2011）;およびSchwartz,P.J.,Crotti,L.,Zipes,D.＆Jalife,,J.Cardiac Electrophysiology:From Cell to Bedside.Elsevier/Saunders,（2009）を参照されたく、これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。このような方法は、例えば、心臓細胞イオンチャネルの活性、および/または例えば薬理学的もしくは遺伝的手段を介したこのような活性の調節を監視するために使用され得る。インビトロで分化した心筋細胞の電気生理学的表現型を特性決定する方法は、以下の他の箇所でさらに論述されている。
成体心筋細胞とは対照的に、インビトロで分化した心筋細胞は、天然の成体心臓組織と生理学的に同等ではない機能的に未熟な胎児様表現型を発現することができる。具体的には、成体CMとは異なり、インビトロで分化した心筋細胞は、KCNJ2の高レベルの発現または活性を欠き、-50～-60mVの不安定なRMP範囲を引き起こす。さらに、心臓の伝導細胞内で顕著であるT型カルシウムチャネルは、成体心室心筋細胞内には存在しないが、多能性幹細胞由来心筋細胞内では様々な量で検出され、多能性幹細胞由来心筋細胞の不均一な分化によるものである可能性が最も高い。例えば、Bkaily et al.,”Angiotensin II-induced increase of T-type Ca2＋current and decrease of L-type Ca2＋current in heart cells.”Peptides 26,1410-1417.（2005）;Ono and Iijima,”Cardiac T-type Ca2＋channels in the heart.”J.Mol.Cell.Cardiol.48,65-70.（2010）を参照されたく、これらの各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
多能性幹細胞由来の心筋細胞間の未成熟な細胞-細胞接続も同様に、それらの電気生理学的機能に影響を及ぼす。例えば、参照によりその内容の全体が本明細書に組み入れられるNoorman,M.et al.,”Cardiac cell-cell junctions in health and disease:electrical versus mechanical coupling.J.Mol.Cell.Cardiol.47,23-31（2009）を参照されたい。
成体心筋細胞と比較したインビトロで分化した心筋細胞間の機能的および形態的差異のさらなる総説は、例えば、参照によりそれらの各々の内容の全体が本明細書に組み入れられるRobertson,C.,et al.,”Concise review:Maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.”Stem Cells 31,829-837（2013）;およびScuderi GJ and Butcher J.”Naturally engineered maturation of cardiomyocytes.”Front Cell Dev Biol.（2017）によって記載されている。例えば、参照によりそれらの各々の内容の全体が本明細書に組み入れられるSartiani,L.et al.,”Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells:a molecular and electrophysiological approach.”Stem Cells 25,1136-1144（2007）;Protze,S.,et al.”Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.”Nat Biotechnol 35,56-68（2017）;およびMa,J.,et al.”High purity human induced pluripotent stem cell（hiPSC）derived cardiomyocytes:electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.”Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.301,H2006-H2017（2011）も参照されたい。
インビトロで分化した心筋細胞によって示される未熟な電気的表現型に関連する課題を克服するために、本明細書に記載されている組成物および方法は、その必要がある対象中に移植されたときに移植不整脈を引き起こさないより安全なインビトロで分化した心筋細胞を生成するために使用され得る。
一局面において、HCN4、CACNA1H（Cav3.2）およびSLC8A1（NCX1）活性が阻害され、ならびにKCNJ2（Kir2.1）活性が刺激される、インビトロで分化したヒト心筋細胞が本明細書に記載されている。この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様において、HCN4チャネルは、インヒビター薬物イバブラジンを使用して阻害される。この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、CACNA1Hチャネルは、ミブレファジルまたはML-218からなる群より選択されるインヒビター薬物の1つまたは複数を使用して阻害される。
この局面および本明細書に記載されている全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、KCNJ2遺伝子のゲノム挿入によって過剰発現され、SLC8A1ポリペプチドは、SLC8A1遺伝子のゲノム修飾によって阻害され、HCN4ポリペプチドは、ゲノム修飾または薬理的作用物質（例えば、イバブラジン）での処理のいずれかによって阻害され、CACNA1Hポリペプチドは、ゲノム修飾または薬理的作用物質（例えば、ミブレファジル、ML-218、フルナリジド）での処理のいずれかによって阻害される。
別の局面において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つもしくは複数、2つ以上またはそれぞれの発現が低下しているインビトロで分化したヒト心筋細胞が本明細書に記載されている。
いくつかの態様において、KCNJ2（Kir2.1）ポリペプチドが過剰発現されている。
HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の構造および機能は、以下でさらに論じられている。
ファニーチャネル - HCN4:
HCNまたは「ファニー」または「（If）」チャネルとしても知られる、過分極活性化環状ヌクレオチド開口型カリウムチャネルは、哺乳動物の心臓におけるペースメーカー活動を維持する。HCN遺伝子によってコードされるHCNチャネルの4つのアイソフォーム、HCN1～HCN4が存在する。具体的には、HCN4は、視床皮質ニューロンおよび心臓のペースメーカー細胞の両方における調律活動を調節する。ペースメーカー活動は、心臓の活動電位の間（すなわち、拡張期中）に起こる自発的で遅い膜脱分極の相に依存する。上述のように、いくつかのイオン電流が、拡張期膜脱分極（例えば、T型およびL型Ca2＋電流）の時間経過および勾配に寄与し、そのうちの一部は自律神経系によって直接制御される。特に、過分極活性化非選択的カチオン性電流Ifの活性はcAMPによって制御される。これは、cAMPとIfチャネルの環状ヌクレオチド結合ドメイン（cNBD）との直接の相互作用を伴う。最終的に、これは、加速された拡張期脱分極および電気インパルス発生をもたらす。抗不整脈作用物質、例えばイバブラジンでファニーチャネルを遮断すると、心拍数の全体的な低下をもたらす。
HCN4は、混合したNa＋およびK＋透過性、過分極での活性化ならびに非常に遅い動態を有する。ヒトおよび動物におけるHCN4の変異は、洞不全症候群およびブルガダ症候群などの心不整脈に関連する。例えば、Milanesi,R.et al.,”Familial sinus bradycardia associated with a mutation in the cardiac pacemaker channel.”New Eng.J.Med.354:151-157,（2006）およびCrotti,L.,et al.,”Spectrum and prevalence of mutations involving BrS1-through BrS12-susceptibility genes in a cohort of unrelated patients referred for Brugada syndrome genetic testing.”J.Am.Coll.Cardiol.60:1410-1418,（2012）を参照されたい。HCN4の構造および機能に関するさらなる詳細は、例えば、Ludwig,A et al.,”Two pacemaker channels from human heart with profoundly different activation kinetics.”EMBO J.18:2323-2329,（1999）に記載されている。
HCN4の構造は、6つの推定膜貫通セグメント、ポア領域および環状ヌクレオチド結合ドメイン（cNBD）を含有する。HCN4のゲノムDNA、転写物およびポリペプチド配列は当技術分野で公知であり、例えば、ヒトHCN4ゲノム配列は、ヒト15番染色体上の位置c73368958-73319859に位置しており、GenBankアクセッション番号AJ238850、NCBI遺伝子ID: 10021およびNCBI参照配列NP_005468.1、ヒトHCN4転写物配列NCBI参照配列: NM_005477.3; ならびに以下に記載されているヒトHCN4ポリペプチドアミノ酸配列: NCBI参照NP_005468.1も参照されたい。
＞NP_005468.1カリウム/ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド開口型チャネル4［ホモ・サピエンス］
Figure 2024517810000002
本明細書において提供される組成物および方法の目的に関して、HCN4チャネル、そのオルソログまたはバリアントのレベルまたは活性は、例えば、欠失もしくは破壊のために完全長遺伝子もしくはコード配列を標的とすることによって、または例えば、機能のために必要とされる構造ドメイン（例えば、チャネルのポア形成ドメインまたはcNBDドメイン）を改変することによって、または本明細書に記載されている薬理学的改変もしくは遺伝子改変を介してチャネルを通じたイオン輸送を標的とすることによって操作され得る。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられるNof,E.,et al.,”Point mutation in the HCN4 cardiac ion channel pore affecting synthesis,trafficking,and functional expression is associated with familial asymptomatic sinus bradycardia.”Circulation 116:463-470,2007も参照されたい。
完全なノックアウトは有効であるが、いくつかの態様においては、HCN4遺伝子またはHCN4ポリペプチドのレベルは、適切な対照と比較して、例えば、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％またはそれを超えて低下させることができる。いくつかの態様において、HCN4遺伝子またはHCN4ポリペプチドの活性は、適切な対照と比較して、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％またはそれを超えて低下する。この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様において、HCN4チャネル活性は、インヒビター薬物であるイバブラジンを使用して低下または阻害される。
本明細書において提供されるイオンチャネルのレベルまたは活性を調節する方法は、本明細書の他の箇所でさらに論じられている。
T型カルシウムチャネル - CACNA1H:
電位開口型Ca2＋チャネル（VGCC）は、多くの細胞応答にとって重要なセカンドメッセンジャーであるCa2＋の流入のための重要な経路を提供する。VGCCは、それらの生物物理学的および薬理学的特性に基づいて伝統的に分類されてきた: L、N、P、QおよびR型チャネルは高電位活性化型（HVA）チャネルのファミリーを構成するのに対して、T型チャネルは低電位活性化型（LVA）として分類される。カルシウムチャネルは、膜分極時に細胞内へのカルシウムイオンの流入を媒介し、1:1:1:1の比のα1、α2/δ、βおよびγサブユニットの複合体からなる。α1サブユニットは24の膜貫通セグメントを有し、イオンが細胞内へ通過するポアを形成する。異なる遺伝子によってコードされるか、または転写物の選択的スプライシングの結果である、複合体中のタンパク質のそれぞれの複数のアイソフォームが存在する。例えば、参照によりそれらの各々の内容の全体が本明細書に組み入れられるWilliams ME,et al.,”Structure and functional characterization of a novel human low-voltage activated calcium channel.”J Neurochem.1999 Feb;72（2）:791-9およびZhang J.F.et al.,”Distinctive pharmacology and kinetics of cloned neuronal Ca2＋channels and their possible counterparts in mammalian CNS neurons.”Neuropharmacology 32,1075-1088を参照されたい。
遺伝子CACNA1Hは、本明細書においてCACNA1HまたはCav3.2とも呼ばれる一過性のまたはT型のカルシウムチャネルのαポア形成サブユニットをコードする。この型のチャネルの特殊性は、極めて負の電位での開口および電圧依存性不活性化である。T型チャネルは、中枢ニューロンおよび心臓結節細胞の両方においてペースメーカー機能を果たし、分泌細胞および血管平滑筋におけるカルシウムシグナル伝達を支える。T型カルシウムチャネルの構造および機能は当技術分野で公知である。例えば、参照によりそれらの各々の内容の全体が本明細書に組み入れられるCribbs L.L.et al.,”Cloning and characterization of alpha1H from human heart,a member of the T-type Ca2＋channel gene family.”Circ.Res.83:103-109（1998）;およびHansen PB.”Functional importance of T-type voltage-gated calcium channels in the cardiovascular and renal system:news from the world of knockout mice.”Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2015 Feb 15;308（4）:R227-37を参照されたい。
CACNA1HおよびCav3.2のゲノムDNA、転写物およびポリペプチド配列は当技術分野で公知であり、例えば、ヒトCACNA1Hゲノム配列はヒト16番染色体上の位置1153106-1221769に位置し、GenbankアクセションAAK61268.1、NCBI遺伝子ID: 8912およびNCBI参照配列NG_012647.1; ヒトCACNA1H転写物配列NCBI参照配列: NM_021098.3; および以下に記載されているヒトCACNA1H（Cav3.2）ポリペプチドアミノ酸配列: NCBI参照配列NP_066921.2も参照されたい。
＞NP_066921.2電位依存性T型カルシウムチャネルサブユニットα-1Hアイソフォームa［ホモ・サピエンス（Homo sapiens）］
Figure 2024517810000003
T型カルシウムチャネル、CACNA1H、Cav3.2、そのオルソログまたはバリアントのレベルまたは活性は、例えば、欠失もしくは破壊のために完全長遺伝子もしくはコード配列を標的とすることによって、または例えば、機能のために必要とされる構造ドメイン（例えば、ポア形成ドメイン）を改変することによって、または本明細書に記載されている薬理学的改変もしくは遺伝子改変を介してチャネルを通じたイオン輸送を標的とすることによって操作され得る。CACNA1H（Cav3.2）の構造および機能に関するさらなる詳細については、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられるRzhepetskyy Y,et al.”Cav3.2/Stac1 molecular complex controls T-type channel expression at the plasma membrane.” Channels（Austin）.2016 Sep 2;10（5）:346-354を参照されたい。
完全なノックアウトは有効であるが、いくつかの態様において、CACNA1H遺伝子またはCav3.2ポリペプチドのレベルは、適切な対照と比較して、例えば、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低下させることができる。いくつかの態様において、CACNA1H遺伝子またはCav3.2ポリペプチドの活性は、適切な対照と比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％またはそれを超えて低下する。この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様において、CACNA1Hチャネル活性は、ミブレファジルまたはML-218からなる群より選択されるインヒビター薬物の1つまたは複数を使用して低下または阻害される。
CACNA1Hのレベルまたは活性を調節する方法は、本明細書の他の箇所でさらに論じられる。
ナトリウム-カルシウム交換体 - SLC8A1:
ナトリウム-カルシウム交換体またはNCX1（溶質輸送体ファミリー8メンバーA1としても知られ、本明細書ではSLC8A1と称される）は、SLC8A1遺伝子によってコードされる。心臓ナトリウム/カルシウム交換体（NCX1）は、心臓の電気的活動に寄与する双方向カルシウム輸送体である。具体的には、Ca2＋濃度は、収縮時の高レベルと弛緩時の低レベルとの間を交互する。収縮時のCa2＋濃度の増加は、主に細胞内貯蔵部からのCa2＋の放出によるものである。しかしながら、一部のCa2＋はまた、筋鞘（細胞膜）を通して細胞に入る。弛緩時には、Ca2＋は細胞内貯蔵部内に隔離されている。細胞内貯蔵の過負荷を防ぐために、筋鞘を横切って入ったCa2＋は細胞から押し出さなければならない。Na＋-Ca2＋交換体は、弛緩時にCa2＋が細胞から押し出される主要な機構である。例えば、それらの各々の内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるShieh,B.-H.,Xia,Y.,Sparkes,R.S.,Klisak,I.,Lusis,A.J.,Nicoll,D.A.,Philipson,K.D.”Mapping of the gene for the cardiac sarcolemmal Na（＋）-Ca（2＋）exchanger to human chromosome 2p21-p23.”Genomics 12:616-617,（1992）;およびKang,T.M.,Hilgemann,D.W.”Multiple transport modes of the cardiac Na（＋）/CA（2＋）exchanger.”Nature 427:544-548,（2004）を参照されたい。
ヒトゲノムDNA、転写物およびポリペプチド配列を含むNCX1の構造および機能は公知であり、例えば、ヒトSLC8A1ゲノム配列はヒト2番染色体上の位置c40512452-40094523に位置し、GenbankアクセッションAF128524、NCBI遺伝子ID: 6546およびNCBI参照配列NC_000002.12; ヒトSLC8A1転写物配列NCBI参照配列: NM_021097.5; および以下に記載されているヒトSLC8A1（NCX1）ポリペプチドアミノ酸配列: NCBI参照配列NP_066920.1も参照されたい。
＞NP_066920.1ナトリウム/カルシウム交換体1アイソフォームA前駆体［ホモ・サピエンス（Homo sapiens）］
Figure 2024517810000004
SLC8A1、NCX1、そのオルソログまたはバリアントのレベルまたは活性は、例えば、欠失もしくは破壊のために完全長遺伝子もしくはコード配列を標的とすることによって、または例えば、機能のために必要とされる構造ドメインを改変することによって、または本明細書に記載されている薬理学的改変もしくは遺伝子改変を介してチャネルを通じたイオン輸送を標的とすることによって操作され得る操作され得る。NCX1の構造および機能に関するさらなる詳細については、例えば、それらの各々の内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるIwamoto,T.,et al.,”Salt-sensitive hypertension is triggered by Ca（2＋）entry via Na＋/Ca＋exchanger type-1 in vascular smooth muscle.”Nature Med.10:1193-1199,（2004）;Langenbacher,A.D.et al.,”Mutation in sodium-calcium exchanger 1（NCX1）causes cardiac fibrillation in zebrafish.”Proc.Nat.Acad.Sci.102:17699-17704,（2005）;およびWakimoto,K.,et al.,”Targeted disruption of Na（＋）/Ca（2＋）exchanger gene leads to cardiomyocyte apoptosis and defects in heartbeat.”J.Biol.Chem.275:36991-36998,（2000）も参照されたい。
完全なノックアウトは有効であるが、いくつかの態様において、SLC8A1遺伝子またはNCX1ポリペプチドのレベルは、適切な対照と比較して、例えば、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低下させることができる。いくつかの態様において、SLC8A1遺伝子またはNCX1ポリペプチドの活性は、適切な対照と比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％またはそれを超えて低下する。NCX1イオンチャネルのレベルまたは活性を調節する方法は、本明細書の他の箇所でさらに論じられる。
内向き整流性カリウムチャネル2 - KIR2.1 - KCNJ2
内向き整流性カリウム（Kir）チャネルは、静止膜電位および細胞興奮性の重要な制御因子である。Kirチャネルの活性は、ホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸（PIP（2））とのチャネル相互作用の完全性に決定的に依存する。例えば、それらの各々の内容全体が参照により本明細書に組み入れられるLopes,C.M.B.,et al.,”Alterations in conserved Kir channel-PIP（2）interactions underlie channelopathies.”Neuron 34:933-944,（2002）;およびDonaldson,M.R.,et al.,”PIP2 binding residues of Kir2.1 are common targets of mutations causing Andersen syndrome.”Neurology 60:1811-1816,（2003）を参照されたい。
具体的には、遺伝子KCNJ2は、心臓、肺、脳、胎盤および骨格筋中で発現される内向き整流性カリウムチャネルKir2.1（本明細書ではKCNJ2とも称される）をコードする。Kir2.1は発生のシグナル伝達を担い、心臓における細胞興奮性を調節する。例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるPlaster,N et al.,”Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome.”Cell 105:511-519,（2001）を参照されたい。したがって、KCNJ2の変異は、アンダーセン症候群、家族性心房細動9、QT短縮症候群3などの心血管疾患をもたらし得る。
ヒトゲノムDNA、転写物およびポリペプチド配列を含むKCNJ2（Kir2.1）の構造および機能は当技術分野で公知であり、例えば、ヒトKCNJ2ゲノム配列はヒト17番染色体上の位置5001-15510に位置し、GenbankアクセションAF153819、NCBI遺伝子ID: 3759およびNCBI参照配列NG_008798.1; KCNJ2のヒトcDNA配列: GenBankおよびNCBIアクセッション番号BC152811.1、AB528777.1、NM_000891.3、CP034495.1、AH009400.2、AF153820.1およびNG_008798.1; ヒトKCNJ2転写物配列NCBI参照配列: NM_000891.3、および以下に記載されているヒトKCNJ2（Kir2.1）ポリペプチドアミノ酸配列: NCBI参照配列NP_000882.1も参照されたい。
＞NP_000882.1内向き整流性カリウムチャネル2［ホモ・サピエンス（Homo sapiens）］
Figure 2024517810000005
KCNJ2（Kir2.1）、そのオルソログまたはバリアントのレベルまたは活性は、調節エレメントを改変すること、ポリペプチドをコードする配列のコピー数を増加させること、またはチャネルを介したイオン輸送を改変することによって、薬理学的にまたは本明細書に記載されている遺伝子改変によって操作され得る。さらなる詳細については、例えば、それらの各々の内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるRaab-Graham,K.,Radeke,C.M.,Vandenberg,C.A.”Molecular cloning and expression of a human heart inward rectifier potassium channel.”Neuroreport 5:2501-2505,（1994）;およびDerst,C.,et al.,”Genetic and functional linkage of Kir5.1 and Kir2.1 channel subunits.”FEBS Lett.491:305-311,（2001）を参照されたい。
いくつかの態様において、KCNJ2遺伝子またはKir2.1ポリペプチドのレベルは、適切な対照と比較して、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％またはそれを超えて増加され、例えば、少なくとも2X、3X、4X、5Xまたはそれより多くを含む。いくつかの態様において、KCNJ2遺伝子またはKir2.1ポリペプチドの活性は、適切な対照と比較して、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％またはそれを超えて増加され、例えば、少なくとも2X、3X、4X、5Xまたはそれより多くを含む。
上記のチャネルおよび交換体に加えて、他のイオンチャネルまたはそれらの調節因子も阻害または活性化され、インビトロで分化した心筋細胞の生着をさらに増強することができることが本明細書において想定される。本明細書に記載されているイオンチャネルおよび交換体のレベルまたは活性を調節する方法は、以下でさらに論述されている。
イオンチャネル発現および機能の遺伝子改変
本明細書に記載されているイオンチャネルおよび交換体（例えば、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2）の発現は、本明細書に記載されているインビトロで分化した心筋細胞が、対象への移植後に移植不整脈を引き起こし得る電気的な乱れを示さないように、変更、欠失、阻害、過剰発現または活性化され得る。これは、例えば、イバブラジン、ミブレファジルまたはML-218などの1つまたは複数のチャネル遮断薬での処置ありまたはなしで、標的配列の標準的な遺伝子編集によって達成することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載されているイオンチャネルおよび交換体（例えば、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2）の遺伝子を含む1つまたは複数の遺伝子をノックアウトし、ノックダウンし、またはその他改変するために細胞を遺伝子改変する方法は、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼおよびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（CRISPR）/Casシステムを含む部位特異的ヌクレアーゼ、ならびに当該分野で公知のニッカーゼシステム、塩基編集システム、プライム編集システムおよび遺伝子書き込みシステムを使用することを含む。これもまた、本開示の遺伝子編集システム（例えば、CRISPR/Cas）を利用して当業者に利用可能な任意の様式で達成することができる。
本明細書に記載されている任意の局面の一態様において、遺伝子編集機構/システム、例えば、RNA誘導型ヌクレアーゼおよびガイド配列、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどの発現は、心筋細胞発達系統の細胞におけるそれらの発現を促進する細胞型特異的な制御配列の調節下で発現される。本明細書の他の箇所で述べられているように、これは、例えば、心筋細胞分化プログラムが開始された後にのみ配列のノックアウト（またはノックイン）を提供する上で有益であり得る。
遺伝子編集のための標的配列は、当技術分野で公知の方法によって決定することができ、宿主細胞における遺伝子機能を阻害する方法は当技術分野で公知である。遺伝子ノックダウン、阻害および変更の非限定的な例としては、CRISPR/Casシステム（例えば、CRISPR/Cas9システム）、標的化された遺伝子切断のための転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（TALENS）、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどの使用、および阻害性核酸の発現を含むがこれに限定されない阻害性核酸の導入が挙げられる。阻害性核酸の種類の例示的な態様は、例えば、siRNA、shRNA、miRNAおよび/またはmiRNAを含むことができる。当業者は、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1の発現を標的とする阻害性核酸作用物質または遺伝子編集アプローチを設計および試験することができる。
遺伝子編集システムを調製および送達する方法は、例えば国際公開第2015/013583号; 米国特許第10,640,789号; 米国特許出願公開第2019/0367948号; 米国特許出願公開第2017/0266320号; 米国特許出願公開第2018/0171361号; 米国特許出願公開第2016/0175462号および米国特許出願公開第2018/0195089号に記載されており、それらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
CRISPR/Casシステム
いくつかの態様において、本明細書に記載されている細胞は、CRISPR（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）/Cas（CRISPR関連）システムを使用して作製される。CRISPRシステムは、最初に原核生物（例えば、細菌および古細菌）において、獲得免疫の一形態を提供する侵入するファージおよびプラスミドに対する防御に関与するシステムとして発見された。現在、CRISPRシステムは、研究および臨床用途において一般的な遺伝子編集ツールとして改良され、使用されている。一般に、CRISPRは、バクテリオファージに対する原核生物の防御機構に由来する酵素および因子を使用して、所与の細胞型において標的遺伝子配列を正確に改変するための遺伝子改変システムを総称する。CRISPR遺伝子編集システムは、Casヌクレアーゼ遺伝子をコードする配列、tracr（トランス活性化型CRISPR）配列（例えば、tracrRNAまたは活性を有する部分的tracrRNA）、tracrメイト配列（内在性CRISPRシステムの文脈では「直列反復配列」およびtracrRNA処理された部分的直列反復配列を包含する）、ガイド配列（内在性CRISPRシステムの文脈では「スペーサー」とも呼ばれる）またはCRISPR遺伝子座からの他の配列および転写物を含む、Cas遺伝子の発現に関与するかまたはCas遺伝子の活性を誘導する転写物および他の要素を含むことができる。いくつかの態様において、CRISPRシステムの1つまたは複数の要素は、I型、II型またはIII型CRISPRシステムに由来する。いくつかの態様において、CRISPRシステムの1つまたは複数の要素は、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）などの内在性CRISPRシステムを含む特定の生物に由来する。
CRISPRシステムのガイド配列は、標的配列（例えば、本明細書に記載されているHCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1）に対して相補性を有するように設計されている。使用される正確なシステムに応じて、標的配列は、任意のDNAまたはRNAポリヌクレオチド配列を含むことができる。標的配列とガイド配列との間でのハイブリダイゼーションは、CRISPR複合体の形成を促進する。活性なCRISPR複合体は、標的配列内または標的配列付近（例えば、標的配列から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50またはそれを超える塩基対以内）の一方または両方の鎖の切断をもたらす。ハイブリダイゼーションを可能にし、活性なCRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在すれば、標的配列とガイド配列との間での完全な相補性は必ずしも必要とされない。
CRISPR/Casシステムは、一般に、少なくとも2つの成分: 1つまたは複数のガイドRNA（gRNA）およびCasタンパク質を含む。Casタンパク質は、標的部位中に二本鎖切断（DSB）を導入するヌクレアーゼである。CRISPR/Casシステムは、2つの主要なクラスに分類される: クラス1システムは、核酸を分解するために複数のCasタンパク質の複合体を使用する; クラス2システムは、同じ目的のために単一の大きなCasタンパク質を使用する。クラス1はI型、III型およびIV型に分類される; クラス2は、II型、V型およびVI型に分類される。遺伝子編集用途に適合された異なるCasタンパク質としては、Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a（Cpf1）、Cas12b（C2c1）、Cas12c（C2c3）、Cas12d（CasY）、Cas12e（CasX）、Cas12f（C2c10）、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k（C2c5）、Cas13、Cas13a（C2c2）、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3およびMad7が挙げられるが、これらに限定されない。最も広く使用されているCas9はII型Casタンパク質であり、例示として本明細書に記載されている。これらのCasタンパク質は、異なる供給源種に由来することができるか、または異なる供給源種を起源とすることができる。例えば、Cas9は化膿レンサ球菌または黄色ブドウ球菌（S.aureus）に由来することができる。
元の微生物のゲノムでは、II型CRISPRシステムは、宿主ゲノム内でアレイとしてコードされるCRISPR反復配列の間に、侵入したDNAからの配列を組み込む。CRISPR反復アレイからの転写物は、それぞれが、「プロトスペーサー」配列として知られる侵入したDNAから転写された可変配列およびCRISPR反復の一部を有するCRISPR RNA（crRNA）に加工される。各crRNAは第2のトランス活性化CRISPR RNA（tracrRNA）とハイブリダイズし、これらの2つのRNAはCas9ヌクレアーゼと複合体を形成する。crRNAのプロトスペーサーがコードされた部分は、相補的な標的DNA配列が「プロトスペーサー隣接モチーフ」（PAM）として知られる短い配列に隣接していれば、相補的な標的DNA配列を切断するようにCas9複合体を導く。
その発見以来、CRISPRシステムは、細菌からヒト細胞を含む真核細胞に及ぶ幅広い範囲の細胞および生物において配列特異的DSBおよび標的化されたゲノム編集を誘導するように改変されてきた。遺伝子編集用途におけるその使用において、人工的に設計された合成gRNAが、元のcrRNA:tracrRNA複合体を置き換えた。例えば、gRNAは、crRNA、テトラループおよびtracrRNAから構成されるシングルガイドRNA（sgRNA）であり得る。crRNAは、通常、関心対象の標的DNAを認識するようにユーザが設計した相補的領域（スペーサーとも呼ばれ、通常約20ヌクレオチド長）を含む。tracrRNA配列は、Casヌクレアーゼ結合のための足場領域を含む。crRNA配列およびtracrRNA配列は、テトラループによって連結されており、それぞれが互いにハイブリダイゼーションするための短い反復配列を有し、これによりキメラsgRNAを生成する。gRNA中に存在するスペーサーまたは相補的領域配列を単に変更することによって、Casヌクレアーゼのゲノム標的を変化させることができる。相補的領域は、標準的なRNA-DNA相補的塩基対形成規則を通じて、Casヌクレアーゼを標的DNA部位に導く。
Casヌクレアーゼが機能するためには、ゲノムDNA中の標的配列のすぐ下流にPAMが存在しなければならない。Casタンパク質によるPAMの認識は、隣接するゲノム配列を不安定化し、gRNAによる配列の調査を可能にし、一致する配列が存在する場合、gRNA-DNA対形成をもたらすと考えられる。PAMの具体的な配列は、Cas遺伝子の種によって異なる。例えば、化膿レンサ球菌（S.pyogenes）由来の最も一般的に使用されるCas9ヌクレアーゼは、5'-NGG-3'のPAM配列、またはより低い効率の速度で5'-NAG-3'のPAM配列を認識し、「N」は任意のヌクレオチドであり得る。代替のPAMを有する他のCasヌクレアーゼバリアントも特性決定されて、ゲノム編集のために首尾よく使用されており、以下の表1に要約されている。
（表１）例示的なCasヌクレアーゼバリアントおよびそれらのPAM配列
Figure 2024517810000006
R＝AまたはG; Y＝CまたはT; W＝AまたはT; V＝AまたはCまたはG; N＝任意の塩基
細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変化させることができる任意のCRISPR/Casシステムを使用することができる。このようなCRISPR-Casシステムは、様々なCasタンパク質を使用することができる（Haft et al.PLoS Comput Biol.2005;1（6）e60）。CRISPR/Casシステムが細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変化させることを可能にするこのようなCasタンパク質の分子機構には、RNA結合タンパク質、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼならびにポリメラーゼが含まれる。いくつかの態様において、CRISPR/CasシステムはCRISPRI型システムである。いくつかの態様において、CRISPR/CasシステムはCRISPRII型システムである。いくつかの態様において、CRISPR/CasシステムはCRISPRV型システムである。
本明細書に記載されている遺伝子編集（例えば、CRISPR/Cas）システムは、細胞内の任意の標的ポリヌクレオチド配列を変化させるために使用することができる。当業者は、任意の特定の細胞中の変更されるべき望ましい標的ポリヌクレオチド配列が、そのゲノム配列の発現が障害と関連しているかまたはそうでなければ病原体の細胞内への侵入を容易にする任意のゲノム配列に対応し得ることを容易に理解するであろう。例えば、細胞内で変化させるための望ましい標的ポリヌクレオチド配列は、疾患に関連する単一ポリヌクレオチド多型を含有するゲノム配列に対応するポリヌクレオチド配列であり得る。
いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチド配列はゲノム配列である。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチド配列はヒトゲノム配列である。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチド配列は哺乳動物のゲノム配列である。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチド配列は脊椎動物のゲノム配列である。
いくつかの態様において、Casヌクレアーゼは、Casヌクレアーゼの活性、特異性、認識および/またはその他の特徴を変化させるための1つまたは複数の変異を含むことができる。例えば、Casヌクレアーゼは、オフターゲット効果を軽減するためにその忠実度を変化させる1つまたは複数の変異を有することができる（例えば、SpCas9のeSpCas9、SpCas9-HF1、HypaSpCas9、HeFSpCas9およびevoSpCas9高忠実度バリアント）。別の例としては、Casヌクレアーゼは、そのPAM特異性を変化させる1つまたは複数の変異を有することができる。
いくつかの態様において、本明細書において提供されるCRISPR/Casシステムは、Casタンパク質と、Casタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導いて、標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフにハイブリダイズすることができる少なくとも1～2個のリボ核酸とを含む。本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された一連のアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸のポリマー）を指すために互換的に使用され、修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類縁体を含む。例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、パラログ、断片ならびに前述のものの他の等価物、バリアント、断片および類縁体が含まれる。
いくつかの態様において、Casタンパク質は、1つまたは複数のアミノ酸置換または修飾を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの例では、置換および/または修飾は、タンパク質分解を防止もしくは低減し、および/または細胞内でのポリペプチドの半減期を延長することができる。いくつかの態様において、Casタンパク質は、ペプチド結合の置き換え（例えば、尿素、チオ尿素、カルバマート、スルホニル尿素など）を含むことができる。いくつかの態様において、Casタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含むことができる。いくつかの態様において、Casタンパク質は、代替アミノ酸（例えば、D-アミノ酸、β-アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含むことができる。いくつかの態様において、Casタンパク質は、部分を含むための修飾（例えば、PEG化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、エンドキャッピングなど）を含むことができる。
いくつかの態様において、Casタンパク質は、コアCasタンパク質、そのアイソフォーム、または任意のCasタンパク質もしくはそのアイソフォームと類似の機能もしくは活性を有する任意のCas様タンパク質を含む。例示的なCasコアタンパク質には、Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8およびCas9が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、Casタンパク質は、大腸菌（E.coli）サブタイプのCasタンパク質（CASS2としても知られる）を含む。大腸菌サブタイプの例示的なCasタンパク質には、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4およびCas5 eが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、Casタンパク質は、YpestサブタイプのCasタンパク質（CASS3としても知られる）を含む。Ypestサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Csy1、Csy2、Csy3およびCsy4が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、Casタンパク質は、NmeniサブタイプのCasタンパク質（CASS4としても知られる）を含む。Nmeniサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Csn1およびCsn2が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、Casタンパク質は、DvulgサブタイプのCasタンパク質（CASS1としても知られる）を含む。Dvulgサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Csd1、Csd2およびCas5dが含まれる。いくつかの態様において、Casタンパク質は、TneapサブタイプのCasタンパク質（CASS7としても知られる）を含む。Tneapサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Cst1、Cst2、Cas5tが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、Casタンパク質は、HmariサブタイプのCasタンパク質を含む。Hmariサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Csh1、Csh2およびCas5hが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、Casタンパク質は、ApernサブタイプのCasタンパク質（CASS5としても知られる）を含む。Apernサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5およびCas5aが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、Casタンパク質は、MtubeサブタイプのCasタンパク質（CASS6としても知られる）を含む。Mtubeサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Csm1、Csm2、Csm3、Csm4およびCsm5が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、Casタンパク質は、RAMPモジュールCasタンパク質を含む。例示的なRAMPモジュールCasタンパク質には、Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5およびCmr6が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Klompe et al.,Nature 571,219-225（2019）;Strecker et al.,Science 365,48-53（2019）を参照されたい。いくつかの態様において、Casタンパク質は、I型サブタイプのCasタンパク質を含む。I型CRISPR/Casエフェクタータンパク質は、クラス1CRISPR/Casエフェクタータンパク質のサブタイプである。例としては、Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3および/またはGSU0054が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、Casタンパク質は、Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3および/またはGSU0054を含む。いくつかの態様において、Casタンパク質は、II型サブタイプのCasタンパク質を含む。II型CRISPR/Casエフェクタータンパク質は、クラス2CRISPR/Casエフェクタータンパク質のサブタイプである。例としては、Cas9、Csn2および/またはCas4が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、Casタンパク質はCas9、Csn2および/またはCas4を含む。いくつかの態様において、Casタンパク質は、III型サブタイプのCasタンパク質を含む。III型CRISPR/Casエフェクタータンパク質は、クラス1CRISPR/Casエフェクタータンパク質のサブタイプである。例としては、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11および/またはCsx10が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、Casタンパク質は、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11および/またはCsx10を含む。いくつかの態様において、Casタンパク質は、IV型サブタイプのCasタンパク質を含む。IV型CRISPR/Casエフェクタータンパク質は、クラス1CRISPR/Casエフェクタータンパク質のサブタイプである。例としては、Csf1が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの態様において、Casタンパク質は、Csf1を含む。いくつかの態様において、Casタンパク質は、V型サブタイプのCasタンパク質を含む。V型CRISPR/Casエフェクタータンパク質は、クラス2CRISPR/Casエフェクタータンパク質のサブタイプである。V型CRISPR/Casシステムおよびそれらのエフェクタータンパク質（例えば、Cas12aなどのCas12ファミリータンパク質）の例については、例えば、Shmakov et al.,Nat Rev Microbiol.2017;15（3）:169-182:”Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems”を参照されたい。例としては、Cas12ファミリー（Cas12a、Cas12b、Cas12c）、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10およびC2c9ならびにCasX（Cas12e）およびCasY（Cas12d）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Koonin et al.,Curr Opin Microbiol.2017;37:67-78:”Diversity,classification and evolution of CRISPR-Cas system”も参照されたい。いくつかの態様において、Casタンパク質は、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12dおよび/またはCas12eなどのCas12タンパク質を含む。
いくつかの態様において、Casタンパク質は、本明細書に記載されているCasタンパク質の任意の1つまたはその機能的部分を含む。本明細書で使用される場合、「機能的部分」は、少なくとも1つのリボ核酸（例えば、ガイドRNA（gRNA））と複合体を形成し、標的ポリヌクレオチド配列を切断するその能力を保持するペプチドの部分を指す。いくつかの態様において、機能的部分は、DNA結合ドメイン、少なくとも1つのRNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインからなる群より選択される機能的に連結されたCas9タンパク質機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの態様において、機能的部分は、DNA結合ドメイン、少なくとも1つのRNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインからなる群より選択される機能的に連結されたCas12a（Cpf1としても知られる）タンパク質機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの態様において、機能的ドメインは複合体を形成する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質の機能的部分はRuvC様ドメインの機能的部分を含む。いくつかの態様において、Cas9タンパク質の機能的部分はHNHヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。いくつかの態様において、Cas12aタンパク質の機能的部分はRuvC様ドメインの機能的部分を含む。
いくつかの態様において、外因性Casタンパク質は、ポリペプチド形態で細胞中に導入され得る。ある態様において、Casタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされ得るか、または融合され得る。本明細書で使用される場合、「細胞透過性ポリペプチド」および「細胞透過性ペプチド」は、それぞれ、細胞中への分子の取り込みを促進するポリペプチドまたはペプチドを指す。細胞透過性ポリペプチドは、検出可能な標識を含有することができる。
ある態様において、Casタンパク質は、（例えば、正、負または全体では中性の電荷を有する）荷電タンパク質にコンジュゲートされ得るか、または融合され得る。このような結合は共有結合性であり得る。いくつかの態様において、Casタンパク質は、Casタンパク質が細胞を透過する能力を有意に増加させるために、著しく正に帯電したGFPに融合され得る（Cronican et al.ACS Chem Biol.2010;5（8）:747-52）。ある態様において、Casタンパク質は、細胞中へのその進入を促進するために、タンパク質形質導入ドメイン（PTD）に融合され得る。例示的なPTDとしては、Tat、オリゴアルギニンおよびペネトラチンが挙げられる。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、PTDに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、tatドメインに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Cas9タンパク質はオリゴアルギニンドメインに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、著しく正に荷電したGFPに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Cas12aタンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたCas12aポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Cas12aタンパク質は、PTDに融合されたCas12aポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Cas12aタンパク質は、tatドメインに融合されたCas12aポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Cas12aタンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたCas12aポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Cas12aタンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたCas12aポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Cas12aタンパク質は、著しく正に荷電したGFPに融合されたCas12aポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、Casタンパク質は、Casタンパク質をコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞中に導入され得る。核酸を細胞中に導入する方法は、任意の適切な技術によって達成され得る。適切な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質媒介形質移入、電気穿孔およびウイルスベクターを用いた形質導入または感染が挙げられる。いくつかの態様において、核酸はDNAを含む。いくつかの態様において、核酸は、本明細書に記載されている修飾されたDNAを含む。いくつかの態様において、核酸は、mRNAを含む。いくつかの態様において、核酸は、本明細書に記載されている修飾されたmRNA（例えば、合成の修飾されたmRNA）を含む。
いくつかの態様において、Casタンパク質は、1～2つのリボ核酸と複合体を形成している。いくつかの態様において、Casタンパク質は、2つのリボ核酸と複合体を形成している。いくつかの態様において、Casタンパク質は、1つのリボ核酸と複合体を形成している。いくつかの態様において、Casタンパク質は、本明細書に記載されている修飾された核酸（例えば、合成の修飾されたmRNA）によってコードされる。
本明細書中に開示されている方法は、Casタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導き、標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフにハイブリダイズさせることができる任意のリボ核酸の使用を想定する。いくつかの態様において、リボ核酸の少なくとも1つは、tracrRNAを含む。いくつかの態様において、リボ核酸の少なくとも1つは、CRISPR RNA（crRNA）を含む。いくつかの態様においては、単一のリボ核酸が、Casタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導き、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフにハイブリダイズさせるガイドRNAを含む。いくつかの態様においては、リボ核酸の少なくとも1つが、Casタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導き、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフにハイブリダイズさせるガイドRNAを含む。いくつかの態様においては、1つ～2つのリボ核酸の両方が、Casタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導き、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフにハイブリダイズさせるガイドRNAを含む。本明細書において提供されるリボ核酸は、当業者によって理解されるように、使用される特定のCRISPR/Casシステムおよび標的ポリヌクレオチドの配列に応じて、様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズするように選択され得る。1つ～2つのリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑えるように選択することもできる。いくつかの態様において、1つ～2つのリボ核酸は、細胞内の全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合、少なくとも2つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの態様において、1つ～2つのリボ核酸は、細胞内の全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合、少なくとも1つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの態様において、1つ～2つのリボ核酸は、Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。
いくつかの態様においては、1つ～2つのリボ核酸の各々が、Casタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導き、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフにハイブリダイズさせるガイドRNAを含む。
いくつかの態様において、1つまたは2つのリボ核酸（例えば、ガイドRNA）は、標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の配列と相補的であり、および/または標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の配列にハイブリダイズする。いくつかの態様において、1つまたは2つのリボ核酸（例えば、ガイドRNA）は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列と相補的であり、および/または標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の配列にハイブリダイズする。いくつかの態様において、1つまたは2つのリボ核酸（例えば、ガイドRNA）は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列と相補的でなく、および/または標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の配列にハイブリダイズしない。いくつかの態様において、1つまたは2つのリボ核酸（例えば、ガイドRNA）は、標的ポリヌクレオチド配列の重複する標的モチーフに相補的であり、および/または標的ポリヌクレオチド配列の重複する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの態様において、1つまたは2つのリボ核酸（例えば、ガイドRNA）は、標的ポリヌクレオチド配列のオフセット標的モチーフに相補的であり、および/または標的ポリヌクレオチド配列のオフセット標的モチーフにハイブリダイズする。
いくつかの態様において、Casタンパク質をコードする核酸および少なくとも1つ～2つのリボ核酸をコードする核酸は、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞内に導入される。いくつかの態様において、Casタンパク質は、1つ～2つのリボ核酸と複合体を形成する。いくつかの態様において、Casタンパク質は、2つのリボ核酸と複合体を形成している。いくつかの態様において、Casタンパク質は、1つのリボ核酸と複合体を形成している。いくつかの態様において、Casタンパク質は、本明細書に記載されている修飾された核酸（例えば、合成の修飾されたmRNA）によってコードされる。
遺伝子の編集が望まれる場合、標的配列を含む標的とされた遺伝子座内への組換えのために、編集配列または編集鋳型ポリヌクレオチドが使用され得る。いくつかの態様において、組換えは相同組換えである。
塩基編集は、本明細書に記載されている内在性遺伝子を変化させるための別のアプローチである。塩基編集は、二本鎖切断を行わずに細胞DNA中に点変異を導入するために使用され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されている内在性核酸を変化させる方法は、シトシン塩基編集、アデニン塩基編集、アンチセンスオリゴヌクレオチド依存性のAからIへのRNA編集またはCas13塩基編集によるものである。塩基編集の方法は当技術分野で公知であり、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられるRees et al.Nature Rev Genet.19（12）;770-788（2018）およびKopmor et al.,Nature 533,420-424（2016）に記載されている。
CRISPRシステムまたは塩基編集要素は、単一のベクター中に組み合わされることができ、1つの要素が第2の要素に対して5'（第2の要素の「上流」）または第2の要素に対して3'（第2の要素の「下流」）に位置するなど、任意の適切な配向で配置され得る。1つの要素のコード配列は、第2の要素のコード配列の同一の鎖または反対の鎖上に位置し得、同一のまたは反対の方向に配向され得る。いくつかの態様において、単一のプロモーターが、CRISPR酵素をコードする転写物ならびに1つまたは複数のイントロン配列内に埋め込まれた（例えば、それぞれが異なるイントロン内に存在するか、少なくとも1つのイントロン内に2つ以上が存在するか、または全てが単一のイントロン内に存在する）ガイド配列、tracrメイト配列（任意で、ガイド配列に機能的に連結されている）およびtracr配列の1つまたは複数の発現を駆動する。いくつかの態様において、CRISPR酵素、ガイド配列、tracrメイト配列およびtracr配列は、同じプロモーターに機能的に連結され、同じプロモーターから発現される。
ZFN
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）は、細菌のFokI制限酵素のエンドヌクレアーゼドメインに付着したジンクフィンガー含有転写因子から適合された部位特異的DNA結合ドメインのアレイを含む融合タンパク質である。ZFNは、DNA結合ドメインまたはジンクフィンガードメインの1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれより多く）を有し得る。例えば、Carroll et al.,Genetics Society of America（2011）188:773-782;Kim et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1996）93:1156-1160を参照されたい。各ジンクフィンガードメインは、1つまたは複数の亜鉛イオンによって安定化された小さなタンパク質構造モチーフであり、通常、3～4bpのDNA配列を認識する。したがって、タンデムドメインは、細胞のゲノム内で特有の伸長したヌクレオチド配列に潜在的に結合することができる。
約6、9、12、15または18bpの配列を認識するマルチフィンガーポリペプチドを作製するために、既知の特異性の様々なジンクフィンガーを組み合わせることができる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッドシステム、細菌ワンハイブリッドおよびツーハイブリッドシステムならびに哺乳動物細胞を含む、特定の配列を認識するジンクフィンガー（およびその組み合わせ）を生成するための様々な選択およびモジュール式組み立て技術が利用可能である。ジンクフィンガーは、所定の核酸配列を結合するように操作され得る。所定の核酸配列に結合するようにジンクフィンガーを操作するための基準は、当技術分野で公知である。例えば、Sera et al.,Biochemistry（2002）41:7074-7081;Liu et al.,Bioinformatics（2008）24:1850-1857を参照されたい。
FokIヌクレアーゼドメインまたは他の二量体ヌクレアーゼドメインを含有するZFNは、二量体として機能する。したがって、非パリンドロームのDNA部位を標的とするためには、一対のZFNが必要とされる。2つの個々のZFNは、これらのヌクレアーゼが適切に隔てられた状態で、DNAの反対鎖を結合しなければならない。Bitinaite et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1998）95:10570-10575を参照されたい。ゲノム内の特定の部位を切断するために、一対のZFNは、前記部位に隣接する、一方がフォワード鎖上にあり、他方がリバース鎖上にある2つの配列を認識するように設計される。部位の両側にZFNが結合すると、ヌクレアーゼドメインはその部位でDNAを二量体化および切断し、5'突出部を有するDSBを生成する。次いで、ホモロジーアームに隣接した所望の変異を含有する修復鋳型の助けを借りて、特定の変異を導入するために、相同組換え（HDR）を利用することができる。修復鋳型は、通常、細胞に導入された外因性二本鎖DNAベクターである。Miller et al.,Nat.Biotechnol.（2011）29:143-148;Hockemeyer et al.,Nat.Biotechnol.（2011）29:731-734を参照されたい。
TALEN
いくつかの態様において、本明細書に記載されている細胞は、転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）方法を使用して作製される。「TALEヌクレアーゼ」（TALEN）によって、典型的には転写アクチベータ様エフェクター（TALE）に由来する核酸結合ドメインと、核酸標的配列を切断するための1つのヌクレアーゼ触媒ドメインとからなる融合タンパク質が意図される。TALENは、標的遺伝子を編集するために使用することができる人工ヌクレアーゼの別の例である。TALENは、通常、伸長したDNA配列を結合して認識する10～30のリピートを有するタンデムアレイを含むTALEリピートと呼ばれるDNA結合ドメインに由来する。各リピートは33～35アミノ酸長であり、2つの隣接するアミノ酸（リピート可変二残基、またはRVDと呼ばれる）が4つのDNA塩基対のうちの一つに対する特異性を付与する。したがって、リピートと標的DNA配列中の塩基対との間には1対1の対応が存在する。触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメイン、より好ましくは、例えばI-TevI、ColE7、NucAおよびFok-Iのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。特定の態様において、TALEドメインは、例えばI-CreIおよびI-OnuIまたはそれらの機能的バリアントのようなメガヌクレアーゼに融合させることができる。より好ましい態様において、前記ヌクレアーゼは単量体TALEヌクレアーゼである。単量体TALEヌクレアーゼは、国際公開第2012138927号に記載されている、操作されたTALリピートの、I-TevIの触媒ドメインとの融合物などの、特異的な認識および切断のために二量体化を必要としないTALEヌクレアーゼである。転写アクチベータ様エフェクター（TALE）は、細菌種ザントモナス（Xanthomonas）からのタンパク質であり、複数の反復配列を含み、各反復は、核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に対して特異的な12および13位の二残基（RVD）を含む。TALENキットは市販されている。
TALENは、1つまたは複数のTALE DNA結合ドメイン（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれより多く）をヌクレアーゼドメイン、例えばFokIエンドヌクレアーゼドメインに融合することによって人工的に作製される。Zhang,Nature Biotech.（2011）29:149-153を参照されたい。TALENにおける使用のために、FokIに対するいくつかの変異が作製されており、これらは、例えば、切断特異性または活性を改善する。Cermak et al.,Nucl.Acids Res.（2011）39:e82;Miller et al.,Nature Biotech.（2011）29:143-148;Hockemeyer et al.,Nature Biotech.（2011）29:731-734;Wood et al.,Science（2011）333:307;Doyon et al.,Nature Methods（2010）8:74-79;Szczepek et al.,Nature Biotech（2007）25:786-793;Guo et al.,J.Mol.Biol.（2010）200:96を参照されたい。FokIドメインは、二量体として機能し、適切な配向および間隔を有する標的ゲノム内の部位に対する特有のDNA結合ドメインを有する2つの構築物を必要とする。TALE DNA結合ドメインとFokIヌクレアーゼドメインとの間のアミノ酸残基の数および2つの個々のTALEN結合部位の間の塩基の数の両方が、高レベルの活性を達成するための重要なパラメータであるようである。Miller et al.,Nature Biotech.（2011）29:143-148。
操作されたTALEリピートをヌクレアーゼドメインと組み合わせることによって、任意の所望のDNA配列に対して特異的な部位特異的ヌクレアーゼを作製することができる。ZFNと同様に、TALENは、ゲノム内の所望の標的部位にDSBを生成するために、細胞内に導入することができ、したがって、同様の、HDRによって媒介される経路において遺伝子をノックアウトするためにまたは変異をノックインするために使用することができる。Boch,Nature Biotech.（2011）29:135-136;Boch et al.,Science（2009）326:1509-1512;およびMoscou et al.,Science（2009）326:3501を参照されたい。
いくつかの態様において、細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を使用して操作される。「ジンクフィンガー結合タンパク質」は、亜鉛イオンの配位を通じたタンパク質構造の安定化の結果として、好ましくは配列特異的な様式で、DNA、RNAおよび/またはタンパク質を結合するタンパク質またはポリペプチドである。ジンクフィンガー結合タンパク質という用語は、しばしばジンクフィンガータンパク質またはZFPと略される。個々のDNA結合ドメインは、典型的には「フィンガー」と称される。ZFPは、少なくとも1つのフィンガー、典型的には2つのフィンガー、3つのフィンガーまたは6つのフィンガーを有する。各フィンガーは、2～4塩基対のDNA、典型的には3または4塩基対のDNAを結合する。ZFPは、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。各フィンガーは、典型的には、約30アミノ酸の、亜鉛をキレートするDNA結合サブドメインを含む。研究により、このクラスの単一のジンクフィンガーは、単一のβターンの2つのシステイン残基とともに亜鉛と配位した2つの不変なヒスチジン残基を含有するαヘリックスからなることが実証されている（例えば、Berg＆Shi,Science 271:1081-1085（1996）を参照されたい）。
ホーミングエンドヌクレアーゼ
いくつかの態様において、本明細書に記載されている細胞は、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して作製される。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは当技術分野で周知である（Stoddard 2005）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、DNA標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖切断を生成する。ホーミングエンドヌクレアーゼは高度に特異的であり、12塩基対～45塩基対（bp）の長さの範囲、通常は14～40bpの長さの範囲のDNA標的部位を認識する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、またはGIY-YIGエンドヌクレアーゼに対応し得る。いくつかの態様において、ホーミングエンドヌクレアーゼは、I-CreIバリアントであり得る。
メガヌクレアーゼ
いくつかの態様において、本明細書に記載されている細胞は、メガヌクレアーゼを使用して作製される。メガヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼファミリーの酵素であり、大きなDNA配列（14～40塩基対）を認識および切断する能力を特徴とする。メガヌクレアーゼは、定義によれば、大きな配列を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである（Chevalier,B.S.and B.L.Stoddard,Nucleic Acids Res.,2001,29,3757-3774）。メガヌクレアーゼは、生細胞内の特有の部位を切断することができ、それによって切断部位の近傍で遺伝子ターゲティングを1000倍以上増強する（Puchta et al.,Nucleic Acids Res.,1993,21,5034-5040;Rouet et al.,Mol.Cell.Biol.,1994,14,8096-8106;Choulika et al.,Mol.Cell.Biol.,1995,15,1968-1973;Puchta et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93,5055-5060;Sargent et al.,Mol.Cell.Biol.,1997,17,267-77;Donoho et al.,Mol.Cell.Biol.,1998,18,4070-4078;Elliott et al.,Mol.Cell.Biol.,1998,18,93-101;Cohen-Tannoudji et al.,Mol.Cell.Biol.,1998,18,1444-1448）。メガヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性および/またはDNA認識に影響を及ぼすそれらの構造モチーフに基づいてファミリーに分類される。最も幅広く、最もよく知られているメガヌクレアーゼは、LAGLIDADGファミリーのタンパク質であり、その名称は保存されたアミノ酸配列に由来する。Chevalier et al.,Nucleic Acids Res.（2001）29（18）:3757-3774を参照されたい。他方、GIY-YIGファミリーメンバーはGIY-YIGモジュールを有し、GIY-YIGモジュールは70～100残基長であり、4つの不変な残基を有する4つまたは5つの保存された配列モチーフを含み、そのうちの2つが活性のために必要とされる。Van Roey et al.,Nature Struct.Biol.（2002）9:806-811を参照されたい。His-Cysファミリーメガヌクレアーゼは、数百のアミノ酸残基を包含する領域にわたる高度に保存された一連のヒスチジンおよびシステインを特徴とする。Chevalier et al.,Nucleic Acids Res.（2001）29（18）:3757-3774を参照されたい。NHNファミリーのメンバーは、アスパラギン残基に囲まれた2対の保存されたヒスチジンを含有するモチーフによって定義される。Chevalier et al.,Nucleic Acids Res.（2001）29（18）:3757-3774を参照されたい。
高い特異性が要求されるために、特定の標的DNA配列に対する天然のメガヌクレアーゼを同定する可能性は低いので、突然変異誘発およびハイスループットスクリーニング法を含む様々な方法が、特有の配列を認識するメガヌクレアーゼバリアントを創出するために使用されてきた。変化したDNA結合特異性を有する、例えば所定の核酸配列に結合するメガヌクレアーゼを操作するための戦略は、当技術分野で公知である。例えば、Chevalier et al.,Mol.Cell.（2002）10:895-905;Epinat et al.,Nucleic Acids Res（2003）31:2952-2962;Silvaet al.,J Mol.Biol.（2006）361:744-754;Seligman et al.,Nucleic Acids Res（2002）30:3870-3879;Sussman et al.,J Mol Biol（2004）342:31-41;Doyon et al.,J Am Chem Soc（2006）128:2477-2484;Chen et al.,Protein Eng Des Sel（2009）22:249-256;Arnould et al.,J Mol Biol.（2006）355:443-458;およびSmith et al.,Nucleic Acids Res.（2006）363（2）:283-294を参照されたい。
ZFNおよびTALENと同様に、メガヌクレアーゼはゲノムDNA中にDSBを作出することができ、これは、例えばNHEJを介して不適切に修復されれば、フレームシフト変異を作出することができ、細胞内の標的遺伝子の発現の減少をもたらす。あるいは、メガヌクレアーゼともに外来DNAを細胞に導入することができる。外来DNAおよび染色体の配列の配列に応じて、標的遺伝子を改変するために、このプロセスが使用され得る。Silva et al.,Current Gene Therapy（2011）11:11-27を参照されたい。
トランスポザーゼ
いくつかの態様において、本明細書に記載されている細胞は、トランスポザーゼを使用して作製される。トランスポザーゼは、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機構または複製転位機構によってゲノムの別の部分へのトランスポゾンの移動を触媒する酵素である。トランスポザーゼをCRISPER/Casシステムなどの他のシステムに連結することによって、ゲノムDNAの部位特異的挿入または操作を可能にするために、新しい遺伝子編集ツールを開発することができる。触媒的に不活性なCasエフェクタータンパク質およびTn7様トランスポゾンを使用する、トランスポゾンを用いた2つの公知のDNA組み込み方法が存在する。トランスポザーゼ依存性DNA組み込みは、ゲノム中にDSBを誘発せず、より安全でより特異的なDNA組み込みを保証し得る。
ニッカーゼ
いくつかの態様において、本明細書に記載されている細胞は、ニッカーゼを使用して作製される。DNA「ニッカーゼ」と呼ばれる酵素を生成するために、Cas、特にCas9ヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインを独立に変異させることができる。ニッカーゼは、例えばCRISPR/Cas9を含む通常のCRISPR/Casヌクレアーゼシステムと同じ特異性で一本鎖切断を導入することができる。ニッカーゼは、遺伝子編集システムでの用途を見出すことができる二本鎖切断を生成するために使用され得る（Mali et al.,Nat Biotech,31（9）:833-838（2013）;Mali et al.Nature Methods,10:957-963（2013）;Mali et al.,Science,339（6121）:823-826（2013））。いくつかの例では、2つのCasニッカーゼが使用されると、平滑末端の代わりに切断された末端のそれぞれに長い突出部が生成され、正確な遺伝子組み込みおよび挿入に対するさらなる調節を可能にする（Mali et al.,Nat Biotech,31（9）:833-838（2013）;Mali et al.Nature Methods,10:957-963（2013）;Mali et al.,Science,339（6121）:823-826（2013））。両方のニッキングCas酵素がそれらの標的DNAに効果的に切れ目を入れなければならないので、対になったニッカーゼは、二本鎖を切断するCasベースのシステムと比較してより低いオフターゲット効果を有することができる（Ran et al.,Cell,155（2）:479-480（2013）;Mali et al.,Nat Biotech,31（9）:833-838（2013）;Mali et al.Nature Methods,10:957-963（2013）;Mali et al.,Science,339（6121）:823-826（2013））。
RNAサイレンシングまたはRNA干渉
いくつかの態様において、本明細書において提供される細胞は、ポリペプチドの発現をノックダウンする（例えば、減少させる、排除する、または阻害する）ためにRNAサイレンシングまたはRNA干渉（RNAi、siRNAとも呼ばれる）を使用して作製される。有用なRNAi法には、合成RNAi分子、低分子干渉RNA（siRNA）、PIWI相互作用NRA（piRNA）、低分子ヘアピン型RNA（shRNA）、マイクロRNA（miRNA）および当業者によって認識される他の一過性ノックダウン法を利用するものが含まれる。配列特異的shRNA、siRNA、miRNAなどを含むRNAi用試薬は市販されている。
いくつかの態様において、宿主細胞遺伝子に対する改変を含有する細胞を含む新しい細胞または細胞株を樹立するために、本明細書に記載されている幹細胞またはインビトロで分化した心筋細胞は、（1つもしくは複数のベクターの一過性形質移入またはRNAによる形質移入などによって）遺伝子編集システムの成分で一過性に形質移入され、CRISPRまたは塩基編集複合体の活性を介して改変される。
いくつかの態様において、細胞、組織および/または発達に特異的な様式で遺伝子編集機構を発現させることが有益であり得る。これは、例えば、導入遺伝子発現または遺伝子ノックアウトが発達または分化のいくつかの段階で細胞に有害であるが、他の段階では有害でない場合に特に有用であり得る。したがって、導入遺伝子またはノックアウトが幹細胞、例えば多能性幹細胞に有害である場合、分化の後期、例えば心筋細胞分化においてのみ活性である調節エレメントを使用して遺伝子編集機構の発現を駆動することが有益であり得る。
上で提供された方法に加えて、本明細書に記載されている移植された心筋細胞による、Kir2.1としても知られるKCNJ2の過剰発現は、細胞を、KCNJ2（すなわち、Kir2.1）をコードする核酸またはこのような核酸を含むベクターと接触させることによって達成され得る。
KCNJ2/Kir2.1の刺激された活性は、当技術分野で公知の多くの方法のいずれでも達成され得る。考慮すべき因子としては、KCNJ2の発現は多能性細胞に対して毒性であることが挙げられる。したがって、未成熟な心筋細胞中での発現を許容するが、分化前の多能性幹細胞中での発現は許容せず、および好ましくは内在性遺伝子が活性である成熟心筋細胞中での発現を許容しない発達的に制御された配列を介して、KCNJ2の刺激された発現または過剰発現を駆動することが有益である。HCN4およびCACNA1Hは、KCNJ2導入遺伝子を制御または駆動するのに有益な様式で制御される遺伝子の非限定的な例である。SLC8A1はさらに増加する前に分化プログラムの初期に高度に発現されるので、SLC8A1は、KCNJ2発現のために有益であると予想されない様式で制御される遺伝子の例である。したがって、一態様において、KCNJ2導入遺伝子をコードする構築物は、本明細書に記載されている組成物および方法によってKCNJ2（Kir2.1）ポリペプチドの有益な発現を提供するために、HCN4またはCACNA1H由来の制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、5'-、3'-および/または内部ゲノム制御配列など）に機能的に連結され得る。
別の態様において、KCNJ2（Kir2.1）をコードする配列は、例えば、対象細胞において不活性化される遺伝子のうちの1つ、例えばHCN4またはCACNA1Hにノックインされ得るか、またはそれを置き換え得る。このアプローチは、潜在的に同じ遺伝子編集プロセスにおいてHNC4またはCACNA1Hを不活性化することおよびKCNJ2の異所性発現を刺激することという両方の利点を有する。
いくつかの態様において、遺伝子編集方法は、HCN4またはCACNA1Hチャネルの薬理学的阻害と組み合わされる。この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様において、HCN4チャネルは、インヒビター薬物イバブラジンを使用して阻害される。この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様において、CACNA1Hチャネルは、ミブレファジルまたはML-218からなる群より選択されるインヒビター薬物の1つまたは複数を使用して阻害される。
イオンチャネル機能の薬理学的調節
遺伝子操作に加えて、本明細書に記載されているイオンチャネルおよび交換体（例えば、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2）を阻害または活性化する薬理的作用物質を使用することができ、以下でさらに論じられている。いくつかの態様において、イオンチャネル機能の薬理学的改変は、本明細書に記載されている遺伝子編集方法と組み合わせて使用される。
いくつかの態様において、作用物質は、小分子、ポリペプチド、抗体またはアプタマーである。本明細書において使用される「小分子」という用語は、約10,000g/モル未満の分子量を有する、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸類縁体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類縁体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、有機または無機化合物（例えば、複素有機化合物および有機金属化合物を含む）、約5,000g/モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約1,000g/モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約500g/モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステルおよびその他の薬学的に許容される形態が含まれ得るが、これらに限定されない天然の（すなわち、自然に見出される）または非天然の（すなわち、自然に見出されない）有機または無機分子を指す。実験室で合成される「小分子」の例には、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるBrunton et al.,”Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics”,McGraw-Hill Education 12th Edition（ISBN-13:978-0071624428）に記載されている化合物が含まれるが、それらに限定されない。
いくつかの態様において、作用物質は、生着前に、インビトロで分化した心筋細胞に投与される。いくつかの態様において、作用物質は、生着後に、処置を受けている対象に投与される。いくつかの態様において、作用物質は、細胞が移植される前に細胞と接触させられ、移植または生着後に、細胞を受ける対象に投与される。
本明細書に記載されているイオンチャネルのレベルまたは活性を調節するために使用することができる小分子の非限定的な例が以下の表2に示されている。
（表２）HCN4、CACNA1H、SLC8A1を阻害するか、またはKCNJ2を活性化する作用物質。
Figure 2024517810000007
＊FDA承認薬
任意の局面のいくつかの態様において、HCN4は、イバブラジン、ゼタブラジンおよびZD 7288からなる群より選択される作用物質によって不活性化される。
任意の局面のいくつかの態様において、CACNA1H（Cav3.2）は、ミベフラジル、ML218およびフルナリジドからなる群より選択される作用物質によって不活性化される。
任意の局面のいくつかの態様において、SLC8A1（NCX1）は、SEA-0400、KB-R7943、CGP 37157および3',4'-ジクロロベンズアミルからなる群より選択される作用物質によって阻害される。
任意の局面のいくつかの態様において、KCNJ2（Kir2.1）は、ザコプリドによって活性化される。
生着のための細胞において、このようなチャネルの遺伝子操作の代わりにまたはこのようなチャネルの遺伝子操作と組み合わせて、これらのチャネルの1つまたは複数の活性を標的とする1つまたは複数の作用物質を使用することができることが想定される。
いくつかの態様において、イオンチャネルタンパク質HCN4、CaV3.2（本明細書ではCACNA1Hとも呼ばれる）、NCX1（本明細書ではSLC8A1とも呼ばれる）およびKir2.1（本明細書ではKCNJ2とも呼ばれる）の活性は、薬理学的アプローチと遺伝的アプローチの組み合わせによって調節され得る。本質的に、任意の組み合わせを使用することができるが、1つの非限定的な例として、HCN4活性は、例えばイバブラジンを使用して阻害され得るが、CACNA1H、SLC8A1およびKCNJ2活性は、1つまたは複数の遺伝的アプローチ（例えば、事例に応じてノックアウト、ノックダウン、過剰発現）を介して調節または操作される。HCN4活性を阻害することができる他の薬物としては、非限定的な例として、ゼタブラジンおよびZD 7288が挙げられる。CACNA1H活性を阻害することができる薬物の非限定的な例としては、ミベフラジル、ML218およびフルナリジドが挙げられる。KCNJ2を活性化することができる薬物の非限定的な例は、ザコプリドである。SLC8A1（NCX1）を阻害することができる薬物の非限定的な例としては、SEA-0400、KB-R7943、CGP 37157および3',4'-ジクロロベンズアミルが挙げられる。これらのイオンチャネルの活性を改変するこれらおよび他の薬物は、事例に応じて、標的イオンチャネルを阻害するか、または活性化することが知られている濃度で使用され得る。
この局面および本明細書に記載されている全ての他の局面の別の態様において、KCNJ2ポリペプチドは、KCNJ2遺伝子のゲノム挿入によって過剰発現され、SLC8A1ポリペプチドは、SLC8A1遺伝子のゲノム修飾によって阻害され、HCN4ポリペプチドは、ゲノム修飾または薬理的作用物質（例えば、イバブラジン）での処理のいずれかによって阻害され、CACNA1Hポリペプチドは、ゲノム修飾もしくは薬理的作用物質（例えば、ミブレファジル、ML-218、フルナリジド）での処理のいずれかまたはこれらの任意の組み合わせによって阻害される。
心臓生着のための心筋細胞
本明細書に記載されている組成物および方法は、心臓疾患または障害（例えば、心筋梗塞または心不全）の処置のために心筋細胞が対象中に生着されたときの電気的乱れを防止する遺伝子操作もしくは遺伝子編集システム（例えば、CRISPR/Cas9）または作用物質（例えば、イオンチャネル遮断薬または抗不整脈作用物質）と接触させた心筋細胞を使用する。
心臓生着は、心筋細胞を心臓中の心臓損傷の部位に投与する。当業者は、当技術分野で公知の方法によって損傷の部位を決定することができる。心臓生着の主な最終目標は、薬学的処置単独によっては達成できない電気的および機械的安定性を損傷した心筋に提供することである。
本明細書に記載されている心筋細胞は、ヒト対象から単離することができるか、または幹細胞もしくは心臓前駆体から分化させることができる。以下では、対象内への生着のための心筋細胞を調製するために使用することができる様々な供給源および幹細胞について説明する。
幹細胞は、有糸分裂細胞分裂を通じて自身を再生する能力を保持し、より特殊化した細胞型に分化することができる細胞である。哺乳動物幹細胞の3つの広範な種類には、胚盤胞において見られる胚性幹（ES）細胞、体細胞から再プログラムされた人工多能性幹細胞（iPSC）および成体組織において見られる成体幹細胞が含まれる。多能性幹細胞の他の供給源には、羊膜由来幹細胞または胎盤由来幹細胞が含まれ得る。多能性幹細胞は、3つの胚葉のいずれにも由来する細胞に分化することができる。
本明細書に記載されている組成物および方法において有用な心筋細胞は、とりわけ、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞から分化し得る。一態様において、本明細書において提供される組成物および方法は、胚性幹細胞から分化したヒト心筋細胞を使用する。あるいは、いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物および方法は、生きたヒト胚から採取された細胞から作製されたヒト心原性細胞の生成または使用を包含しない。
胚性幹細胞: 胚性幹細胞およびそれらの回収方法は当技術分野で周知であり、例えば、Trounson A O Reprod Fertil Dev（2001）13:523,Roach M L Methods Mol Biol（2002）185:1およびSmith A G Annu Rev Cell Dev Biol（2001）17:435に記載されている。「胚性幹細胞」という用語は、胚の胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指すために使用される（例えば、米国特許第5,843,780号、同第6,200,806号を参照されたい）。このような細胞は、体細胞核移植に由来する胚盤胞の内部細胞塊から同様に取得され得る（例えば、米国特許第5,945,577号、同第5,994,619号、同第6,235,970号を参照されたい）。
胚性供給源に由来する細胞には、幹細胞バンクまたは他の認知された寄託機関から得られる胚性幹細胞または幹細胞株が含まれ得る。幹細胞株を作製する他の手段としては、胚盤胞の形成前の初期胚（およそ8細胞期）からの割球細胞の使用を含む方法が挙げられる。このような技術は、補助生殖医療機関において日常的に実施されている着床前遺伝子診断技術に対応する。このアプローチでは、単一の割球細胞を確立されたES細胞株と共培養し、次いでそれらから分離して完全にコンピテントなES細胞株を形成する。
未分化胚性幹（ES）細胞は、当業者によって容易に認識され、典型的には、高い核/細胞質比および顕著な核を有する細胞のコロニー中に、顕微鏡視野の二次元に現れる。いくつかの態様において、本明細書に記載されているヒト心筋細胞は、胚性幹細胞または胚由来の任意の他の細胞に由来しない。
人工多能性幹細胞（iPSC）:
いくつかの態様において、本明細書に記載されている組成物および方法は、人工多能性幹細胞からインビトロで分化させた心筋細胞を利用する。本明細書に記載されている組成物のための心筋細胞を生成するためにiPSCを使用することの利点は、そのように所望した場合に、細胞が、所望のヒト心筋細胞が投与されるのと同じ対象に由来し得ることである。すなわち、体細胞を対象から得て、人工多能性幹細胞に再プログラムし、次いで、対象に投与するためのヒト心筋細胞（例えば、自己細胞）に再分化させることができる。心筋細胞（またはそれらの分化した子孫）が本質的に自己源に由来するので、生着拒絶またはアレルギー反応のリスクは、別の対象または対象の群からの細胞の使用と比較して軽減される。これはiPSCの利点であるが、代替的な態様においては、本明細書に記載されている方法および組成物に有用な心筋細胞は、非自己源（例えば、同種異系）に由来する。さらに、iPSCの使用は、胚性の源から得られる細胞の必要性をなくす。したがって、一態様においては、本明細書に記載されている方法および組成物において使用するための心筋細胞を生成するために使用される幹細胞は、胚性幹細胞ではない。
分化は生理学的状況下では一般に不可逆的であるが、体細胞を人工多能性幹細胞に再プログラムするためのいくつかの方法が近年開発されている。例示的な方法は当業者に公知であり、本明細書の以下で簡単に説明される。
再プログラム化は、分化した細胞（例えば、体細胞）の分化状態を変更させるか、または逆転させるプロセスである。別の表現をすれば、再プログラム化は、細胞の分化をより未分化なまたはより原始的な型の細胞に戻すプロセスである。多くの初代細胞を培養下に置くことは、完全に分化した特徴のいくらかの喪失をもたらし得ることに留意すべきである。しかしながら、分化した細胞という用語に包含されるこのような細胞を単に培養することは、これらの細胞を非分化細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞にしない。分化した細胞の多能性への移行には、分化した細胞が培養に置かれたときに分化した特徴の部分的な喪失をもたらす刺激を超える再プログラム化刺激が必要とされる。一般に培養において限られた数の分裂のみに対して能力を有する初代細胞親と比較して、再プログラムされた細胞は、増殖能を喪失しない長期継代の能力という特徴も有する。
再プログラムされる細胞は、再プログラム化の前に、部分的にまたは高度に分化させることができる。したがって、細胞は、高度に分化した体細胞であり得、および成体幹細胞または体性幹細胞に由来し得る。
いくつかの態様において、再プログラム化は、分化した細胞（例えば、体細胞）の分化状態の、多能性状態または複能性状態への完全な復帰を包含する。いくつかの態様において、再プログラム化は、分化した細胞（例えば、体細胞）の分化状態の、未分化細胞（例えば、胚様細胞）への完全なまたは部分的な復帰を包含する。再プログラム化は、細胞による特定の遺伝子の発現をもたらすことができ、その発現は再プログラム化にさらに寄与する。本明細書に記載されているある態様においては、分化した細胞（例えば、体細胞）の再プログラム化は、分化した細胞に、3つ全ての胚葉系統の細胞への自己複製および分化の能力を有する未分化状態をとらせる。これらは人工多能性幹細胞（iPSCまたはiPS細胞）である。
体細胞をiPSCに再プログラム化する方法は、当技術分野で公知である。例えば、参照によりそれらの全体が組み入れられる米国特許第8,129,187号; 同第8,058,065号; 米国特許出願公開第2012/0021519号; Singh et al.Front.Cell Dev Biol.（2015）; およびPark et al.Nature（2008）を参照されたい。具体的には、iPSCは、再プログラム化転写因子の組み合わせを導入することによって体細胞から生成される。再プログラミング因子は、例えば、核酸、ベクター、小分子、ウイルス、ポリペプチドまたはこれらの任意の組み合わせであり得る。再プログラミング因子の非限定的な例としては、Oct4（オクタマー結合転写因子-4）、Sox2（性決定領域Y）-ボックス2、Klf4（クルッペル様因子-4）およびc-Mycが挙げられる。さらなる因子（例えば、LIN 28＋Nanog、Esrrb、Pax5 shRNA、C/EBPa、p53 siRNA、UTF1、DNMT shRNA、Wnt3a、SV40 LT（T）、hTERT）または化学物質（例えば、BIX-01294、BayK8644、RG108、AZA、デキサメタゾン、VPA、TSA、SAHA、PD025901＋CHIR99021（2i）、A-83-01）が、基礎的な再プログラミング因子から1つまたは他の再プログラミング因子を置き換えること、または再プログラム化の効率を増大させることが見出されている。
体細胞（例えば、生殖系列細胞を除いた身体の任意の細胞; 線維芽細胞など）から多能性幹細胞を作製するために使用される具体的なアプローチまたは方法は、特許請求された発明にとって重要ではない。したがって、体細胞を多能性表現型に再プログラムする任意の方法が、本明細書に記載されている方法での使用に適切であろう。
本明細書に開示される再プログラムされた体細胞は、アルカリホスファターゼ（AP）; ABCG2; ステージ特異的胎児抗原-1（SSEA-1）; SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6E; ERas/ECAT5、E-カドヘリン; β-III-チューブリン; α-平滑筋アクチン（α-SMA）; 線維芽細胞成長因子4（Fgf4）、Cripto、Dax1; ジンクフィンガータンパク質296（Zfp296）; N-アセチルトランスフェラーゼ-1（Nat1）; （ES細胞関連転写物1（ECAT1）; ESG1/DPPA5/ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT15-2; Fthl17; Sal14; 未分化胚細胞転写因子（Utf1）; Rex1; p53; G3PDH; TERTを含むテロメラーゼ; サイレントX染色体遺伝子; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; F-box含有タンパク質15（Fbx15）; Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42、FoxD3; GDF3; CYP25A1; 発達多能性関連2（DPPA2）; T細胞リンパ腫切断点1（Tcl1）; DPPA3/Stella; DPPA4; 多能性のための他の一般的なマーカーなどを含む多数の多能性細胞マーカーのいずれをも発現することができる。他のマーカーとしては、Dnmt3L; Sox15; Stat3; Grb2; β-カテニンおよびBmi1を挙げることができる。このような細胞は、人工多能性幹細胞が由来する体細胞に特徴的なマーカーの下方制御によっても特徴付けられ得る。
出発細胞の集団に由来する再プログラム化の効率（すなわち、再プログラムされた細胞の数）は、Shi,Y.,et al.（2008）Cell-Stem Cell 2:525-528,Huangfu,D.,et al.（2008）Nature Biotechnology 26（7）:795-797およびMarson,A.,et al.（2008）Cell-Stem Cell 3:132-135によって示されるように、様々な小分子の添加によって増大され得る。再プログラム化効率を増大させる作用物質のいくつかの非限定的な例としては、とりわけ、可溶性Wnt、Wnt馴化培地、BIX-01294（G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ）、PD0325901（MEKインヒビター）、DNAメチルトランスフェラーゼインヒビター、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）インヒビター、バルプロ酸、5'-アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリド、ヒドロキサム酸（SAHA）、ビタミンCおよびトリコスタチン（TSA）が挙げられる。
本明細書に記載されている方法とともに使用するための多能性幹細胞の誘導を確認するために、1つまたは複数の幹細胞マーカーの発現について、単離されたクローンを試験することができる。体細胞に由来する細胞におけるこのような発現は、当該細胞を人工多能性幹細胞として同定する。幹細胞マーカーとしては、とりわけ、SSEA3、SSEA4、CD9、Nanog、Oct4、Fbx15、Ecat1、Esg1、Eras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Dax1、Zpf296、Slc2a3、Rex1、Utf1およびNat1を挙げることができるが、これらに限定されない。一態様において、Oct4またはNanogを発現する細胞が多能性として同定される。このようなマーカーの発現を検出するための方法としては、例えば、RT-PCRおよびウエスタンブロットまたはフローサイトメトリー分析などのコードされたポリペプチドの存在を検出する免疫学的方法を挙げることができる。いくつかの態様において、検出はRT-PCRのみを伴うのではなく、タンパク質マーカーの検出も含む。細胞内マーカーはRT-PCRによって最もよく同定され得るのに対して、細胞表面マーカーは、例えば免疫細胞化学によって容易に同定される。
単離された細胞の多能性幹細胞特性は、iPSCが3つの胚葉のそれぞれの細胞に分化する能力を評価する試験によって確認することができる。一例として、単離されたクローンの多能性特性を評価するために、ヌードマウスにおける奇形腫形成を使用することができる。細胞がヌードマウスに導入され、細胞から生じる腫瘍に対して組織学および/または免疫組織化学が行われる。例えば、3つ全ての胚葉に由来する細胞を含む腫瘍の成長は、細胞が多能性幹細胞であることをさらに示す。
成体幹細胞: 成体幹細胞は、出生後もしくは新生児/新生仔期後の生物の組織または成体生物に由来する幹細胞である。成体幹細胞は、胚性幹細胞と対比して成体幹細胞が発現するまたは発現しないマーカーにおいてのみならず、エピジェネティックな相違、例えばDNAメチル化パターンの相違の存在によっても、胚性幹細胞と構造的に異なる。成体幹細胞から分化した心筋細胞もまた、本明細書に記載されるような心臓移植片のために使用され得ることが想定される。成体幹細胞を単離する方法は、当技術分野で公知である。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第9,206,393号および米国特許出願公開第2010/0166714号を参照されたい。
インビトロでの分化
本明細書に記載されている様々な方法および組成物は、インビトロで分化した心筋細胞を使用する。ESCまたはiPSCからいずれかの細胞型を分化させるための方法は、当技術分野で公知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる心筋細胞の分化について記載しているLaFlamme et al.,Nature Biotech 25:1015-1024（2007）を参照されたい。
ある態様において、ESCまたはiPSCの心筋細胞への段階的な分化は、以下の順序で進行する: ESCまたはiPSC＞心原性中胚葉＞心筋前駆細胞＞心筋細胞（例えば、それらの各々の内容の全体が、参照により本明細書に組み入れられるLian et al.Nat Prot（2013）; 米国特許出願公開第2017/0058263号; 同第2008/0089874号; 同第2006/0040389号; 米国特許第10,155,927号; 同第9,994,812号; および同第9,663,764号を参照されたい）。ESCおよびiPSCを心筋細胞に分化させるための多数のプロトコルが当技術分野で公知である。例えば、段階的に心筋細胞への分化を誘導するために、細胞培養培地に作用物質を添加するか、または細胞培養培地から作用物質を除去することができる。心筋細胞分化を促進することができる因子および作用物質の非限定的な例としては、小分子（例えば、Wntインヒビター、GSK3インヒビター）、ポリペプチド（例えば、増殖因子）、核酸、ベクターおよびパターン化された基材（例えば、ナノパターン）が挙げられる。線維芽細胞増殖因子2（FGF2）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）スーパーファミリー増殖因子-アクチビンAおよびBMP4、血管内皮増殖因子（VEGF）ならびにWntインヒビターDKK-1を含むがこれらに限定されない、心血管系の発達に必要な増殖因子の添加もまた、心臓系統に沿って分化を誘導する上で有益であり得る。心筋細胞の分化の促進を補助する因子および条件のさらなる例としては、とりわけ、インスリンを欠くB27サプリメント、細胞馴化培地、外部電気的ペーシングおよびナノパターン化基材が挙げられるが、これらに限定されない。
当業者によって理解されるように、心筋細胞のインビトロ分化は、所望の細胞型の表現型および形態的特徴を有する細胞という最終結果を生じるが、インビトロ分化の分化工程は、胚において天然に生じる分化と同じである必要はない。すなわち、心筋細胞への分化中に、そのような細胞を生産するために利用される段階的な分化アプローチは、胚形成中に同定されている全ての前駆細胞型を通して進行する必要はなく、胚形成の間に生じる発生のある段階を本質的に「スキップする」ことができることが本明細書において特に想定される。例えば、hPSCの転写因子媒介性再プログラム化に関して国際公開第2018096343号を参照されたい。例えば、分化転換を介して他の細胞から誘導された心筋細胞も、移植のために使用される場合、本明細書に記載されているイオンチャネルセットの調節から恩恵を受けることができることも想定される。
心筋細胞の分化のモニタリングおよび機能的特性決定
当業者によって理解されるように、本明細書に記載されているインビトロで分化した心筋細胞は、造血（hematopoietic）細胞もしくは造血性（hemogenic）細胞、血管内皮細胞、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞のマーカーを欠く。本明細書に記載されている方法の一態様において、例えば完全に分化した心筋細胞への、胚性幹細胞またはiPSCのスペクトルに沿った分化の程度を決定するために、1つまたは複数の細胞表面マーカーが使用される。
いくつかの態様において、蛍光活性化細胞選別（FACS）、パニング法、磁気粒子選択、粒子選別機選択ならびに密度分離（Xu et al.（2002）Circ.Res.91:501; 米国特許出願第20030022367号）および他の物理的特性に基づく分離（Doevendans et al.（2000）J.Mol.Cell.Cardiol.32:839-851）を含む、当業者に公知の他の方法を使用して所望の細胞を分離および単離するために、所与のマーカーまたはマーカーのセットに対して特異的な抗体または類似の作用物質を使用することができる。望ましくないマーカーまたは特徴、例えば線維芽細胞マーカー、上皮細胞マーカーなどを有する細胞を選択および除去することを含む、負の選択を行うことができる。
未分化ES細胞は、未分化細胞の存在を検出するためのマーカーとして使用され得る遺伝子を発現する。例示的なES細胞マーカーとしては、ステージ特異的胎児抗原（SSEA）-3、SSEA-4、TRA-I-60、TRA-1-81、アルカリホスファターゼ、または例えば、それぞれそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第2003/0224411号もしくはBhattacharya（2004）Blood 103（8）:2956-64に記載されているものが挙げられる。心筋前駆細胞上に発現される例示的なマーカーとしては、TMEM88、GATA4、ISL1、MYL4およびNKX2-5が挙げられるが、これらに限定されない。
心筋細胞上に発現される例示的なマーカーとしては、NKX2-5、MYH6、MYL7、TBX5、ATP2a2、RYR2、およびcTnTが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、所望の細胞（例えば、インビトロで分化した心筋細胞）は、濃縮された細胞集団である。すなわち、細胞の集団におけるインビトロで分化した心筋細胞のパーセンテージ（例えば、細胞のパーセント）は、集団中の細胞の総数の少なくとも10％である。例えば、濃縮された集団は、少なくとも15％の最終心筋細胞を含み、集団の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％またはさらには100％がインビトロで分化したヒト心筋細胞を含む。いくつかの態様において、細胞の集団は、少なくとも100個の細胞、少なくとも500個の細胞、少なくとも1000個の細胞、少なくとも1×104個の細胞、少なくとも1×105個の細胞、少なくとも1×106個の細胞、少なくとも1×107個の細胞、少なくとも1×108個の細胞、少なくとも1×109個の細胞、少なくとも1×1010個の細胞、少なくとも1×1011個の細胞、少なくとも1×1012個の細胞、少なくとも1×1013個の細胞、少なくとも1×1014個の細胞、少なくとも1×1015個の細胞、またはそれより多くを含む。
心筋細胞の分化および成熟の確認は、筋節の形態ならびにアクチンおよびミオシンの構造的特徴をアッセイすることによって評価され得る。心臓の筋節の構造は高度に秩序化されているので、当業者はこれらのタンパク質（アクチン、ミオシン、α-アクチニン、タイチン）を認識することができ、成熟筋細胞および組織を同定するためのマーカーとして、組織または培養細胞の集合中でのそれらの配置を使用することができる。発達中の心臓細胞は、細胞内に新しい筋節単位を作り出す「筋節形成」を経る。筋節組織化の程度は、心筋細胞の成熟度の尺度を提供する。
筋節構造を同定および測定するために、とりわけ、α-アクチニン、β-ミオシン、アクチン、cTnT、トロポミオシンおよびコラーゲンに対する免疫蛍光アッセイおよび電子顕微鏡法を使用することができる。免疫蛍光画像は、筋節の整列、パターン強度および筋節長について定量化され得る。これは、筋節内のタンパク質（例えば、α-アクチニン）を染色し、筋節が整列しているかどうかを定性的または定量的に決定することによって達成され得る。筋節整列の定量的測定のために、筋節内のタンパク質の位置を決定するために走査勾配フーリエ変換スクリプトを使用するなど、いくつかの方法を使用することができる。これは、個々の分析のために顕微鏡およびカメラによって撮影された各画像を使用することによって行われる。方向導関数を使用して、筋節の局所的な整列を決定するために各セグメントの画像勾配を計算することができる。パターン強度は、勾配の方向の1次元フーリエ変換の最大ピークを計算することによって決定することができる。筋節の長さは、この同じ勾配方向に沿った筋節の強度プロファイルを測定することによって計算することができる。
構造的に成熟した幹細胞由来心筋細胞を同定するために、細胞の形態を使用することができる。形態および構造のパラメータの非限定的な例としては、筋節長、Zバンド幅、二核性割合、核偏心度、細胞面積および細胞アスペクト比が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞活性および成熟は、心筋細胞の電気的成熟度、代謝的成熟度または収縮的成熟度などの多くのパラメータによって決定することができる。
成熟心筋細胞は、心筋収縮の同期を可能にする機能的イオンチャネルを有する。心筋細胞の電気的機能は、様々な方法によって測定され得る。このような方法の非限定的な例としては、とりわけ、ホールセルパッチクランプ（手動または自動）、多重電極アレイ、電場電位刺激、カルシウムイメージングおよび光学マッピングが挙げられる。心筋細胞は、電気的および/または収縮的応答を生じさせるために、ホールセル電流クランプまたは電場電位記録中に電気的に刺激され得る。さらに、心筋細胞は、例えば、細胞の光刺激を可能にするチャネルロドプシンを発現するように遺伝子改変され得る。
心筋細胞の分化段階および細胞成熟度を決定するために、心筋細胞の電場電位および生体電位の測定を使用することができる。限定するものではないが、例えば心筋細胞の電気生理学的機能を決定するために、以下のパラメータ: とりわけ、電場電位持続時間（FPD）の変化、FPDの定量化、拍動数、毎分の拍動数、立ち上がり速度、静止膜電位、活動電位の振幅、最大拡張期電位、弛緩の時定数、90％再分極の活動電位持続時間（APD）、スパイク間間隔、拍動間隔の変化、電流密度、活性化および不活性化速度論を使用することができる。
電気的成熟度は、基準レベルと比較される以下のマーカーの1つまたは複数によって決定される: イオンチャネル遺伝子の増加した遺伝子発現、増加したナトリウム電流密度、増加した内向き整流カリウムチャネル電流密度、減少した活動電位頻度、減少したカルシウム波頻度および減少した電場電位頻度。
疾患状態中には、心筋細胞の電気生理学的機能が損なわれることがあり得る。例えば、正常な幹細胞由来の心筋細胞と比較して、延長された電場電位持続時間（FPD）および延長された活動電位持続時間（APD）は、不整脈電位を有する心筋細胞の指標である。本明細書で使用される場合、「電場電位持続時間（FPD）」という用語は、所与の脱分極事象から最後の脱分極事象までの時間を指すのに対して、「活動電位持続時間（APD）」という用語は、ナトリウムチャネルの開口（または第0相）と電位膜を静止電位にするカリウムチャネルの開口（第3相）との間の時間を指す。FPDおよびAPDの「正常な」または「延長された」値は、試験される細胞株に依存するが、約200msのFDPおよび約100msのAPDは、hESC-CMについて「正常な」と考えることができ、FPD＞400msおよびAPD＞300msは、このような細胞について「延長された」と考えることができる（例えば、Stem Cell Res Ther 12,278（2021）を参照されたい）。
成体心筋細胞は、増大したミトコンドリア機能および予備の呼吸能力を特徴とする胎児心筋細胞と比較して、増強された酸化的細胞代謝を有することが示されている。本明細書に記載されている幹細胞由来心筋細胞の分化段階および細胞成熟度を決定するために、代謝アッセイを使用することができる。代謝アッセイの非限定的な例としては、細胞生体エネルギーアッセイ（例えば、Seahorse Bioscience XF Extracellular Flux Analyzer）および酸素消費試験が挙げられる。
具体的には、細胞代謝は、パラメータの中でも特に、酸素消費速度（OCR）、脂肪酸ストレス試験中のOCRトレース、OCRの最大変化、FCCP添加後のOCRの最大変化および最大呼吸能力によって定量化され得る。
さらに、代謝的チャレンジまたはラクタート濃縮アッセイは、幹細胞由来の心筋細胞の成熟の尺度またはこのような細胞の様々な処理の効果の尺度を提供することができる。ほとんどの哺乳動物細胞は、一般に、その主なエネルギー源としてグルコースを使用する。しかしながら、心筋細胞は、ラクタートまたは脂肪酸などの異なる源からのエネルギー産生が可能である。いくつかの態様において、ラクタートが補充され、グルコースが枯渇された培養培地、またはラクタートもしくは脂肪酸をエネルギー源として使用する細胞の能力は、成熟心筋細胞およびそれらの機能の変動を同定するのに有用である。
インビトロで分化した心筋細胞の代謝的成熟度は、基準レベルと比較した、以下のマーカーの1つまたは複数によって決定される:
ミトコンドリア機能の増加した活性、増加した脂肪酸代謝、増加した酸素消費速度（OCR）、増加したリン酸化ACCレベルまたは活性、脂肪酸結合タンパク質（FABP）の増加したレベルまたは活性、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ-4（PDK4）の増加したレベルまたは活性、増加したミトコンドリア呼吸能力、増加したミトコンドリア体積、およびミトコンドリアDNAの増加したレベル。
心筋細胞の収縮性は、ビデオ解析などの光学的追跡法によって測定され得る。光学的追跡に加えて、インピーダンス測定も実行され得る。例えば、本明細書に記載されている心筋細胞は、xCelligence（商標）リアルタイム細胞分析（Acea Biosciences,Inc.,San Diego,CA）によって決定された収縮性または拍動数の測定値を有することができる。
心筋細胞機能を決定するための有用なパラメータは拍動数である。幹細胞分化段階、幹細胞由来心筋細胞の成熟度、および拍動数に対する所与の処置の効果を決定するために、収縮の頻度、拍動数、拍動間隔の変化（ΔBI）または拍動間隔を使用することができる。拍動数は、光学的追跡によって測定され得る。拍動数は、典型的には胎児心筋細胞において上昇し、心筋細胞が発達するにつれて低下する。限定するものではないが、収縮パラメータとしては、収縮力、収縮速度、弛緩速度、収縮角度分布または収縮異方性比も挙げることができる。
収縮的成熟度は、基準レベルと比較された以下のマーカーの1つまたは複数によって決定される: 増加した拍動数、増加した収縮力、α-ミオシン重鎖（α-MHC）の増加したレベルまたは活性、筋節の増加したレベルまたは活性、減少した真円度指数、トロポニンの増加したレベルまたは活性、タイチンN2bの増加したレベルまたは活性、増加した細胞面積、および増加したアスペクト比。
心臓/心筋細胞移植片
一局面において、心筋細胞、例えば、インビトロで分化した心筋細胞を移植する方法であって、心臓組織を、本明細書に記載されているヒト心筋細胞、本明細書に記載されている薬学的組成物、本明細書に記載されている移植組成物と接触させる工程、または本明細書に記載されている心臓送達装置を使用して、その必要がある対象に心筋細胞を送達する工程を含む、方法が、本明細書に記載されている。
本明細書で使用される場合、「移植する」または「移植」という用語は、所望の効果が生じるように、損傷または修復部位などの所望の部位に、導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、本明細書に記載されている細胞、例えば心筋細胞の、対象内への配置の文脈で使用される。細胞、例えば心筋細胞、またはそれらの分化した子孫（例えば、心臓線維芽細胞など）および心筋細胞は、直接またはレシピエントの心臓組織内に、例えば、部位にもしくはその付近に、または心疾患を有する対象の心臓組織内に植え込まれ得る。当業者が理解するように、心筋細胞は、一般に、心臓が細胞死を含む急性損傷から治癒することができる程度まで増殖しないので、心筋細胞の長期生着が所望される。いくつかの態様において、細胞は、任意で、植え込まれた心筋細胞の生存を支え、および/または例えば、投与された細胞を生着のために所望の位置に保持することを補助するか、または対象における天然の心臓細胞との統合を促進する足場または生体適合性材料上またはその中に移植される。好ましくは、心筋細胞は、本明細書に記載されているヒト幹細胞由来心筋細胞またはインビトロで分化した心筋細胞である。
足場組成物:
一局面において、本明細書に記載されている心筋細胞は、細胞を支持するための足場またはパターン化された基材を提供する調製物と混合され得るか、またはその上で培養され得る。このような足場またはパターン化された基材は、例えば植え込み後に、細胞を所定の位置に固定する上での物理的な利点に加えて、例えば、さらなる成熟または例えば細胞が確立されるまでの表現型の維持のための細胞外の合図を提供する上での生化学的利点を提供することができる。
足場は、細胞を所望の位置に封じ込めることができるが、生存および機能のために必要な因子の、環境内への進入または拡散を許容するゲル、シートまたは格子を含むがこれらに限定されない生体適合性材料を含む構造である。足場に適した多くの生体適合性ポリマーが、当技術分野で公知である。
生体適合性の合成ポリマー、天然ポリマーおよび半合成ポリマーが、足場材料として使用することができるポリマー粒子を合成するために使用され得る。一般に、本明細書に記載されている方法を実施するために、心筋細胞を植え込み前にポリマーから単離することができるように、または時間が経過するにつれて足場が対象内で分解し、除去を必要としないように、足場は生分解することが好ましい。したがって、一態様において、足場は、その必要がある対象への、心筋細胞の成長および/または送達のための一時的な構造またはマトリックスを提供する。いくつかの態様において、足場は、その必要がある対象中への移植または投与に適した形状でヒト細胞を成長させることを可能にし、それによって植え込み前に足場の除去を可能にし、足場自体によって開始される拒絶またはアレルギー反応のリスクを低減する。
使用され得るポリマーの例としては、天然および合成ポリマーが挙げられるが、再現性および徐放性動態のために合成ポリマーが好ましい。使用され得る合成ポリマーとしては、ポリ（ラクチド）（PLA）、ポリ（グリコール酸）（PGA）、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（PLGA）および他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボナート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリラートおよび生分解性ポリウレタンなどの生分解性ポリマー; ポリアクリラート、エチレン-酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換された酢酸セルロースおよびその誘導体; ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィンおよびポリエチレンオキシドなどの非生分解性ポリマーが挙げられる。生分解性天然ポリマーの例としては、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、絹、合成ポリアミノ酸およびプロラミンなどのタンパク質; アルギナート、ヘパリンなどの多糖類; ならびに糖単位の他の天然に存在する生分解性ポリマーが挙げられる。あるいは、前述のポリマーの組み合わせを使用することができる。一局面において、細胞外マトリックス中に一般的に見られない天然ポリマーを使用することができる。
PLA、PGAおよびPLA/PGAコポリマーは、生分解性足場を形成するのに特に有用である。PLAポリマーは、通常、乳酸の環状エステルから調製される。PLAポリマー、ならびにD（-）およびL（＋）乳酸の光学的に不活性なDL-乳酸混合物を調製するために、L（＋）およびD（-）形態の乳酸の両方を使用することができる。ポリラクチドを調製する方法は、特許文献に十分に記載されている。その教示が参照により本明細書に組み入れられる以下の米国特許: Doroughの米国特許第1,995,970号; Schneiderの米国特許第2,703,316号; Salzbergの米国特許第2,758,987号; Zeileの米国特許第2,951,828号; Higginsの米国特許第2,676,945号; および米国特許第2,683,136号; Trehuの米国特許第3,531,561号は、適切なポリラクチド、それらの特性およびそれらの調製を詳細に記載している。
PGAは、グリコール酸（ヒドロキシ酢酸）のホモポリマーである。グリコール酸のポリ（グリコール酸）への変換において、グリコール酸は最初にそれ自体と反応して環状エステルグリコリドを形成し、環状エステルグリコリドは熱および触媒の存在下で高分子量直鎖ポリマーに変換される。PGAポリマーおよびそれらの特性は、”Cyanamid Research Develops World's First Synthetic Absorbable Suture”,Chemistry and Industry,905（1970）により詳細に記載されている。
繊維は、溶融紡糸、押出、流延成形またはポリマー加工分野で周知の他の技術によって形成され得る。植え込み前に足場を除去するために使用される場合、好ましい溶媒は、処理によって完全に除去されるか、または処理後に残存する量で生体適合性である溶媒である。
マトリックスにおいて使用するためのポリマーは、その後の成長および増殖を伴う細胞に十分な支持を提供するために必要な機械的および生化学的パラメータを満たすべきである。ポリマーは、Instron試験機を使用して引張強度などの機械的特性に関して、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によってポリマー分子量、示差走査熱量測定（DSC）によってガラス転移温度および赤外（IR）分光法によって結合構造について性質決定され得る。
基材または足場は、任意で、例えば足場上の心臓組織の成長、配置または成熟を可能にするかまたは促進する溝および隆起でナノパターン化またはマイクロパターン化され得る。足場は、任意の所望の形状を有することができ、本明細書に記載されている方法にとって有用な幅広い幾何学的形状を含むことができる。形状の非限定的なリストは、例えば、とりわけ、パッチ、中空粒子、チューブ、シート、円柱、球および繊維を含む。足場の形状またはサイズは、細胞成長、細胞分化、細胞増殖または任意の他の細胞プロセスを実質的に妨げるべきではなく、足場は、例えばアポトーシスまたは壊死を介して細胞死を誘導すべきではない。さらに、細胞生存性が損なわれないように、周囲の培地から集団中の細胞への栄養素の送達のために足場形状が適切な表面積を確実に許容するように注意を払うべきである。足場の多孔度も、当業者が所望するように変更され得る。
いくつかの態様において、ポリマーへの細胞の付着は、基底膜成分、フィブロネクチン、寒天、アガロース、ゼラチン、アラビアガム、I型、II型、III型、IV型およびV型コラーゲン、ラミニン、グリコサミノグリカン、ポリビニルアルコール、これらの混合物、ならびに細胞培養または組織工学の当業者に公知の他の親水性およびペプチド付着材料などの化合物でポリマーをコーティングすることによって増強される。ポリマー足場をコーティングするための材料の例としては、ポリビニルアルコールおよびコラーゲンが挙げられる。当業者によって理解されるように、Matrigel（商標）はヒト対象への投与に適しておらず、したがって、本明細書に記載されている組成物はMatrigel（商標）を含まない。
いくつかの態様において、生物活性分子/因子を足場に添加することが望ましい場合があり得る。本明細書に記載されているマトリックスを使用して、様々な生物活性分子を送達することができる。
一態様において、生物活性因子は増殖因子を含む。増殖因子の例としては、血小板由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング増殖因子αまたはβ（TGFβ）、骨形成タンパク質4（BMP4）、線維芽細胞増殖因子7（FGF7）、線維芽細胞増殖因子10（FGF10）、上皮増殖因子（EGF/TGFα）、血管内皮増殖因子（VEGF）が挙げられ、これらのいくつかは血管新生因子でもある。
これらの因子は当業者に公知であり、市販されているか、または文献に記載されている。生物活性分子は、マトリックス中に組み込まれ、時間が経過するにつれてマトリックスの拡散および/もしくは分解によって放出され得るか、または細胞懸濁液で懸濁され得る。
薬学的に許容される担体
本明細書に記載されているようにヒト心筋細胞を対象に投与する方法は、このような細胞を含む治療組成物の使用を伴う。治療組成物は、細胞組成物および任意で、活性成分としてその中に溶解または分散された本明細書に記載されている少なくとも1つの追加の生物活性作用物質、ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸または因子とともに、生理的に耐容される担体を含有する。
好ましい態様において、治療組成物は、実質的に免疫原性であることが所望される場合を除いて、治療目的で哺乳動物またはヒト患者に投与された場合に実質的に免疫原性ではない。本明細書で使用される「薬学的に許容される」、「生理的に耐容される」という用語およびそれらの文法的変形は、それらが組成物、担体、希釈剤および試薬に言及する場合、互換的に使用され、これらの材料が、悪心、めまい、胃の不調、移植拒絶、アレルギー反応などの望ましくない生理学的効果を生じることなく哺乳動物にまたは哺乳動物の上に投与することができることを表す。薬学的に許容される担体は、そのように所望される場合を除き、薬学的に許容される担体と混合される作用物質に対する免疫応答の発生を促進しない。その中に溶解または分散された活性成分を含有する組成物の調製は、当技術分野で十分に理解されており、調合に基づいて限定される必要はない。典型的には、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能なものとして調製されるが、使用前に液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態も調製され得る。
ヒト用の移植組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される担体または材料を賦形剤として含むことができる。対照的に、（ヒト移植用ではない）細胞培養組成物は、典型的には、賦形剤として細胞培養培地のような研究試薬を使用する。心筋細胞はまた、FDA承認マトリックス/足場に入れて、または上記のようにFDA承認薬と組み合わせて投与され得る。
一般に、本明細書に記載されている心筋細胞を含む組成物は、細胞が薬学的に許容される担体と混合されている懸濁製剤として投与される。当業者は、細胞組成物において使用される薬学的に許容される担体は、対象に送達される細胞の生存性を実質的に妨害する量で、緩衝剤、化合物、凍結保存剤、防腐剤または他の作用物質を含まないことを認識するであろう。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜の完全性を維持することを可能にする浸透圧緩衝剤、および任意で、投与時に細胞生存性を維持するかまたは生着を増強する栄養素を含むことができる。このような製剤および懸濁液は、当業者に公知であり、および/または日常的な実験を使用して本明細書に記載されているヒト心筋前駆細胞での使用に対して適合させることができる。
細胞組成物はまた、乳化手順が細胞生存性に悪影響を及ぼさない限り、乳化され得るか、またはリポソーム組成物として提示され得る。細胞および任意の他の活性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合性であり、本明細書に記載されている治療方法での使用に適した量の賦形剤と混合され得る。
生理的に耐容される担体は当技術分野で周知である。例示的な液体担体は、活性成分と水の他に材料を含有しないか、または生理的pH値のリン酸ナトリウム、生理食塩水などの緩衝液、もしくはリン酸緩衝生理食塩水など、その両方を含有する無菌水溶液である。さらに、水性担体は、1つより多くの緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含有することができる。液体組成物は、水に加えて、および水を除いて、液相を含有することもできる。このような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油および水-油エマルジョンである。特定の障害または症状の処置に有効である本明細書に記載されている細胞組成物において使用される活性化合物の量は、障害または症状の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。
凍結保存:
いくつかの態様において、HCN4、CACHA1HおよびSLC8A1が阻害され、KCNJ2が活性化された心筋細胞を含む本明細書に記載されている心筋細胞は凍結保存される、すなわち後の解凍および投与のために凍結される。凍結保存および凍結保存剤は当技術分野で周知であり、例えば、凍結保存剤の中でもとりわけ、（例えば、7.5％～15％のまたは約7.5％～15％の）DMSOまたは（例えば、10％のまたは約10％の）グリセロールを含有する培地中の細胞の懸濁液が挙げられる。心筋細胞を含む哺乳動物細胞は、一般に、例えば約-1℃/分で温度を-70℃～-90℃の温度まで低下させることによって、ゆっくりと凍結される。保存は、-80℃で、例えば、超低温フリーザー中で、または例えばドライアイス上もしくは液体窒素下で行うことができる。
投与および有効性
その必要がある対象に心筋細胞を投与する工程を含む、心疾患、心障害、心臓損傷、心不全または心筋梗塞を処置するための方法が本明細書において提供される。いくつかの態様において、予想される障害、例えば、心筋損傷後の心不全を予防するための方法および組成物が本明細書において提供される。
測定されるまたは測定可能なパラメータには、疾患の臨床的に検出可能なマーカー、例えば、臨床的または生物学的マーカーの上昇したまたは低下したレベルの他、症候の臨床的に受容されたスケールに関連するパラメータまたは疾患もしくは障害に対するマーカーが含まれる。しかしながら、本明細書に開示される組成物および製剤の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。必要とされる正確な量は、処置されている疾患の種類などの因子に応じて変化する。
いくつかの態様において、対象は、本明細書に記載されている方法に従って細胞を投与する前に、最初に、心筋に影響を及ぼす疾患または障害を有すると診断される。いくつかの態様において、対象は、細胞を投与する前に、最初に、疾患（例えば、心筋損傷後の心不全）または障害を発症するリスクがあると診断される。
当業者は、移植片に対して必要とされる心筋細胞の数を決定することができる。いくつかの態様において、約1000万個の心筋細胞～約100億個の心筋細胞が対象に投与される。本明細書に記載されている様々な局面における使用の場合、ヒト心筋細胞の有効量は、少なくとも1×103、少なくとも1×104、少なくとも1×105、少なくとも5×105、少なくとも1×106、少なくとも2×106、少なくとも3×106、少なくとも4×106、少なくとも5×106、少なくとも6×106、少なくとも7×106、少なくとも8×106、少なくとも9×106、少なくとも1×107、少なくとも1.1×107、少なくとも1.2×107、少なくとも1.3×107、少なくとも1.4×107、少なくとも1.5×107、少なくとも1.6×107、少なくとも1.7×107、少なくとも1.8×107、少なくとも1.9×107、少なくとも2×107、少なくとも3×107、少なくとも4×107、少なくとも5×107、少なくとも6×107、少なくとも7×107、少なくとも8×107、少なくとも9×107、少なくとも1×108、少なくとも2×108、少なくとも5×108、少なくとも7×108、少なくとも1×109、少なくとも2×109、少なくとも3×109、少なくとも4×109、少なくとも5×109またはそれより多くの心筋細胞を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載されているポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードする核酸の任意の1つまたは複数で処理された心筋細胞を含む組成物は、このような心筋細胞が単独で投与された場合の生着よりも少なくとも20％高い効率で心臓内の細胞の生着を可能にする。他の態様において、このような効率は、本明細書に記載されているポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードする核酸なしで心筋細胞が単独で投与された場合の生着の効率より少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくはそれを超えるか、または少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、少なくとも100倍もしくはそれを超える。
いくつかの態様において、有効量の心筋細胞は、心臓内投与または送達によって対象に投与される。本明細書で定義される場合、「心臓内」投与または送達は、直接心臓注射、心筋内注射、梗塞部位内注射、手術中（例えば、心臓バイパス手術、心臓ミニポンプまたはペースメーカーの植え込み中など）の注射が含まれるがこれらに限定されない、心筋細胞の集団が、対象の心筋とのこれらの細胞の直接の接触をもたらすように投与される全ての投与経路を指す。いくつかのこのような態様において、細胞は心筋（例えば、心筋細胞）中に、または心房および/もしくは心室の腔中に注入される。いくつかの態様において、細胞の心臓内送達には、心臓の所望の領域中への単回注射または複数回の「ミニ」注射を介して、細胞が、例えば細胞懸濁液として、手術を受けている対象に投与される投与方法が含まれる。
製剤の選択は、使用される具体的な組成物および投与される心筋細胞の数に依存し、このような製剤は、当業者によって調整され得る。しかしながら、一例として、組成物が薬学的に許容される担体中の心筋細胞である場合、組成物は、溶液1mL当たりの細胞の有効濃度での、適切な緩衝液（例えば、生理食塩水緩衝液）中の細胞の懸濁液であり得る。製剤は、細胞栄養素、（例えば、浸透圧調整のための）単糖または細胞の生存性を維持するための他の成分も含むことができる。あるいは、製剤は、生分解性足場などの足場を含むことができる。
いくつかの態様において、対象の処置を補助するための追加の作用物質は、記載されているように心筋細胞での処置の前または後に投与され得る。前駆細胞の投与のための標的組織を調製するために、このような追加の作用物質を使用することができる。あるいは、心臓または他の所望の投与部位内への投与された細胞の生着および成長を支えるために、心筋細胞の後に追加の作用物質を投与することができる。いくつかの態様において、追加の作用物質は、VEGFまたはPDGFなどの増殖因子を含む。心筋細胞が生着している間、心臓への負荷を軽減するために、他の例示的な作用物質を使用することができる（例えば、β遮断薬、血圧を低下させるための薬物など）。
処置の有効性は、当業者によって決定され得る。しかしながら、処置は、本用語が本明細書で使用される場合、本明細書に記載されているヒト心筋細胞を含む組成物での処置後に、前記症候、または疾患、例えば心疾患、心不全、心臓損傷および/もしくは心障害のその他の臨床的に受容された症候もしくはマーカーの任意の1つまたは全てが、例えば少なくとも10％低下すれば、「有効な処置」と考えられる。これらの指標を測定する方法は当業者に公知であり、および/または本明細書に記載されている。一態様において、処置は、本明細書に記載されているように、移植された心筋細胞が実質的に移植不整脈を引き起こさずに生着すれば有効である。この文脈での「実質的に引き起こさずに」とは、移植不整脈が起こらないこと、または本明細書に記載されている心筋細胞の導入によって引き起こされる拍数もしくは調律の乱れが、本明細書に記載されているように処置または改変されていない類似の心筋細胞の生着と比較して、持続時間および/もしくは重度において、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％低いなど、少なくとも20％低いことを意味する。
心疾患または心障害または心臓損傷の指標には、機能的指標またはパラメータ、例えば心拍出量、心拍数、左室駆出率、心拍数、心調律、血圧、心容積、逆流などの他、とりわけ、血清乳酸デヒドロゲナーゼまたは血清トロポニンなどの心損傷のマーカーの減少などの生化学的指標が含まれる。一例として、心筋虚血および再灌流は、低下した心機能に関連する。虚血性心イベントに罹患したことがあるおよび/または再灌流療法を受けたことがある対象は、虚血および/または再灌流前の心機能と比較すると、低下した心機能を有する。心機能の尺度には、例えば、駆出率および短縮率が含まれる。駆出率は、心拍ごとに心室から送り出される血液の割合である。駆出率という用語は、右心室および左心室の両方に適用される。LVEFは、左室駆出率（LVEF）を指す。短縮率は、拡張末期寸法と収縮末期寸法との差を拡張末期寸法で割ったものを指す。
心機能パラメータを評価するために使用することができる臨床検査の非限定的な例には、心エコー（ドップラーフローイメージングありまたはなし）、心電図（EKG）、運動負荷試験、ホルター心電図またはβ-ナトリウム利尿ペプチドの測定が含まれる。
必要な場合または所望される場合、本明細書に記載されている特定の組成物の有効性を評価するために、損傷または疾患の動物モデルを使用することができる。例えば、単離された鼓動しているウサギもしくはラット心臓モデル、またはイヌもしくはブタのいずれかにおける冠動脈結紮モデルを使用することができる。心機能の動物モデルは、梗塞部位、冠動脈灌流、電気伝導、左室拡張末期圧、左室駆出率、心拍数、血圧、肥大の程度、拡張期弛緩機能、心拍出量、心拍変動および心室壁厚などをモニタリングするのに有用である。本明細書の実施例に記載されているブタモデルが特に好ましい。
いくつかの態様において、本明細書に記載されている心筋細胞を含む組成物は、例えば心筋梗塞後に、再灌流の開始の少なくとも6時間後に送達される。虚血発作およびその後の再灌流の間、心臓の微小環境または梗塞部位の微小環境は「敵対的」すぎるために、心臓に投与された心筋細胞の生着を許容できないことがあり得る。したがって、いくつかの態様において、再灌流の開始後、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも11時間、少なくとも12時間、少なくとも13時間、少なくとも14時間、少なくとも15時間、少なくとも16時間、少なくとも17時間、少なくとも18時間、少なくとも19時間、少なくとも20時間、少なくとも21時間、少なくとも22時間、少なくとも23時間、少なくとも24時間、少なくとも25時間、少なくとも26時間、少なくとも27時間、少なくとも28時間、少なくとも29時間、少なくとも30時間、少なくとも31時間、少なくとも32時間、少なくとも33時間、少なくとも34時間、少なくとも35時間、少なくとも36時間、少なくとも37時間、少なくとも38時間、少なくとも39時間、少なくとも40時間、少なくとも41時間、少なくとも42時間、少なくとも43時間、少なくとも44時間、少なくとも45時間、少なくとも46時間、少なくとも47時間、少なくとも48時間、少なくとも49時間、少なくとも50時間、少なくとも51時間、少なくとも52時間、少なくとも53時間、少なくとも54時間、少なくとも55時間、少なくとも56時間、少なくとも57時間、少なくとも58時間、少なくとも59時間、少なくとも60時間、少なくとも61時間、少なくとも62時間、少なくとも63時間、少なくとも64時間、少なくとも65時間、少なくとも66時間、少なくとも67時間、少なくとも68時間、少なくとも69時間、少なくとも70時間、少なくとも71時間、少なくとも72時間、少なくとも73時間、少なくとも74時間、少なくとも75時間、少なくとも76時間、少なくとも77時間、少なくとも78時間、少なくとも79時間、少なくとも80時間、少なくとも81時間、少なくとも82時間、少なくとも83時間、少なくとも84時間、少なくとも85時間、少なくとも86時間、少なくとも87時間、少なくとも88時間、少なくとも89時間、少なくとも90時間、少なくとも91時間、少なくとも92時間、少なくとも93時間、少なくとも94時間、少なくとも95時間、少なくとも96時間、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも8日、少なくとも9日、少なくとも10日またはそれを超えて、このような組成物を投与することが好ましい。いくつかの態様において、本明細書に記載されている心筋細胞を含む組成物は、心筋梗塞後任意の長さの時間で（例えば、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、少なくとも9ヶ月、少なくとも10ヶ月、少なくとも11ヶ月、少なくとも1年、少なくとも1.5年、少なくとも2年、少なくとも3年、少なくとも4年、少なくとも5年、少なくとも6年、少なくとも7年、少なくとも8年、少なくとも9年、少なくとも10年、少なくとも15年、少なくとも20年、少なくとも25年、または少なくとも30年またはそれを超えて）、梗塞部位、梗塞周囲部位、虚血部位、境界域または心臓の境界部に投与され得るが、当業者によって理解されるように、梗塞後の長い時間間隔後における生着の成功は、瘢痕組織の沈着量、瘢痕組織の密度、梗塞部位のサイズ、梗塞部位を取り囲む血管新生化の程度などを含むがこれらに限定されない多くの要因に依存する。このため、心筋細胞を含む組成物の投与によるより早期の介入は、例えば、梗塞後1ヶ月以上後の投与よりも有効であり得る。
本明細書に記載されている心筋細胞を含む組成物は、梗塞領域、梗塞周囲領域、虚血領域、境界部、境界域、壁菲薄化の領域、緻密化障害の領域、または不適応心臓リモデリングのリスクがある領域内を含むがこれらに限定されない心臓の任意の所望の領域に投与され得る。
本発明は、下記の番号付けされたパラグラフのいずれか1つに記載されるとおりであり得る。
1. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも部分的に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、インビトロで分化したヒト心筋細胞。
2. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現と、内在性HCN4制御配列によって調節される、KCNJ2をコードする導入遺伝子の発現とを含む、インビトロで分化したヒト心筋細胞。
3. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が、心筋細胞または他の対照細胞と比較して少なくとも部分的に阻害される、パラグラフ2のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
4. KCNJ2活性が、心筋細胞または他の対照細胞と比較して少なくとも部分的に刺激される、パラグラフ2またはパラグラフ3のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
5. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の少なくとも部分的な阻害が、前記心筋細胞を1つもしくは複数のインヒビター薬物と接触させることを介した阻害を含み、かつ/または遺伝子操作を含む、請求項1～4のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
6. KCNJ2活性の少なくとも部分的な刺激が、前記心筋細胞を1つもしくは複数の活性化薬物と接触させることを含み、かつ/または遺伝子操作を含む、請求項1～5のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
7. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記低下した発現が遺伝子操作によるものである、請求項2～6のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
8. KCNJ2の少なくとも部分的に刺激された活性が遺伝子操作によるものである、請求項2～8のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
9. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つまたは複数が不活性化される、請求項1～8のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
10. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の各々が不活性化される、請求項1～9のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
11. 対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が完全に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項1～10のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
12. 前記1つまたは複数のインヒビター薬物、活性化薬物および/または遺伝子操作が、HCN4、CACNA1H、SLC8A1および/またはKCNJ2の発現を変化させない、請求項5～11のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
13. 1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない心筋細胞または他の対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項1～12のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
14. 遺伝子操作によって操作されていない心筋細胞または他の対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項1～13のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
15. 対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が遺伝子操作によって完全に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項1～14のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
16. 前記心筋細胞または他の対照細胞が、野生型心筋細胞、初代心筋細胞、PSCもしくはESC由来のインビトロで分化した心筋細胞、または出発材料である、請求項11～15のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
17. 対照細胞が、1つまたは複数のインヒビター薬物、活性化薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない、請求項11～16のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
18. 前記1つまたは複数のインヒビター薬物、活性化薬物および/または遺伝子操作が、HCN4、CACNA1H、SLC8A1および/またはKCNJ2の発現を変化させない、パラグラフ17のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
19. 前記対照細胞が、PSCまたはESCに由来するインビトロで分化した心筋細胞であり、該対照細胞、PSCまたはESCが、1つ、2つまたは3つの編集を含むが4つ全ては含まず、前記HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも部分的に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激され、該PSCが任意でiPSCである、請求項11～18のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
20. 遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が遺伝子操作によって少なくとも10％または1倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項1～19のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
21. 遺伝子操作方法が遺伝子ノックダウンであり、任意で、該遺伝子ノックダウンが、RNAサイレンシングまたは、siRNA、piRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群より任意で選択されるRNAiによるものである、請求項1～20のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
22. 遺伝子操作方法が遺伝子ノックアウトであり、任意で、該遺伝子ノックアウトは、遺伝子編集システムを使用して前記遺伝子中に挿入または欠失を誘導することによるものであり、前記遺伝子編集システムは、ZFN、TALEN、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、CRISPR/Casシステム、ニッカーゼシステム、塩基編集システム、プライム編集システム、および遺伝子書き込みシステムからなる群より任意で選択される、請求項1～21のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
23. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の1つまたは複数の対立遺伝子に導入される、請求項1～22のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
24. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の両方の対立遺伝子に導入される、請求項1～23のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
25. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現をもたらす、請求項1～24のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
25. 前記遺伝子不活性化が、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む、請求項1～24のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
27. 前記遺伝子不活性化が、RNA誘導型ヌクレアーゼ、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる、パラグラフ25のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
28. 前記RNA誘導型ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼを含む、パラグラフ27のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
29. 前記遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトが、RNAi、アンチセンス、またはRNAを標的とするCasヌクレアーゼを介して行われる、請求項9～25のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
30. 前記遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトが、CRISPR/Casシステムを使用して行われる、パラグラフ28またはパラグラフ29のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
31. 少なくとも1つの外因性核酸配列をさらに含む、請求項1～30のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
32. 少なくとも1つの外因性核酸配列からポリペプチドを発現する、パラグラフ313のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
33. 少なくとも1つのさらなる遺伝子の低下した発現をさらに含む、請求項1～32のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
34. KCNJ2が導入遺伝子から過剰発現される、請求項1～33のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
35. HCN4またはCACNA1H発現調節配列によって駆動される外因性KCNJ2コード配列を含む、請求項1～26のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
36. 置き換えられたHCN4またはCACNA1Hコード配列が発現されずかつ置き換えられたKCNJ2が内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列の調節下で発現されるように、KCNJ2コード配列がHCN4またはCACNA1Hのコード配列と置き換わる、請求項1～27のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
37. 前記KCNJ2コード配列が、CRISPR/Casシステムを使用して置き換えられている、パラグラフ35または36のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
38. HCN4の前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項35～37のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
39. CACNA1Hの前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項35～37のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
40. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子が不活性化され、前記KCNJ2ポリペプチドが過剰発現される、請求項1～39のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
41. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子が、少なくとも1つの対立遺伝子中にインデルを含む、パラグラフ40のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
42. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子が、2つの対立遺伝子中にインデルを含む、パラグラフ40のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
43. HCN4インデル/インデル、CACNA1Hインデル/インデル、およびSCL8A1インデル/インデル細胞である、パラグラフ42のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
44. 前記インデルが、CRISPR/Casシステムを使用して作成される、請求項40～43のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
45. KCNJ2ポリペプチドが、導入遺伝子によってコードされ、前記内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列に機能的に連結されている、請求項1～44のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
46. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子がCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつ前記KCNJ2ポリペプチドが内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される、請求項1～45のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
47. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記内在性HCN4制御配列に機能的に連結された前記導入遺伝子によってコードされる、パラグラフ46のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
48. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記HCN4遺伝子座において前記内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される、パラグラフ47のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
49. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子がCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつ前記KCNJ2ポリペプチドが内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される、請求項1～45のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
50. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記内在性CACNA1H制御配列に機能的に連結された導入遺伝子によってコードされる、パラグラフ49のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
51. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記CACNA1H遺伝子座において前記内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される、パラグラフ50のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
52. HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性が、前記心筋細胞を薬物と接触させることによって操作され、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性が遺伝子操作される、請求項1～51のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
53. 前記心筋細胞が多能性幹細胞からインビトロで分化している、請求項1～52のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
54. 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC）である、パラグラフ53のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
55. 前記心筋細胞が、前記インビトロで分化したヒト心筋細胞が移植される対象に由来するiPSCからインビトロで分化している、請求項1～54のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
56. 前記心筋細胞が、健康な対象に由来するiPSCからインビトロで分化している、請求項1～55のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
57. 前記心筋細胞が出発材料からインビトロで分化している、請求項1～56のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
58. 前記出発材料が、ドナーから収集された初代細胞を含む、パラグラフ57のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
59. 前記健康な対象、前記出発材料、および/または前記ドナーの各々が、前記インビトロで分化したヒト心筋細胞が移植される対象と同じ個体に由来しない、請求項56～58のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
60. 前記ドナーから収集された前記初代細胞が幹細胞である、パラグラフ58のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
61. 前記幹細胞がESCである、パラグラフ60のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
62. 前記出発材料が幹細胞株である、パラグラフ57のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
63. 前記幹細胞株がESC株またはiPSC株である、パラグラフ62のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
64. 前記幹細胞株がiPSC株である、パラグラフ63のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
65. その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性の少なくとも部分的な阻害ならびにKCNJ2活性の少なくとも部分的な刺激を含まないインビトロで分化したヒト心筋細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を促進する、請求項1～64のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
66. その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、前記対象が、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性の少なくとも部分的な阻害ならびにKCNJ2活性の少なくとも部分的な刺激を含まないインビトロで分化したヒト心筋細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を経験する、請求項1～65のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
67. 凍結保存剤と混合されている、請求項1～66のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
68. 凍結保存剤と混合されて凍結されている、請求項1～67のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
69. NKX2-5、MYH6、MYL7、TBX5、ATP2a2、RYR2、およびcTnTからなる群より選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、請求項1～68のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
70. 細胞活性および成熟が、電気的成熟度、代謝的成熟度、および収縮的成熟度からなる群より選択される数値パラメータによって決定可能である、請求項1～55のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
71. 前記インビトロで分化した心筋細胞の代謝的成熟度が、基準レベルと比較した、
ミトコンドリア機能の増加した活性、増加した脂肪酸代謝、増加した酸素消費速度（OCR）、増加したリン酸化ACCレベルまたは活性、脂肪酸結合タンパク質（FABP）の増加したレベルまたは活性、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ-4（PDK4）の増加したレベルまたは活性、増加したミトコンドリア呼吸能力、増加したミトコンドリア体積、およびミトコンドリアDNAの増加したレベル
からなる群より選択されるマーカーの1つまたは複数によって決定される、パラグラフ70のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
73. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現ならびにKCNJ2の増加した発現を含む、多能性幹細胞。
74. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現が、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の各々についての低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現を含む、パラグラフ73の多能性幹細胞。
75. KCNJ2の増加した発現が、増加したタンパク質発現および/または増加した遺伝子発現を含む、パラグラフ73の多能性幹細胞。
76. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現と、内在性HCN4制御配列によって調節される、KCNJ2をコードする導入遺伝子の発現とを含む、請求項73～75のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
77. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の前記阻害が、前記心筋細胞を1つもしくは複数のインヒビター薬物と接触させることを介した阻害を含み、かつ/または遺伝子操作を含む、請求項73～76のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
78. KCNJ2活性の前記刺激が、前記多能性幹細胞を1つもしくは複数の活性化薬物と接触させることを含み、かつ/または遺伝子操作を含む、請求項73～77のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
79. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記低下した発現が遺伝子操作によるものである、請求項73～78のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
80. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つまたは複数が不活性化される、請求項73～79のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
81. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の各々が不活性化される、請求項73～80のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
82. 1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が完全に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項73～81のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
83. 1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項73～82のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
84. 遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項73～83のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
85. 遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が遺伝子操作によって完全に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項73～84のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
86. 前記対照細胞が、野生型心筋細胞、初代心筋細胞、PSCもしくはESC由来のインビトロで分化した心筋細胞、または出発材料である、請求項73～85のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
87. 前記対照細胞が、PSCまたはESCに由来するインビトロで分化した心筋細胞であり、前記対照細胞、PSC、ESCが、1つ、2つまたは3つの編集を含むが4つ全ては含まず、前記HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも部分的に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項73～86のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
88. 遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が遺伝子操作によって少なくとも10％または1倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、パラグラフ87の多能性幹細胞。
89. 前記遺伝子操作方法が遺伝子ノックダウンであり、任意で、前記遺伝子ノックダウンが、RNAサイレンシングまたは、siRNA、piRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群より任意で選択されるRNAiによるものである、請求項73～88のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
90. 前記遺伝子操作方法が遺伝子ノックアウトであり、任意で、前記遺伝子ノックアウトは、遺伝子編集システムを使用して前記遺伝子中に挿入または欠失を誘導することによるものであり、前記遺伝子編集システムは、ZFN、TALEN、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、CRISPR/Casシステム、ニッカーゼシステム、塩基編集システム、プライム編集システム、および遺伝子書き込みシステムからなる群より任意で選択される、請求項73～89のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
91. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の1つまたは複数の対立遺伝子に導入される、請求項73～90のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
92. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の両方の対立遺伝子に導入される、請求項73～91のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
93. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現をもたらす、請求項73～92のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
94. 前記遺伝子不活性化が、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む、請求項73～94のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
95. 前記遺伝子不活性化が、RNA誘導型ヌクレアーゼ、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる、パラグラフ94の多能性幹細胞。
96. 前記RNA誘導型ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼを含む、パラグラフ95の多能性幹細胞。
97. 前記遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトが、RNAi、アンチセンス、またはRNAを標的とするCasヌクレアーゼを介して行われる、請求項80～96のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
98. 前記遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトが、CRISPR/Casシステムを使用して行われる、パラグラフ96またはパラグラフ97の多能性幹細胞。
99. 少なくとも1つの外因性核酸配列をさらに含む、請求項73～98のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
100. 少なくとも1つの外因性核酸配列からポリペプチドを発現する、パラグラフ99の多能性幹細胞。
101. 少なくとも1つのさらなる遺伝子の低下した発現をさらに含む、請求項73～100のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
102. KCNJ2が導入遺伝子から過剰発現される、請求項73～101のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
103. HCN4またはCACNA1H発現調節配列によって駆動される外因性KCNJ2コード配列を含む、請求項73～102のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
104. 置き換えられたHCN4またはCACNA1Hコード配列が発現されずかつ置き換えられたKCNJ2が内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列の調節下で発現されるように、KCNJ2コード配列がHCN4またはCACNA1Hのコード配列と置き換わる、請求項73～104のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
105. 前記KCNJ2コード配列が、CRISPR/Casシステムを使用して置き換えられている、パラグラフ103または104のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
106. HCN4の前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項73～105のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
107. CACNA1Hの前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項73～106のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
108. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子が不活性化され、前記KCNJ2ポリペプチドが過剰発現される、請求項73～107のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
109. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子が、少なくとも1つの対立遺伝子中にインデルを含む、パラグラフ108の多能性幹細胞。
110. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子が、2つの対立遺伝子中にインデルを含む、パラグラフ108の多能性幹細胞。
111. HCN4インデル/インデル、CACNA1Hインデル/インデル、およびSCL8Aインデル/インデル細胞である、パラグラフ110の多能性幹細胞。
112. 前記インデルが、CRISPR/Casシステムを使用して作成される、請求項109～111のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
113. KCNJ2ポリペプチドが、導入遺伝子によってコードされ、前記内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列に機能的に連結されている、請求項73～112のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
114. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子がCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつ前記KCNJ2ポリペプチドが内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される、請求項73～113のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
115. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記内在性HCN4制御配列に機能的に連結された前記導入遺伝子によってコードされる、パラグラフ114の多能性幹細胞。
116. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記HCN4遺伝子座において前記内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される、パラグラフ115の多能性幹細胞。
117. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子がCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつ前記KCNJ2ポリペプチドが内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される、請求項73～116のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
118. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記内在性CACNA1H制御配列に機能的に連結された導入遺伝子によってコードされる、パラグラフ117の多能性幹細胞。
119. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記CACNA1H遺伝子座において前記内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される、パラグラフ118の多能性幹細胞。
120. HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性が、前記心筋細胞を薬物と接触させることによって操作され、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性が遺伝子操作される、請求項73～119のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
121. 胚性幹細胞（ESC）である、請求項73～120のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
122. 人工多能性幹細胞（iPSC）である、請求項73～121のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
123. 前記多能性幹細胞が移植される対象に由来するiPSCに由来する、請求項73～122のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
124. 健康な対象に由来するiPSCに由来する、請求項73～123のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
125. 出発材料からインビトロで分化する、請求項73～124のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
126. 前記出発材料が、ドナーから収集された初代細胞を含む、パラグラフ125の多能性幹細胞。
127. 前記健康な対象、前記出発材料、および/または前記ドナーの各々が、前記多能性幹細胞が移植される対象と同じ個体に由来しない、請求項124～126のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
128. 前記ドナーから収集された前記初代細胞が幹細胞である、パラグラフ126の多能性幹細胞。
129. 前記幹細胞がESCである、パラグラフ127の多能性幹細胞。
130. 前記出発材料が幹細胞株である、パラグラフ125の多能性幹細胞。
131. 前記幹細胞株がESC株またはiPSC株である、パラグラフ130の多能性幹細胞。
132. 前記幹細胞株がiPSC株である、パラグラフ130の多能性幹細胞。
133. その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性の阻害ならびにKCNJ2活性の刺激を含まない多能性幹細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を促進する、請求項73～132のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
134. 凍結保存剤と混合されている、請求項73～133のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
135. 凍結保存剤と混合されて凍結されている、請求項73～134のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
136. 前記多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞が、NKX2-5、MYH6、MYL7、TBX5、ATP2a2、RYR2、およびcTnTからなる群より選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、請求項73～135のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
137. 前記多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞の細胞活性および成熟が、電気的成熟度、代謝的成熟度、および収縮的成熟度からなる群より選択される数値パラメータによって決定可能である、請求項73～136のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
138. 前記多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞の代謝的成熟度が、基準レベルと比較した、
ミトコンドリア機能の増加した活性、増加した脂肪酸代謝、増加した酸素消費速度（OCR）、増加したリン酸化ACCレベルまたは活性、脂肪酸結合タンパク質（FABP）の増加したレベルまたは活性、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ-4（PDK4）の増加したレベルまたは活性、増加したミトコンドリア呼吸能力、増加したミトコンドリア体積、およびミトコンドリアDNAの増加したレベル
からなる群より選択されるマーカーの1つまたは複数によって決定される、パラグラフ137の多能性幹細胞。
139. 請求項73～138のいずれか一項記載の多能性幹細胞を含む細胞バンク。
140. 請求項73～138のいずれか一項記載の多能性幹細胞からインビトロで分化した心筋細胞。
141. 出発材料と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現ならびにKCNJ2の増加した発現を含む、細胞。
142. 前記出発材料が、ドナーから収集された初代細胞を含む、パラグラフ141の細胞。
143. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下したタンパク質発現が、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の各々についての低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現を含む、パラグラフ141またはパラグラフ142の細胞。
144. KCNJ2の増加した発現が、増加したタンパク質発現および/または増加した遺伝子発現を含む、請求項141～143のいずれか一項記載の細胞。
145. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現と、内在性HCN4制御配列によって調節される、KCNJ2をコードする導入遺伝子の発現とを含む、請求項141～144のいずれか一項記載の細胞。
146. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の前記阻害が、前記細胞を1つもしくは複数のインヒビター薬物と接触させることを介した阻害を含み、かつ/または遺伝子操作を含む、請求項141～145のいずれか一項記載の細胞。
147. KCNJ2活性の前記刺激が、前記細胞を1つもしくは複数の活性化薬物と接触させることを含み、かつ/または遺伝子操作を含む、請求項141～146のいずれか一項記載の細胞。
148. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記低下した発現が遺伝子操作によるものである、請求項141～147のいずれか一項記載の細胞。
149. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つまたは複数が不活性化される、請求項141～148のいずれか一項記載の細胞。
150. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の各々が不活性化される、請求項141～149のいずれか一項記載の細胞。
151. 1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が完全に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項141～140のいずれか一項記載の細胞。
152. 1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項141～151のいずれか一項記載の細胞。
153. 遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項141～152のいずれか一項記載の細胞。
154. 遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が遺伝子操作によって完全に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項141～153のいずれか一項記載の細胞。
155. 前記対照細胞が、野生型心筋細胞、初代心筋細胞、PSCもしくはESC由来のインビトロで分化した心筋細胞、または出発材料である、請求項141～154のいずれか一項記載の細胞。
156. 前記対照細胞が、PSCまたはESCに由来するインビトロで分化した心筋細胞であり、前記対照細胞、PSC、ESCが、1つ、2つまたは3つの編集を含むが4つ全ては含まず、前記HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも部分的に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項152～155のいずれか一項記載の細胞。
157. 遺伝子操作によって操作されていない前記対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が遺伝子操作によって少なくとも10％または1倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、パラグラフ156の細胞。
158. 前記遺伝子操作方法が遺伝子ノックダウンであり、任意で、前記遺伝子ノックダウンが、RNAサイレンシングまたは、siRNA、piRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群より任意で選択されるRNAiによるものである、請求項141～157のいずれか一項記載の細胞。
159. 前記遺伝子操作方法が遺伝子ノックアウトであり、任意で、前記遺伝子ノックアウトは、遺伝子編集システムを使用して前記遺伝子中に挿入または欠失を誘導することによるものであり、前記遺伝子編集システムは、ZFN、TALEN、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、CRISPR/Casシステム、ニッカーゼシステム、塩基編集システム、プライム編集システム、および遺伝子書き込みシステムからなる群より任意で選択される、請求項141～158のいずれか一項記載の細胞。
160. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の1つまたは複数の対立遺伝子に導入される、請求項141～159のいずれか一項記載の細胞。
161. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の両方の対立遺伝子に導入される、請求項141～160のいずれか一項記載の細胞。
162. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現をもたらす、請求項141～161のいずれか一項記載の細胞。
163. 前記遺伝子不活性化が、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む、請求項141～162のいずれか一項記載の細胞。
164. 前記遺伝子不活性化が、RNA誘導型ヌクレアーゼ、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる、パラグラフ163の細胞。
165. 前記RNA誘導型ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼを含む、パラグラフ164の細胞。
166. 前記遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトが、RNAi、アンチセンス、またはRNAを標的とするCasヌクレアーゼを介して行われる、請求項149～165のいずれか一項記載の細胞。
167. 前記遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトが、CRISPR/Casシステムを使用して行われる、パラグラフ166の細胞。
168. 少なくとも1つの外因性核酸配列をさらに含む、請求項141～167のいずれか一項記載の細胞。
169. 少なくとも1つの外因性核酸配列からポリペプチドを発現する、パラグラフ168の細胞。
170. 少なくとも1つのさらなる遺伝子の低下した発現をさらに含む、請求項141～169のいずれか一項記載の細胞。
171. KCNJ2が導入遺伝子から過剰発現される、請求項141～170のいずれか一項記載の細胞。
172. HCN4またはCACNA1H発現調節配列によって駆動される外因性KCNJ2コード配列を含む、請求項141～171のいずれか一項記載の細胞。
173. 置き換えられたHCN4またはCACNA1Hコード配列が発現されずかつ置き換えられたKCNJ2が内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列の調節下で発現されるように、KCNJ2コード配列がHCN4またはCACNA1Hのコード配列と置き換わる、請求項141～172のいずれか一項記載の細胞。
174. 前記KCNJ2コード配列が、CRISPR/Casシステムを使用して置き換えられている、パラグラフ172または173のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
175. HCN4の前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項172～174のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
176. CACNA1Hの前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項172～174のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
177. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子が不活性化され、前記KCNJ2ポリペプチドが過剰発現される、請求項141～173のいずれか一項記載の細胞。
178. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子が、少なくとも1つの対立遺伝子中にインデルを含む、パラグラフ177の細胞。
179. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子が、2つの対立遺伝子中にインデルを含む、パラグラフ177の細胞。
180. HCN4インデル/インデル、CACNA1Hインデル/インデル、およびSCL8A1インデル/インデル細胞である、パラグラフ179の細胞。
181. 前記インデルが、CRISPR/Casシステムを使用して作成される、請求項178～180のいずれか一項記載の細胞。
182. KCNJ2ポリペプチドが、導入遺伝子によってコードされ、前記内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列に機能的に連結されている、請求項141～181のいずれか一項記載の細胞。
183. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子がCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつ前記KCNJ2ポリペプチドが内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される、請求項141～182のいずれか一項記載の細胞。
184. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記内在性HCN4制御配列に機能的に連結された前記導入遺伝子によってコードされる、パラグラフ183の細胞。
185. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記HCN4遺伝子座において前記内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される、パラグラフ183の細胞。
186. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子がCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつ前記KCNJ2ポリペプチドが内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される、請求項141～185のいずれか一項記載の細胞。
187. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記内在性CACNA1H制御配列に機能的に連結された導入遺伝子によってコードされる、パラグラフ186の細胞。
188. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記CACNA1H遺伝子座において前記内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される、パラグラフ186の細胞。
189. HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性が、前記細胞を薬物と接触させることによって操作され、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性が遺伝子操作される、請求項121～188のいずれか一項記載の細胞。
190. 多能性幹細胞からインビトロで分化している、請求項121～189のいずれか一項記載の細胞。
191. 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC）である、パラグラフ190の細胞。
192. 前記インビトロで分化したヒト心筋細胞が移植される対象に由来するiPSCからインビトロで分化している、請求項121～191のいずれか一項記載の細胞。
193. 健康な対象に由来するiPSCからインビトロで分化している、請求項121～192のいずれか一項記載の細胞。
194. 出発材料からインビトロで分化している、請求項121～193のいずれか一項記載の細胞。
195. 前記出発材料が、ドナーから収集された初代細胞を含む、パラグラフ194の細胞。
196. 前記健康な対象、前記出発材料、および/または前記ドナーの各々が、前記細胞が移植される対象と同じ個体に由来しない、請求項193～195のいずれか一項記載の細胞。
197. 前記ドナーから収集された前記初代細胞が幹細胞である、パラグラフ196の細胞。
198. 前記幹細胞がESCである、パラグラフ197の細胞。
199. 前記出発材料が幹細胞株である、パラグラフ198の細胞。
200. 前記幹細胞株がESC株またはiPSC株である、パラグラフ199の細胞。
201. 前記幹細胞株がiPSC株である、パラグラフ200の細胞。
202. その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性の阻害ならびにKCNJ2活性の刺激を含まない細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を促進する、請求項141～201のいずれか一項記載の細胞。
203. 凍結保存剤と混合されている、請求項141～202のいずれか一項記載の細胞。
204. 凍結保存剤と混合されて凍結されている、請求項141～203のいずれか一項記載の細胞。
205. 前記多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞が、NKX2-5、MYH6、MYL7、TBX5、ATP2a2、RYR2、およびcTnTからなる群より選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、請求項141～204のいずれか一項記載の細胞。
206. 前記多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞の細胞活性および成熟が、電気的成熟度、代謝的成熟度、および収縮的成熟度からなる群より選択される数値パラメータによって決定可能である、請求項141～205のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
207. 前記細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞の代謝的成熟度が、基準レベルと比較した、
ミトコンドリア機能の増加した活性、増加した脂肪酸代謝、増加した酸素消費速度（OCR）、増加したリン酸化ACCレベルまたは活性、脂肪酸結合タンパク質（FABP）の増加したレベルまたは活性、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ-4（PDK4）の増加したレベルまたは活性、増加したミトコンドリア呼吸能力、増加したミトコンドリア体積、およびミトコンドリアDNAの増加したレベル
からなる群より選択されるマーカーの1つまたは複数によって決定される、パラグラフ206の細胞。
208. 請求項141～207のいずれか一項記載の細胞を含む細胞バンク。
209. 請求項141～208のいずれか一項記載の細胞からインビトロで分化した心筋細胞。
210. 請求項171～208のいずれか一項記載の出発材料細胞からインビトロで分化した心筋細胞。
211. 請求項1～210のいずれか一項記載のまたは請求項1～210のいずれか一項に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
212. 細胞外マトリックスまたは足場組成物を含む、パラグラフ211の薬学的組成物。
213. 少なくとも1つの追加の細胞型をさらに含む、パラグラフ211またはパラグラフ212の薬学的組成物。
214. 請求項1～213のいずれか一項記載のもしくは請求項1～213のいずれか一項に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞または請求項211～213のいずれか一項記載の薬学的組成物を含む、移植組成物。
215. 請求項211～214のいずれか一項記載の薬学的組成物または移植組成物を備える、心臓送達装置またはシステム。
216. 前記薬学的組成物または移植組成物を含むシリンジを備える、パラグラフ215の心臓送達装置またはシステム。
217. 前記薬学的組成物または移植組成物の通過に十分な管腔を備える針を備える、パラグラフ215またはパラグラフ216の心臓送達装置またはシステム。
218. 前記針が前記シリンジと流体連通している、パラグラフ215の心臓送達装置またはシステム。
219. 心臓カテーテルをさらに備える、請求項215～218のいずれか一項記載の心臓送達装置。
220. 薬学的組成物を調製する方法であって、心筋細胞の単離された集団において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の活性を阻害しかつKCNJ2の活性を刺激する工程を含む、前記方法。
221. 薬学的組成物を調製する方法であって、PSCの集団において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の活性を阻害しかつKCNJ2の活性を刺激する工程と、PSCの該集団をインビトロで心筋細胞に分化させる工程とを含む、前記方法。
222. 前記PSCが、請求項73～120のいずれか一項に従って改変される、パラグラフ221の方法。
223. 心筋細胞の前記集団を薬学的に許容される担体と混合する工程をさらに含む、パラグラフ221および222の方法。
224. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1の1つまたは複数が、前記心筋細胞を1つもしくは複数のインヒビター薬物と接触させることによって、および/または遺伝子操作によって阻害される、請求項221～223のいずれか一項記載の方法。
225. KCNJ2が、前記心筋細胞を1つもしくは複数の活性化薬物と接触させることによって、および/または遺伝子操作によって刺激される、請求項221～224のいずれか一項記載の方法。
226. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つまたは複数が不活性化される、請求項220～225のいずれか一項記載の方法。
227. 前記遺伝子不活性化が、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む、請求項226記載の方法。
228. 前記遺伝子不活性化が、RNA誘導型ヌクレアーゼ、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる、パラグラフ226の方法。
229. 前記RNA誘導型ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼを含む、パラグラフ228の方法。
230. 前記遺伝子不活性化が、RNAi、アンチセンス、またはRNAを標的とするCasヌクレアーゼを介して行われる、パラグラフ226の方法。
231. インビトロで分化した心筋細胞を移植する方法であって、請求項1～210のいずれか一項記載のもしくは請求項1～210のいずれか一項に由来するインビトロで分化した心筋細胞、請求項211～213のいずれか一項記載の薬学的組成物、パラグラフ214の移植組成物、または請求項215～219のいずれか一項記載の心臓送達装置もしくはシステムを、その必要がある対象の心臓組織と接触させる工程を含む、前記方法。
232. インビトロで分化した心筋細胞を移植する方法であって、請求項1～210のいずれか一項記載のもしくは請求項1～210のいずれか一項に由来するインビトロで分化した心筋細胞、請求項211～213のいずれか一項記載の薬学的組成物、パラグラフ214の移植組成物、または請求項215～219のいずれか一項記載の心臓送達装置もしくはシステムを、その必要がある対象の心臓組織に送達する工程を含む、前記方法。
233. 前記移植することが、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の阻害を欠きかつKCNJ2の刺激を欠くインビトロで分化した心筋細胞の移植と比較して、低下した移植不整脈をもたらす、パラグラフ204の方法。
234. その必要がある対象における心臓組織の損傷または機能障害を伴う疾患または障害を処置する方法であって、前記対象の心臓組織を、請求項1～210のいずれか一項記載の細胞、請求項211～213のいずれか一項記載の薬学的組成物、パラグラフ214の移植組成物、または請求項215～219のいずれか一項記載の心臓送達装置もしくはシステムと接触させる工程を含む、前記方法。
235. その必要がある対象における心臓組織の損傷または機能障害を伴う疾患または障害を処置する方法であって、請求項1～210のいずれか一項記載のもしくは請求項1～210のいずれか一項に由来するインビトロで分化した心筋細胞、請求項211～213のいずれか一項記載の薬学的組成物、パラグラフ214の移植組成物、または請求項215～219のいずれか一項記載の心臓送達装置もしくはシステムを、その必要がある対象の心臓組織に送達する工程を含む、前記方法。
236. 前記接触させる工程または送達する工程が、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の阻害を欠きかつKCNJ2の刺激を欠くインビトロで分化した心筋細胞の移植と比較して、低下した移植不整脈をもたらす、パラグラフ234またはパラグラフ236の方法。
237. アミオダロンおよびイバブラジンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項220～236のいずれか一項記載の方法。
238. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のうち2つ以上についてのインヒビターを含む組成物。
239. インビトロで分化した心筋細胞の集団と混合されている、パラグラフ238の組成物。
240. KCNJ2についてのアクチベータをさらに含む、パラグラフ238またはパラグラフ239の組成物。
241. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のそれぞれについてのインヒビターを含む、請求項238～240のいずれか一項記載の組成物。
242. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のそれぞれについてのインヒビターとKCNJ2についてのアクチベータとを含む、請求項238～241のいずれか一項記載の組成物。
243. HCN4遺伝子、CACNA1H遺伝子、およびSLC8A1遺伝子の発現が、有害な変異によってまたは挿入によって部分的にまたは完全に不活性化され、かつKCNJ2遺伝子の発現が少なくとも部分的に増加される、単離されたヒト心筋細胞。
244. 前記不活性化が、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む、パラグラフ243の単離されたヒト心筋細胞。
245. 前記不活性化が、RNA誘導型ヌクレアーゼ、RNAi、アンチセンス、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる、パラグラフ243またはパラグラフ244の単離されたヒト心筋細胞。
246. 前記RNA誘導型ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼを含む、請求項243～245のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
247. 少なくとも1つの外因性核酸配列をさらに含む、請求項243～246のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
248. ポリペプチドが前記少なくとも1つの外因性核酸配列から発現される、パラグラフ247の単離されたヒト心筋細胞。
249. 少なくとも1つのさらなる遺伝子の低下した発現をさらに含む、請求項243～248のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
250. KCNJ2が導入遺伝子から過剰発現される、請求項243～249のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
251. HCN4またはCACNA1H発現調節配列によって駆動される外因性KCNJ2コード配列を含む、請求項243～250のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
252. 置き換えられたHCN4またはCACNA1Hコード配列が発現されずかつKCNJ2が内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列の調節下で発現されるように、KCNJ2コード配列がHCN4またはCACNA1Hのコード配列と置き換わる、請求項243～251のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
253. 前記KCNJ2コード配列がCRISPR/Casシステムを使用して置き換えられている、請求項251または252のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
254. HCN4の前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項251～253のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
255. CACNA1Hの前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項251～253のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
256. 前記心筋細胞が多能性幹細胞からインビトロで分化している、請求項243～255のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
257. 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC）である、パラグラフ256の単離されたヒト心筋細胞。
258. 前記心筋細胞が、前記インビトロで分化したヒト心筋細胞が移植される第2の対象とは異なる第1の対象に由来するiPSCからインビトロで分化している、請求項243～257のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
259. その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1遺伝子発現の部分的または完全な不活性化ならびにKCNJ2遺伝子の少なくとも部分的に増加した発現を含まない単離されたヒト心筋細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を促進する、請求項243～258のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
260. その必要がある対象の心臓組織に送達するための、請求項1～210のいずれか一項記載のもしくは請求項1～210のいずれか一項に由来するインビトロで分化した心筋細胞、請求項211～213のいずれか一項記載の薬学的組成物、パラグラフ214の移植組成物、または請求項215～219のいずれか一項記載の心臓送達装置もしくはシステムを含む、対象における心臓組織の損傷または機能障害を伴う疾患または障害の処置において使用するための組成物。
261. 前記組成物の送達が、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の阻害を欠きかつKCNJ2の刺激を欠くインビトロで分化した心筋細胞の移植と比較して、低下した移植不整脈をもたらす、パラグラフ260の使用のための組成物。
262. 対象における心臓移植不整脈の処置または予防の方法において使用するための、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のうち2つ以上についてのインヒビターを含む組成物。
263. インビトロで分化した心筋細胞の集団と混合されている、パラグラフ262の使用のための組成物。
264. KCNJ2アクチベータをさらに含む、パラグラフ262または263の使用のための組成物。
265. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のそれぞれについてのインヒビターを含む、請求項262～264のいずれか一項記載の使用のための組成物。
266. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のそれぞれについてのインヒビターとKCNJ2についてのアクチベータとを含む、請求項262～265のいずれか一項記載の使用のための組成物。
実施例1: 不整脈を理解し、抑制するための電気生理学的DNAの改変（MEDUSA）
背景
心臓の再生のためのヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（hPSC-CM）またはヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞（hiPSC-CM）の使用は、移植後の一時的な不整脈の発生によって妨げられる。この現象は、「移植不整脈」またはEAと記載されてきた（PMID:24776797、31056479）。EAを経験している動物の電気生理学的分析は、この不整脈が、増強された自動性または後脱分極のいずれかに起因するインパルス発生から生じることを示唆した。hPSC-CMの電気生物学に基づいて（図1A）、EAはhPSC-CMの固有の自動性によって引き起こされると考えられた。
活動電位（AP）は、イオンチャネルの電気化学的勾配に従ったイオンチャネルの律動的な開口および閉鎖から生じる。APは、イオンチャネルの多く存在する種類およびその相に存在する電流に応じて異なる相（0～4、図1A）に分割される。成体心室心筋細胞と比較して、hPSC-CMのAPの特徴には、より脱分極した第4相（静止膜電位に対応する）およびより短いAP持続時間（第2/3相）（PMID:32015528）が含まれ、これは自発性活動電位（すなわち、自動性）の増加した発生をもたらす。
第4相に関与するイオンチャネルには、いわゆる「ファニー電流」に関与するHCNファミリーチャネル（HCN1～HCN4）、比較的過分極された状態でカルシウムイオンの進入を媒介するT型カルシウムチャネル（CACNA1G、CACNA1H、CACNA1I）が含まれる。これらの活性化電流に対抗するのが、（KCNJ2遺伝子によってコードされる）IK1チャネルであり、IK1チャネルはカリウム流出において重要な役割を果たし、したがって静止膜電位を確立する。hPSC-CMは極めて低レベルのKCNJ2を発現するので、膜電位は第0相イオンチャネル、すなわち（SCN5Aによってコードされる）Nav1.5の活性化閾値により近く、APの形成を可能にする。Nav1.5の開口後、少量の急速なカリウム電流がKv4.2（KCND2、第1相）を通じて流れる。これは、増加した量のカルシウムイオンが細胞内を流れ始める再分極相の開始を設定する。この相（第2相）は、（CACNA1Cによってコードされる）L型カルシウムチャネル、電位制御型カルシウムチャネル、細胞内カルシウムを細胞外ナトリウムイオンと交換することによって細胞内カルシウムを制御するナトリウム-カルシウム交換体（NCX1、SLC8A1によってコードされる）および小胞体からのカルシウム放出を制御するITPR2に依存する。第3相は、カルシウムチャネルの閉鎖および（それぞれKCNH2およびKCNQ1によってコードされる）カリウムチャネルhERGおよびKvLQT1の開口によって媒介される。
自動性に関与する主な候補を確定するために、培養中および心筋梗塞に供された無胸腺ラットの心臓内への移植後の両方におけるhPSC-CMの成熟中の上記イオンチャネルの遺伝子発現プロファイルおよびその生物学がEAに寄与し得る他の候補（例えば、PIEZO1;Jiang,F.,et al.,”The mechanosensitive Piezo1 channel mediates heart mechano-chemo transduction”Nat Commun 12,869（2021））が分析された。EAの自然の進行はhPSC-CMの成熟を反映し、成熟の間、自動性促進チャネルの発現は減少し、自動性抑制チャネルの発現は増加した（図1B）。
これらのイオンチャネルの活性を体系的に擾乱することによって、本発明者らは、移植に際して直ちに移植片自動性を防止する条件を特定することができた。これを達成するために、不整脈促進性電流を阻害するためにまたは生着後のhPSC-CM成熟の比較分析を通じて特定され、hPSC-CMの自動性を調節することが薬理学的手段を通じてさらに確認された不整脈抑制性電流を促進するために遺伝子工学を適用した。
1重、2重、3重および4重の編集を有する遺伝子編集されたhESC（ヒト胚性幹細胞）系統の大きなパネルを作製し、多重電極アレイ（MEA）を使用したインビトロおよび移植後のインビボの両方でそれらの表現型を性質決定した。hESC-CMの電気生理学的特徴を評価し、同じイオンチャネルを標的とする化合物で処理した。いくつかの遺伝子改変された系統が拍動数または拍動の不規則性の低下を示したが、（1重から2重、3重の編集へと進行する）試験されたこれらのうちの最初の5つは、ブタへの移植後になお重度のEAを引き起こした。これは、関与する発症機序の冗長性の程度が予想外に高いこと、および必要とされる編集に関して自明性を欠いていることの両方を示している。最後に、本発明者らは、インビトロでhESC-CMの自動性を防止し、かつ移植後にEAを実質的に消滅させるのに十分であることが証明された遺伝子編集の4重の組み合わせを同定した（図1C、図2）。
方法
候補EA遺伝子を1つ組、2つ組または3つ組で連続的にノックアウトするために、プラスミド形質移入とリボ核タンパク質複合体電気穿孔の組み合わせを通したCRISPR/Cas9を介して、未分化RUES2ヒト胚性幹細胞（RUES2 hESC、RUESe002-A;WiCell）を遺伝子操作した（図1C）。本発明者らはまた、発生的に制御された様式で、すなわち、細胞が成熟し、内在性KCNJ2遺伝子が発現されるにつれて自然に発現を減弱させるように、候補抗EA遺伝子、KCNJ2を過剰発現させようとした。これを達成するために、本発明者らは、CRISPR/Cas9および相同組換えを使用してKCNJ2 cDNAをHCN4遺伝子座にノックインし、これにより、KCJN2発現がHCN4の正常な一過性発現パターンを模倣する心筋細胞を作製した。
RUES2 MEDUSA未分化hESCの品質管理: 各遺伝子座にホモ接合の改変を作出するために、全ての遺伝子編集された細胞株を慎重にスクリーニングし、全ての株が正常な核型を有していた。専門の細胞遺伝学専門家によって行われた標準的なG分染法により、遺伝子編集の各回後に核型を試験したところ、クローン異常は観察されなかった。コンピュータで予測されたCRISPR/Cas9潜在的オフターゲット変異の分析を、ゲノムDNA PCR、続いてサンガー配列決定を通じて実施し、遺伝子編集手順の特異性を確認した。フローサイトメトリーによって多能性マーカーOct-3/4およびSSEA-4の発現を評価し、それらの均一な発現を確認した。
RUES2 MEDUSA心筋細胞（MEDUSA-CM）の分析: 心筋トロポニンT（cTnT）発現を使用してCMの純度を評価した。集団の90％以上においてcTnTを発現するCM培養物のみを使用して、それらの電気的表現型を性質決定した。対応するmRNAのナンセンス変異依存分解をRT-qPCRによって示すことによって、HCN4およびCACNA1Hのノックアウトを確認し、KCNJ2過剰発現をRT-qPCRによって検証した。パッチクランプ分析により、HCN4およびCACNA1Hのノックアウトが確認された。NCX1のノックアウトをウエスタンブロッティングによって確認した。多電極アレイ（MEA）システムにおいて培養された単層を分析することによって、全ての遺伝子編集された心筋細胞に対して電気生理学的表現型決定を行った。MEAは、拍動数、拍動規則性、細胞外電場電位持続時間および伝導速度の測定を可能にした。
ブタにおける催不整脈性の評価: 免疫抑制されたユカタンミニブタの非損傷心臓内への移植による催不整脈効果について、野生型および遺伝子編集された心筋細胞を調べた。外科的露出後に、ブタは、自由壁前部の筋肉内への直接注射によって1億5000万個の心筋細胞を受けた。遠隔測定を介した連続的な心電図測定によって、心調律を監視した。
膜電流のパッチクランプ記録: イオンチャネルおよびイオンチャネルが許容する膜電流、したがってこのようなチャネルの活性の阻害および活性化は、例えばホールセルパッチクランプアッセイによってアッセイされ得る。異なる膜電流は、穿孔ホールセルパッチクランプ技術によって評価される。簡単に記載すると、B27サプリメントが補充されたRPMI培地を使用して、単一細胞密度（約15～25,000細胞/cm 2）でhPSC-CMをマトリゲル被覆カバーガラス上に播種する。培地を1日おきに交換する。1週間後、カバーガラス上のhPSC-CMを温度調節された倒立顕微鏡の上に移した。記録のために使用されるガラスピペットは、細胞内溶液で満たされたときに5～10 MΩの抵抗を有し、ギガオームシールの形成を可能にした。評価される電流に応じて、細胞外および細胞内溶液を改変した（If電流およびIK1電流についてはMaら、2011およびProtzeら、2017; ICaT電流についてはKernikら2019およびMangoniら2006、INCX1についてはWuら2016）。チャネル遮断薬の適用後のトレースを差し引くことによって、各単一細胞において各電流成分を決定した。
結果
インビトロでの電気生理学的特徴
収縮/分および分化バッチあたりの拍動するウェルのパーセンテージを数えることによって、最初に、心臓分化中に自動性の開始を監視した。MEAシステムを使用して電気的活動をさらに試験した。以下の表3は、インビトロ電気的活動および移植不整脈に対する影響についての主な観察を要約する。HCN4チャネルの欠失は、拍動数を約50％低下させた。T型Caチャネル遺伝子CACNA1Hの欠失は、拍動を約19％低下させた。伸展活性化型チャネルPIEZO1のノックアウトは、拍動数に影響を及ぼさなかった。ナトリウム-カルシウム交換体SLC8A1をコードする遺伝子のノックアウトは、不規則な拍動を引き起こした。HCN4およびCACNA1Hの組み合わされたKOは、HCN4 KO単独よりも拍動数を低下させなかった。HCN4 KOをKCNJ2の過剰発現と組み合わせると、突発的バーストに不規則な拍動が引き起こされた。HCN4およびCACNA1HのKOに加えてKCNJ2の過剰発現を伴う組み合わせ編集も、HCN4およびSLC8A1のKOに加えたKCNJ2の過剰発現と同様に、不規則な拍動を引き起こした。これらのデータは、上記の遺伝子編集がペースメーカーシステムの構成要素に影響を与えたこと、但し、鍵となる要素が全ての株で残存していることを示した。
（表３）遺伝子編集されたhESC-CMの概要
Figure 2024517810000008
注: インビトロデータは、3つの独立した分化のバッチのWT拍動数±SEMに対して正規化されている。多重比較のためのSidak補正伴う一元配置ANOVAによるWTとの差（＊＝p＜0.05; ＊＊＊＝p＜0.001）。
これらのデータとは対照的に、HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1のKOに加えてKCNJ2の過剰発現を有する4遺伝子編集された株は、インビトロで自発的に拍動せず、MEAによって自発的細胞膜脱分極を実質的に示さなかった。本発明者らは、以下、これらの細胞をMEDUSA株と称する。図2Aに示されているように、対応する野生型対照hESC-CMにおける早い拍動開始とは全く対照的に、MEDUSA-CMは、採取の日まで静止したままであった。図2Bに示されているように、MEDUSA-CMは自発的脱分極を示さず、編集が自動性を停止させたことを示した。MEDUSA-CMは、培養中に自動性を示さないが、図4に示されているような電気的ペーシング研究は、MEDUSA-CMが野生型心筋細胞と同様に電気的にペースを調整され得ることを実証し、MEDUSA-CMが移植後に心臓のペースメーカーに従う可能性が高いことを示している。
MEDUSA遺伝子編集は移植不整脈を防止する
次に、本発明者らは、これらの心臓イオンチャネルの遺伝子編集がhESC-CM移植によって誘発される催不整脈性を減弱させるかどうかを調べた。1.5×108個のCMを再懸濁し、免疫抑制されたナイーブユカタンミニブタの心筋中への直接注射を通じて移植し、連続的な心電図検査によって監視した。最初の5つの遺伝子編集された細胞株: HCN4 KO、PIEZO1 KO、HCN4 KO＋KCNJ2過剰発現、HCN4/CACNA1H KO＋KCNJ2過剰発現およびHCN4/SLC8A1 KO＋KCNJ2過剰発現は移植不整脈を引き起こした。これは、インビトロで評価されるペースメーカーシステムのいくつかの要素を破壊したにもかかわらず、これらの細胞が、移植不整脈を引き起こすために必要なイオンチャネルをなお有していたことを示している（図3A）。
全く対照的に、本発明者らがMEDUSA株（HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1のKOに加えてKCNJ2の過剰発現を含有する）を2匹のブタに移植すると、移植不整脈は実質的に観察されなかった。平均心拍数がEAの発症中に150bpmを超えて急上昇したWT-CMレシピエントと比較して、MEDUSA-CMレシピエントの心拍数は、4週間の観察全体で100bpm以内を保った（図3A、左パネル）。MEDUSA-CMレシピエントは、稀な期外心室収縮および24時間の間に平均して10％未満の負荷の二連脈を示した。4週間の観察にわたって持続性不整脈は観察されなかった。対照的に、野生型心筋細胞を与えられた3匹の対照対象は全て、移植後4日目までに、24時間の間に50％超の負荷の持続的な移植不整脈を示した（図3A右パネル）。野生型対象のうちの1匹は、移植後6日目に、安楽死を必要とする350bpmを超える心拍数を伴う不安定なEAを経験した。残りの2匹の対照対象は、予め定められた2週間での終点まで、頻繁なEAを伴いながら臨床的に安定な状態を保った（図3B、右パネル）。全体として、MEDUSA-CMは、野生型細胞と比較して有意な移植不整脈を示さなかった。重要なことに、MEDUSA-CMはブタ心臓中でヒト心筋の大きく安定した移植片を形成し（図3C）、生着の不成功が、不整脈が存在しない原因であるという可能性を除外した。
この研究では、ノックアウトまたは過剰発現された場合に、幹細胞由来心筋細胞の生着から生じる不整脈を防止する一連のイオンチャネルを同定するために遺伝学を使用する。CACNA1HまたはSLC8A1の編集が省略された「1つを除いた」研究は、重度の移植不整脈をもたらしたことに注目されたい。これは、この障害に対するこれらの遺伝子の必要性を示している。遺伝子ノックアウトから得られた知見は、薬理学、遺伝子発現の一時的制御を含む他の手段によってチャネル活性を操作することも、この種の不整脈を防止できることを示している。これらの教示は、再筋肉化が可能な他の細胞、例えば、増殖するように誘導された内在性心筋細胞、運命再プログラム化によって誘導された心筋細胞または類似の特性を有する他の細胞に適用されるであろう。これは、インパルス生成から生じる他の不整脈にも適用することができ、内在性細胞中のこれらのチャネルを操作することにより、生着の文脈を超えて不整脈を防止できることを示している。
実施例2: hPSC-CM移植後の移植不整脈を軽減させるための遺伝子編集（MEDUSAプロジェクト）
ヒトの心臓は、誕生後すぐにその再生能を失う［1,2］。心筋梗塞（MI）後に、約10億（billon）の成体心筋細胞が非収縮性瘢痕組織によって置き換えられ、これは心機能を弱め、しばしば慢性心不全に進行する［3-5］。虚血性心疾患は、年間1億2000万人を超える人に発症し、世界中で死亡および入院の主な原因である［6］。多能性幹細胞（PSC）の発見は、MIの処置および心不全の予防に新しい展望を開いた［7］。ヒトPSCは、実際に、高純度の心筋細胞（hPSC-CM）に迅速かつ大規模に分化させることができる。hPSC-CMの心筋内注射は、梗塞した心臓中に新しい心筋の長期間持続する移植片をもたらす［8,9］。これらの移植片は、宿主と機能的なシンシチウムを形成し、洞房結節からのペーシングに従うことができる［8,9］。亜急性MIの異なるモデルにおいて、hPSC-CMの移植は、心臓収縮機能を改善する: マウス［10］、ラット［11］、モルモット［12］および非ヒト霊長類（NHP）［13,14］。これら全ての理由のために、hPSC-CMは、正真正銘のヒト心臓再生のための前臨床候補として熱心に研究されている［9,15］。
細胞移植後における、治療をしなくても長期的には症状が落ち着くが重度の不整脈の存在は、臨床への移行に対する大きな障害である［13,16-18］。本発明者らはこの現象を「移植不整脈」（EA）と名付けた［17］。EAは、典型的には、移植片-宿主電気的カップリング後（移植後約1週間）に生じ、最長約1ヶ月持続する多形性ワイドコンプレックス頻脈として現れる［17］。この一過性毒性は、大型動物モデル（すなわち、NHPおよびブタ）におけるhPSC-CMの移植後にのみ観察され［13、16、17］、より小型のげっ歯類モデル（マウスについては約600bpm）と比較して、これらの動物の安静時心拍数がより低い（それぞれ、約120および約80bpm）ことが原因である可能性がある［19］。実際、重篤な事例では、ブタおよび/またはNHPの心拍数は、毎分約300拍（bpm）に達することがある［13、14、16、17］。EAはNHPでは十分に耐容され、移植片が成熟するにつれて徐々に弱まるが［13、14］、ブタなどの不整脈感受性動物にとって致死的であり得る［16,17］。同様に、ヒトは急速なEAを耐容し得ない場合があり、移植片の電気的成熟までEAを防止するかまたは少なくとも制御するための戦略を特定することが不可欠である［17］。
心不整脈は、一般に、電気的伝導の欠陥（すなわち、興奮旋回）または異常なインパルス発生（すなわち、ペースメーカー様活動または後脱分極）のいずれかによって引き起こされる［18］。NHPおよびブタにおける電気マッピング研究は、EAが細胞注射部位に局所的に起因することを示しており［11,19］、さらに、オーバードライブペーシングおよび電気的除細動（興奮旋回経路が存在すれば、通常、洞調律を回復させる）は、EAを終了させることに成功しなかった。これにより、移植片によるインパルス生成がEAの起源であるという仮説が導かれた。hPSC-CMは、胎児心筋細胞と表現型が類似しており［20、21］、特に、自動性、すなわち自発的に脱分極して活動電位（AP）を発生させる能力を示す［22］。実際、成体心室心筋細胞（vCM）と比較して、hPSC-CMは、発達的に制御されたイオンチャネル遺伝子発現の相違から生じる特徴である［23～26］、より脱分極した膜電位およびより短いAP持続時間を示す［22、23］。したがって、EAを引き起こす催不整脈電流は、成体vCMに通常存在しないチャネルの存在か、または成体状態において通常存在するチャネルの非存在のいずれかから生じると仮定された。
本研究では、本発明者らは、EAの候補のリストを確立するために、hPSC-CM移植後の異なるイオンチャネル遺伝子の発現動態を決定した。CRISPR-Cas9技術を使用して、本発明者らは、成体vCMのように自動性を有さず、電気刺激に応答して拍動する心筋細胞を作出することを目標として、イオンチャネル遺伝子を体系的にノックアウトおよび/または過剰発現させた。それらの電気生理学的挙動をインビトロで評価し、ユカタンミニブタモデルにおける細胞移植後にEA負荷を定量した。本発明者らは、4つの遺伝子（KCNJ2の過剰発現と組み合わされたHCN4 CACNA1HおよびSLC8A1のノックアウト）の改変が、刺激されたときに活動電位を発生する細胞の能力に影響を及ぼすことなく、インビトロで自動性を除去することを見出した。重要なことに、これらの遺伝子編集は、インビボ移植後にEAを完全に除去し、EAがペースメーカー活動に似た電流の複雑な相互作用によって生じることを実証する。これらの遺伝子編集された細胞は、hPSC-CM移植のリスク:ベネフィット比を低下させることによって治療上有益であり得る。
結果
hPSC-CMのインビボでの成熟は、自動性に関与するイオンチャネルの発現を変化させる。
未成熟hPSC-CMにおける活動電位（AP）は、顕著な第4相（成体vCMには一般に存在しない［22、23、26］）、ゆっくり脱分極する第0相、第1相における再分極ノッチの非存在、ならびにより短い再分極第2相および第3相を特徴とし、成体細胞と比較して全体的により短いAP持続時間をもたらす（図5A）［24、25］。hPSC-CMの成熟はAP形態に強く影響し、これはイオンチャネル発現の変化と相関する［25、26］。ある程度のhPSC-CM成熟は、長期培養、電気機械的および/またはホルモン刺激を通じて達成することができるが、遺伝子発現プロファイルが正真正銘の成体段階に達するかどうかは不明である［22、23］。これに対して、梗塞したラット心臓内に移植されたhPSC-CMは、成熟して成体様の筋原線維アイソフォームの発現および組織化を有することが以前に示されている［29］。最も重要なことに、このモデルは、ヒト対象においてhPSC-CMによって経験され得る成熟環境をより厳密に模倣し、したがって、より臨床的に適切である。インビボ成熟中のhPSC-CMのゲノムワイドな発現動態を性質決定するために、本発明者らは、梗塞ラット心臓における移植1日後から12週間後まで、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞（hiPSC-CM）のバルクRNA-seqタイムコースを行った（図5B）。比較として、インビトロで最長1年間長期培養されたhiPSC-CMを分析した。宿主ラット心臓からインビボ移植されたhiPSC-CMを同定し、抽出するために、本発明者らは、注射前にGCamp3でhiPSC-CMを形質導入し［29］、レーザー捕捉微細解剖（LCM; 図5C）を使用して組織切片からGFP＋移植片を単離した。宿主ラットをヒト移植片シグナルから区別するために、その後、いずれも廃棄された曖昧にまたは明らかにラット特異的なマッピングとは別に、ヒト特異的RNA-seqリードを分析した（図12A）。主成分分析（PCA、図5D）を通じたデータの次元縮小は、hiPSC-CMトランスクリプトームが生着（PC1）に際して急速に強く変化し、おそらく関連するストレスに対する応答であることを明らかにした。同様の規模の遺伝子発現変動性がPC2によって説明され、PC2は異なる時点での両培養条件によってサンプルを分離し、事前の知識に基づいて、これは「成熟度指数」と解釈された。実際、以前に報告されたタンパク質発現研究［29］と一致して、遺伝子発現プロファイルは、培養の1年目においてさえ細胞に大きく遅れを取ったインビトロ培養と比較して、インビボでより強くかつより速い成熟を示した（図5E、図12Bおよび表4A～4B）。
（表４Ａ）上位40の上方制御されたGOターム 3ケ月 インビボ対インビトロ
Figure 2024517810000009
（表４Ｂ）上位40の下方制御されたGOターム 3ケ月 インビボ対インビトロ
Figure 2024517810000010
例えば、筋原線維関連遺伝子の胎児から成体へのアイソフォームスイッチング（TNNI1からTNNI3へ、MYH6からMYH7へ、およびMYL7からMYL2へ）および酸化的代謝に関与する遺伝子の上方制御は、インビボ移植によってより強く活性化された（図5E）。
次いで、本発明者らは、hPSC-CM APに関与するイオンチャネルの遺伝子発現の変化を特異的に分析した（図5F）。大型動物におけるEAの発症に対応する初期の時点で、本発明者らは、HCN4およびCACNA1H（そのタンパク質産物は、それぞれ内向きのNa＋電流およびCa2＋電流を担うIfおよびICaTを媒介し、第4相脱分極に関与する）の強い発現を観察したが、KCNJ2転写物（第3相再分極および第4相における最小拡張期電位の維持に関与するIK1内向き整流性K＋電流をもたらす）をほとんど検出しなかった。EAの解消よりずっと後であり、より成熟したhPSC-CM状態に対応する3ヶ月までに、この関係は逆転し、KCNJ2発現は強く上方制御され（初期の時点と比較して約10倍）、一方、HCN4およびCACNA1Hはそれぞれ約50％および＞90％減少した。If（例えば、HCN1、HCN2およびHCN3）およびICaT（CACNA1GおよびCACNA1I）に寄与する可能性がある他のアイソフォームの発現動態も評価した。図12Cに示されているように、hiPSC-CMにおけるこれらのアイソフォームの発現は、HCN4およびCACNA1Hと比較してより低く、hiPSC-CMでは、HCN4およびCACNA1HがそれぞれIfおよびICaTの主な寄与因子であることを示している。これは、より成熟したhPSC-CMおよびvCMにおける第4相自発的脱分極の非存在と相関する［22］。
SCN5A（INa電流を媒介する）、CACNA1C（ICaL電流を媒介する）およびSLC8A1（INCX電流を媒介する）は、APの開始後の脱分極電流の量を制御すると考えられている。hPSC-CMでは、INaおよびICaLは、成体vCMにおけるよりも有意に低く［25、28］、図5Fに示されているように、SCN5AおよびCACNA1Cの発現レベルは、SLC8A1よりもほぼ4倍低い。これは、hPSC-CMの電気生理学におけるINCXの支配的な役割を示す研究と一致している［28、30、31］。本発明者らはまた、KCND3（Ito）、KCNQ1（IKs）およびKCNH2（IKr）を含むAPの再分極相に関与するカリウムチャネルの発現を分析した。電気生理学的研究は、hPSC-CMの成熟が、増加した再分極電流と同時に起こるのみならず、KCND3/Itoの上方制御によって媒介される、APトレースにおける特徴的な「ノッチ」（第1相-第2相移行）の存在と同時に起こることを以前に報告した［22、25］。図5Fに示されているように、hPSC-CMがインビボで成熟するにつれて、KCND3、KCNQ1およびKCNH2の発現が時間とともに増加した。全てを総合すると、これらの結果は、インビボ移植が、より成熟した成体様表現型に向かうイオンチャネル発現に徐々に影響を及ぼすことを示している。これは、hPSC-CMにおいてより成体様のイオンチャネル遺伝子発現プロファイルを誘導することにより、移植後の自動性を軽減することができ、EAの負荷を軽減できる可能性があることを示している。
インビトロでのhPSC-CM自動性の薬理学的阻害。
自動性におけるイオンチャネルの役割は、これまで、多くは成体マウスの洞房結節に関して研究されてきた［32］。同じ機序がhPSC-CMおよび/または胎児のヒト心筋細胞にも当てはまるかどうかには、依然として議論の余地がある［30］。最初に、小分子に基づくWNT経路の連続的な活性化および阻害によって分化させた、RUES2ヒト胚性幹細胞（hESC）に由来するhPSC-CM［33］に対して様々な薬理学的化合物を試験した。本発明者らは、hPSC-CMの自発的電気的活動に対する異なる化合物の効果を記録するために、多重電極アレイ（MEA）を使用して電気生理学的分析を行った。この最初のインビトロスクリーニングにおいて、本発明者らは、hPSC-CM APの第4相に寄与し得る、インビボ実験から同定されたイオンチャネルに対する選択的阻害活性を有することが報告された異なる化合物を試験した（図5F）。最近のインビボ結果は、アミオダロン（クラスIII抗不整脈化合物）とともにイバブラジン（選択的Ifインヒビター）を添加すると、ブタにおけるEA症候を軽減することができる（低下した心拍数および洞調律の増加した傾向）ことを示した［17］。したがって、しばしば主要なペースメーカー電流と考えられるIf［34］の阻害が自動性に影響を及ぼすかどうかを試験した。以前に報告されたように［35,36］、イバブラジン処理はhESC-CMの拍動数を強力に低下させた。それにもかかわらず、極めて高用量のイバブラジン（100μM）でさえ、自発的なAP発生を防止しなかった（図6A、図6B）。これは、EAとの関連において、イバブラジンは心拍数を低下させるがEAを予防しないという最近の知見と相関する［17］。イバブラジンは電気信号のスパイク振幅を変化させず、Ifは一旦閾値に達するとINa活性化を調節しないことを示した。次いで、本発明者らは、ICaTを阻害することが報告された化合物、ML-218（図6C、図6D）およびミベフラジル（図13A）の効果を調べた。ML-218は10μM未満の用量では拍動数に影響を及ぼさなかったが、スパイク振幅は1μMを超える用量で減少した。実際、ML218は、スパイク振幅が検出不能になるまで拍動数に対する影響を示さなかった。ミベフラジル処理後にも同等の効果が観察されたが、最低用量で観察され（LogIC50ミベフラジル＝-7.7±0.1261対LogIC50ML218＝-4.8±0.1424）、ICaTおよびICaLの両方に対するミベフラジルの複合的阻害効果のためである可能性がある。IK1電流を媒介するKir2.1チャネル（KCNJ2によってコードされる）に対してアゴニスト効果を有することが報告されたザコプリド［37］も試験した。この化合物は、拍動数またはスパイク振幅のいずれに対しても測定可能な効果を示さなかったが、標的イオンチャネルの極めて低い発現によるものであった可能性がある（図13B）。これらのデータは、個々のイオンチャネルの活性を操作することは、第4相を抑止し、自動性を防止するには十分ではない可能性があることを示唆した［30、38、39］。
ナトリウム-カルシウム交換体NCX1は、追い出されるCa2＋イオン1つにつき3つのNa＋イオンの取り込みを媒介するので、起電性チャネルと考えられる。これは、Ca2＋細胞内蓄積の場合にhPSC-CMの自発的活動を増加させ得る正電荷の流入をサイクルごとに生じさせる［30］。したがって、NCX1インヒビターSEA0400およびKB-R3702の効果も試験され、周波数およびスパイク振幅の両方の用量依存的低下が観察された（図6E、図6F）。
本発明者らは、L型カルシウムチャネルを遮断するクラスIV抗不整脈薬である［40］ベラパミルの効果も評価した（図6C）。ベラパミルは上室性不整脈の処置に適応され、結節細胞の発火頻度を減少させ、第4相の勾配、したがってそれらのペースメーカー活性を調節する［40］。実際、ナトリウムチャネルのコンダクタンスがあまり優勢ではないより脱分極した静止膜電位のために、結節細胞は、vCMと比較して、L型カルシウムチャネルの開口により依存する［41］。hPSC-CMのベラパミル処理は、拍動数およびスパイク振幅の両方を徐々に減少させ（図6C）、これは、結節細胞に関しては、hPSC-CM APにおける主なエフェクターがICaLによって表され得ることを示している。
これらの結果は、未成熟hPSC-CMにおいては、複数のイオンチャネルがAPの第4相に寄与しており、筋鞘を横切るカルシウム輸送がAPの生成および制御の両方において主要な役割を果たし得ることを実証する［31］。
脱分極および再分極イオンチャネルの一重および二重の擾乱はペースメーカー生成を弱めるが、EAを防止しない。
薬理学的観察は強力であるが、使用される化合物の特異性によって制限される。特定のイオン電流の役割のより強固な評価は、それらの遺伝的破壊または過剰発現によって達成され得る。これまでに提示されたトランスクリプトームの証拠および薬理学的な証拠ならびに成熟と自動性との間の逆相関を考慮して、本発明者らは、vCMにおいて観察される発現パターン: 低/無HCN4（HCN4）、無CACNA1H（Cav3.2）および高KCNJ2（Kir2.1）を模倣するようにRUES2 hESCを遺伝子改変することに決めた（図7Aおよび図14A）［2,22］。本発明者らは、自動性および/またはEAを抑止するために必要とされる擾乱の最小のセットを同定するために、個々の遺伝子編集および組み合わせアプローチの両方を実行した。
本発明者らは、まず、ノックアウト（KO）擾乱に焦点を当てた。本発明者らは、タンパク質翻訳を破壊すると予測されるインデルを有するいくつかのCRISPR/Cas9編集されたクローンを単離した。正常な核型およびオフターゲット突然変異誘発の欠如を確認することによって細胞株を品質管理し、条件当たり2つのクローンを選択した（クローン間の表現型の変動を制御するため; 図14B）。本発明者らは、単独でおよび/またはCACNA1Hと組み合わせて、HCN4の発現を抑止した（図14A）。QRT-PCRおよびパッチクランプ測定により、それぞれ、IfまたはICaTを調節する他のアイソフォームに対する代償作用なしに、Ifの機能的消失およびCACNA1Hの下方制御が確認された（図7Bおよび図14C～図14E）。薬理学的観察を確認して、HCN4単独のKOはインビトロでhESC-CMの自動性を除去しなかったが、むしろhESC-CMの拍動数を約50％低下させた（図7C～図7D）。CACNA1H KOは、hESC-CMの拍動数もスパイク振幅も変化させなかった（図7C～図7D）。これは、高用量のML-218による処置がICaT阻害とは無関係の非特異的効果を示しているという本発明者らの前述した疑いを実証した（図7D）。HCN4/CACNA1H 2KOの組み合わせは、HCN4 KO単独よりもわずかに抑制された拍動数を示したが、自動性は完全には抑止されなかった（図7C～図7D）。
EAの抑制のために完全な自動性の欠如は必要ではない可能性があるので、本発明者らは、インビボでHCN4 KOを試験することに着手した。本発明者らは、合計1億5000万個の遺伝子編集された（n＝2）hESC-CMまたは野生型（WT）対照（n＝3）hESC-CMを、免疫抑制されたユカタンミニブタの損傷を受けていない心臓に外科的に注射した（表5）。
（表５）移植片サイズの定量化
Figure 2024517810000011
EKG遠隔測定システムによって心臓を継続的に監視し、不整脈負荷（1日のうち不整脈に費やされた割合）および心拍数の両方を不整脈重症度の測定基準として得た。群あたりの動物の数が少ないため、本発明者らは複数の介入をスクリーニングすることが可能であったが、この分析では、EAに対する劇的な影響を検出することのみに意図的に注力した。対照心臓においては、EAが4日目までに開始し、5日目までに1日の約75％を占めるまで進行した（図7E、左パネル）。1匹の対照対象は6日目に不整脈合併症のために死亡したのに対して、HCN4 KO CMを与えた他の2匹の動物では、不整脈負荷は2週間の監視期間にわたって徐々に減少した。これらの動物は、対照動物と比較してEA負荷に有意な差を示さなかったのに対して、HCN4 KO hESC-CMでは、WT対照と比較して心拍数がわずかに良好に制御された（図7E、右パネル）。HCN4 KO hESC-CMを与えられた両方のブタは4週間の終点に到達し、イバブラジン処理後にも観察されたように［17］、心筋細胞のペーシング、したがって心拍数を調節する上でのHCN4の極めて重要な役割を示している。
最終的な個別のノックアウト擾乱として、本発明者らは、EAにおける圧活性化型カチオン性チャネルPIEZO1の潜在的な役割を調べた。インビボでのhiPSC-CM成熟中に最も異なって制御されたイオンチャネルの偏りのない分析から、EAのタイミングに概ね対応する生着の初期段階における約10倍の上方制御のため、PIEZO1が際立っていた（図8A、図8B）。マウス心臓におけるこのチャネルの過剰発現は、Ca2＋流入に起因する不整脈をもたらす［42］。自発的活動についてのhPSC-CMのCa2＋への依存性（図6E）［30、31］を考慮して、hESCにおいてPIEZO1をノックアウトした（図8C～図8D）。MEA分析は、PIEZO1 KO hESC-CMの拍動数の有意な変化を示さなかった（図8E）。これは、インビトロでのAP発生のために、PIEZO1が必要とされないことを示している。自動性に対する影響の不存在にもかかわらず、本発明者らは、PIEZO1上方制御と成体心臓の機械的に活動する環境との組み合わせが、このチャネルを開口させることによってEAを誘導するかもしれず、したがって、hPSC-CM中に存在する脱分極電流の量を増加させるかどうか疑問を抱いた。したがって、本発明者らは、PIEZO1 KO hESC-CMを2匹のブタに移植した。いずれのPIEZO1 KOブタも（わずかな遅れを伴うが）EAを発症し、対照と類似の負荷を示した（図8F）。KO動物の一方は、不安定な頻脈（心拍数＞220bpmが1日の50％を超えて持続した）を発症し、安楽死を必要とした。他方では、EAは4週間持続した。したがって、PIEZO1 KOはEAを防止するには不十分であり、自動性とEA負荷が関連している可能性があるという仮説をさらに裏付けている。
脱分極電流に対する数多くの機能喪失型の擾乱を調査したので、本発明者らは、IK1電流を過剰発現させる可能性に目を向けた。この電流はhESC-CMには実質的に存在せず［22］、成体心筋細胞においてより過分極した、より興奮性の低いレベルに静止膜電位を設定することが知られているので［43、44］、本発明者らは、KCNJ2を過剰発現させることを決定した［45、46］。本発明者らは、最初に、AAVS1ゲノムのセーフハーバー中へのノックインを通じてこのチャネルを構成的に過剰発現させることを試みた［47］。しかしながら、数多くの試みおよび対照EGFPノックインが極めて成功したという事実にもかかわらず、本発明者らは、正しく標的化されたKCNJ2過剰発現hESCを単離することはできなかった（データは示さず）。この予想外の知見は、KCNJ2過剰発現が多能性の維持と適合的でないことを示した。この問題を克服するために、本発明者らは、KCNJ2をHCN4遺伝子座にノックインして、KCNJ2をHCN4内在性プロモーターの転写制御下に置いた（図8Aおよび図16A）。この戦略は、単一の遺伝子編集工程でKCNJ2の過剰発現およびHCN4のノックアウトを可能にした（図8A）。さらに、hESC-CM分化中のKCNJ2発現は、HCN4の正常パターンと類似しており、前駆細胞から最終心筋細胞への移行後に上昇した（図8B）。hPSC-CMのインビボ成熟中に内在性KCNJ2が活性化されるにつれてHCN4レベルが低下するという以前の観察に鑑みると、このノックイン/ノックアウト戦略は、時間的に制御されたKCNJ2上方制御を与え、未成熟心筋細胞から成熟心筋細胞へのKCNJ2の発現を橋渡しするというさらなる潜在的な利益を提供した。本発明者らは、HCN4 KO/KCNJ2 KI hESC-CMを、HCN4遺伝子座へのEGFPノックインを有する対照細胞と比較した。興味深いことに、この二重の擾乱は心臓の分化効率に影響を及ぼさなかった（図16B）にもかかわらず、拍動の開始を有意に遅延させた（図8C）。完全に分化したhESC-CMにおける自発的な拍動は完全には抑止されなかったが、実際に、二重編集されたhESC-CMは、長い静止状態の休止が介在する急速かつ不規則なバーストを示した（図8D）。これは、自動性を制御する機構が、2つ以上または2つのイオンチャネルの同時活動に依存することを示している［32、38、39、48］。
これらの結果に興味を持ち、当惑した本発明者らは、HCN4 KO/KCNJ2 KI hESC-CMをインビボで試験することにした。二重編集された細胞の生着を有する動物は、EAの発症の約3日の遅延を示した（図8E）。しかしながら、EAが開始すると、EAは、両方の動物において不安定なEAへと急速に悪化し、7日目および11日目に安楽死を必要とした。総合すると、これらのデータは、おそらくは他のイオンチャネルとの相互作用を介した、自動性とEAの両方の制御におけるKCNJ2の複雑な役割を示している［32、38、39、48］。
三重遺伝子編集の組み合わせ: CACNA1Hの欠失はペースメーカー活性を低下させるが、EAを防止しない。
単純化されたインシリコモデルおよび非興奮性細胞では、過分極によって増強される脱分極性Ifと脱分極によって活性化される再分極性IK1の均衡のとれた交替が、拡張期膜電位の律動性振動を作り出し、したがってAP形成のためのステージを設定するのに十分である［43］。しかしながら、それら自体の性質により、これらの拮抗的な電流は、単独では第0相脱分極の閾値に到達することができない中程度の振動をもたらし、活動電位を発生させるためには追加の脱分極性電流が必要である［36］。
結節細胞の自動性を制御する複数の機構の存在を示す他の結果［30,38］と一致して、これらの結果は、より複雑で冗長な回路がhESC-CMの自動性も制御することを示している。実際、HCN4およびKCNJ2の擾乱は、より遅いおよび/または不規則な拍動数をもたらし、IfおよびIK1によって作り出された振動は主に脱分極性の調律を設定し得るのに対して、より確率的な脱分極率ではあるが、自動性を維持するためには第2の機構が必要とされることを示している。
このため、本発明者らは、T型カルシウムチャネル（CACNA1H）とNCX1（SLC8A1）の両方に着目した。ICaTは、ICaLまたはさらにはINaと比較してより低い、より過分極した電圧で活性化されるのに対して［36、38、49］、INCXは、膜電圧ではなく、主に筋鞘を横切るNa＋/Ca2＋の濃度によって制御される［30、32、38、39］。したがって、インシリコおよびインビトロ結果［36、48］によって示されたように、ICaTおよび/またはINCXが自動性の「バックアップ」機構に関与している可能性があると仮定された。
したがって、まず、KCNJ2過剰発現を有し、脱分極性IfおよびICaT電流の両方を欠くhESCを作製することにした（図7A、図9C）。三重編集されたhESCは、正常な核型および心臓分化能を維持した（図16D、図16E）。遺伝子のノックアウトは、配列類似性を共有する遺伝子の代償性上方制御をもたらし得るので［50］、本発明者らは、他のIfおよびICaTを媒介するイオンチャネルの発現を評価した。図9Aに示されているように、HCN4およびCACNA1Hのノックアウトは、遺伝子ファミリーメンバーの発現に影響を及ぼさなかった。三重編集されたHCN4/CACNA1H 2KO＋KCNJ2 KI hESC-CMは、分化の間、遅延した一貫性のない拍動を示し（図9B）、MEA分析は、脱分極の完全な非存在または不規則なバースト活動のいずれかを示した（図9C; 図16F）。インビボで移植された場合、三重編集されたhESC-CMは、生着後6日目に、なおEAを誘発した（図9D）。その後、心拍数は徐々に加速し、9日目までに300bpmを超える持続的拍数に達して、安楽死を必要とした（図9D）。総合すると、CACNA1H KOを追加することは、HCN4 KO/KCNJ2 KI hESC-CMの挙動に対してわずかな影響しか及ぼさず、冗長な機構がhPSC-CMにおいてある程度の自動性を維持することを示している。次のセクションに記載されているように、この機構はNCX1の開口によって媒介され得ると仮定された。
SLC8A1依存性機構は、ペースメーカー活動およびEA負荷に決定的に寄与する。
上述のように、筋鞘を横切るNa＋/Ca2＋の濃度によって媒介されるNCX1の開口は、hPSC-CMの自動性のための「バックアップ」および/または二次機構としてのAPの生成に寄与し得る［38］。主にIf/ICaT/IK1によって媒介される「電圧クロック」と、主なプレーヤーがNCX1である「カルシウムクロック」の両方の存在が、実際に、SAN細胞だけでなくhPSC-CMについても記載されている［30、32］。この考えは、NCX1阻害の薬理学的実験によって支持される（図5E）。したがって、本発明者らは、hPSC-CMの自動性に関与する機構の一方または両方の機能を引き出すことを目標として、NCX1遺伝子（SLC8A1）を単独でまたはHCN4 KO/KCNJ2 KIのバックグラウンドでノックアウトすることを決定した（図7A、図9G、図9H）。ウエスタンブロットにより、一重および三重編集されたクローンの両方においてNCX1タンパク質の非存在が確認された（図9E）。SLC8A1 KO hESC-CMは、分化中の拍動の開始に差を示さなかったが、間欠的な静止状態の期間を特徴とした（図9F）。これらの特徴は、HCN4 KO/KCNJ2 KIと組み合わせてSLC8A1が除去された場合に大きく強められた（図9F）。分化中の観察およびMEA分析の両方から、実際、三重に編集されたhESC-CMは大部分が静止状態を保ち、拍動は極めて散発的に過ぎなかった（プレート全体で1％未満（図9F、図9G）。興味深いことに、MEAシステムでは、SLC8A1 KOクローンにおいて自発的な電気的活動が検出されなかったが、本発明者らは、おそらくは同期性の欠如のために検出可能な電気信号をもたらさなかった両クローンにおいて、脱同期化された収縮を観察した。
これらの結果に促されて、本発明者らは、SLC8A1/HCN4 2KO＋KCNJ2 KI心筋細胞のインビボ移植に着手した。3匹のブタのうち2匹は、4週間の観察期間にわたって最小のEAを示した。3匹目は、移植後9日目に安楽死を必要とする不安定なEAを発症した（図9H）。移植片サイズは変動したが、全てのブタは容易に検出可能な移植片を有していた（図9H、右）。特に、本発明者らは、研究のこの時点まで、いずれの動物においてもEAの不存在を見ることはなかった。インビトロデータと組み合わせて、カルシウムクロックと電圧クロックの両方の非活性化は、インビトロで自動性を有意に低下させ、インビボでEA負荷を低下させる可能性があると結論付けられた。これは、完全な静止状態がEAを完全に抑止し得ることを示唆した。
MEDUSA: hESC-CM静止状態を誘導するが興奮性を維持する4重の遺伝子編集。
カルシウムクロックおよび電圧クロックの両方がなおいくらかの自動性を示すことができ、EAをもたらし得るhESC-CMであるので、本発明者らは、脱分極増幅装置であるCACNA1Hの除去が、どの冗長な脱分極機構が残っているかを非活性化し得ると仮定した。したがって、HCN4/CACNA1H/SLC8A1 3KO＋KCNJ2 KI hESCのクローンを作製した。4回の連続するゲノム編集を経たにもかかわらず、この細胞株は、正常な核型および多能性マーカーの均一な発現を保持した（図7A、図10A、図10B）。以降では、この四重編集された細胞株は、より短い頭字語MEDUSA（Modification of Electrophysiological DNA to Understand and Suppress Arrhythmias（不整脈を理解し、抑制するための電気生理学的DNAの改変））と称される。MEDUSA hESCは、予想通り、HCN4、CACNA1Hの発現を欠き、KCNJ2の増加した発現を示す（図9A）心筋細胞になお分化することができた（図17D）。SLC8A1発現はWT CMと同等であったが、遺伝子編集は、図17Cに示されているように損なわれたNCX1翻訳をもたらした。さらに、この4重の遺伝子編集された細胞株では、本発明者らは、他のイオンチャネルアイソフォームの代償性上方制御を観察しなかった（図10A）。
MEDUSA-CMは、観察の期間全体にわたって静止状態を保ち、細胞がストレス（すなわち、乳酸選択または熱ショック、図10B）を受けているときにのみ散発的な単収縮が見られた。同様に、MEAシステム（図10C）では、本発明者らは2週間の観察後でさえ自発的活動を何ら観察せず、これらの細胞が三重に編集された対応物のいずれよりも静止状態であることを示した。
MEDUSA-CMの機能性をさらに調べるために、本発明者らは、ペースを調整されたCMからのカルシウムトランジェントを記録した。図10Gに示されているように、MEDUSA-CMおよびWT CMは、1Hzでペースを調整されたときに律動的なカルシウムトランジェントを示し、これは遺伝子型間で区別不能であった。合わせると、これらのデータは、MEDUSA遺伝子編集が、ベースライン条件下で静止状態にあるが、刺激時に活動電位をなお発生することができる心筋細胞をもたらすことを示している。
MEDUSA遺伝子編集はインビボでEAを抑止する。
EAを防止する上でのMEDUSA-CMの有効性を試験するために、本発明者らは、ブタ心臓内へのMEDUSA-CMの移植に着手した。特筆すべきことに、MEDUSA-CMを与えられた2匹の動物は観察の期間全体にわたってEAを示さず、いずれの動物も4週間の終点に到達し、実験全体を通じて安定した洞調律を有していた（図11A、図11B）。4週間の期間にわたって平均心拍数にいくつかのわずかな変動が存在し、詳細に検討すると遠隔測定信号の障害に関連していた研究終了時の心拍数の小さな低下が存在した。研究のいずれの時点においても、臨床的に検出可能な不整脈は見られなかった。重要なことに、EAの非存在は生着の非存在によるものではなかった。実際、MEDUSA移植片サイズは、4週目に検査された他のものと同等であった（図11C）。
成熟するにつれて、心筋細胞は、MLC2aからMLC2vおよびssTnIからcTnIなど、いくつかの筋原線維タンパク質のアイソフォームスイッチングを経験し、発達のベンチマークを提供する［22、23、29］。移植片がMLC2v＋、MLC2a＋およびMLC2a/MLC2v＋細胞の混合集団ならびにssTnIを上回るcTnIの発現増加を示したので、免疫蛍光イメージングによって、MEDUSA-CM移植片がインビボで成熟化を受けることが明らかになった（図11D）。これは、進行中であるがまだ完全ではない成熟を示す。重要なことに、MEDUSA-CMは、宿主CMに近接して並置されており、移植片-宿主境界面にカドヘリンおよびコネキシン43陽性の接合部を有し（図11E、図11F）、MEDUSAと宿主心筋細胞の構造的連関の証拠を提供した。
総合すると、これらの結果は、EAの抑止を伴った、四重遺伝子編集されたMEDUSA-CMにおける自発的電気的活動の完全な抑制を実証する。これは、自動性の根底に存在する一連の電流がEAを引き起こすという仮説を支持する。自動性およびEAを抑止するために複数のイオンチャネル操作が必要であったという事実は、生じた電流における複雑かつ部分的に冗長な役割を示している。
心臓再生のためのhPSC-CM細胞療法の臨床への移行は、hPSC-CM生着後の一過性不整脈の発生によって妨げられてきた［13、16］。マウス［10］、ラット［11］またはモルモット［12］では、おそらくそれらの自然の心拍数が速すぎるために、移植不整脈は観察されなかったが、PSC-CMがブタ［16、17］およびNHP［13、14］に移植された場合には、複数のグループによって移植不整脈が観察され、移植不整脈が手順固有の現象とは無関係に発症することを示している。一般に、不整脈は、興奮旋回をもたらす伝導の欠陥および/または異常な脱分極（ペースメーカー様活動または後脱分極）の存在のいずれかから生じる［20］。電気マッピング研究は、オーバードライブペーシング、直流電気的除細動およびプログラムされた電気刺激などの介入と共に、EAが興奮旋回機序ではなく異常な移植片脱分極から生じることを示唆した［13、17、18、21］。本発明者らは最近、市販の化合物（イバブラジンおよびアミオダロン）による薬理学的処理が、ブタにおけるEAに関連する1日の負荷および最大心拍数の両方を低下させ、死亡率の有意な低下をもたらすことを示した［17］。EAはNHPでは耐容されるが、ブタでは致死的であり得る［13、14、16］。ヒトの心臓がEAを耐容することができるかどうかはなお不明であるが、最初の臨床試験が進行中であり［51］、この治療の安全性プロファイルを改善するためにこの現象の背後に存在する機構を理解することが不可欠である。
ここでは、本発明者らは、EAはhPSC-CMの電気的未成熟に起因し、成体心筋細胞には通常存在しない電流の存在として、または成体心筋細胞中に通常存在する電流の非存在から現れるという仮説から開始した。目標は、ゲノム編集を使用して、成体心室心筋細胞のように、低下した自動性を有するが、電気的に刺激されたときに拍動することができる心筋細胞を作り出すことであった。催不整脈電流の候補を特定するために、本発明者らは、インビボ移植されたhPSC-CMがインサイチューで成熟している際に、その転写動態を分析した。成熟は、活動電位の全ての相を調節するイオンチャネル遺伝子の発現に大きく影響した（図5A～図5G）。hPSC-CMの自動性を理解することはなお決着がついていない課題であり、提案された機構は主に洞房結節モデルに基づいており、hPSC-CMからさらなる洞察が得られている［34、39、52］。手短に言えば、洞房結節では、主にHCN4およびKir2.1（KCNJ2）によって媒介される「電圧クロック」およびNCX1によって調節される「カルシウムクロック」という2つの機構または「クロック」が自動性に関与することが提案されている［38、39、48、52］。増加する証拠は、これらの2つのクロックが、調律の安定性を増加させる強化機構を介して結合されていることを示している［38、39］。同様の機構がhPSC-CMの自動性においても提案されており、結果は、研究されたインビトロモデルに応じて、一方のクロックまたは他方のクロックまたは両方のいずれかを支持する［30、43、46、53］。
本発明者らは、ここでは、RUES2 hESC-CMにおけるIf、ICaTおよびIK1の薬理学的標的化は拍動数を遅らせるが、自動性を除去しないことを示した（図5A～図5Dおよび図13A～図13C）。「カルシウム」クロック、特にINCXおよびL型カルシウムチャネルの薬理学的阻害のみにより、本発明者らは、ペースメーカー挙動の有意な用量依存的減少を観察した（図6E）。これは、以前に報告されたように［31、48］、自動性の調節におけるCa2＋の中心的な役割を示している。
次に、発明者らは、電圧クロックにおける主要なプレーヤーを体系的に標的とした（図6A、図6Bおよび図14A、図14B）。薬理学的阻害からも示唆されるように、HCN4 KO CM（単独またはCACNA1H KOとの組み合わせのいずれか）は、拍動数の約50％の減少を示したが（図7C、図7D）、移植後には、EAに対する効果は存在しなかった（図6E）。本発明者らは次に、KCNJ2を過剰発現させることによってHCN4 KO細胞をより過分極にすることによって興奮性を低下させることを試みた（図8A～図8C）。これは拍動数を有意に低下させたが、インビトロで不規則なバースト様脱分極をもたらした（図8D）。移植後に、これらの二重編集されたRUES2 hESC-CMは依然としてEAを誘導したが、不整脈の発症は遅延された可能性がある（図8E）。
本発明者らはまた、インビボで特異的に上方制御されたイオンチャネルがEAを誘発し得るという仮説を試験した（図15A、図15B）。それらの中で、PIEZO1は、hPSC-CM生着の初期段階において極めて独特の上方制御を有していたが（図15B）、このチャネルの除去は、自発的活動またはEAの負荷のいずれにも影響を及ぼさなかった（図15C～図15F）。これらの結果は、EAを除去するためにはより静止状態の表現型を誘導することが必要とされるという仮説をさらに裏付けている。
次いで、本発明者らは、さらなる脱分極性電流がCACNA1HによってコードされるT型カルシウムチャネルによって送達され得るかどうかを試験するために三重の編集を使用し、HCN4 KOおよびKCNJ2過剰発現のバックグラウンドにおいてこの遺伝子をノックアウトした（図14A）。T型カルシウム電流のさらなる除去は、hESC-CMをそれらの二重編集された対応物と比較してより静止状態の方向に推し進めたが（図9A～図9C）、CACNA1Hの追加されたKOはEAを除去しなかった（図9D）。本発明者らは、HCN4 KOおよびKCNJ2過剰発現のバックグラウンドにおいて、NCX1、SLC8A1をコードする遺伝子を欠失させることによって、三重編集された細胞の第2の株を作製した（図9Eおよび図14A）。これは、二重編集と比較してインビトロ自動性をさらに低下させたが、細胞は培養中になお散発的に発火した（図9F、図9G）。これらの細胞を移植すると、EAは100％浸透性であるわけではないことが初めて観察され、2匹のブタは移植後4週間までEAを示さなかったが、1匹は安楽死を必要とする重度のEAを示した（図9H）。
最後に、本発明者らは、HCN4 KOおよびKCNJ2過剰発現の状況でSLC8A1およびCACNA1Hの両方が欠失された四重編集（図10A）は、自動性およびEAを完全に除去すると仮定した。本明細書でMEDUSAと呼ばれるこの細胞株は、単層で培養された場合に自動性を示さなかったが、外部刺激に応答して活動電位を発生し、カルシウムを循環させる能力をなお示した心筋細胞を生成した（図10B～図10G）。これは、拡張期脱分極の基礎を成す電流を操作し、静止膜電位を設定するための戦略が、自動性を欠くhPSC-CMを産生することに成功したことを示している。さらに、2D培養で増殖させたMEDUSA-CM細胞の電場刺激はWT CMと同様にカルシウムトランジェントを開始したので、MEDUSA-CMは外部からペース調整することができ、興奮-収縮連関が保存されたことを示している（図10G）。インビボで移植された場合、これらの細胞は、生着し、宿主心筋と構造的接合部を形成する能力を保持し、EAの本質的に完全な除去が存在した（図11A～図11D）。
これらの結果は、EAがhPSC-CM移植片内の自動性に起因するという仮説、およびこの自動性が移植片の電気的未成熟に起因するという仮説を強く裏付けている。ゲノム編集を通じて、本発明者らは、hPSC-CMにおいてより成体様の電気生理学的表現型を誘導し、内因的には静止状態であるが、外的に興奮性である細胞を作製した。
これらの結果は、hESC-CMにおける自動性の機構についての新たな展望を与えるのみならず、EAの病因についての新たな洞察も与える。APの第4相は、脱分極性および再分極性電流によって生成され、電圧またはイオン濃度のいずれかによって活性化される、律動的電圧振動である。興味深いことに、（薬理学または遺伝子編集のいずれかを通じた）HCN4の除去は、CACNA1Hと組み合わせた場合でさえ（図7C）、拍動数を約50％低下させたが、律動を乱さなかった（図6A、図7C）。これは、1）IfおよびICaTがhESC-CMにおける唯一のペースメーカー電流ではないこと、および2）脱分極性電流と再分極性電流の平衡は依然として無傷であることを示唆する。実際、KCNJ2が過剰発現された場合にのみ、本発明者らは律動的振動の乱れを観察した（図8D、図9C、図9G）。計算モデルでも示されたように、カリウムのコンダクタンスを増加させると、脱分極性電流と再分極性電流との間の平衡を乱すことによって、細胞をより静止状態の方向に向かわせる。これは、HCN4 KO/KCNJ2 KIにおける律動的脱分極の欠如を説明するが、ICaTおよび/またはINCXはなお活性化され得るので、自動性はなお存在する［32、38］。
IK1（KCNJ2）過剰発現の存在下での、If（HCN4）、ICaT（CACNA1H）およびINCX（SLC8A1）の除去のみで、自動性が完全に消失したことを考慮すると、理論に束縛されることを望むものではないが、If、ICaTおよびINCXは、hESC-CMの第4相を調節する3つの主要な脱分極性電流に相当すると仮定することができる。
IK1が低いかまたは存在しないhESC-CMにおけるこれらの電流の活性化機構を明らかにするために、さらなる実験が必要とされる。
さらに、本発明者らは、EAを防止するためには完全な静止状態に達することによるのみが必要であることを実証した。実際、図15に示されているように、（インビボで特異的に上方制御された）PIEZO1の除去は、EAを防止するのに十分ではなかったのに対して、MEDUSA-CMはEAを完全に抑止し、hPSC-CM移植片に存在する自動性によってEAが主に引き起こされることを実証する。
MEDUSA-CMが、インサイチューでの成熟後に、どのくらい宿主心筋細胞と機能的に同等であるかを推測することは興味深い。成熟心筋細胞においてはHCN4およびCACNA1Hの遺伝子は下方制御されているので、HCN4およびCACNA1HのKOが機能に影響を及ぼすはずはない。同様に、導入遺伝子の遺伝子座（HCN4内）は、同時に内在性KCNJ2遺伝子座の活性化を伴って、成熟につれて自然に発現抑制されるはずであるので、KCNJ2を過剰発現させる戦略が成熟細胞機能に影響を及ぼすはずはない。NCX1チャネルは成体心筋細胞のCa2＋放出の主要経路であるので、SLC8A1を欠失させることの影響はより不明確である。Slc8a1の全体的な欠失はマウスにおいて胚段階で致死的であるが［54］、Slc8a1の心臓特異的な欠失を有するマウスは生存可能であり、成体に成長し、生殖可能である［55］。これらの動物は、やや低下した収縮機能を示すが、APの間に細胞に入るCa2＋の量を低下させることによって、NCX1の非存在に適応したようである。これは、成体心筋細胞が機能的能力に関してNCX1にあまり依存しない可能性があることを示している。
結論として、これらの結果は、hESC-CMの自動性の背後に存在する機構についての新たな洞察を提供し、EAは、イオンチャネルが成体状態に向かって再構築するにつれて衰える移植片におけるペースメーカー様機構から生じるという仮説を強く支持する。MEDUSA-CMの安全性および有効性プロファイルをさらに確認するためにはさらなる研究が必要とされるが、これらの細胞は、催不整脈有害作用なしに損傷した心臓の筋肉を再増大化することに向けての進歩である。
方法
単層でのhPSCの培養および分化
ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC、253G1G-Camp3）およびヒト胚性幹細胞（hESC、RUES2e002-A）を維持し、以前に記載されたように（Palpantら、2017）心筋細胞に分化させた。簡潔には、Matrigelで被覆されたプレート上のmTeSR Plus（0.17mg/mL）中でhiPSCおよびhESCを培養し、Versene（商標）を使用して70％培養密度で継代した。継代後の最初の24時間、10μMのY-27632を添加した。心臓分化の準備をするために、1μMのChiron 99021を補充したmTeSR Plusで、約90％の培養密度のhiPSC/hESCを24時間刺激した。分化0日目に、213μg/mLアスコルビン酸および500μg/mLウシ血清アルブミンを補充したRPMI（RBA培地）中の、細胞株に対して最適化された濃度のChiron99021（範囲: 3～5μM）を使用して中胚葉を誘導した。48時間後、分化の2日目に、細胞をDPBSで洗浄し、心臓前駆細胞をRBA中の2μM WNT-C59で誘導した。48時間後、4日目に、細胞をDPBSで再度洗浄し、素のRBA培地とさらに48時間インキュベートした。6日目から10日目まで、ペニシリン-ストレプトマイシンおよびB-27を補充したRPMI-1640（RPMI-B27培地）中で心筋細胞を維持し、48時間ごとに培地交換を行った。48時間後に培地交換しながら、10日目から14日目まで、4mM L-乳酸ナトリウムを補充した無グルコースRPMI中で細胞を培養することによって乳酸選択を行った。14日目に、培地をRPMI-B7に戻した。凍結の前日に、42℃で30分間、hPSC-CMを熱ショックに供した。0.25％トリプシン/バーゼンを使用してhPSC-CMを解離させ、3×107細胞/mLの細胞密度で、Cryostore中で凍結させ、液体窒素中で保存した。
懸濁状態でのhPSCの培養および分化
以前に記載されたように（Nakamuraら、2021a）野生型およびHCN4 KO RUES2心筋細胞を分化させ、凍結保存した。簡潔には、多能性凝集体を懸濁培養で拡大増殖させ、次いで、市販の培地中の小分子インヒビターのみを使用して心筋細胞に分化するように誘導した。RUES2 HCN4 KO/KCNJ2 KI、PIEZO1 KOおよびHCN4/CACNA1H 2KO/KCNJ2 KIを、分化4日目まで同じ方法によって分化させ、その時点で、TrypLE（Gibco）で凝集体を解離させ、rhLaminin-521（BioLamina）上に播種し、分化プロトコルの残りの間、接着性培養物として維持した。
分化開始から10日後に採集されたPIEZO1 KO株を除いて、全ての細胞を分化開始から17～22日後に酵素的に採集した。Liberase TH（Fisher）およびTrypLEを用いて、懸濁心筋細胞を採集した。TrypLEのみを用いて、接着性心筋細胞を採集した。採集の24時間前に、全ての細胞バッチを熱ショックに供し、CryoStor CS10（BioLife Solutions,Inc）中で凍結保存した。
細胞注射準備（ブタ手術）
細胞注射の日に、500μg/mLウシ血清アルブミンを補充した無フェノールレッドRPMI（RB培地）中でhESC-CMを解凍し、4℃で5分間、300gで遠心分離することによって回収した。RUES2-CMをRB培地で2回洗浄し、100μM細胞濾過器を通して濾過した。150e6個のRUES2 CMを無フェノールレッドRPMI-1640中に再懸濁し、経皮的経心内膜注射用の1つのシリンジまたは直接心外膜注射用の5つのシリンジに移した。シリンジを無菌容器中に個別に詰め、注射の瞬間まで氷上に保った。
動物対象のケア
全てのプロトコルが承認され、ワシントン大学（UW）Office of Animal WelfareおよびInstitutional Animal Care and Use Committeeに従って実施された。動物には自由に水を与え、1日2回給餌した（Lab Diet-5084 Laboratory Porcine Grower Diet）。手術手順のために、筋肉内ブトルファノール、アセプロマジンおよびケタミンの組み合わせで麻酔を誘導した。動物に挿管し、イソフルランおよび酸素を使用して機械的に換気して手術の麻酔深度を維持した。各手順全体を通じて、バイタルサインを連続的にモニターした。全ての動物は、術後の鎮痛のためにブプレノルフィンSR-Lab（ZooPharm）を皮下に与えられ、静脈内Euthasol（Virbac）によって安楽死させた。全ての死後検査は、委員会によって認定された盲検の獣医病理学者によって行われた。
ブタ手術
対照、HCN4 KO、HCN4 KO/KCNJ2 KI、HCN4/CACNA1H 2KO/KCNJ2 KIおよびPIEZO1 CMレシピエントは、心筋梗塞なしで以前に記載されたように（Nakamuraら、2021a）、NOGA-MyoStarプラットフォーム（BioSense Webster）を使用した経皮的経心内膜注射を介して細胞移植を受けた。簡潔に述べると、まず左心室をマッピングし、次いで、150e6個のhESC-CMの総用量に対して、それぞれ100μLの5回の別個の経心内膜注射を前壁に送達することによって、経皮的移植を行った。注射は、電気解剖学的マップによって適切な位置に針を挿入して、優れた位置およびループ安定性、ST部分の上昇ならびに期外心室収縮（PVC）の存在を伴う場合にのみ行われた。
製造業者によるNOGA-MyoStarプラットフォームの供給停止のため、残りの2つの編集、HCN4/CACNA1H 2KO＋KCNJ2 KI SLC8A1/HCN4 2KO_KCNJ2 KIについての細胞移植は、心筋梗塞なしで以前に記載されたように（Nakamuraら、2021a）、直接の経心外膜外科的注射によって行った。簡単に述べると、部分的胸骨正中切開による経心外膜注入を行って左心室前部を露出させた。LADによって定められた5つの別個の位置に、巾着縫合糸を予め配置した。巾着縫合糸を針の周りにしっかりと結んだ後、部分的な引き抜きおよび側方への再配置によってそれぞれ100μLの3回の注射を行い、合計15回の注射で150e6個のhESC-CMの総用量を送達した。
細胞注射準備（げっ歯類手術）
げっ歯類手術において使用されるhiPSC-CMを分化の18～20日目に凍結保存し、以前に記載されたプロトコルに従って（Kadotaら、2017、Gerbinら、2015、Laflammeら、2007）、細胞注射の直前に解凍した。凍結保存の1日前に、42℃で30分間、細胞を熱ショックに供した。酵素的分散の前に、ROCKインヒビターY-27632（10μM）を培養培地に1時間添加し、Versene（商標）に引き続くEDTA中0.05％トリプシンとのインキュベーションによって細胞を分散させた。hiPSC-CMをCryoStor（商標）細胞保存培地に再懸濁し、液体窒素中に保存する前に、制御された速度の冷凍庫内のクライオバイアル中で-80℃まで凍結させた。凍結保存された細胞を解凍するために、クライオバイアルを37℃で短時間解凍し、続いてY-27632（10μM）を加えたRPMI＋B27＋インスリンを添加した。細胞をPBSで洗浄し、50％増殖因子低減マトリゲル、100μM ZVAD（ベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp（O-メチル）-フルオロメチルケトン、Calbiochem）、50nM Bcl-XLBH4（細胞透過性TATペプチド、Calbiochem）、200nMシクロスポリンA（Novartis）、100ng/mL IGF-1（Peprotech）および50μMピナシジル（Sigma）を含有するRPMIベースの生存促進カクテル（Laflammeら、2007）に再懸濁した。
げっ歯類の手術およびレーザー捕捉顕微鏡
68.2mg/kgのケタミンおよび4.4mg/kgのキシラジンの腹腔内注射によって、8～10週齢の雄の無胸腺ラット（240～300g）を麻酔し、挿管し、機械的に換気した。開胸術により心臓を露出させ、LADを60分間閉塞させ、再灌流し、胸部を閉じた。虚血/再灌流傷害の4日後、イソフルラン吸入によってラットを麻酔し、機械的に換気した。2回目の開胸術によって心臓を露出させ、梗塞した左心室壁の中心に10×106個のhiPSC-CMを注射した（3～4回の注射、各30μl）。それぞれ縫合糸および創傷クリップによって胸部および皮膚を閉じた。1日2回、各手術後に48時間、ラットに鎮痛薬（ブプレノルフィン0.05mg/kg）を与えた。移植前日から開始して7日間、シクロスポリンA（5mg/kg/日）を与えた。
RNA-seq調製および配列決定
インビトロ試料については、DNase処理を含め、製造業者のプロトコルに従って、RNeasy（商標）Mini Kitを使用して全RNAを単離した。インビボ試料については、ラット心臓を採取し、スライスし、OCT包埋化合物に直ちに包埋し、-80℃で保存した。クリオスタット（Leica）を使用して組織を10μmの厚さで切片化し、連続切片に4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを載せて、緑色蛍光タンパク質の自己蛍光によって移植片領域を可視化した。レーザー捕捉微細解剖システム（Leica）を使用して、膜で被覆されたスライド（Leica、11600289）に付着された染色されていない非固定標本から移植片領域を捕捉した。Arcturus PicoPure（商標）RNA単離キットを使用して、ラット心臓組織中の移植片領域から全RNAを抽出した。Agilent 4200 Tapestation（商標）（Agilent Technologies）を用いてRNA完全性（RNA完全性数相当物≧7）および量を決定した。SMART-Seq（商標）v4 ultra low input RNA kit for sequencing（Takara Bio）を用いてcDNAを合成した。製造者の説明書に従ってNextera（商標）XT DNA Library Preparation Kit（Illumina）を使用して、ライブラリー調製を行った。シングルエンド設定（72bp）でのIllumina Next-Seq 500でRNA-seqライブラリーを配列決定した。STARアライナ（Dobinら、2013）を使用して、ヒト（hg38）ゲノムとラット（Rnor_6.0）ゲノムのハイブリッドであるカスタムライブラリにリードをマッピングした。Cufflinks（Trapnellら、2012）を使用する下流分のために、ヒトゲノムに特異的かつユニークにマッピングされたリードを使用した。topGO Rパッケージ（Alexaら、2006）を使用して、遺伝子オントロジー分析を行った。
HCN4およびCACNA1H KOのための遺伝子編集
HCN4およびCACNA1H KOのために、Zhang labのプロトコルに従って、鍵となるコーディングエクソンを標的とする単一のgRNAをpX459V2プラスミド中にクローニングし、サンガー配列決定によって検証した。QIAGEN Midiプレップキットを用いて遺伝子編集用プラスミドを調製した。10μMのY-27632 Rockインヒビターが補充されたmTESR Plus中に、15,000細胞/cm2でRUES2 hESCを播種し、100μLのOPTI-MEM中の、6μLのGeneJuice（商標）および2μgのpX459V2_gRNAプラスミドを使用して形質移入した。24時間後、細胞をDPBSで洗浄し、5μMのY-27632および0.5μg/mLピューロマイシンが補充されたmTESR Plusとともに48時間インキュベートした。その後、細胞をDPBSで洗浄し、上記のように維持した。96ウェル中に0.5細胞/ウェルで単一細胞を播種することによって、限界希釈プロトコルを使用して単一クローンを単離した。方法表6に列挙されているプライマーおよびQ5 High-Fidelity Master Mixを使用して得られたPCRアンプリコンのサンガー配列決定を使用して、クローン株に対して遺伝子型分析を行った。混合された配列決定トレースを観察した場合、アンプリコンをTOPOクローニングし、個々の対立遺伝子上の編集を決定するために、少なくとも48個の個々の細菌クローンに対してサンガー配列決定を実施した。核型異常の非存在を確認するために、未分化細胞に対して標準的なG分染法分析を行った。Cas-OFFinderソフトウェア（カットオフ: 最大4つのミスマッチ、DNAまたはRNA配列のいずれかに1つのバルジ）およびインデルの存在を排除するためのサンガー配列決定による遺伝子型決定のために選択されたhESC-CM中で発現された遺伝子のエクソン中の潜在的オフターゲットを使用して、CRISPR/Cas9オフターゲット分析を行った。
HCN4遺伝子座でのKCNJ2 KIのための遺伝子編集
CRISPR/Cas9相同組換え修復（HDR）を通じて、HCN4遺伝子座でのKCNJ2のノックインを行った。NEBuilder（商標）Hifi DNA Assemblyキットを使用して、ドナーベクターを作製した。PCRによって、hESC RUES2ゲノムDNAから3'および5'HCN4ホモロジーアーム（3'/5'-HA）を増幅する一方、AAVS1_CAGGS_EGFPからSV40ポリA断片を増幅した（全て本明細書に記載されているプライマーを使用）。NsiIおよびBsiWIを用いた制限消化によって、MV-PGK-Puro-TKプラスミドからPuro-T2A-TKカセットを単離した。同じMV-PGK-Puro-TKプラスミドをNotIおよびAscIで消化して、トランスポゾン逆方向タンデムリピートおよびアンピシリン耐性遺伝子を含有する骨格ベクターを単離した。次いで、このアセンブリから得られたドナープラスミド（pbHCN4）およびKCNJ2 cDNAを有するPCRをClaIおよびNcoI制限酵素で消化し、Quick Ligationキットを使用して連結した。対照ベクターを作製するために、同じ手順を行ったが、AAVS1_CAGGS_EGFPから増幅されたEGFPを使用した。得られた標的化プラスミド（pbHCN4_KCNJ2またはpbHCN4_GFP）を上記のように増幅した。全てZhang labのプロトコルに従って、pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9中のHCN4プロモーターを標的とする2つのgRNA（HCN4_gRNA1_KIおよびHCN4_gRNA2_KI）をクローニングすることによって、HDRを駆動するのに必要な二本鎖切断を誘導するように設計されたCRISPR/Cas9プラスミドを得て、上記のように増幅した。次いで、上記のGeneJuiceを使用して、1μgのドナープラスミド（pbHCN4_KCNJ2またはpbHCN4_GFPのいずれか）ならびにpX330_HCN4gRNA1_KIおよびpX330_HCN4gRNA2_KIのそれぞれについては0.5μgで、RUES2 hESCを形質移入した。ピューロマイシン選択後、限界希釈によって単一クローンを得て、PCRによって遺伝子型を決定した。カセット上および遺伝子座上、但しホモロジーアームの外側にマッピングするプライマーを使用して、HCN4遺伝子座の下流への導入遺伝子カセットのオンサイト組み込みを確認し、野生型対立遺伝子（ホモ接合の編集された細胞において増幅の喪失をもたらす）を増幅することによって遺伝子編集された遺伝子座の数を決定し、挿入断片およびプラスミド骨格にマッピングするプライマーを使用して標的化プラスミドのランダムな組み込みの非存在を確認した。異常の非存在を確認するために核型分析を行い、CRISPR/Cas9オフターゲットを除外した。
SLC8A1 KOのための遺伝子編集
SLC8A1 KOを誘導するために、SLC8A1のエクソン1を標的とするCRISPR/Cas9リボ核タンパク質複合体をhESCに電気穿孔した。簡潔に述べれば、60pmolのSpCas9 2xNLSヌクレアーゼ（Synthego）および60pmolのSLC8A1 gRNAミックス（20pmol/gRNA）および300μLのNeon Buffer Rの混合物中に、500.000個のRUES2 hESCを再懸濁した。次いで、Neon電気穿孔システムを使用して細胞を電気穿孔し（30ms間、1,300Vで1パルス）、10μMのY-27632が補充されたmTeSR1中の、Matrigel（商標）で被覆された6ウェルプレート上に直ちに再播種した。限界希釈によってSLC8A1 KO単一クローンを単離し、PCRおよびサンガー配列決定によって遺伝子型を決定した。異常の非存在を確認するために核型分析を行い、CRISPR/Cas9オフターゲットを除外した。
（表６）gRNAのクローニングおよび遺伝子型決定のためのオリゴヌクレオチド
Figure 2024517810000012
Figure 2024517810000013
Figure 2024517810000014
定量的リアルタイムPCRによる遺伝子発現分析
製造者の説明書に従ってRNAesy Miniキットを使用して、異なる細胞株からの14日目のRUES2 CMから全RNAを抽出した。M-MLV RTキットを用いた逆転写によって一本鎖cDNAを得て、10ngのcDNAならびに400nMのフォワードおよびリバースプライマーを使用して、SYBR Select Master Mixを用いて定量的リアルタイム逆転写PCR（RT-qPCR）を行った（表7）。CFX384 Real-Time System（Biorad）で反応を実行し、HPRT1をハウスキーピング遺伝子として使用するΔΔCt法を使用してデータを分析した。PrimerBlastを使用してプライマーを設計し、単一の産物を増幅することを確認した。
（表７）RT-qPCRオリゴヌクレオチド
Figure 2024517810000015
ウエスタンブロッティング
14日目のhESC-CM WTおよびSLC81A KO CMクローンを、氷冷RIPA Buffer（150mM NaCl、1％NP-40、0.5％デオキシコラート、0.1％SDS、50mM Tris・HCl、1Xプロテアーゼインヒビター）とともに4℃で30分間インキュベートした。4℃で、15分間の21,000rcfでの遠心分離によってタンパク質可溶化液を収集し、BCAアッセイによって定量した。37℃で30分間、1×非還元試料緩衝液中で試料あたり30μgのタンパク質を、インキュベートし、4～20％のMini-Proteanゲル上で泳動し、PVDF膜上に転写した。PIEZO1については、チオ尿素緩衝液（8M尿素、2Mチオ尿素、3％SDS、75mM DTT、50mM Tris-HCl）を使用してCMペレットを採集し、50％グリセロール＋2Xプロテアーゼインヒビターと等体積で混合した。次いで、試料を37℃で10分間インキュベートし、4～20％のMini-Proteanゲル上で直接泳動させた。次いで、還元条件でタンパク質をPVDF膜上に転写した。0.1％Tween-20が補充されたTBS緩衝液中の5％BSA（ブロッキング緩衝液）とともに、膜を室温で1時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液中で、一次抗体を室温で2時間インキュベートし、次いで、ブロッキング緩衝液中で膜を3回洗浄し、フルオロフォアがコンジュゲートされた二次抗体とともに1時間インキュベートした。蛍光シグナルは、GelDoc Imagerを用いて取得した。
自発的拍動数のMEA分析
0.17mg/mLのMatrigelで、CytoView（商標）MEA 48を37℃で1時間被覆した。50,000個のRUES2 CMを6μLに再懸濁し、以前に記載されたように（Berteroら、2019b）各MEAウェル上に播種した。1日おきに1週間、培地をB-27が補充されたRPMI-1640と交換した。自発的拍動記録のために、Maestro（商標）Proシステムを使用して、37℃、5％CO2で5分間、自発的電気的活動を記録した。KCNJ2 KIを有する細胞株の不規則な拍動数を考慮して、データは、実験当たりの記録された総拍動数を記録の総時間で割ったもの（平均拍動数/分）として示される。薬理学的研究のために、異なる化合物をDMSOで希釈し、MEAプレート上で、37℃で5分間直接インキュベートした。薬物インキュベーション後に15分間記録することによって、自発的拍動数に対する効果を決定した。非線形回帰曲線は、Y＝100/（1＋10＾（（LogIC50-X）＊ヒル勾配）））として計算される。ノイズ低減のために2kHzのローパスデジタルフィルタを用いて、12.5kHzで全ての電極に対して電圧を同時に取得した。Axis Navigator（拍動検出器閾値: 30～100μV; 最小拍動間隔: 200～500ms; 最大拍動間隔: 30s）を使用して、拍動数、スパイク振幅および拍動間隔の不規則性の定量化を行った。
パッチクランプ電気生理学
ラミニンで被覆されたガラスのカバーガラス上に、13～18.5k/cm2の密度で単一のhESC-CM（14～21日目）を播種した。2～4Mの典型的な抵抗を有するボロシリカートガラスピペットを使用して、電流クランプモードで穿孔パッチ活動電位（AP）記録を行った。5kHzでデータを取得し、Multiclamp 700B増幅器、Digidata 1550デジタイザおよびClampex 11ソフトウェアを使用して、2kHzでフィルタリングした。NaOHでpHを7.4に調整しながら、（mM単位で）140NaCl、5.4KCl、1.8CaCl2、1MgCl2、10グルコースおよび10HEPESを含有するTyrodeの溶液の連続灌流下にて、35±1℃で実験を行った。ピペット溶液は、（mM単位で）: 150KCl、5NaCl、5MgATP、10HEPES、5EGTA、2CaCl2および240μg/mLのアムホテリシンBを含有し、KOHでpHを7.2に調整した。1Hzの周波数で5msの電流注入パルス（0.3～0.5nA）を用いて、誘発された活動電位を記録した。自発的活動電位パラメータを30秒間の記録から決定し、一方、刺激されたAPパラメータを10秒間の記録から決定した。Clampfit 11ソフトウェアを使用してAPを分析した。
Ifについては、室温で、改変Tyrode溶液（0.2mmol/LのCdCl2を含む）中において電流を記録した。-40mVの保持電位から、10mVの増分で-120mVから-50mVまでの2秒間の試験パルスによってIfを誘発した。Ifは、0.5mmol/LBa2＋非感受性および5mmol/LCs＋感受性電流と定義された。改変Tyrode溶液は、（mmol/L）: 120NaCl、20KCl、10HEPES、10グルコース、2CaCl2および1MgCl2で構成され、NaOHでpH7.4に調整された。ピペット溶液は、（mmol/L）: 100KCl、10NaCl、14EGTA、10HEPES、5MgATP、1CaCl2を含有し、KOHでpH7.2に調整された。
カルシウムトランジェント分析
B-27およびペニシリン-ストレプトマイシンが補充されたRPMI-1640を有する、Matrigelで被覆された6ウェルプレート中に、5,000細胞/cm2でRUES2-CMを播種した。1日おきに1週間、細胞を供給した後、37℃で30分間、1μMFluo-4 AMとインキュベートした。IonOptixペーシングシステムを使用して、1Hz（0.025秒のパルス持続時間、40mV）で培養物を電気的にペース調整しながら、カルシウムトランジェントを取得し、特注のMATLABコード（Berteroら、2019b）で分析した。
組織学（ブタ心臓）
心臓全体を採取し、以前に記載されたように（Nakamuraら、2021a）処理した。簡潔には、心臓全体から左心室を単離し、秤量し、スライスするために1.6％寒天中に包埋した。4mmの切片を得て、4％パラホルムアルデヒド中で、4℃で一晩固定した。次いで、70％エタノール中で切片を脱水した後、パラフィン中に包埋した。次いで、異なる切片を4μMの切片で切断し、正に帯電した顕微鏡用スライド上に置いた。染色前に、異なる濃度のキシレンおよびエタノール中でのその後の洗浄によって、スライドを徐々に再水和させた。過酸化水素とメタノールの混合物（1:20）中でのクエンチ後、クエン酸緩衝液（またはMLC2aおよびMLC2v抗体のプロテイナーゼK消化）を使用して、熱誘導抗原賦活化処理を行った。次いで、DPBS（ブロッキング緩衝液）中に希釈された1.5％正常ウマ血清中で、室温で1時間、スライドをインキュベートした。ブロッキング緩衝液で一次抗体を希釈し、4℃で一晩インキュベートした。ブロッキング緩衝液で二次抗体を希釈し、室温で1時間インキュベートした。アビジン-ビオチン複合体検出のために、スライドをABC Peroxidaseと室温で30分間インキュベートした後、3,3'ジアミノベンジジンで可視化した。全スライド画像に特注コードを使用して移植片を定量化し、ブロックの面積とLV重量の両方に対して正規化した（Nakamuraら、2021a）。免疫蛍光のために、二次抗体インキュベーション後に、Yokogawa W1スピニングディスクヘッドを備えたNikon Eclipse顕微鏡で20倍および60倍の油浸対物レンズを用いてスライドを画像化し、Fijiソフトウェアでフォーマットした。
組織学（げっ歯類の心臓）
各時点のラット心臓を回収し、上記のようにスライスし、直ちにOCT包埋化合物に包埋し、-80℃で保存した。クリオスタット（Leica）を用いて10μmの厚さで組織を切片化し、4％パラホルムアルデヒドで5分間固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
参考文献
Figure 2024517810000016
Figure 2024517810000017
Figure 2024517810000018
Figure 2024517810000019

Claims (265)

  1. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも部分的に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、インビトロで分化したヒト心筋細胞。
  2. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現と、内在性HCN4制御配列によって調節される、KCNJ2をコードする導入遺伝子の発現とを含む、インビトロで分化したヒト心筋細胞。
  3. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が、心筋細胞または他の対照細胞と比較して少なくとも部分的に阻害される、請求項2記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  4. KCNJ2活性が、心筋細胞または他の対照細胞と比較して少なくとも部分的に刺激される、請求項2または請求項3記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  5. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の少なくとも部分的な阻害が、前記心筋細胞を1つもしくは複数のインヒビター薬物と接触させることを介した阻害を含み、かつ/または遺伝子操作を含む、請求項1～4のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  6. KCNJ2活性の少なくとも部分的な刺激が、前記心筋細胞を1つもしくは複数の活性化薬物と接触させることを含み、かつ/または遺伝子操作を含む、請求項1～5のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  7. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記低下した発現が遺伝子操作によるものである、請求項2～6のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  8. KCNJ2の少なくとも部分的に刺激された活性が遺伝子操作によるものである、請求項2～8のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  9. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つまたは複数が不活性化される、請求項1～8のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  10. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の各々が不活性化される、請求項1～9のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  11. 対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が完全に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項1～10のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  12. 前記1つまたは複数のインヒビター薬物、活性化薬物および/または遺伝子操作が、HCN4、CACNA1H、SLC8A1および/またはKCNJ2の発現を変化させない、請求項5～11のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  13. 1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない心筋細胞または他の対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項1～12のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  14. 遺伝子操作によって操作されていない心筋細胞または他の対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項1～13のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  15. 対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が遺伝子操作によって完全に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項1～14のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  16. 前記心筋細胞または他の対照細胞が、野生型心筋細胞、初代心筋細胞、PSCもしくはESC由来のインビトロで分化した心筋細胞、または出発材料である、請求項11～15のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  17. 対照細胞が、1つまたは複数のインヒビター薬物、活性化薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない、請求項11～16のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  18. 前記1つまたは複数のインヒビター薬物、活性化薬物および/または遺伝子操作が、HCN4、CACNA1H、SLC8A1および/またはKCNJ2の発現を変化させない、請求項17記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  19. 前記対照細胞が、PSCまたはESCに由来するインビトロで分化した心筋細胞であり、該対照細胞、PSCまたはESCが、1つ、2つまたは3つの編集を含むが4つ全ては含まず、前記HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも部分的に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激され、該PSCが任意でiPSCである、請求項11～18のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  20. 遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が遺伝子操作によって少なくとも10％または1倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項1～19のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  21. 遺伝子操作方法が遺伝子ノックダウンであり、任意で、該遺伝子ノックダウンが、RNAサイレンシングまたは、siRNA、piRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群より任意で選択されるRNAiによるものである、請求項1～20のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  22. 遺伝子操作方法が遺伝子ノックアウトであり、任意で、該遺伝子ノックアウトは、遺伝子編集システムを使用して前記遺伝子中に挿入または欠失を誘導することによるものであり、前記遺伝子編集システムは、ZFN、TALEN、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、CRISPR/Casシステム、ニッカーゼシステム、塩基編集システム、プライム編集システム、および遺伝子書き込みシステムからなる群より任意で選択される、請求項1～21のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  23. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の1つまたは複数の対立遺伝子に導入される、請求項1～22のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  24. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の両方の対立遺伝子に導入される、請求項1～23のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  25. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現をもたらす、請求項1～24のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  26. 前記遺伝子不活性化が、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む、請求項1～24のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  27. 前記遺伝子不活性化が、RNA誘導型ヌクレアーゼ、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる、請求項25記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  28. 前記RNA誘導型ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼを含む、請求項27記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  29. 前記遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトが、RNAi、アンチセンス、またはRNAを標的とするCasヌクレアーゼを介して行われる、請求項9～25のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  30. 前記遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトが、CRISPR/Casシステムを使用して行われる、請求項28または請求項29記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  31. 少なくとも1つの外因性核酸配列をさらに含む、請求項1～30のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  32. 少なくとも1つの外因性核酸配列からポリペプチドを発現する、請求項313記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  33. 少なくとも1つのさらなる遺伝子の低下した発現をさらに含む、請求項1～32のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  34. KCNJ2が導入遺伝子から過剰発現される、請求項1～33のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  35. HCN4またはCACNA1H発現調節配列によって駆動される外因性KCNJ2コード配列を含む、請求項1～26のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  36. 置き換えられたHCN4またはCACNA1Hコード配列が発現されずかつ置き換えられたKCNJ2が内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列の調節下で発現されるように、KCNJ2コード配列がHCN4またはCACNA1Hのコード配列と置き換わる、請求項1～27のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  37. 前記KCNJ2コード配列が、CRISPR/Casシステムを使用して置き換えられている、請求項35または36記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  38. HCN4の前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項35～37のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  39. CACNA1Hの前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項35～37のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  40. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子が不活性化され、前記KCNJ2ポリペプチドが過剰発現される、請求項1～39のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  41. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子が、少なくとも1つの対立遺伝子中にインデルを含む、請求項40記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  42. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子が、2つの対立遺伝子中にインデルを含む、請求項40記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  43. HCN4インデル/インデル、CACNA1Hインデル/インデル、およびSCL8A1インデル/インデル細胞である、請求項42記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  44. 前記インデルが、CRISPR/Casシステムを使用して作成される、請求項40～43のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  45. KCNJ2ポリペプチドが、導入遺伝子によってコードされ、前記内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列に機能的に連結されている、請求項1～44のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  46. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子がCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつ前記KCNJ2ポリペプチドが内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される、請求項1～45のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  47. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記内在性HCN4制御配列に機能的に連結された前記導入遺伝子によってコードされる、請求項46記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  48. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記HCN4遺伝子座において前記内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される、請求項47記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  49. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子がCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつ前記KCNJ2ポリペプチドが内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される、請求項1～45のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  50. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記内在性CACNA1H制御配列に機能的に連結された導入遺伝子によってコードされる、請求項49記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  51. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記CACNA1H遺伝子座において前記内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される、請求項50記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  52. HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性が、前記心筋細胞を薬物と接触させることによって操作され、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性が遺伝子操作される、請求項1～51のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  53. 前記心筋細胞が多能性幹細胞からインビトロで分化している、請求項1～52のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  54. 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC）である、請求項53記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  55. 前記心筋細胞が、前記インビトロで分化したヒト心筋細胞が移植される対象に由来するiPSCからインビトロで分化している、請求項1～54のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  56. 前記心筋細胞が、健康な対象に由来するiPSCからインビトロで分化している、請求項1～55のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  57. 前記心筋細胞が出発材料からインビトロで分化している、請求項1～56のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  58. 前記出発材料が、ドナーから収集された初代細胞を含む、請求項57記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  59. 前記健康な対象、前記出発材料、および/または前記ドナーの各々が、前記インビトロで分化したヒト心筋細胞が移植される対象と同じ個体に由来しない、請求項56～58のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  60. 前記ドナーから収集された前記初代細胞が幹細胞である、請求項58記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  61. 前記幹細胞がESCである、請求項60記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  62. 前記出発材料が幹細胞株である、請求項57記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  63. 前記幹細胞株がESC株またはiPSC株である、請求項62記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  64. 前記幹細胞株がiPSC株である、請求項63記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  65. その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性の少なくとも部分的な阻害ならびにKCNJ2活性の少なくとも部分的な刺激を含まないインビトロで分化したヒト心筋細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を促進する、請求項1～64のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  66. その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、前記対象が、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性の少なくとも部分的な阻害ならびにKCNJ2活性の少なくとも部分的な刺激を含まないインビトロで分化したヒト心筋細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を経験する、請求項1～65のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  67. 凍結保存剤と混合されている、請求項1～66のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  68. 凍結保存剤と混合されて凍結されている、請求項1～67のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  69. NKX2-5、MYH6、MYL7、TBX5、ATP2a2、RYR2、およびcTnTからなる群より選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、請求項1～68のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  70. 細胞活性および成熟が、電気的成熟度、代謝的成熟度、および収縮的成熟度からなる群より選択される数値パラメータによって決定可能である、請求項1～55のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  71. 前記インビトロで分化した心筋細胞の代謝的成熟度が、基準レベルと比較した、
    ミトコンドリア機能の増加した活性、増加した脂肪酸代謝、増加した酸素消費速度（OCR）、増加したリン酸化ACCレベルまたは活性、脂肪酸結合タンパク質（FABP）の増加したレベルまたは活性、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ-4（PDK4）の増加したレベルまたは活性、増加したミトコンドリア呼吸能力、増加したミトコンドリア体積、およびミトコンドリアDNAの増加したレベル
    からなる群より選択されるマーカーの1つまたは複数によって決定される、請求項70記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  72. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現ならびにKCNJ2の増加した発現を含む、多能性幹細胞。
  73. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現が、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の各々についての低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現を含む、請求項72記載の多能性幹細胞。
  74. KCNJ2の増加した発現が、増加したタンパク質発現および/または増加した遺伝子発現を含む、請求項72記載の多能性幹細胞。
  75. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現と、内在性HCN4制御配列によって調節される、KCNJ2をコードする導入遺伝子の発現とを含む、請求項72～74のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  76. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の前記阻害が、前記心筋細胞を1つもしくは複数のインヒビター薬物と接触させることを介した阻害を含み、かつ/または遺伝子操作を含む、請求項72～75のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  77. KCNJ2活性の前記刺激が、前記多能性幹細胞を1つもしくは複数の活性化薬物と接触させることを含み、かつ/または遺伝子操作を含む、請求項72～76のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  78. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記低下した発現が遺伝子操作によるものである、請求項72～77のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  79. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つまたは複数が不活性化される、請求項72～78のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  80. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の各々が不活性化される、請求項72～79のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  81. 1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が完全に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項72～80のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  82. 1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項72～81のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  83. 遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項72～82のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  84. 遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が遺伝子操作によって完全に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項72～83のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  85. 前記対照細胞が、野生型心筋細胞、初代心筋細胞、PSCもしくはESC由来のインビトロで分化した心筋細胞、または出発材料である、請求項72～84のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  86. 前記対照細胞が、PSCまたはESCに由来するインビトロで分化した心筋細胞であり、前記対照細胞、PSC、ESCが、1つ、2つまたは3つの編集を含むが4つ全ては含まず、前記HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも部分的に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項72～85のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  87. 遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が遺伝子操作によって少なくとも10％または1倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項86記載の多能性幹細胞。
  88. 前記遺伝子操作方法が遺伝子ノックダウンであり、任意で、前記遺伝子ノックダウンが、RNAサイレンシングまたは、siRNA、piRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群より任意で選択されるRNAiによるものである、請求項72～87のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  89. 前記遺伝子操作方法が遺伝子ノックアウトであり、任意で、前記遺伝子ノックアウトは、遺伝子編集システムを使用して前記遺伝子中に挿入または欠失を誘導することによるものであり、前記遺伝子編集システムは、ZFN、TALEN、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、CRISPR/Casシステム、ニッカーゼシステム、塩基編集システム、プライム編集システム、および遺伝子書き込みシステムからなる群より任意で選択される、請求項72～88のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  90. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の1つまたは複数の対立遺伝子に導入される、請求項72～89のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  91. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の両方の対立遺伝子に導入される、請求項72～90のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  92. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現をもたらす、請求項73～92のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  93. 前記遺伝子不活性化が、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む、請求項73～94のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  94. 前記遺伝子不活性化が、RNA誘導型ヌクレアーゼ、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる、請求項94記載の多能性幹細胞。
  95. 前記RNA誘導型ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼを含む、請求項95記載の多能性幹細胞。
  96. 前記遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトが、RNAi、アンチセンス、またはRNAを標的とするCasヌクレアーゼを介して行われる、請求項80～96のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  97. 前記遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトが、CRISPR/Casシステムを使用して行われる、請求項96または請求項97記載の多能性幹細胞。
  98. 少なくとも1つの外因性核酸配列をさらに含む、請求項73～98のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  99. 少なくとも1つの外因性核酸配列からポリペプチドを発現する、請求項99記載の多能性幹細胞。
  100. 少なくとも1つのさらなる遺伝子の低下した発現をさらに含む、請求項73～100のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  101. KCNJ2が導入遺伝子から過剰発現される、請求項73～101のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  102. HCN4またはCACNA1H発現調節配列によって駆動される外因性KCNJ2コード配列を含む、請求項73～102のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  103. 置き換えられたHCN4またはCACNA1Hコード配列が発現されずかつ置き換えられたKCNJ2が内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列の調節下で発現されるように、KCNJ2コード配列がHCN4またはCACNA1Hのコード配列と置き換わる、請求項73～104のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  104. 前記KCNJ2コード配列が、CRISPR/Casシステムを使用して置き換えられている、請求項103または104記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  105. HCN4の前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項73～105のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  106. CACNA1Hの前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項73～106のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  107. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子が不活性化され、前記KCNJ2ポリペプチドが過剰発現される、請求項73～107のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  108. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子が、少なくとも1つの対立遺伝子中にインデルを含む、請求項108記載の多能性幹細胞。
  109. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子が、2つの対立遺伝子中にインデルを含む、請求項108記載の多能性幹細胞。
  110. HCN4インデル/インデル、CACNA1Hインデル/インデル、およびSCL8Aインデル/インデル細胞である、請求項110記載の多能性幹細胞。
  111. 前記インデルが、CRISPR/Casシステムを使用して作成される、請求項109～111のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  112. KCNJ2ポリペプチドが、導入遺伝子によってコードされ、前記内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列に機能的に連結されている、請求項73～112のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  113. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子がCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつ前記KCNJ2ポリペプチドが内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される、請求項73～113のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  114. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記内在性HCN4制御配列に機能的に連結された前記導入遺伝子によってコードされる、請求項114記載の多能性幹細胞。
  115. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記HCN4遺伝子座において前記内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される、請求項115記載の多能性幹細胞。
  116. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子がCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつ前記KCNJ2ポリペプチドが内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される、請求項73～116のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  117. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記内在性CACNA1H制御配列に機能的に連結された導入遺伝子によってコードされる、請求項117記載の多能性幹細胞。
  118. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記CACNA1H遺伝子座において前記内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される、請求項118記載の多能性幹細胞。
  119. HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性が、前記心筋細胞を薬物と接触させることによって操作され、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性が遺伝子操作される、請求項73～119のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  120. 胚性幹細胞（ESC）である、請求項73～120のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  121. 人工多能性幹細胞（iPSC）である、請求項73～121のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  122. 前記多能性幹細胞が移植される対象に由来するiPSCに由来する、請求項73～122のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  123. 健康な対象に由来するiPSCに由来する、請求項73～123のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  124. 出発材料からインビトロで分化する、請求項73～124のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  125. 前記出発材料が、ドナーから収集された初代細胞を含む、請求項125記載の多能性幹細胞。
  126. 前記健康な対象、前記出発材料、および/または前記ドナーの各々が、前記多能性幹細胞が移植される対象と同じ個体に由来しない、請求項124～126のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  127. 前記ドナーから収集された前記初代細胞が幹細胞である、請求項126記載の多能性幹細胞。
  128. 前記幹細胞がESCである、請求項127記載の多能性幹細胞。
  129. 前記出発材料が幹細胞株である、請求項125記載の多能性幹細胞。
  130. 前記幹細胞株がESC株またはiPSC株である、請求項130記載の多能性幹細胞。
  131. 前記幹細胞株がiPSC株である、請求項130記載の多能性幹細胞。
  132. その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性の阻害ならびにKCNJ2活性の刺激を含まない多能性幹細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を促進する、請求項73～132のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  133. 凍結保存剤と混合されている、請求項73～133のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  134. 凍結保存剤と混合されて凍結されている、請求項73～134のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  135. 前記多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞が、NKX2-5、MYH6、MYL7、TBX5、ATP2a2、RYR2、およびcTnTからなる群より選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、請求項73～135のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  136. 前記多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞の細胞活性および成熟が、電気的成熟度、代謝的成熟度、および収縮的成熟度からなる群より選択される数値パラメータによって決定可能である、請求項73～136のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  137. 前記多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞の代謝的成熟度が、基準レベルと比較した、
    ミトコンドリア機能の増加した活性、増加した脂肪酸代謝、増加した酸素消費速度（OCR）、増加したリン酸化ACCレベルまたは活性、脂肪酸結合タンパク質（FABP）の増加したレベルまたは活性、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ-4（PDK4）の増加したレベルまたは活性、増加したミトコンドリア呼吸能力、増加したミトコンドリア体積、およびミトコンドリアDNAの増加したレベル
    からなる群より選択されるマーカーの1つまたは複数によって決定される、請求項137記載の多能性幹細胞。
  138. 請求項73～138のいずれか一項記載の多能性幹細胞を含む細胞バンク。
  139. 請求項73～138のいずれか一項記載の多能性幹細胞からインビトロで分化した心筋細胞。
  140. 出発材料と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現ならびにKCNJ2の増加した発現を含む、細胞。
  141. 前記出発材料が、ドナーから収集された初代細胞を含む、請求項141記載の細胞。
  142. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下したタンパク質発現が、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の各々についての低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現を含む、請求項141または請求項142記載の細胞。
  143. KCNJ2の増加した発現が、増加したタンパク質発現および/または増加した遺伝子発現を含む、請求項141～143のいずれか一項記載の細胞。
  144. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の低下した発現と、内在性HCN4制御配列によって調節される、KCNJ2をコードする導入遺伝子の発現とを含む、請求項141～144のいずれか一項記載の細胞。
  145. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の前記阻害が、前記細胞を1つもしくは複数のインヒビター薬物と接触させることを介した阻害を含み、かつ/または遺伝子操作を含む、請求項141～145のいずれか一項記載の細胞。
  146. KCNJ2活性の前記刺激が、前記細胞を1つもしくは複数の活性化薬物と接触させることを含み、かつ/または遺伝子操作を含む、請求項141～146のいずれか一項記載の細胞。
  147. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記低下した発現が遺伝子操作によるものである、請求項141～147のいずれか一項記載の細胞。
  148. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つまたは複数が不活性化される、請求項141～148のいずれか一項記載の細胞。
  149. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の各々が不活性化される、請求項141～149のいずれか一項記載の細胞。
  150. 1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が完全に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項141～140のいずれか一項記載の細胞。
  151. 1つまたは複数のインヒビター薬物および/または遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項141～151のいずれか一項記載の細胞。
  152. 遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも10％～少なくとも1000％または1倍～100倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項141～152のいずれか一項記載の細胞。
  153. 遺伝子操作によって操作されていない対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が遺伝子操作によって完全に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項141～153のいずれか一項記載の細胞。
  154. 前記対照細胞が、野生型心筋細胞、初代心筋細胞、PSCもしくはESC由来のインビトロで分化した心筋細胞、または出発材料である、請求項141～154のいずれか一項記載の細胞。
  155. 前記対照細胞が、PSCまたはESCに由来するインビトロで分化した心筋細胞であり、前記対照細胞、PSC、ESCが、1つ、2つまたは3つの編集を含むが4つ全ては含まず、前記HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が少なくとも部分的に阻害され、KCNJ2活性が少なくとも部分的に刺激される、請求項152～155のいずれか一項記載の細胞。
  156. 遺伝子操作によって操作されていない前記対照細胞と比較して、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性が遺伝子操作によって少なくとも10％または1倍阻害され、KCNJ2活性が少なくとも10％または1倍刺激される、請求項156記載の細胞。
  157. 前記遺伝子操作方法が遺伝子ノックダウンであり、任意で、前記遺伝子ノックダウンが、RNAサイレンシングまたは、siRNA、piRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群より任意で選択されるRNAiによるものである、請求項141～157のいずれか一項記載の細胞。
  158. 前記遺伝子操作方法が遺伝子ノックアウトであり、任意で、前記遺伝子ノックアウトは、遺伝子編集システムを使用して前記遺伝子中に挿入または欠失を誘導することによるものであり、前記遺伝子編集システムは、ZFN、TALEN、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、CRISPR/Casシステム、ニッカーゼシステム、塩基編集システム、プライム編集システム、および遺伝子書き込みシステムからなる群より任意で選択される、請求項141～158のいずれか一項記載の細胞。
  159. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の1つまたは複数の対立遺伝子に導入される、請求項141～159のいずれか一項記載の細胞。
  160. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の両方の対立遺伝子に導入される、請求項141～160のいずれか一項記載の細胞。
  161. HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の前記遺伝子ノックアウトが、HCN4、CACNA1H、またはSLC8A1の低下したタンパク質発現および/または低下した遺伝子発現をもたらす、請求項141～161のいずれか一項記載の細胞。
  162. 前記遺伝子不活性化が、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む、請求項141～162のいずれか一項記載の細胞。
  163. 前記遺伝子不活性化が、RNA誘導型ヌクレアーゼ、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる、請求項163記載の細胞。
  164. 前記RNA誘導型ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼを含む、請求項164記載の細胞。
  165. 前記遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトが、RNAi、アンチセンス、またはRNAを標的とするCasヌクレアーゼを介して行われる、請求項149～165のいずれか一項記載の細胞。
  166. 前記遺伝子不活性化または遺伝子ノックアウトが、CRISPR/Casシステムを使用して行われる、請求項166記載の細胞。
  167. 少なくとも1つの外因性核酸配列をさらに含む、請求項141～167のいずれか一項記載の細胞。
  168. 少なくとも1つの外因性核酸配列からポリペプチドを発現する、請求項168記載の細胞。
  169. 少なくとも1つのさらなる遺伝子の低下した発現をさらに含む、請求項141～169のいずれか一項記載の細胞。
  170. KCNJ2が導入遺伝子から過剰発現される、請求項141～170のいずれか一項記載の細胞。
  171. HCN4またはCACNA1H発現調節配列によって駆動される外因性KCNJ2コード配列を含む、請求項141～171のいずれか一項記載の細胞。
  172. 置き換えられたHCN4またはCACNA1Hコード配列が発現されずかつ置き換えられたKCNJ2が内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列の調節下で発現されるように、KCNJ2コード配列がHCN4またはCACNA1Hのコード配列と置き換わる、請求項141～172のいずれか一項記載の細胞。
  173. 前記KCNJ2コード配列が、CRISPR/Casシステムを使用して置き換えられている、請求項172または173記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  174. HCN4の前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項172～174のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  175. CACNA1Hの前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項172～174のいずれか一項記載のインビトロで分化したヒト心筋細胞。
  176. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子が不活性化され、前記KCNJ2ポリペプチドが過剰発現される、請求項141～173のいずれか一項記載の細胞。
  177. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子が、少なくとも1つの対立遺伝子中にインデルを含む、請求項177記載の細胞。
  178. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1をコードする遺伝子が、2つの対立遺伝子中にインデルを含む、請求項177記載の細胞。
  179. HCN4インデル/インデル、CACNA1Hインデル/インデル、およびSCL8A1インデル/インデル細胞である、請求項179記載の細胞。
  180. 前記インデルが、CRISPR/Casシステムを使用して作成される、請求項178～180のいずれか一項記載の細胞。
  181. KCNJ2ポリペプチドが、導入遺伝子によってコードされ、前記内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列に機能的に連結されている、請求項141～181のいずれか一項記載の細胞。
  182. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子がCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつ前記KCNJ2ポリペプチドが内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される、請求項141～182のいずれか一項記載の細胞。
  183. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記内在性HCN4制御配列に機能的に連結された前記導入遺伝子によってコードされる、請求項183記載の細胞。
  184. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記HCN4遺伝子座において前記内在性HCN4制御配列の調節下で過剰発現される、請求項183記載の細胞。
  185. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子がCRISPR/Casシステムを用いて不活性化され、かつ前記KCNJ2ポリペプチドが内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される、請求項141～185のいずれか一項記載の細胞。
  186. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記内在性CACNA1H制御配列に機能的に連結された導入遺伝子によってコードされる、請求項186記載の細胞。
  187. 前記KCNJ2ポリペプチドが、前記CACNA1H遺伝子座において前記内在性CACNA1H制御配列の調節下で過剰発現される、請求項186記載の細胞。
  188. HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性が、前記細胞を薬物と接触させることによって操作され、HCN4、CACNA1H、SLC8A1、およびKCNJ2の少なくとも1つの活性が遺伝子操作される、請求項121～188のいずれか一項記載の細胞。
  189. 多能性幹細胞からインビトロで分化している、請求項121～189のいずれか一項記載の細胞。
  190. 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC）である、請求項190記載の細胞。
  191. 前記インビトロで分化したヒト心筋細胞が移植される対象に由来するiPSCからインビトロで分化している、請求項121～191のいずれか一項記載の細胞。
  192. 健康な対象に由来するiPSCからインビトロで分化している、請求項121～192のいずれか一項記載の細胞。
  193. 出発材料からインビトロで分化している、請求項121～193のいずれか一項記載の細胞。
  194. 前記出発材料が、ドナーから収集された初代細胞を含む、請求項194記載の細胞。
  195. 前記健康な対象、前記出発材料、および/または前記ドナーの各々が、前記細胞が移植される対象と同じ個体に由来しない、請求項193～195のいずれか一項記載の細胞。
  196. 前記ドナーから収集された前記初代細胞が幹細胞である、請求項196記載の細胞。
  197. 前記幹細胞がESCである、請求項197記載の細胞。
  198. 前記出発材料が幹細胞株である、請求項198記載の細胞。
  199. 前記幹細胞株がESC株またはiPSC株である、請求項199記載の細胞。
  200. 前記幹細胞株がiPSC株である、請求項200記載の細胞。
  201. その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1活性の阻害ならびにKCNJ2活性の刺激を含まない細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を促進する、請求項141～201のいずれか一項記載の細胞。
  202. 凍結保存剤と混合されている、請求項141～202のいずれか一項記載の細胞。
  203. 凍結保存剤と混合されて凍結されている、請求項141～203のいずれか一項記載の細胞。
  204. 前記多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞が、NKX2-5、MYH6、MYL7、TBX5、ATP2a2、RYR2、およびcTnTからなる群より選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、請求項141～204のいずれか一項記載の細胞。
  205. 前記多能性幹細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞の細胞活性および成熟が、電気的成熟度、代謝的成熟度、および収縮的成熟度からなる群より選択される数値パラメータによって決定可能である、請求項141～205のいずれか一項記載の多能性幹細胞。
  206. 前記細胞に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞の代謝的成熟度が、基準レベルと比較した、
    ミトコンドリア機能の増加した活性、増加した脂肪酸代謝、増加した酸素消費速度（OCR）、増加したリン酸化ACCレベルまたは活性、脂肪酸結合タンパク質（FABP）の増加したレベルまたは活性、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ-4（PDK4）の増加したレベルまたは活性、増加したミトコンドリア呼吸能力、増加したミトコンドリア体積、およびミトコンドリアDNAの増加したレベル
    からなる群より選択されるマーカーの1つまたは複数によって決定される、請求項206記載の細胞。
  207. 請求項141～207のいずれか一項記載の細胞を含む細胞バンク。
  208. 請求項141～208のいずれか一項記載の細胞からインビトロで分化した心筋細胞。
  209. 請求項171～208のいずれか一項記載の出発材料細胞からインビトロで分化した心筋細胞。
  210. 請求項1～210のいずれか一項記載のまたは請求項1～210のいずれか一項に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
  211. 細胞外マトリックスまたは足場組成物を含む、請求項211記載の薬学的組成物。
  212. 少なくとも1つの追加の細胞型をさらに含む、請求項211または請求項212記載の薬学的組成物。
  213. 請求項1～213のいずれか一項記載のもしくは請求項1～213のいずれか一項に由来するインビトロで分化したヒト心筋細胞または請求項211～213のいずれか一項記載の薬学的組成物を含む、移植組成物。
  214. 請求項211～214のいずれか一項記載の薬学的組成物または移植組成物を備える、心臓送達装置またはシステム。
  215. 前記薬学的組成物または移植組成物を含むシリンジを備える、請求項215記載の心臓送達装置またはシステム。
  216. 前記薬学的組成物または移植組成物の通過に十分な管腔を備える針を備える、請求項215または請求項216記載の心臓送達装置またはシステム。
  217. 前記針が前記シリンジと流体連通している、請求項215記載の心臓送達装置またはシステム。
  218. 心臓カテーテルをさらに備える、請求項215～218のいずれか一項記載の心臓送達装置。
  219. 薬学的組成物を調製する方法であって、心筋細胞の単離された集団において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の活性を阻害しかつKCNJ2の活性を刺激する工程を含む、前記方法。
  220. 薬学的組成物を調製する方法であって、PSCの集団において、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の活性を阻害しかつKCNJ2の活性を刺激する工程と、PSCの該集団をインビトロで心筋細胞に分化させる工程とを含む、前記方法。
  221. 前記PSCが、請求項73～120のいずれか一項に従って改変される、請求項221記載の方法。
  222. 心筋細胞の前記集団を薬学的に許容される担体と混合する工程をさらに含む、請求項221および222記載の方法。
  223. HCN4、CACNA1H、およびSCL8A1の1つまたは複数が、前記心筋細胞を1つもしくは複数のインヒビター薬物と接触させることによって、および/または遺伝子操作によって阻害される、請求項221～223のいずれか一項記載の方法。
  224. KCNJ2が、前記心筋細胞を1つもしくは複数の活性化薬物と接触させることによって、および/または遺伝子操作によって刺激される、請求項221～224のいずれか一項記載の方法。
  225. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1をコードする遺伝子の1つまたは複数が不活性化される、請求項220～225のいずれか一項記載の方法。
  226. 前記遺伝子不活性化が、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む、請求項226記載の方法。
  227. 前記遺伝子不活性化が、RNA誘導型ヌクレアーゼ、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる、請求項226記載の方法。
  228. 前記RNA誘導型ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼを含む、請求項228記載の方法。
  229. 前記遺伝子不活性化が、RNAi、アンチセンス、またはRNAを標的とするCasヌクレアーゼを介して行われる、請求項226記載の方法。
  230. インビトロで分化した心筋細胞を移植する方法であって、請求項1～210のいずれか一項記載のもしくは請求項1～210のいずれか一項に由来するインビトロで分化した心筋細胞、請求項211～213のいずれか一項記載の薬学的組成物、請求項214記載の移植組成物、または請求項215～219のいずれか一項記載の心臓送達装置もしくはシステムを、その必要がある対象の心臓組織と接触させる工程を含む、前記方法。
  231. インビトロで分化した心筋細胞を移植する方法であって、請求項1～210のいずれか一項記載のもしくは請求項1～210のいずれか一項に由来するインビトロで分化した心筋細胞、請求項211～213のいずれか一項記載の薬学的組成物、請求項214記載の移植組成物、または請求項215～219のいずれか一項記載の心臓送達装置もしくはシステムを、その必要がある対象の心臓組織に送達する工程を含む、前記方法。
  232. 前記移植することが、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の阻害を欠きかつKCNJ2の刺激を欠くインビトロで分化した心筋細胞の移植と比較して、低下した移植不整脈をもたらす、請求項204記載の方法。
  233. その必要がある対象における心臓組織の損傷または機能障害を伴う疾患または障害を処置する方法であって、前記対象の心臓組織を、請求項1～210のいずれか一項記載の細胞、請求項211～213のいずれか一項記載の薬学的組成物、請求項214記載の移植組成物、または請求項215～219のいずれか一項記載の心臓送達装置もしくはシステムと接触させる工程を含む、前記方法。
  234. その必要がある対象における心臓組織の損傷または機能障害を伴う疾患または障害を処置する方法であって、請求項1～210のいずれか一項記載のもしくは請求項1～210のいずれか一項に由来するインビトロで分化した心筋細胞、請求項211～213のいずれか一項記載の薬学的組成物、請求項214記載の移植組成物、または請求項215～219のいずれか一項記載の心臓送達装置もしくはシステムを、その必要がある対象の心臓組織に送達する工程を含む、前記方法。
  235. 前記接触させる工程または送達する工程が、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の阻害を欠きかつKCNJ2の刺激を欠くインビトロで分化した心筋細胞の移植と比較して、低下した移植不整脈をもたらす、請求項234または請求項236記載の方法。
  236. アミオダロンおよびイバブラジンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項220～236のいずれか一項記載の方法。
  237. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のうち2つ以上についてのインヒビターを含む組成物。
  238. インビトロで分化した心筋細胞の集団と混合されている、請求項238記載の組成物。
  239. KCNJ2についてのアクチベータをさらに含む、請求項238または請求項239記載の組成物。
  240. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のそれぞれについてのインヒビターを含む、請求項238～240のいずれか一項記載の組成物。
  241. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のそれぞれについてのインヒビターとKCNJ2についてのアクチベータとを含む、請求項238～241のいずれか一項記載の組成物。
  242. HCN4遺伝子、CACNA1H遺伝子、およびSLC8A1遺伝子の発現が、有害な変異によってまたは挿入によって部分的にまたは完全に不活性化され、かつKCNJ2遺伝子の発現が少なくとも部分的に増加される、単離されたヒト心筋細胞。
  243. 前記不活性化が、HCN4、CACNA1H、および/またはSLC8A1をコードする遺伝子座における核酸配列の挿入または欠失を含む、請求項243記載の単離されたヒト心筋細胞。
  244. 前記不活性化が、RNA誘導型ヌクレアーゼ、RNAi、アンチセンス、TALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を介して行われる、請求項243または請求項244記載の単離されたヒト心筋細胞。
  245. 前記RNA誘導型ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼを含む、請求項243～245のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
  246. 少なくとも1つの外因性核酸配列をさらに含む、請求項243～246のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
  247. ポリペプチドが前記少なくとも1つの外因性核酸配列から発現される、請求項247記載の単離されたヒト心筋細胞。
  248. 少なくとも1つのさらなる遺伝子の低下した発現をさらに含む、請求項243～248のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
  249. KCNJ2が導入遺伝子から過剰発現される、請求項243～249のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
  250. HCN4またはCACNA1H発現調節配列によって駆動される外因性KCNJ2コード配列を含む、請求項243～250のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
  251. 置き換えられたHCN4またはCACNA1Hコード配列が発現されずかつKCNJ2が内在性のHCN4またはCACNA1H制御配列の調節下で発現されるように、KCNJ2コード配列がHCN4またはCACNA1Hのコード配列と置き換わる、請求項243～251のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
  252. 前記KCNJ2コード配列がCRISPR/Casシステムを使用して置き換えられている、請求項251または252のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
  253. HCN4の前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項251～253のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
  254. CACNA1Hの前記コード配列を前記KCNJ2コード配列で置き換えるためにCRISPR/Casシステムが使用される、請求項251～253のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
  255. 前記心筋細胞が多能性幹細胞からインビトロで分化している、請求項243～255のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
  256. 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC）である、請求項256記載の単離されたヒト心筋細胞。
  257. 前記心筋細胞が、前記インビトロで分化したヒト心筋細胞が移植される第2の対象とは異なる第1の対象に由来するiPSCからインビトロで分化している、請求項243～257のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
  258. その必要がある対象の心臓組織に投与したときに、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1遺伝子発現の部分的または完全な不活性化ならびにKCNJ2遺伝子の少なくとも部分的に増加した発現を含まない単離されたヒト心筋細胞を投与された対象と比較して、低下した不整脈を促進する、請求項243～258のいずれか一項記載の単離されたヒト心筋細胞。
  259. その必要がある対象の心臓組織に送達するための、請求項1～210のいずれか一項記載のもしくは請求項1～210のいずれか一項に由来するインビトロで分化した心筋細胞、請求項211～213のいずれか一項記載の薬学的組成物、請求項214記載の移植組成物、または請求項215～219のいずれか一項記載の心臓送達装置もしくはシステムを含む、対象における心臓組織の損傷または機能障害を伴う疾患または障害の処置において使用するための組成物。
  260. 前記組成物の送達が、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1の阻害を欠きかつKCNJ2の刺激を欠くインビトロで分化した心筋細胞の移植と比較して、低下した移植不整脈をもたらす、請求項260記載の使用のための組成物。
  261. 対象における心臓移植不整脈の処置または予防の方法において使用するための、HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のうち2つ以上についてのインヒビターを含む組成物。
  262. インビトロで分化した心筋細胞の集団と混合されている、請求項262記載の使用のための組成物。
  263. KCNJ2アクチベータをさらに含む、請求項262または263記載の使用のための組成物。
  264. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のそれぞれについてのインヒビターを含む、請求項262～264のいずれか一項記載の使用のための組成物。
  265. HCN4、CACNA1H、およびSLC8A1のそれぞれについてのインヒビターとKCNJ2についてのアクチベータとを含む、請求項262～265のいずれか一項記載の使用のための組成物。
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