CN103190392A - 一种角膜中期保存液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种角膜中期保存液及其制备方法。以1000mL计，所述中期保存液的组成如下：低限量基础培养基4～5克，组织培养基1994～5克，低分子右旋糖酐10～20克，硫酸软骨素20～30克，丙酮酸钠100～150毫克，HEPES3～4克，小牛血清20～40毫升，非必需氨基酸10～20毫升，硫酸庆大霉素1～2毫升，碱性成纤维细胞生长因子100～200微升，和余量的双蒸水。本发明具有促进角膜内皮细胞损伤的修复，细胞形态的重建，调节细胞膜表面各种整合素的表达，促进细胞的黏附生长，刺激内皮细胞的增殖等作用，对中期保存角膜有减少细胞凋亡和维持细胞形态及活性的作用。

Description

一种角膜中期保存液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种角膜中期保存液及其制备方法。

背景技术

角膜保存是眼库的重要技术之一，分为活性和非活性保存两种，活性保存根据角膜内皮细胞活性的保存时间分为短期、中期、长期3种保存。短期保存是将全眼球消毒无菌处理后湿房4℃保存24小时。中期保存一般采用角膜片组织营养液4℃保存，目前世界范围内最常使用Dexsol、Optisol和Optisol-GS，保存时间可达14天。长期保存方法有器官培养法和超低温冷冻保存法。1965年，Capella和Kaufman用超低温保存法有效地延长了角膜保存的时间最长至1年，但由于设备复杂，操作麻烦，故难以推广。器官培养法保存角膜用于临床角膜移植一般在保存4周内、最长保存至7周。但由于方法复杂，所需设备昂贵，一般眼库和基层医院难于开展此项工作。

鉴于短期保存的保存时间过于短暂以及长期保存法的不易推广应用，角膜保存液研制的热点集中于中期保存液。目前国际上最常用的Dexsol和Optisol虽然在保持角膜内皮细胞活性方面功能显著，但价格昂贵，不适合我国国情。根据我国角膜供体材料来源严重匮乏，又缺少足够数量的正规眼库，因此，研制理想的新型角膜中期保存液以最大限度的利用有限的供体材料是亟待解决的研究课题。

发明内容

本发明的目的是提供一种角膜中期保存液及其制备方法。

本发明所提供的一种角膜中期保存液，以1000mL计，所述中期保存液的组成如下：

低限量基础培养基 4～5克，组织培养基199 4～5克，

低分子右旋糖酐 10～20克，硫酸软骨素 20～30克，

丙酮酸钠 100～150毫克，HEPES 3～4克，

小牛血清 20～40毫升，非必需氨基酸 10～20毫升，

硫酸庆大霉素 1～2毫升，碱性成纤维细胞生长因子 100～200微升，和

余量的双蒸水。

以1000mL计，所述中期保存液的组成具体可为：

上述的角膜中期保存液中，所述非必需氨基酸具体可为美国生命技术公司提供的商品目录号为11140-050的氨基酸，其组成和配方如表1中所示。

表1非必需氨基酸的组成和配方

上述的角膜中期保存液中，所述低限量基础培养基具体可为美国Invitrogen生命技术公司提供的商品目录号为41500018的基础培养基，其组成和配方如表2中所示。

表2低限量基础培养基的组成和配方

上述的角膜中期保存液中，所述组织培养基199具体可为Sigma公司提供的商品目录号为M0393-10的组织培养基，其组成和配方如表3中所示。

表3组织培养基的组成和配方

上述的角膜中期保存液中，所述中期保存液的pH值可为7.2～7.6，渗透压可为330～390mOsm/Kg，可在2～8℃保存；该角膜中期保存液在温度为4℃保存角膜材料时，保存时间可达14天。

本发明还提供了上述中期保存液的制备方法，包括如下步骤：

（1）将所述低限量基础培养基、基础培养基199、低分子右旋糖酐、硫酸软骨素、丙酮酸钠和HEPES溶于所述双蒸水中，经除菌后得到基础液；

（2）将所述小牛血清、非必需氨基酸、硫酸庆大霉素和碱性成纤维细胞生长因子加入至所述基础液中得到全液，即为所述角膜中期保存液。

本发明提供的角膜中期保存液是一种新型的角膜保存基质，因其含有较高的硫酸软骨素，故其保存的角膜水肿较轻。另外，硫酸软骨素除了高渗作用外，还具有稳定细胞膜的作用。并且，改进的保存液含有Hepes平衡系统，以使保存液PH值更趋稳定。角膜中期保存液中添加碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），具有促进角膜细胞损伤的修复，细胞形态的重建，调节细胞膜表面各种整合素的表达，促进内皮细胞的黏附生长，刺激内皮细胞的增殖等作用，对中期保存角膜有减少细胞凋亡和维持细胞形态及活性的作用。

附图说明

图1为在接种有绿脓杆菌的培养皿中，实施例4中角膜中期保存液培养24h后绿脓杆菌的抑菌环直径，其中A表示本发明的角膜中期保存液，B为庆大溶液。

图2为在接种有金黄色葡萄球菌的培养皿中，实施例4中角膜中期保存液培养24h后金黄色葡萄球菌的抑菌环直径，其中A表示本发明的角膜中期保存液，B为庆大溶液。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的非必需氨基酸为美国生命技术公司提供的商品目录号为11140-050的氨基酸，其组成和配方如表1中所示。

下述实施例中所用的低限量基础培养基为美国Invitrogen生命技术公司提供的商品目录号为41500018的基础培养基，其组成和配方如表2中所示。

表1非必需氨基酸的组成和配方

下述实施例中所用的组织培养基199为Sigma公司提供的商品目录号为M0393-10×1L的组织培养基，其组成和配方如下，单位为g/L：

表3组织培养基的组成和配方

实施例1、角膜中期保存液的配制

以配置1000毫升为例，配方如下：

（1）将上述配比的低限量基础培养基、组织培养基199、低分子右旋糖酐、硫酸软骨素、丙酮酸钠和HEPES缓冲盐溶于950毫升双蒸水中，用过滤器抽滤除菌后，装入无菌容器内，制备成基础液。

（3）将上述配比的小牛血清、非必需氨基酸、硫酸庆大霉素和碱性成纤维细胞生长因子加入到基础液中制成全液，即得角膜中期保存液。

将该角膜中期保存液分装于无菌20毫升玻璃瓶中，密封后在4℃的冰箱储备待用。

实施例2、角膜中期保存液的配制

以配置1000毫升为例，配方如下：

（1）将上述配比的低限量基础培养基、组织培养基199、低分子右旋糖酐、硫酸软骨素、丙酮酸钠和HEPES缓冲盐溶于950毫升双蒸水中，用过滤器抽滤除菌后，装入无菌容器内，制备成基础液。

（2）将上述配比的小牛血清、非必需氨基酸、硫酸庆大霉素和碱性成纤维细胞生长因子加入到基础液中制成全液，即得角膜中期保存液。

将该角膜中期保存液分装于无菌20毫升玻璃瓶中，密封后在4℃的冰箱储备待用。

实施例3、角膜中期保存后的角膜内皮细胞密度及角膜内皮细胞死亡率实验

取来源于北京大学第三医院2010年1月至2011年1月的新鲜人角膜组织（各种原因死亡的捐献者，6小时内取材）共45例，放置于眼库用角膜保存瓶内，每个角膜材料均使用20毫升实施例1制备的角膜中期保存液，封口膜封好瓶口，放于4℃冰箱保存。使用HAI EB—3000xyz型眼库内皮显微镜对角膜材料进行监测，检测时间点分别为0天、3天、7天和14天。分别在各时间点取经穿透性角膜移植剩下的角膜环，使用2.5g/L台盼蓝溶液滴于内皮面，1-2分钟后将染料用生理盐水洗净，再将2g/L茜素红溶液滴于内皮面，染色3分钟，将染料洗净放入3%戊二醛中固定10分钟后，置于光学显微镜下进行内皮细胞检查并照相。每片角膜选取5个视野，每个视野数100个细胞，由此计算内皮细胞死亡率。

检测结果如表4所示。

表4角膜中期保存液保存下不同保存时间角膜内皮细胞密度及内皮细胞死亡率(X±SD)

﹡与对照组比较有显著性统计学差异P<0.05

由表4中的数据可得知，保存时间达到及超过7天，角膜内皮细胞密度有所降低，角膜内皮细胞死亡率升高。在保存14天后，角膜内皮细胞计数为3092±32（个/mm2），角膜内皮细胞死亡率为（9.10±4.4）%表明该角膜中期保存液可使角膜活性的保存达2周以上，存放期间角膜内皮细胞活性稳定，变化较小。

实施例4、角膜中期保存液的抗菌活力检测

实验方法：

1、检测物：A：实施例2中制备的角膜中期保存液；B：庆大霉素溶液（143ug/ml)

2检测项目：金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑制直径（inhibition diameter）mm

3检测内容：

（1）种植培养2天的金黄色葡萄球菌（ATCC6538）和铜绿假单胞菌在胰蛋白胨豆肉汤。

（2）将无菌吸水纸（圆形）分别浸泡在A和B溶液中，然后立即放在培养盘（petridishes）上。

（3）样品在37℃培养24小时，测量抑制直径（mm）。

4检测次数：每种菌种做3个盘子，分别测量后取平均值。

实验结果：

1、培养24h后，铜绿假单胞菌的抑菌环直径（mm）如图1所示，由图1可以看出，其中A为本发明的角膜中期保存液，B为庆大溶液（浓度为143ug/ml）。统计结果显示两组的抑菌环直径的大小无统计学差异。通过此项实验可以表明本发明的角膜中期保存液的抑制铜绿假单胞菌效果可靠。

2、培养24h后，金黄色葡萄球菌的抑菌环直径(mm)如图2所示，由图2可以看出，其中A为本发明的角膜中期保存液，B为庆大溶液（浓度为143ug/ml）。统计结果显示两组的抑菌环直径的大小无统计学差异。通过此项实验可以表明本发明的角膜中期保存液的抑制金黄色葡萄球菌效果可靠。

实施例5角膜中期保存液的临床应用

实验方法：角膜材料在眼库使用角膜中期保存液（实施例1）保存7天以上，行穿透性角膜移植手术，术后3个月、6个月、1年常规复查角膜植片透明度及视力。

实验结果：复查数据来自北京大学第三医院眼科门诊，获得共计29名患者的复查资料。其中，29名患者中共计24名患者视力提高2行以上，术后3个月植片透明率86.2%（25/29），并且在术后6个月和1年的复查中保持此植片透明率。综合以上实验结果，表明本发明提供的角膜中期保存液的有效性和可靠性，且具有价格明显低于国外同类产品的特点。因此，本发明提供的角膜中期保存液具有良好的推广应用价值。

Claims (3)

1.一种角膜中期保存液，其特征在于：以1000mL计，所述中期保存液的组成如下：

低限量基础培养基 4～5克，组织培养基199 4～5克，

低分子右旋糖酐 10～20克，硫酸软骨素 20～30克，

丙酮酸钠 100～150毫克，HEPES 3～4克，

小牛血清 20～40毫升，非必需氨基酸 10～20毫升，

硫酸庆大霉素 1～2毫升，碱性成纤维细胞生长因子 100～200微升，和余量的双蒸水。

2.根据权利要求1所述的中期保存液，其特征在于：所述中期保存液的pH值为7.2～7.6，渗透压为330～390mOsm/Kg。

3.权利要求1或2所述中期保存液的制备方法，包括如下步骤：

（1）将所述低限量基础培养基、组织培养基199、低分子右旋糖酐、硫酸软骨素、丙酮酸钠和HEPES溶于所述双蒸水中，经除菌后得到基础液；

（2）将所述小牛血清、非必需氨基酸、硫酸庆大霉素和碱性成纤维细胞生长因子加入至所述基础液中得到全液，即为所述角膜中期保存液。

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