CN116569916B - 一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用 - Google Patents
一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116569916B CN116569916B CN202310854031.2A CN202310854031A CN116569916B CN 116569916 B CN116569916 B CN 116569916B CN 202310854031 A CN202310854031 A CN 202310854031A CN 116569916 B CN116569916 B CN 116569916B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- cell
- solution
- frozen
- freezing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 25
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical class OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 claims abstract description 9
- FZAQROFXYZPAKI-UHFFFAOYSA-N anthracene-2-sulfonyl chloride Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC(S(=O)(=O)Cl)=CC=C3C=C21 FZAQROFXYZPAKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 128
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 18
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 16
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- ZLWYEPMDOUQDBW-UHFFFAOYSA-N 6-aminonicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=C(N)N=C1 ZLWYEPMDOUQDBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 claims description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 10
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 abstract 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 abstract 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 17
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 10
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 10
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 description 10
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 4
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 4
- 229940093181 glucose injection Drugs 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 3
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 2
- PRRZDZJYSJLDBS-UHFFFAOYSA-N 3-bromo-2-oxopropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CBr PRRZDZJYSJLDBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 6-amino nicotinoyl Chemical group 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000019371 dormancy process Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Abstract
本发明提供了一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用。该冷冻方式包括冻存前的糖酵解抑制剂预处理以及活化肝素预处理过程，该冻存液包括如下组分：DMSO、人血白蛋白、β‑烟酰胺单核苷酸、以及注射用溶媒。本发明所述细胞冷冻保存方式及保存液可以避免程序降温仪的使用，细胞存活率高。预处理过程具有细胞冷冻保护的功能，提高保存效率。整个过程中全部使用注射剂和药用辅料，具有很高的安全性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用。
背景技术
近年来针对各种疾病的细胞疗法取得了重大进展，但依旧存在许多挑战，例如作为常规的货架产品，很多细胞产品需要按批进行长期的低温（-80℃）或深低温（-196℃）储存。而且细胞冻存程序大部分依赖程序降温过程以最大程度降低对长期储存前的细胞损伤。而程序降温设备较高，目前很多商业化产品在开发非程序降温细胞冻存液，但冻存效果仍不及程序降温效果理想。因此，迫切需要一种方便快捷的非程序降温的方法及冻存液来实现细胞产品的冻存。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种细胞冻存液及冻存方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种细胞冷冻保存的方法，包括如下步骤：
步骤1：收获培养的细胞，以富含糖酵解抑制剂的溶液制备细胞悬液孵育，离心收集细胞；
步骤2：将步骤1离心收获的细胞，以富含活化肝素的溶液制备细胞悬液孵育，离心收集细胞；
步骤3：以DPBS或PBS缓冲液重悬清洗步骤2收集的细胞两次后收集细胞，加入细胞冻存液，混匀后置于-86℃超低温条件下过夜，然后转移至液氮中保存即成。
进一步，所述的步骤1中的糖酵解抑制剂为2-脱氧葡萄糖、3-溴丙酮酸或6-氨基烟酰胺中的一种；所述的糖酵解抑制剂在所述的步骤1中的细胞悬液中的浓度为20-50nM；所述的步骤1中的孵育步骤的温度为37℃，时间为10min；所述的步骤1中的离心步骤的离心力为2000 g，时间为5min。
优选地，所述的糖酵解抑制剂为6-氨基烟酰胺。
进一步，所述的步骤2中活化肝素由EDC和NHS交联活化而成；所述的活化肝素在所述的步骤2中的细胞悬液中的浓度为50-200μg/106个细胞；所述的步骤2中的孵育步骤的温度为室温，时间为15min。
所述的活化肝素的制法具体如下：将肝素加入活化EDC（浓度为2 mmol/l）、NHS（浓度为5 mmol/l）、2-(N-morpholino)-乙烷磺酸/NaCl缓冲液室温孵育15 min（常规化学试剂)，然后向反应体系中加入2-巯基乙醇(终浓度20 mmol/l) 以中止反应，然后通过PBS平衡脱盐柱上脱盐即成。
进一步，步骤3中加入细胞冻存液后细胞的浓度为2-20×106细胞/ml。
进一步，所述的步骤3中的细胞冻存液包括如下组分：DMSO 3-10 v/v%，人血白蛋白8-20w/v%，β-烟酰胺单核苷酸 5-10ug/ml，余量为注射用溶媒。
进一步，所述的细胞为干细胞、NK细胞或CIK细胞中的至少一种。
本发明还提供了一种细胞冻存液，该冻存液包括如下组分：
DMSO 3-10v/v%，
人血白蛋白 8-20w/v%，
β-烟酰胺单核苷酸 5-10ug/ml，
余量为注射用溶媒。
进一步，所述的注射用溶媒为复方电解质注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、复方右旋糖酐40注射液或注射用生理盐水中的至少一种；所述的注射用溶媒由复方电解质注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液或复方右旋糖酐40注射液按6：4体积比混合而成。
本发明还提供了一种冻存细胞，其特征在于：该细胞由权利要求1-6中任一项所述的方法冻存而成。
本发明还提供了一种所述的细胞冷冻保存的方法的应用，所述的方法在生物样本库的样本保存、细胞库、细胞药物或类器官保存领域中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明创新性提出细胞预处理方式来实现细胞产品的非程序降温冷冻应用。降低细胞代谢是细胞可以长久冷冻保存的关键环节。而在细胞培养结束后，到细胞置于超低温液氮进入深度休眠过程的操作会造成细胞冻存效果的差异，处理不当会造成细胞的深度损伤，导致细胞活力下降或细胞死亡。
本发明针对细胞冻存过程进行创新型预处理，以最大程度的降低在细胞进入深低温冻存之前的损伤。第一步，降低细胞代谢，糖酵解是进行细胞代谢最重要的途径，因此通过糖酵解抑制剂进行短时处理，可以使细胞快速进入休眠环境。而合适的浓度又不至于产生过多ROS活性氧等物质，从而保护细胞免受过度损伤。第二步，通过活化的肝素对低代谢的细胞进行包裹，活化肝素有抑制体内补体对细胞的杀伤作用，但尚未有报道用于细胞冻存保护。基于这两步预处理，可以使细胞在简单配方中进行非程序降温冻存而保证细胞的高活力。
除此之外，细胞收获后冻存的过程本身也需要细胞的清洗过程，而这两步预处理过程同时也具有细胞洗涤的作用，不会增加过多的复杂操作，具有广泛的可应用性。与常规细胞冻存方法相比，能够更好的满足科研以及临床产品需求。
附图说明
图1为本发明实施例4所述的对照组细胞活率图；
图2为本发明实施例4所述的验证组细胞活率图；
图3为本发明实施例4所述的对照组细胞贴壁再生长图：其中A图为4小时，B图为24小时，C图为48小时；
图4为本发明实施例4所述的验证组细胞贴壁再生长图：其中A图为4小时，B图为24小时，C图为48小时。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
一种细胞冷冻保存的方法，包括如下步骤：
步骤1：收获培养的细胞，以富含糖酵解抑制剂的溶液制备细胞悬液37℃下孵育10min，离心收集细胞，离心力为2000g，离心时间5min；
步骤2：将步骤1离心收获的细胞，以富含活化肝素的溶液制备细胞悬液室温下孵育15min，离心收集细胞；
步骤3：以DPBS或PBS缓冲液重悬清洗步骤2收集的细胞两次后收集细胞，加入细胞冻存液，混匀后置于-86℃超低温条件下过夜，然后转移至液氮中保存即成。
所述的步骤1中的糖酵解抑制剂为2-脱氧葡萄糖、3-溴丙酮酸或6-氨基烟酰胺中的一种；所述的糖酵解抑制剂在所述的步骤1中的细胞悬液中的浓度为20-50nM。
所述步骤2中活化肝素由EDC和NHS交联活化而成；所述的活化肝素在所述的步骤2中的细胞悬液中的浓度为50-200μg/106个细胞。
步骤3中加入细胞冻存液后细胞的浓度为2-20×106细胞/ml。
所述的步骤3中的细胞冻存液包括如下组分：DMSO 3-10v/v%，人血白蛋白8-20w/v%，β-烟酰胺单核苷酸 5-10ug/ml，余量为注射用溶媒。
所述的注射用溶媒为复方电解质注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、复方右旋糖酐40注射液或注射用生理盐水中的至少一种；所述的注射用溶媒由复方电解质注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液或复方右旋糖酐40注射液按6：4体积比混合而成。
下面结合实施例来详细说明本发明。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1：对糖酵解抑制剂的筛选与优化
按照三因素三水平的DOE实验设计对糖酵解抑制剂的种类、浓度、作用时间以及反应条件进行优化，置于37℃糖酵解抑制剂预处理后以PBS洗涤细胞两次，然后加入冻存液进行非程序降温冻存，细胞置于冰箱前细胞置于室温存放30min加速细胞损伤，以细胞活力分析仪检测细胞活性。细胞冻存液成分为DMSO 5%、白蛋白 15%以及勃脉力A：右旋糖酐40按6：4 的混合液体。
表1 实验分组设置
表2 实验结果
SPSS软件分析可知：
K6-AN20=84.03；K6-AN 50=91.50；K6-AN 100= 82.30；极差R6-AN=9.20；
K细胞2=84.57；K细胞10=86.20；K细胞20=87.07；极差R细胞=2.50；
K时间5=84.70；K时间10=89.90；K时间15= 83.23；极差R时间=6.67；
其中：R6-AN＞R时间＞R细胞，糖酵解抑制物浓度对细胞活力保护影响最大，高浓度反而会破会细胞冻存活力，且超过15min会导致细胞活力降低，而细胞浓度在此过程不影响。
最优实验组合为6-氨基烟酰50 nM，作用时间10min，细胞浓度为10×106。
实施例2：冻存液按照预处理条件的筛选与优化
按照三因素三水平的DOE实验设计对活化肝素的浓度、作用时间以及细胞浓度三个条件进行优化，活化肝素预处理后以PBS洗涤两次细胞，加入冻存液进行非程序降温冻存，细胞置于冰箱前细胞置于室温存放30min加速细胞损伤，然后细胞置于-80℃冰箱过夜，置于-196℃液氮，冻存一周后以细胞活力分析仪检测细胞活性。对干细胞进行非程序降温冻存，细胞冻存液成分为DMSO 5%、白蛋白 15%以及勃脉力A：右旋糖酐40按6：4 的混合液体。
表3 DOE实验条件设计
表4 实验分组情况
SPSS软件分析可知：
K肝素50=91.23；K肝素100=92.70；K肝素200=90.43；极差R肝素=2.27；
K细胞2=92.30；K细胞10=90.57；K细胞20=91.50；极差R细胞=1.73；
K时间5=92.50；K时间15=94.77；K时间30= 87.10；极差R时间=7.67；
其中：R时间＞R肝素＞R细胞，长时间作用对细胞保护作用降低，而细胞浓度对细胞最终活力影响最低，活化肝素浓度升高对细胞保护作用降低。
最优组合为活化肝素浓度为50ng/ml，作用时间15min，细胞浓度为10×106。
实施例3：对冻存液组分进行筛选剂的筛选与优化
按四因素三水平的DOE实验设计对DMSO的浓度、白蛋白浓度以及β-烟酰胺单核苷酸以及溶媒四个组分条件进行优化，正常培养收获细胞后，加入冻存液进行非程序降温冻存，细胞浓度为5×106ml细胞置于冰箱前细胞置于室温存放30min加速细胞损伤，然后细胞置于-80℃冰箱过夜，置于-196℃液氮，冻存1周后以细胞活力分析仪检测细胞活性。对干细胞进行非程序降温冻存，冻存液为组分按照以下实验分组。
表5 DOE实验条件设计
表6 实验分组情况
SPSS软件分析可知：
KDMSO5=94.90；KDMSO5=94.37；KDMSO10=95.10；极差RDMSO=0.73；
K白蛋白5=92.30；K白蛋白10=90.57；K白蛋白20=91.50；极差R白蛋白=1.93；
KNMN5=96.50；KNMN10=95.77；KNMN20= 92.10；极差RNMN=4.4；
K溶媒1=96.50；K溶媒2=95.77；K溶媒3= 92.10；极差溶媒=0.4；
其中：RNMN＞R白蛋白＞RDMSO＞R溶媒， NMN浓度对细胞冻存活力影响最大，低浓度有保护作用，高浓度会导致细胞损伤。白蛋白含量对细胞活力影响次之；其中溶媒对细胞活力影响基本没有，因此可以考虑实验所用溶媒配比或独立使用。
最优组合为DMSO体积分数5%；白蛋白体积分数5%；NMN 5ug/ml，以复方电解质溶液做溶媒。
实施例4：发明方法的组合验证
以实施例1-实施例3筛选最优条件进行发明内容冻存。以商品A（南京三生，亘诺，YB090050）冻存液以及非预处理为对照。收获新鲜培养的间充质干细胞，离心收集细胞后，以6-氨基烟酰含量为 50 nM PBS缓冲液重悬细胞，37℃下孵育10min， 2000g离5min收集细胞；以50ng/ml活化肝素的缓冲液悬液室温下孵育15min，离心收集细胞，以PBS清洗细胞一次；加入细胞冻存液，混匀后置于-86℃超低温条件下过夜，转移至液氮中保存即成，7天后，常规复苏，检测细胞活率。对照组按照产品使用说明书收获细胞后以PBS清洗三次，程序降温冻存。7天后常规复苏，检测细胞活率和细胞贴壁再生长情况（4，24，48h）。重复三组实验，实验结果如下表所示。
表7 实验结果
结果表明：
如表7所示，采用本简化方案的细胞冻存保护方案，细胞复苏后活率高（如图1-图2所示）；细胞再接种后，贴别率高，且24-48h仍保持一定的增殖速度，呈典型的间充质干细胞生长特性（如图3-图4所示）。
综上结果表明，本发明所述的方案具有显著的细胞冻存效果。
Claims (4)
1.一种细胞冷冻保存的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：收获培养的细胞，以富含糖酵解抑制剂的溶液制备细胞悬液孵育，离心收集细胞；
步骤2：将步骤1离心收获的细胞，以富含活化肝素的溶液制备细胞悬液孵育，离心收集细胞；
步骤3：以DPBS或PBS缓冲液重悬清洗步骤2收集的细胞两次后收集细胞，加入细胞冻存液，混匀后置于-86℃超低温条件下过夜，然后转移至液氮中保存即成；
所述的步骤1中的糖酵解抑制剂为6-氨基烟酰胺；所述的糖酵解抑制剂在所述的步骤1中的细胞悬液中的浓度为20-50nM；
所述的步骤2中活化肝素由EDC和NHS交联活化而成；所述的活化肝素在所述的步骤2中的细胞悬液中的浓度为50-200μg/106个细胞；
所述的步骤1中的孵育步骤的温度为37℃，时间为5-10min；
所述的步骤2中的孵育步骤的温度为室温，时间为10-15min；
所述的步骤3中的细胞冻存液包括如下组分：DMSO 3-10 v/v%，人血白蛋白8-20w/v%，β-烟酰胺单核苷酸 5-10ug/ml，余量为注射用溶媒。
2.根据权利要求1所述的冷冻保存的方法，其特征在于：所述的步骤1中的离心步骤的离心力为2000g，时间为5min。
3.根据权利要求1所述的冷冻保存的方法，其特征在于：步骤3中加入细胞冻存液后细胞的浓度为2-20×106细胞/ml。
4.根据权利要求1所述的冷冻保存的方法，其特征在于：所述的细胞为干细胞、NK细胞或CIK细胞中的至少一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310854031.2A CN116569916B (zh) | 2023-07-13 | 一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310854031.2A CN116569916B (zh) | 2023-07-13 | 一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116569916A CN116569916A (zh) | 2023-08-11 |
| CN116569916B true CN116569916B (zh) | 2023-11-28 |
Family
ID=
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005281258A (ja) * | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Tokkusu Kk | 動物細胞及び臓器の保存液及び保存方法 |
| CN102038976A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-05-04 | 浙江大学 | 负载rhGM-CSF的组织工程皮肤真皮替代物再生材料及其制备方法 |
| CN102578078A (zh) * | 2012-02-02 | 2012-07-18 | 温州医学院附属第二医院 | 一种神经细胞的冻存液及冻存方法 |
| CN103827293A (zh) * | 2011-06-29 | 2014-05-28 | 通用医疗公司 | 用于增强雌性生殖细胞中生物能状态的组合物和方法 |
| CN105230604A (zh) * | 2015-09-21 | 2016-01-13 | 深圳华毓造血干细胞研究有限公司 | 骨髓间充质干细胞保存液及其应用 |
| CN106982821A (zh) * | 2017-05-22 | 2017-07-28 | 安徽瑞杰赛尔生物科技有限公司 | 脐带间充质干细胞临床冻存保护液组合物及其用途 |
| CN109744227A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-05-14 | 广州益养生物科技有限公司 | 一种细胞冻存液及其应用 |
| CN112245662A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-22 | 中山大学附属第五医院 | 一种Hep-HA复合多孔材料的制备方法及其在构建根管内置支架中的应用 |
| CN114540283A (zh) * | 2022-01-27 | 2022-05-27 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 用于牛体外胚胎生产的高效玻璃化冷冻方法 |
| CN114945667A (zh) * | 2020-01-10 | 2022-08-26 | Sio2医药产品公司 | 核酸和细胞保存剂组合物以及使用方法 |
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005281258A (ja) * | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Tokkusu Kk | 動物細胞及び臓器の保存液及び保存方法 |
| CN102038976A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-05-04 | 浙江大学 | 负载rhGM-CSF的组织工程皮肤真皮替代物再生材料及其制备方法 |
| CN103827293A (zh) * | 2011-06-29 | 2014-05-28 | 通用医疗公司 | 用于增强雌性生殖细胞中生物能状态的组合物和方法 |
| CN102578078A (zh) * | 2012-02-02 | 2012-07-18 | 温州医学院附属第二医院 | 一种神经细胞的冻存液及冻存方法 |
| CN105230604A (zh) * | 2015-09-21 | 2016-01-13 | 深圳华毓造血干细胞研究有限公司 | 骨髓间充质干细胞保存液及其应用 |
| CN106982821A (zh) * | 2017-05-22 | 2017-07-28 | 安徽瑞杰赛尔生物科技有限公司 | 脐带间充质干细胞临床冻存保护液组合物及其用途 |
| CN109744227A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-05-14 | 广州益养生物科技有限公司 | 一种细胞冻存液及其应用 |
| CN114945667A (zh) * | 2020-01-10 | 2022-08-26 | Sio2医药产品公司 | 核酸和细胞保存剂组合物以及使用方法 |
| CN112245662A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-22 | 中山大学附属第五医院 | 一种Hep-HA复合多孔材料的制备方法及其在构建根管内置支架中的应用 |
| CN114540283A (zh) * | 2022-01-27 | 2022-05-27 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 用于牛体外胚胎生产的高效玻璃化冷冻方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Iloprost液4℃保存兔胎脑皮层组织的细胞存活率及腺苷磷酸酯的含量变化";刘海鹏 等;《第三军医大学学报》;第第18卷第5期卷(第第5期期);第406-408页 * |
| 结合转化生长因子β1的肝素化胶原/壳聚糖支架复合脂肪干细胞修复兔关节软骨缺损;韩宁波;赵建宁;张勇;何劼;卢翔;王金良;郭亭;;中国组织工程研究与临床康复(第34期);全文 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NAYLER et al. | A protective effect of verapamil on hypoxic heart muscle | |
| RU2396748C2 (ru) | Среда для хранения клеток | |
| US8198085B2 (en) | Somatic cells for use in cell therapy | |
| CN103210903B (zh) | 一种用于保存cik细胞的冻存液及其应用 | |
| CN104938477A (zh) | 一种cik细胞冻存液及冻存方法 | |
| CN111602648B (zh) | 一种免疫细胞无血清冻存液及冻存方法 | |
| CN112167240A (zh) | 临床级细胞冷藏保存液及其制备方法和应用 | |
| Skiles et al. | Quantitative analysis of composite umbilical cord tissue health using a standardized explant approach and an assay of metabolic activity | |
| CN116569916B (zh) | 一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用 | |
| CN108029679B (zh) | 一种用于冻存单个核细胞的冻存液 | |
| CN116569916A (zh) | 一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用 | |
| CN112167241A (zh) | 干细胞冻存液及干细胞冻存和复苏方法 | |
| CN114250196A (zh) | 一种外泌体扩增及保存方法 | |
| CN116569917B (zh) | 一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用 | |
| CN112056309A (zh) | 一种细胞保存液及其在保存脐血nk细胞中的应用 | |
| Pope et al. | Effect of umbilical cord blood prefreeze variables on postthaw viability | |
| CN107711823A (zh) | 一种常温保存的细胞冻存液及其应用 | |
| Araújo et al. | Non‐cryopreserved peripheral blood stem cells as a safe and effective alternative for autologous transplantation in multiple myeloma | |
| Atkins | Preservation of Viable Leucocytes in Glycerol at− 80° C. | |
| Lionetti et al. | Factors affecting the stability of cryogenically preserved granulocytes | |
| CN110115265A (zh) | 一种胚胎玻璃化冷冻液 | |
| CN112219838B (zh) | 外周血单个核细胞的冻存方法 | |
| CN115005199A (zh) | 一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用 | |
| CN115053891A (zh) | 一种细胞冻存液及实施方法 | |
| Kuriyama et al. | Sensitivity of CryopreservedLavandula veraCells to Ammonium Ion |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |