WO2018189877A1 - 荷電粒子線装置および細胞評価方法 - Google Patents

荷電粒子線装置および細胞評価方法 Download PDF

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WO2018189877A1
WO2018189877A1 PCT/JP2017/015230 JP2017015230W WO2018189877A1 WO 2018189877 A1 WO2018189877 A1 WO 2018189877A1 JP 2017015230 W JP2017015230 W JP 2017015230W WO 2018189877 A1 WO2018189877 A1 WO 2018189877A1
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cell
feature amount
charged particle
particle beam
platelets
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PCT/JP2017/015230
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昭朗 池内
川俣　茂
大海 三瀬
朗 澤口
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/60—Analysis of geometric attributes
    • G06T7/62—Analysis of geometric attributes of area, perimeter, diameter or volume
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    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
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    • H—ELECTRICITY
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    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J2237/00—Discharge tubes exposing object to beam, e.g. for analysis treatment, etching, imaging
    • H01J2237/22—Treatment of data
    • H01J2237/221—Image processing

Definitions

  • the present invention relates to a charged particle beam apparatus, a cell evaluation method using the same, and a program thereof.
  • charged particle beam devices use charged particle beams such as electron beams and ion beams with wavelengths shorter than that of light, so they cannot be observed with an optical microscope, and have a size on the order of several nanometers to hundreds of nanometers. There is an advantage that a microstructure can be observed.
  • Patent Document 1 differentiated cells induced from undifferentiated cells and the products of the differentiated cells were observed with a transmission electron microscope, and the cells were evaluated by confirming the internal structure unique to the desired differentiated cells.
  • An example is disclosed.
  • Patent Document 2 a plurality of cells having nuclei are extracted from a captured image obtained by imaging a sample including target cells with an optical microscope, and feature quantities relating to the size of at least one of the cells and nuclei are calculated from the images.
  • An image processing apparatus that determines whether a cell extracted using a threshold value is a desired cell is disclosed.
  • Patent Document 1 an image of a differentiated cell is taken with a transmission electron microscope in order to determine that the differentiation-induced cell is a desired cell, and the internal structure unique to the desired cell has an appropriate distribution inside the cell. It was judged by the eyes of an expert with knowledge of cell morphology whether or not it exists in proportion. Such visual inspections judged by human eyes are not objective in terms of quality assurance, and when the number of inspections increases, an enormous amount of inspection time is required.
  • Patent Document 2 with respect to the problem of objectivity and inspection time in such visual inspection, a plurality of cells having nuclei are extracted from an image obtained by imaging a sample including target cells with an optical microscope. A feature quantity related to the size of at least one is calculated from the image, and it is determined whether or not the extracted cell is a desired cell using a threshold value.
  • the target cell is determined using a nucleus of several micrometers in size as a clue, the internal structure unique to the desired cell is microfilament (about 6 nanometers), ribosome ( In the case of cytoplasmic microstructures such as about 20 nanometers) and secretory granules (several tens to hundreds of nanometers), the microstructure cannot be imaged due to the resolution limit of the optical microscope, and judgment may not be performed. there were.
  • An object of the present invention is to solve the above-described problems, to calculate the characteristics of cells from an observation image of the cells more objectively and with high accuracy, and to perform evaluation of the cells, and to use the charged particle beam device A cell evaluation method and a program therefor.
  • an acquisition unit that acquires an image of a cell, and a determination unit that determines the quality and / or functionality of the cell based on a feature amount in the acquired image
  • a charged particle beam apparatus having a configuration comprising:
  • a cell evaluation method using an image processing device wherein the image processing device generates a cross-sectional image of a cell based on a signal detected by a detector of a charged particle beam device.
  • a cell evaluation method for determining whether a cell is good and / or functional based on the acquired feature amount in the acquired cross-sectional image is provided.
  • a cell evaluation program executed by an image processing device is used to acquire a cross-sectional image of a cell based on a signal detected by a detector of a charged particle beam device.
  • a cell evaluation program for causing an image processing apparatus to function so as to determine the quality and / or functionality of a cell based on a feature amount in an acquired cross-sectional image is provided.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an example of a system configuration of a charged particle beam apparatus according to Embodiment 1.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a flowchart of contour extraction processing with the configuration according to the first embodiment. The figure which shows the correspondence of the outline data linked
  • FIG. The figure for demonstrating the definition of the expansion degree of an open small tube system based on Example 1.
  • FIG. FIG. 3 is a flowchart illustrating a configuration determination process according to the first embodiment.
  • the charged particle beam apparatus of the present invention is not limited to the scanning electron microscope.
  • the observation range on the sample from which the observation image is acquired by the charged particle beam device is set as the visual field range, while the charged particle beam Any device may be used as long as it can irradiate the observation range on the sample corresponding to the visual field range with the apparatus to acquire the observation image of the sample.
  • a scanning ion microscope, a scanning transmission electron microscope, a transmission electron microscope, and the like an apparatus for analyzing and inspecting them using a combined device of a sample processing device and a sample processing device.
  • platelets will be described as examples of cells to be evaluated as differentiated cells derived from pluripotent stem cells (undifferentiated cells) such as iPS cells and ES cells. It is not limited to platelets.
  • the differentiated cell that is the cell to be evaluated according to the present invention may be any cell that can evaluate the quality and / or functionality of the cell based on the morphology of the cell and / or the characteristics of the internal structure. And also include cells of the cornea, retina, bone, cartilage, muscle, kidney, and the like, and cardiac muscle cells, insulin-producing cells, stem cells, hematopoietic stem cells.
  • platelets are produced by mature megakaryocytes after hematopoietic stem cells have differentiated into megakaryocytes. That is, white blood cells, red blood cells, and platelets are produced by differentiation of hematopoietic stem cells. That is, pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells that are undifferentiated cells are differentiated into various stem cells such as hematopoietic stem cells and neural stem cells that are undifferentiated cells, and then platelets, erythrocytes, leukocytes, which are differentiated cells, Differentiate into various cells such as cardiomyocytes, insulin-producing cells, corneal cells, retinal cells, bone cells, chondrocytes, muscle cells, and kidney cells.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of an example of a scanning electron microscope that is a charged particle beam apparatus according to the first embodiment.
  • the scanning electron microscope 1 has a microscope apparatus body 4 in which a lens barrel 2 and a sample chamber 3 are integrated, and a control device 5 that controls each part in the scanning electron microscope apparatus body.
  • the lens barrel 2 is provided with an electron gun 7 that emits an electron beam 6 and an electron optical system 8 that controls irradiation of the electron beam 6.
  • the electron optical system 8 focuses the electron beam 6 so that the condenser lens 9 that focuses the electron beam 6 emitted from the electron gun 7, the deflector 10 that scans the electron beam 6, and the surface of the sample 12 are in focus. Objective lens 11 to be moved.
  • a detector 14 for detecting a signal 13 such as reflected electrons or secondary electrons generated when the sample 12 is irradiated with the electron beam 6 is also provided.
  • the sample chamber 3 is configured to accommodate the sample 12 through an inlet / outlet port (not shown) that can be opened and closed, and the sample 12 is provided with a sample stage 15.
  • the sample stage 15 moves the sample 12 in the sample chamber 3, for example, by moving the sample 12 in a horizontal plane and in a direction perpendicular to the surface, rotating or tilting the sample 12, and displacing the position and orientation of the sample 12 in the sample chamber 3.
  • a mechanism 16 is provided.
  • the sample moving mechanism 16 and the electron optical system 8 are controlled by the control device 5, the electron beam 6 is irradiated to an arbitrary position of the sample 12, and the generated signal 13 is detected by the detector 14.
  • the magnification may be the width of the field of view (Field Of View: FOV), or the length (pixel size) indicated by one pixel in the case of a digital image.
  • the image processing device 17 includes an image acquisition unit 18 that converts a signal such as reflected electrons obtained by the detector 14 into observation image data (hereinafter referred to as electron microscope image data), a contour extraction unit 19, and a feature amount calculation. Unit 20, determination unit 21, and evaluation classification model storage unit 22.
  • the evaluation classification model storage unit 22 includes not only the evaluation classification model but also electron microscopic image data acquired by the image acquisition unit 18, contour data extracted by the contour extraction unit 19, and feature amounts calculated by the feature amount calculation unit 20. It can be configured by a storage unit capable of storing data and the like.
  • Electron microscopic image data is read from the image acquisition unit 18 to the contour extraction unit 19 and subjected to region division (segmentation) processing by image processing.
  • Contour extraction is first performed on the contours of individual platelets included in the electron microscope image data.
  • the contour (polygon) data of the individual platelet outline is calculated from the electron microscope image data.
  • contour data of internal structures such as secretory granules contained in platelets and organelles such as open canal system (OCS) is performed by performing contour extraction again on the internal region of each platelet. Is calculated.
  • OCS open canal system
  • the feature amount calculation unit 20 assigns IDs to the individual platelets calculated by the contour extraction unit 19, and outlines associated with unique platelet IDs, organelles contained in platelets such as secretory granules, open tubules, and the like.
  • the characteristic amount data such as the distribution, area ratio, and expansion of the secretory granules and open tubules are calculated.
  • the feature amount calculation process executed by the feature amount calculator 20 and details of each feature amount will be described later.
  • the length of the maximum line segment that connects two points on the outer periphery of the contour indicated by the contour data of the platelet and passes through the center of gravity of the contour is defined as a diameter.
  • the length of the minimum line segment that connects two points on the outer periphery of the contour indicated by the contour data and passes through the center of gravity of the contour may be defined as the minimum diameter, or two points on the outer periphery of the contour indicated by the contour data may be defined as It is also possible to measure the length of the line segment that passes through the center of gravity of the contour in a range of 360 degrees in arbitrary angular increments, and define the average value as the average diameter.
  • the maximum diameter the smallest rectangle surrounding the entire contour indicated by the contour data is calculated, and the length of the long side of this rectangle is defined as the maximum diameter.
  • the diameter is calculated using the center of gravity of the contour, but when the center of gravity is outside the contour, effective measurement values may not be obtained, so when obtaining size information of an open tubule system Can more accurately quantify the degree of expansion of the open tubule system by using the maximum diameter using the circumscribed rectangle (the smallest rectangle that encloses the entire contour).
  • the determination unit 21 determines the quality and / or functionality of the platelets by evaluating each feature amount data associated with each platelet ID according to the evaluation classification model stored in the evaluation classification model storage unit 22.
  • Information such as the evaluation classification model used in the determination unit 21 and the determination value and determination reference value used in the evaluation can be edited by the user via the input unit 23, and the determination result and evaluation classification model information are displayed. It is displayed to the user via the unit 24. Details of the evaluation classification model used in the determination unit 21 and details of the determination method will be described later. Further, the display unit 24 displays statistical information of the evaluation results of each platelet and / or the determination result of all platelets evaluated by the determination unit 21.
  • control apparatus 5 the image processing apparatus 17, the input part 23, the display part 24, etc. using a personal computer (PC).
  • the control device 5 and the image processing device 17 can be realized by executing a program of a central processing unit (CPU) of the PC, and the operation program and the evaluation classification model described above are stored in the storage unit of the PC.
  • Various types of data can be stored.
  • the user images platelets and selects an evaluation classification model suitable for the purpose of evaluation, so that the quality and / or functionality of the platelets included in the captured image can be objectively increased. Evaluation can be performed with high accuracy, and platelets can be evaluated regardless of whether the user has expertise in cell morphology.
  • step S101 electron microscopic image data is read as a captured image (step S101).
  • image noise removal processing is performed for the purpose of improving the accuracy of contour extraction (step S102).
  • image processing technique such as a median filter, a Gaussian filter, a deconvolution filter, or the like
  • filter processing for improving the accuracy of binarization processing for edge extraction and edge detection processing described later is performed.
  • the noise removal process may be omitted.
  • the contour extraction target and the background image are separated by binarizing the electron microscope image data after the noise removal processing (step S103).
  • binarization is performed using well-known image processing and image recognition techniques such as Otsu's binarization and p-tile method.
  • segmentation region division of the electron microscope image data after binarization is performed, and the binarized region is divided into individual platelet regions (step S104).
  • the image may be captured in a state where the platelets are adjacent or in contact with each other, and a large number of platelet aggregates may be erroneously recognized as one platelet only by the binarization process described above. Therefore, it is necessary to separate individual platelets from the aforementioned platelet aggregate by a segmentation process.
  • segmentation processing is performed by using well-known image processing and image recognition techniques such as Watershed method and pattern matching, and machine learning such as Deep Learning to divide into individual platelet contour data. .
  • the contour data corresponding to each platelet is stored in step S105.
  • the individual platelets included in the electron microscopic image data are associated with the contour data that is the shape data of the platelet contour.
  • the above is an example of processing when the contour extraction unit extracts the contour of individual platelets.
  • the contour extraction unit extracts the contour of individual platelets.
  • the contour data of the organelles contained within the platelets such as secretory granules and open tubule systems, are calculated and stored.
  • the calculation of the contour data of the internal structure such as the organelle is performed by repeatedly applying the above-described steps S103 to S105, which is the contour extraction process, to the region inside the contour data of the already calculated platelet contour. Do it.
  • the threshold value is set so that only the open tubule system can separate the binarization condition, thereby collecting the contour data of all the open tubule systems included in the platelets. .
  • the contour data of the darkly dyed region can be collected.
  • FIG. 3 schematically shows the detected platelets 31 and 32, the open tubule systems 33, 34 and 35 therein, the darkly stained region 36, and the corresponding identifier (ID).
  • the collected outline data of the open tubule system is stored in association with the platelet ID to which the open tubule system belongs, as shown in FIG. 3, and an ID is also assigned to each open tubule system.
  • an ID is also assigned to each open tubule system.
  • ⁇ granules that are platelet-specific organelles, dense granules, secretory granules such as glycogen granules contained in platelets, and mitochondria are collectively defined as a densely stained region, and contour data is defined.
  • contour data of the open tubule system which is also an organelle unique to platelets, is calculated and stored.
  • three contour data of the platelet contour, the deeply dyed region inside the platelet, and the open tubule system are calculated and stored, and the feature amount calculation unit 20 calculates each feature amount.
  • the outline extraction target it is not necessary to limit the outline extraction target to the outline of the platelet, the deeply stained area, and the open tubule system in order to evaluate the platelets.
  • Other organelles such as dark tubule systems and microtubules contained in platelets may be set as contour extraction targets.
  • other cytoplasms, inclusion bodies, or sub-characters that correlate with quality and / or functionality and quality of platelets may be set as contour extraction targets.
  • ⁇ Feature amount calculation unit> When acquiring electron microscope image data with the configuration shown in FIG. 1, magnification data including the width of the field of view (FOV) or the length (pixel size) shown per pixel when converted into a digital image is acquired. Therefore, it is possible to quantify the morphological features of the contour extraction target using the contour data calculated and stored by the contour extraction unit 19. For example, when the contour extraction target is a platelet outline, information regarding the size, such as the area, diameter, maximum diameter, minimum diameter, and peripheral length of the platelet outline can be calculated as the feature amount.
  • an example of observing a platelet sample using the scanning electron microscope 1 is shown.
  • a method in which a cell sample is embedded in a resin, a section sample is prepared by slicing the resin into sections of several micrometers thickness, and the section of the section sample is observed Is common. Therefore, for example, the diameter of the cross-sectional image of the platelets seen in the cross-section of the section sample is expected to be different from the true diameter of the platelets. Improvement is not expected.
  • the feature complexity that can be used to evaluate the quality and / or functionality of the platelet also from the cross-sectional image of the platelet slice sample is used. Then, the area ratio and degree of expansion of the open tubule system and the area ratio of the deeply dyed region are calculated and stored as feature amount data. All feature amount data is stored in association with individual platelet IDs as described above. Details of each feature amount will be described below.
  • Morphological complexity is a feature amount indicating the roundness of the outer shape of the platelet. It is known that platelets take the shape of a disc like a meteorite in blood. As described above, since a platelet sample is prepared by slicing a resin in which platelets are embedded, the observed platelet cross section is expected to be circular or elliptical. In addition, it is known that when platelets are activated by an external stimulus, they produce long protrusions that are entangled with each other to form aggregates (thrombi). Therefore, it can be determined that platelets that have lost their roundness and have a complicated morphology are in an activated state. As a medical platelet preparation, it is desirable that platelets are not activated.
  • the feature quantity calculation unit 20 calculates “morphological complexity” by the following equation (1).
  • (Morphological complexity) (perimeter) 2 / (area) (1)
  • the morphological complexity is calculated by the equation (1).
  • the morphological complexity only needs to be able to quantitatively express the roundness and complexity of the platelets. For example, circularity or roundness may be used.
  • the morphological complexity may be calculated by combining the perimeter, area, diameter, or the center of gravity of platelets.
  • OCS area ratio is a feature amount indicating the ratio of the open tubule system to the inside of platelets. It is known that the life span of platelets collected from human blood is about 4 days, and platelets near the end of their life tend to increase the area of the open tubule system. Therefore, by calculating the OCS area ratio, the degree of increase in the open tubule system can be calculated, and it can be estimated whether the platelets are near the end of their lifetime.
  • the feature amount calculation unit 20 calculates “OCS area ratio” by the following equation (2).
  • OCS area ratio (total area of open tubule system) / (platelet area) (2) Open tube system expansion (OCS expansion)
  • OCS expansion degree is a feature amount indicating the degree of expansion of an open tubule system that is elongated and elongated among the open tubule systems inside the platelet as shown in FIG. Even in the case where the area ratio of the open tubule system is low, the platelet 41 has an elongated tubule 42 and other open tubule system 43, and the maximum diameter of the elongated tubule 42 is elongated.
  • the present inventors have shown that there is a high possibility that the hemostatic ability of platelets is remarkably reduced when the maximum diameter of the platelet exceeds 50% of the maximum diameter of the platelet. Therefore, platelets with low hemostatic ability can be selected by calculating the OCS expansion degree. In addition, this hemostatic ability has shown the magnitude
  • the feature amount calculation unit 20 calculates the “OCS expansion degree” by the following equation (3).
  • (OCS expansion) (maximum diameter of open tubule system) / (platelet diameter) (3)
  • the “maximum diameter of the open tubule system” uses the maximum value of the maximum diameters of all the open tubule systems in the platelets.
  • the OCS expansion degree is calculated by the equation (3).
  • the OCS expansion degree only needs to be able to quantitatively express the expansion degree of the open tubule system inside the platelet.
  • the OCS expansion degree is changed to “platelet diameter”. “Maximum diameter of platelets” may be replaced with “maximum diameter of open tubule system” or “maximum diameter of open tubule system”.
  • the formula is not limited to formula (3).
  • Area ratio of deeply dyed area area ratio of darkly dyed area
  • “Densely dyed area ratio” is a feature amount indicating the ratio of the darkly dyed area to the inside of platelets.
  • the deeply stained region contains chemical substances (secretory substances) that are closely related to the hemostatic mechanism of platelets such as ⁇ granules and darkly stained granules. Therefore, it can be estimated that the platelets have a low hemostatic ability if the area ratio of the deeply stained region shows a low value such as 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%.
  • the feature amount calculation unit 20 calculates the “dark dye area ratio” by the following equation (4).
  • (Dense area area ratio) (Total area of dark area) / (Platelet area) (4)
  • (Dense area area ratio) (Total area of dark area) / (Platelet area) (4)
  • the components of the deeply stained area defined for the evaluation of platelets need not be limited to ⁇ granules, darkly stained granules, glycogen granules, and mitochondria, but at least one or more secretions related to the hemostatic mechanism. It only needs to include the cell tubule system.
  • cytoplasm, inclusion bodies, or sub-traits that correlate with the quality and / or functionality and quality of platelets may be defined instead of the deeply stained region, and the area ratio may be calculated.
  • ⁇ Determining unit> As an example of the operation of the determination unit 21 in this embodiment, the quality of platelets and / or the functionality of platelets is evaluated using the evaluation classification model stored in the evaluation classification model storage unit 22 based on the feature data using FIG. An operation example in the case of evaluation will be described.
  • FIG. 5 is a flowchart showing the operation of the determination unit 21 in the configuration of the present embodiment. This operation can also be realized by program execution.
  • the feature quantity data calculated and stored is read (step S201).
  • the feature amount data is a set of each feature amount data associated with the platelet ID as shown in the feature amount data table 61 of FIG.
  • the feature amount data storage format is not limited as long as the feature amount data is stored in a form linked to individual platelet IDs. It does not specify an item.
  • the item of feature amount data is calculated by the feature amount calculation unit 20 such as the above-described morphological complexity, OCS area ratio, OCS expansion degree, deeply dyed area ratio, and feature amounts related to size such as area and perimeter. It is only necessary to include at least one or more pieces of information such as the feature amount and / or the average value, the total value, the maximum value, the minimum value, and the statistic amount of the feature amount.
  • the evaluation classification model means a model that classifies the quality of platelets and / or the presence or absence of functionality based on the feature data calculated by the feature calculator 20.
  • the evaluation classification model storage unit 22 records reference values and classification conditions for each feature quantity, and each platelet is evaluated according to the classification conditions of the evaluation classification model (step S203).
  • the platelet evaluation results are stored in a form associated with each platelet ID (step S204), and the evaluation results are displayed to the user via the display unit 24 (step S205).
  • This allows the user to confirm platelet evaluation results using any evaluation classification model, based on the morphological characteristics of the platelet, regardless of whether the user has expertise in cell morphology. It is possible to objectively evaluate the quality and / or functionality of platelets.
  • FIG. 7 shows, as an example, a reference value table 71 that stores reference values of a reference value model, and a platelet information table 72 that stores feature value data associated with the platelet ID of each platelet and evaluation results of platelets. .
  • the platelet information table 72 stores the results of the platelet classification and classification performed by the determination unit 21 based on the information in the reference value table 71.
  • Information on the platelet information table 72 is displayed to the user via the display unit 24.
  • the display items in the information display unit 24 of the platelet information table 72 may include at least one of platelet ID or feature amount data in addition to the evaluation result, and the format is not particularly limited. .
  • whether or not each feature value satisfies a reference value may be displayed to the user for each feature value.
  • the user can browse the platelet evaluation result and the value of each feature amount for each platelet based on the selected classification evaluation model.
  • the user can view not only the evaluation result based on the classification evaluation model but also the correspondence between the classification evaluation standard and the feature amount of each platelet via the display unit 24, and the platelet evaluation result and the evaluation result Validity can be examined.
  • the above-described reference value model is used as the evaluation classification model.
  • the evaluation classification used for platelet evaluation is used.
  • the model is not particularly limited to the reference value model, but a classification model using a decision tree, a classification model created using a known machine learning method, or a classification model created by learning using Deep Learning is used. May be.
  • the feature amount of the structure existing inside the cell is calculated.
  • the quality and / or functionality of the contained cells can be objectively and accurately evaluated, and the cells can be evaluated regardless of whether the user has expertise in cell morphology.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for better understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.
  • control devices have been described as examples in which a program that realizes part or all of them is created. Needless to say, it can be realized with this. That is, all or part of the functions of the control device, the image acquisition unit, and the like may be realized by an integrated circuit such as ASIC (Application Specific Integrated Circuit) or FPGA (Field Programmable Gate Array) instead of the program. .
  • ASIC Application Specific Integrated Circuit
  • FPGA Field Programmable Gate Array

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Abstract

細胞の観察画像から細胞の特徴をより客観的かつ高精度に算出し、細胞の評価をおこなうことができる荷電粒子線装置を提供する。荷電粒子線装置は、細胞の画像を取得する画像取得部１８と、画像の輪郭を抽出する輪郭抽出部１９と、輪郭に基づいて輪郭の形態的特徴量を算出し、輪郭の内部領域に含まれる細胞質などの内部構造物の特徴量を算出する特徴量算出部２０と、この特徴量に基づいて細胞の良否及び／又は機能性を判定する判定部２１とを備え、撮像画像に含まれる細胞の良否及び／又は機能性を客観的かつ高精度に評価することができる。

Description

荷電粒子線装置および細胞評価方法
　本発明は荷電粒子線装置、それを用いた細胞評価方法、及びそのプログラムに関するものである。
　近年再生医療に関する技術として、人工多能性幹（iPS）細胞や、胚性幹（ES）細胞に代表される未分化な多能性幹細胞を培養し、多能性幹細胞を分化誘導することで特定の細胞（分化細胞）を製造する方法が提案されている。このとき、所望の細胞が製造されたかを評価するために、光学顕微鏡や、透過型電子顕微鏡（TEM）に代表される荷電粒子線装置が用いられている。
　特に荷電粒子線装置は、光よりも波長の短い電子線やイオン線などの荷電粒子線を用いているため、光学顕微鏡では観察できない、数ナノメートルから数百ナノメートルオーダーの大きさの細胞内微小構造を観察できるという利点がある。
　例えば、特許文献１には、未分化細胞から分化誘導した分化細胞および分化細胞の産出物を透過型電子顕微鏡で観察し、所望の分化細胞に特有の内部構造を確認することで細胞を評価した例が開示されている。また、特許文献２には、標的細胞を含む試料を光学顕微鏡で撮像した撮像画像について、核を有する複数の細胞を抽出し、細胞と核の少なくとも１つについてのサイズに関する特徴量を画像から算出し、しきい値を用いて抽出した細胞が所望の細胞であるか否かを判定する画像処理装置が開示されている。
特開２０１５－１９８６４４号公報 特許第５３３３６３５号公報
　特許文献１では、分化誘導した細胞が所望の細胞であることを判断するために透過型電子顕微鏡で分化細胞の画像を撮像し、細胞内部に所望の細胞に特有の内部構造が適切な分布と割合で存在するか否かを細胞形態学の知識を持つ専門家の目で判断していた。このような人の目で判断する目視検査は品質保証という面では客観性に乏しく、検査数が増大する場合には膨大な検査時間が必要であった。
　特許文献２では、このような目視検査における客観性と検査時間の問題に対し、標的細胞を含む試料を光学顕微鏡で撮像した撮像画像について、核を有する複数の細胞を抽出し、細胞と核の少なくとも１つについてのサイズに関する特徴量を画像から算出し、しきい値を用いて抽出した細胞が所望の細胞であるか否かを判定している。
　しかしながら、この光学顕微鏡の撮像画像の場合、数マイクロメートルの大きさの核を手がかりに標的細胞の判定をおこなうため、所望の細胞に特有の内部構造がミクロフィラメント（約６ナノメートル）、リボソーム（約２０ナノメートル）、分泌顆粒（数十～数百ナノメートル）など細胞質の微小構造物である場合には、光学顕微鏡の分解能限界から微小構造物を画像化できず、判定を実施できない場合があった。
　本発明の目的は、上述した課題を解決し、細胞の観察画像から細胞の特徴をより客観的かつ高精度に算出し、細胞の評価をおこなうことを可能とする荷電粒子線装置、それを用いた細胞評価方法、及びそのプログラムを提供することにある。
　上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞の画像を取得する取得部と、取得した前記画像の中の特徴量に基づいて、前記細胞の良否及び／又は機能性を判定する判定部と、を備える構成の荷電粒子線装置を提供する。
　また、上記の目的を達成するため、本発明においては、画像処理装置による細胞評価方法であって、画像処理装置は、荷電粒子線装置の検出器で検出した信号に基づき、細胞の断面画像を取得し、取得した断面画像の中の特徴量に基づいて、細胞の良否及び／又は機能性を判定する細胞評価方法を提供する。
　更に、上記の目的を達成するため、本発明においては、画像処理装置で実行される細胞評価プログラムであって、荷電粒子線装置の検出器で検出した信号に基づき、細胞の断面画像を取得し、取得した断面画像の中の特徴量に基づいて、細胞の良否及び／又は機能性を判定するよう、画像処理装置を機能させる細胞評価プログラムを提供する。
　本発明によれば、撮像画像に含まれる細胞の良否及び／又は機能性を客観的かつ高精度に評価することができる。
実施例１に係る、荷電粒子線装置のシステム構成の一例を示す図。 実施例１に係る構成の輪郭抽出処理のフローチャートを示す図。 実施例１に係る、血小板IDに紐付けられた輪郭データの対応関係を示す図。 実施例１に係る、開放小管系の拡張度の定義を説明するための図。 実施例１に係る構成の判定処理のフローチャートを示す図。 実施例１に係る、特徴量データが血小板IDと関連付けられて記憶されているテーブルの一例を示す図。 実施例１に係る、基準値を記憶したテーブルと、基準値と特徴量をもとに血小板の良否判定を実施した結果を記憶したテーブルの一例を示す図。
　以下、本発明の荷電粒子線装置の実施形態について、図面に基づき順次説明する。なお、説明に当り、荷電粒子線装置として走査電子顕微鏡（SEM）を例に説明するが、本発明の荷電粒子線装置は走査電子顕微鏡に限られることはない。本発明に係る荷電粒子線装置は、撮像装置によって取得された試料の撮像画像上で、荷電粒子線装置によって観察像を取得する当該試料上の観察範囲を視野範囲として設定する一方、荷電粒子線装置によって当該視野範囲に該当する試料上の観察範囲に荷電粒子線を照射して試料の観察像を取得するものであればよく、例えば、走査イオン顕微鏡や走査透過電子顕微鏡や透過電子顕微鏡、これらと試料加工装置との複合装置、またはこれらを応用した解析・検査装置等も含まれる。
　また、説明に当り、iPS細胞、ES細胞などの多能性幹細胞（未分化細胞）から分化誘導された分化細胞として、血小板を評価対象細胞の例として説明するが、本発明の評価対象細胞は血小板に限られることはない。本発明に係る評価対象細胞である分化細胞は、当該細胞の形態及び／または内部構造物の特徴を基に当該細胞の良否及び／又は機能性を評価できるものであればよく、例えば、神経幹細胞や心筋細胞やインシュリン生産細胞や幹細胞や造血幹細胞、または角膜や網膜や骨や軟骨や筋肉や腎臓の細胞等も含まれる。
　なお、血小板は造血幹細胞が巨核球に分化した後に、成熟した巨核球により産出される。すなわち、白血球、赤血球、血小板は造血幹細胞が分化することにより作られる。すなわち、未分化細胞であるiPS細胞、ES細胞などの多能性幹細胞は、未分化細胞である造血幹細胞、神経幹細胞などの各種幹細胞に分化し、その後、分化細胞である血小板、赤血球、白血球、心筋細胞、インシュリン生産細胞、角膜細胞、網膜細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、腎臓細胞などの各種細胞に分化する。
　＜荷電粒子線装置のシステム構成例と細胞評価フロー＞
  図１は、実施例１に係る荷電粒子線装置である走査電子顕微鏡の一例の概略構成図である。
　走査電子顕微鏡１は、鏡筒２と、試料室３とが一体化されてなる顕微鏡装置本体４と、走査電子顕微鏡装置本体内の各部をそれぞれ制御する制御装置５とを有する。鏡筒２には、電子ビーム６を放出する電子銃７と、この電子ビーム６を照射制御する電子光学系８とが設けられている。
　電子光学系８は、電子銃７から放出された電子ビーム６を集束するコンデンサレンズ９と、電子ビーム６を走査する偏向器１０と、試料１２表面上に焦点が合うように電子ビーム６を集束させる対物レンズ１１とを含む。図示の例では、電子ビーム６が試料１２に照射されることにより発生する反射電子や二次電子等の信号１３を検出する検出器１４も設けられた構成になっている。
　試料室３は、開閉可能な図示せぬ導入／導出口を解して、試料１２が収容される構成になっており、試料１２は試料ステージ１５が設けられている。試料ステージ１５は、試料室３内で、試料１２を例えば水平面内及び面直方向へ移動させたり、回転や傾斜させたりして、試料室３内における試料１２の位置や向きを変位させる試料移動機構１６を備えている。試料移動機構１６と電子光学系８とを制御装置５で制御し、試料１２の任意の位置に電子ビーム６を照射し、発生した信号１３を検出器１４で検出することにより、試料の任意の位置と倍率における電子顕微鏡観察を実施する。ここで、倍率とは、視野（Field Of View: FOV）の幅、もしくはデジタル画像にした場合の１画素当りが示す長さ（ピクセルサイズ）などでもよい。
　画像処理装置１７は、検出器１４により得られた反射電子などの信号を観察画像データ（以下、電顕像データと称する）に変換する画像取得部１８と、輪郭抽出部１９と、特徴量算出部２０と、判定部２１と、評価分類モデル記憶部２２とを有する。この評価分類モデル記憶部２２は、評価分類モデルのみならず、画像取得部１８が取得した電顕像データや、輪郭抽出部１９が抽出した輪郭データや、特徴量算出部２０が算出した特徴量データなども記憶することが可能な記憶部で構成することができる。
　電顕像データは画像取得部１８から輪郭抽出部１９に読込まれ、画像処理による領域分割（セグメンテーション）処理を施される。輪郭抽出はまず電顕像データに含まれる個々の血小板の外形に対して実施される。これにより、電顕像データから個々の血小板外形の輪郭（ポリゴン）データを算出する。次に、個々の血小板の内部領域に再び輪郭抽出を実施することにより、血小板内部に含まれる分泌顆粒や開放小管系（Open Canalicular System：OCS）などの細胞小器官等の内部構造物の輪郭データを算出する。なお、輪郭抽出部１９で実行される輪郭抽出処理の詳細は後述する。
　特徴量算出部２０では、輪郭抽出部１９で算出された個々の血小板にIDを振り分け、固有の血小板IDに紐付く外形及び、分泌顆粒、開放小管系等の血小板に含まれる細胞小器官等の内部構造物の輪郭データを、面積や直径や周囲長などの形態的特徴を示す特徴量データ及び／又は血小板面積と分泌顆粒との面積比や血小板直径に対する開放小管系の最大径の比率を用いた、分泌顆粒や開放小管系の分布や面積比や拡張具合などの特徴量データを算出する。なお、特徴量算出部２０で実行される特徴量算出処理と各特徴量の詳細については後述する。
　ここで、血小板の輪郭データが示す輪郭の外周の２点を結び、かつ輪郭の重心を通る最大の線分の長さを直径と定義する。また、輪郭データが示す輪郭の外周の２点を結び、かつ輪郭の重心を通る最小の線分の長さを最小直径と定義してもよいし、輪郭データが示す輪郭の外周の２点を結び、かつ輪郭の重心を通る線分の長さを任意の角度刻みに３６０度の範囲で測定し、その平均値を平均直径と定義してもよい。
　また、最大径とは、輪郭データが示す輪郭全体を囲む最小の矩形を算出し、この矩形の長辺の長さを最大径と定義する。直径は輪郭の重心を利用して直径の値を算出するが、重心が輪郭の外部にある場合には有効な測定値が得られない場合があるため、開放小管系のサイズ情報を得る場合には外接四角形（輪郭全体を囲む最小の矩形）を利用した最大径を用いたほうが、開放小管系の拡張具合をより正確に定量化することができる。
　判定部２１では、個々の血小板IDに紐付けられた各特徴量データを評価分類モデル記憶部２２に記憶された評価分類モデルに従い評価することにより、血小板の良否及び／または機能性を判定する。また、判定部２１で用いられる評価分類モデルや評価に用いられる判定値および判定基準値などの情報は、入力部２３を介してユーザが編集可能であり、判定結果や評価分類モデルの情報は表示部２４を介してユーザに表示される。なお、判定部２１で用いる評価分類モデルの詳細や判定方法についての詳細は後述する。また、表示部２４には、判定部２１により評価された各血小板の評価結果及び／又は全血小板の判定結果の統計情報が表示される。
　なお、制御装置５と、画像処理装置１７、入力部２３、表示部２４などを、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）を使って実現しても良い。この場合、制御装置５と画像処理装置１７は、ＰＣの中央処理部（ＣＰＵ）のプログラム実行で実現することができ、ＰＣの記憶部には、それらの動作プログラムや、上述した評価分類モデルを含め各種のデータを記憶することができる。
　以上が、図１に示される実施例１の走査電子顕微鏡を用いたシステム構成例の各構成要素の概説である。本実施例の走査電子顕微鏡によれば、ユーザが血小板を撮像し、評価目的に適した評価分類モデルを選択することで、撮像画像に含まれる血小板の良否及び／又は機能性を客観的かつ高精度に評価することができ、ユーザが細胞形態学の専門知識を有しているかに関わらず血小板の評価が可能となる。
　＜輪郭抽出部＞
  本実施例の構成における輪郭抽出部１９の一動作例として、電顕像データを読込んだ場合の動作例を、図２のフローチャートを用いて説明する。なお、このフローチャートの動作は、画像取得部１８、輪郭抽出部１９と特徴量算出部２０であり、上述したＣＰＵでのプログラム実行で実現可能である。
　最初に、撮像画像として電顕像データを読込む（ステップＳ１０１）。次に、輪郭抽出の精度を高める目的で画像のノイズ除去処理をおこなう（ステップＳ１０２）。具体的には、例えばメディアンフィルタ、ガウシアンフィルタ、デコンボリューションフィルタ等の周知の画像処理技術を用いて後述する輪郭抽出のための２値化処理やエッジ検出処理の精度を向上させるフィルタ処理をおこなう。なお、電顕像データのシグナルノイズ比が輪郭抽出処理をおこなうに当たり十分高い場合には、ノイズ除去処理を省略してもよい。
　続いて、ノイズ除去処理後の電顕像データを２値化することにより、輪郭抽出対象と背景画像の分離をおこなう（ステップＳ１０３）。具体的には、大津の２値化、pタイル法等の周知の画像処理及び画像認識技術を用いて２値化をおこなう。
　続いて、２値化後の電顕像データのセグメンテーション（領域分割）をおこない、２値化された領域を個々の血小板の領域に分割する（ステップＳ１０４）。血小板試料を撮像した場合、血小板同士が隣接または接触した状態で撮像される場合があり、上述した２値化処理のみでは多数の血小板の集合体を１つの血小板として誤認識する場合がある。したがって、セグメンテーション処理により前述の血小板の集合体から個々の血小板を分離する必要がある。具体的には、例えばWatershed法、パターンマッチング等の手法や、Deep Learning等の機械学習を用いた周知の画像処理及び画像認識技術を用いてセグメンテーション処理をおこない、個々の血小板の輪郭データに分割する。
　これまでの処理により、個々の血小板の輪郭データを算出したため、ステップＳ１０５にて各血小板と対応する輪郭データを記憶する。これにより、電顕像データに含まれる個別の血小板に対して、当該血小板外形の形状データである輪郭データが紐付けられる。
　以上が、輪郭抽出部で個別の血小板の外形を抽出する場合の処理の一例である。本実施例では、血小板の評価精度向上のため、血小板の外形だけでなく血小板内部に含まれる細胞小器官、例えば分泌顆粒、開放小管系等の輪郭データの算出・記憶を実施している。
　細胞小器官等の内部構造物の輪郭データの算出は、既に算出済みの血小板外形の輪郭データの内側の領域に対して再び輪郭抽出処理である上述したステップＳ１０３～ステップＳ１０５を繰り返し適用することによりおこなう。例えば、開放小管系の輪郭データを算出する場合は、２値化の条件を開放小管系のみが分離できるように閾値を設定することで血小板内部に含まれる開放小管系すべての輪郭データを収集する。同様に、濃染領域のみが分離できるように閾値を設定することで、濃染領域の輪郭データを収集することができる。
　図３に検出された血小板３１、３２と、それぞれの内部の開放小管系３３、３４、３５と、濃染領域３６と、対応する識別子（ID）を模式的に示した。そして、収集された開放小管系の輪郭データは、図３に示されるように開放小管系が所属する血小板IDと紐付けられて記憶されるとともに、個々の開放小管系にもIDが割り振られて記憶される。同様の処理を電顕像データから抽出された全ての血小板に対して実行することにより、個々の血小板の外形及び、血小板に含まれる細胞小器官等（分泌顆粒、開放小管系等）の内部構造物の輪郭データを算出・記憶することができる。
　本実施例の構成・動作においては、血小板固有の細胞小器官であるα顆粒、濃染顆粒および血小板内部に含まれるグリコーゲン顆粒などの分泌顆粒、ミトコンドリアを総じて濃染領域と定義し、輪郭データを算出・記憶する。加えて、同じく血小板に固有の細胞小器官である開放小管系の輪郭データも算出・記憶する。これにより、血小板外形と、血小板内部の濃染領域と、開放小管系との３つの輪郭データを算出・記憶し、特徴量算出部２０にてそれぞれの特徴量を算出する。
　なお、血小板の評価を実施するために血小板外形と、濃染領域と、開放小管系に輪郭抽出対象を限定する必要はなく、α顆粒や濃染顆粒やグリコーゲン顆粒やミトコンドリアを個別に輪郭抽出対象に設定してもよいし、その他血小板に含まれる暗調小管系や微小管等の細胞小器官を輪郭抽出対象に設定してもよい。また、その他の血小板の良否及び／又は機能性、品質に相関のある細胞質、封入体又は副形質を輪郭抽出対象に設定してもよい。
　＜特徴量算出部＞
  図１の構成による電顕像データの取得時に、視野（Field Of View: FOV）の幅、もしくはデジタル画像にした場合の１画素当りが示す長さ（ピクセルサイズ）などを含む倍率データを取得しているため、輪郭抽出部１９にて算出・記憶された輪郭データを用いて輪郭抽出対象の形態的特徴を数値化することが可能となる。例えば、輪郭抽出対象が血小板外形であった場合、血小板外形の面積、直径、最大径、最小径、周囲長等のサイズに関する情報を特徴量として算出することができる。
　本実施例では、走査電子顕微鏡１を用いて血小板試料を観察する例を示している。電子顕微鏡を用いた細胞の内部構造を含む観察では、細胞試料を樹脂で包埋し、その樹脂を厚み数マイクロメートル程度の切片にスライスした切片試料を作製し、切片試料の断面を観察する手法が一般的である。したがって、例えば切片試料の断面に見られる血小板の断面像の直径と、当該血小板の真の直径とは異なる値となることが予想されるため、直径等のサイズに関する特徴量のみでは細胞評価の精度の向上は見込めない。
　この問題を解決するため、本実施例の構成ではサイズに関する特徴量に加えて、血小板の切片試料の断面像からでもその血小板の良否及び／又は機能性を評価可能な特徴量として、形態複雑度と、開放小管系の面積比および拡張度と、濃染領域の面積比を特徴量データとして算出・記憶する。すべての特徴量データは、上述したように個々の血小板IDと紐付けられて記憶される。以下にそれぞれの特徴量の詳細を説明する。
　形態複雑度
  「形態複雑度」は血小板外形の丸さを示す特徴量である。血小板は血液中で碁石のような円盤型の形状をとることが知られている。上述したように、血小板が包埋された樹脂をスライスすることで血小板試料を作製するため、観察される血小板の断面は円形もしくは楕円形であることが予想される。また、血小板は外部刺激により活性化された状態になると長い突起を出し、それが相互にからまって凝集体（血栓）を作ることが知られている。したがって、丸みを失い、形態が複雑化した血小板は活性化状態であると判断できる。なお、医療用の血小板製剤としては、血小板は活性化していない状態が望ましい。
　特徴量算出部２０は、下記式（１）により「形態複雑度」を算出する。
（形態複雑度） =  （周囲長）2／（面積）　・・・　（１）

なお、本実施例では式（１）により形態複雑度を算出したが、形態複雑度は血小板の丸さと複雑さを定量的に表現できればよく、例えば円形度や真円度を用いても良く、周囲長や面積や直径、もしくは血小板の重心位置等を組み合わせて形態複雑度を算出してもよい。
　開放小管系の面積比（OCS面積比）
  「OCS面積比」は血小板内部に開放小管系が占める割合を示す特徴量である。人間の血液から採取された血小板の寿命は4日程度であることが知られており、寿命間近の血小板は開放小管系の面積が増加する傾向がある。したがって、OCS面積比を算出することで開放小管系の増加具合を算出することができ、血小板が寿命間近であるかを推定することができる。
特徴量算出部２０は、下記式（２）により「OCS面積比」を算出する。
（OCS面積比） = （開放小管系の総面積）／（血小板の面積）・・・（２）

　開放小管系の拡張度（OCS拡張度）
  「OCS拡張度」は図４に示すような、血小板内部の開放小管系の中でも細長く拡張した開放小管系の拡張具合を示す特徴量である。前述した開放小管系の面積比が低い値の場合でも、血小板４１の内部に、細長く拡張した開放小管系４２やその他の開放系小管系４３が存在し、細長く拡張した開放小管系４２の最大径が血小板外形の最大径の５０％を超えるような場合には、血小板の止血能力が著しく低下している可能性が高いことが本発明者等の生化学検査結果により示されている。したがって、OCS拡張度を算出することで、止血能力が低い血小板を選別することができる。なお、この止血能力は血液を固める血小板の機能性の大きさを示している。
　特徴量算出部２０は、下記式（３）により「OCS拡張度」を算出する。
（OCS拡張度） = （開放小管系の最大径）／（血小板の直径）・・・（３）
このとき、「開放小管系の最大径」は血小板内のすべての開放小管系の最大径のうち最大のものの値を使用する。
　なお、本実施例では式（３）によりOCS拡張度を算出したが、OCS拡張度は血小板内部の開放小管系の拡張具合を定量的に表現できればよく、例えば、「血小板の直径」に変えて「血小板の最大径」としてもよく、「開放小管系の最大径」に変えて「開放小管系の最大直径」としてもよく、血小板外形に対する開放小管系の拡張具合を示すものであればその定義式を式（３）に限定するものではない。
　濃染領域の面積比（濃染領域面積比）
  「濃染領域面積比」は血小板内部に濃染領域が占める割合を示す特徴量である。上述したように、濃染領域はα顆粒や濃染顆粒等の血小板の止血メカニズムと密接な関係がある化学物質（分泌物）を含んでいる。したがって、もしも濃染領域面積比が０％、１％、２％、３％、４％、５％など、低い値を示す場合には当該血小板は止血能力が低いと推定できる。
　特徴量算出部２０は、下記式（４）により「濃染領域面積比」を算出する。
（濃染領域面積比） = （濃染領域の総面積）／（血小板の面積）・・・（４）

なお、血小板の評価を実施するために定義した濃染領域の構成要素はα顆粒、濃染顆粒、グリコーゲン顆粒、ミトコンドリアに限定する必要はなく、止血メカニズムと関連する分泌物を含む少なくともひとつ以上の細胞小管系が含まれていればよい。また、その他血小板の良否及び／又は機能性、品質に相関のある細胞質、封入体又は副形質を濃染領域の変わりに定義し、その面積比を算出してもよい。
　＜判定部＞
  本実施例における判定部２１の一動作例として、図５を用いて、特徴量データを基に評価分類モデル記憶部２２に記憶された評価分類モデルを用いて血小板の良否及び／又は機能性を評価する場合の動作例を説明する。
　図５は、本実施例の構成における、判定部２１の動作を示すフローチャートである。この動作もプログラム実行で実現可能である。最初に、算出・記憶された特徴量データを読込む（ステップＳ２０１）。特徴量データは図６の特徴量データテーブル６１に示されるように、血小板IDに紐付けられた各特徴量データの集合である。なお、特徴量データの記憶形式については、図６に示されるように、個別の血小板IDに紐つけられる形で特徴量データが格納されていればよく、特にその形式や含まれる特徴量データの項目を指定するものではない。特徴量データの項目としては、上述した形態複雑度、OCS面積比、OCS拡張度、濃染領域面積比や、面積、周囲長などのサイズに関する特徴量など、特徴量算出部２０で算出された特徴量及び／又は特徴量の平均値、合計値、最大値、最小値、統計量等の情報を少なくとも１つ以上を含んでいればよい。
　次に、入力部２３を介してユーザが任意の評価分類モデルを選択し、評価分類モデル記憶部２２から選択された評価分類モデルが判定部２１に読込まれる（ステップＳ２０２）。評価分類モデルとは、特徴量算出部２０で算出した特徴量データに基づいて血小板の良否及び／又は機能性の有無を分類するモデルを意味している。評価分類モデル記憶部２２には、各特徴量に対する基準値や分類条件が記録されており、評価分類モデルの分類条件に従って各血小板の評価が実施される（ステップＳ２０３）。
　次に、血小板の評価結果は各血小板IDに紐付けられる形で記憶され（ステップＳ２０４）、併せて評価結果は表示部２４を介してユーザに対して表示される（ステップＳ２０５）。これにより、ユーザは任意の評価分類モデルを用いた血小板の評価結果を確認することができ、ユーザが細胞形態学の専門知識を有しているかに関わらず、血小板の形態的特徴を基にした客観的な血小板の良否及び／又は機能性の評価が可能となる。
　図７を参照しながら、評価分類モデルの一例として基準値モデルを説明する。基準値モデルとは、各特徴量データに対して基準値を設定し、すべての特徴量データが基準値を満たす場合にのみ当該血小板の評価結果を「良」とし、ひとつでも基準値を満たさない特徴量データがあった場合には当該血小板の評価結果を「否」とする評価分類モデルである。図７に、基準値モデルの基準値を格納した基準値テーブル７１と、各血小板の血小板IDに紐つけられた特徴量データと血小板の評価結果を格納した血小板情報テーブル７２とを例として示した。
　血小板情報テーブル７２には、判定部２１が基準値テーブル７１の情報をもとに血小板の評価分類を実施した結果が格納されている。図７に示す例では、評価分類に用いられる特徴量は形態複雑度、OCS面積比、OCS拡張度、濃染領域面積比の４つであり、すべての特徴量について基準値を満たした血小板ID「P1R1」のみが「良」と評価分類されている。これら血小板情報テーブル７２の情報は、表示部２４を介してユーザに表示される。このとき、血小板情報テーブル７２の情報の表示部２４における表示項目は、評価結果の他に血小板IDまたは特徴量データの少なくとも１つ以上を含んでいればよく、その形式を特に限定するものではない。また、図７に示すように各特徴量の値が基準値を満たしているか否かを、個々の特徴量の値ごとユーザに表示してもよい。
　この血小板情報テーブル７２の情報は表示部２４を介してユーザに表示されるため、ユーザは選択した分類評価モデルによる血小板の評価結果と各特徴量の値とを血小板ごとに閲覧することができる。これにより、ユーザは分類評価モデルによる評価結果だけでなく、分類評価の基準と、各血小板の特徴量との対応とを表示部２４を介して閲覧することができ、血小板評価結果や評価結果の妥当性を検討することができる。
　本実施例では、評価分類モデルに上述した基準値モデルを用いたが、特徴量データを用いて血小板の良否及び／又は機能性を評価し分類できるのであれば、血小板の評価に用いられる評価分類モデルを基準値モデルに特に限定するものではなく、決定木を用いた分類モデルや公知の機械学習手法を用いて作成される分類モデル、またはDeep Learningを用いた学習により作成した分類モデル等を用いてもよい。
　本発明によれば、荷電粒子線装置で撮像した細胞画像を用いて、細胞外形の形態的特徴に加えて細胞質などの細胞内部に存在する構造物の特徴量を算出することにより、撮像画像に含まれる細胞の良否及び／又は機能性を客観的かつ高精度に評価することができ、ユーザが細胞形態学の専門知識を有しているかに関わらず細胞の評価が可能となる。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　更に、上述した各構成、機能、制御装置等は、それらの一部又は全部を実現するプログラムを作成する例を説明したが、それらの一部又は全部を例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良いことは言うまでもない。すなわち、制御装置や画像取得部等の全部または一部の機能は、プログラムに代え、例えば、ＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｃｉｒｃｕｉｔ）、ＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｇａｔｅ　Ａｒｒａｙ）などの集積回路などにより実現してもよい。
１　走査電子顕微鏡，２　鏡体，３　試料室，４　顕微鏡装置本体，５　制御装置，６　電子ビーム，７　電子銃，８　電子光学系，９　コンデンサレンズ，１０　偏向器，１１　対物レンズ，１２　試料，１３　信号，１４　検出器，１５　試料ステージ，１６　試料移動機構，１７　画像処理装置，１８　画像取得部，１９　輪郭抽出部，２０　特徴量算出部，２１　判定部，２２　評価分類モデル記憶部，２３　入力部，２４　表示部，４１　血小板，４２　細長く拡張した開放小管系，４３　開放小管系，６１　特徴量データテーブル，７１　基準値テーブル，７２　血小板情報テーブル

Claims (20)

  1. 細胞の画像を取得する取得部と、
    取得した前記画像の中の特徴量に基づいて、前記細胞の良否及び／又は機能性を判定する判定部と、を備える
    ことを特徴とする荷電粒子線装置。
  2. 請求項１記載の荷電粒子線装置であって、
    取得した前記画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する抽出部と、
    抽出した前記輪郭に基づいて当該輪郭の形態的特徴量と、前記輪郭の内部領域に含まれる内部構造物の特徴量を前記特徴量として算出する算出部と、を更に備える、
    ことを特徴とする荷電粒子線装置。
  3. 請求項２記載の荷電粒子線装置であって、
    前記画像は断面画像であり、前記細胞は未分化細胞から生成される分化細胞である、
    ことを特徴とする荷電粒子線装置。
  4. 請求項３記載の荷電粒子線装置であって、
    前記分化細胞は血小板であり、
    前記血小板の良否とは止血能力の有無を示し、
    前記血小板の機能性とは前記止血能力の大きさを示す、
    ことを特徴とする荷電粒子線装置。
  5. 請求項４記載の荷電粒子線装置であって、
    前記輪郭の形態的特徴量とは、前記血小板外形の丸さを示す特徴量であり、前記内部構造物の特徴量は、前記血小板の開放小管系の面積比と、当該開放小管系の拡張度と、前記血小板の濃染領域の面積比を含む、
    ことを特徴とする荷電粒子線装置。
  6. 請求項５記載の荷電粒子線装置であって、
    前記血小板外形の丸さを示す特徴量は、前記血小板の面積と周囲長から算出する、
    ことを特徴とする荷電粒子線装置。
  7. 請求項５記載の荷電粒子線装置であって、
    前記開放小管系の面積比とは、前記血小板の面積に占める前記開放小管系の総面積の割合である、
    ことを特徴とする荷電粒子線装置。
  8. 請求項５記載の荷電粒子線装置であって、
    前記開放小管系の拡張度とは、前記血小板の直径に対する前記開放小管系の最大径である、
    ことを特徴とする荷電粒子線装置。
  9. 請求項５記載の荷電粒子線装置であって、
    前記濃染領域とは、前記血小板の分泌顆粒、ミトコンドリアを示す領域である、
    ことを特徴とする荷電粒子線装置。
  10. 画像処理装置による細胞評価方法であって、
    前記画像処理装置は、
    荷電粒子線装置の検出器で検出した信号に基づき、細胞の断面画像を取得し、
    取得した前記断面画像の中の特徴量に基づいて、前記細胞の良否及び／又は機能性を判定する、
    ことを特徴とする細胞評価方法。
  11. 請求項１０記載の細胞評価方法であって、
    取得した前記画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出し、
    抽出した前記輪郭に基づいて当該輪郭の形態的特徴量と、前記輪郭の内部領域に含まれる内部構造物の特徴量を前記特徴量として算出する、
    ことを特徴とする細胞評価方法。
  12. 請求項１１記載の細胞評価方法であって、
    前記細胞は未分化細胞から生成される分化細胞である、
    ことを特徴とする細胞評価方法。
  13. 請求項１２記載の細胞評価方法であって、
    前記分化細胞は血小板であり、
    前記血小板の良否とは止血能力の有無を示し、
    前記血小板の機能性とは前記止血能力の大きさを示す、
    ことを特徴とする細胞評価方法。
  14. 請求項１２記載の細胞評価方法であって、
    前記輪郭の形態的特徴量とは、前記血小板外形の丸さを示す特徴量であり、前記内部構造物の特徴量は、前記血小板の開放小管系の面積比と、当該開放小管系の拡張度と、前記血小板の濃染領域の面積比を含む、
    ことを特徴とする細胞評価方法。
  15. 請求項１４記載の細胞評価方法であって、
    前記開放小管系の拡張度とは、前記血小板の直径に対する前記開放小管系の最大径である、
    ことを特徴とする細胞評価方法。
  16. 画像処理装置で実行される細胞評価プログラムであって、
    荷電粒子線装置の検出器で検出した信号に基づき、細胞の断面画像を取得し、
    取得した前記断面画像の中の特徴量に基づいて、前記細胞の良否及び／又は機能性を判定するよう、前記画像処理装置を機能させる、
    ことを特徴とする細胞評価プログラム。
  17. 請求項１６記載の細胞評価プログラムであって、
    取得した前記画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出し、
    抽出した前記輪郭に基づいて当該輪郭の形態的特徴量と、前記輪郭の内部領域に含まれる内部構造物の特徴量を前記特徴量として算出するよう、前記画像処理装置を機能させる、
    ことを特徴とする細胞評価プログラム。
  18. 請求項１７記載の細胞評価プログラムであって、
    前記断面画像を取得する前記細胞は未分化細胞から生成される分化細胞である、
    ことを特徴とする細胞評価プログラム。
  19. 請求項１８記載の細胞評価プログラムであって、
    前記分化細胞は血小板であり、
    前記血小板の良否とは止血能力の有無を示し、
    前記血小板の機能性とは前記止血能力の大きさを示す、
    ことを特徴とする細胞評価プログラム。
  20. 請求項１９記載の細胞評価プログラムであって、
    前記輪郭の形態的特徴量とは、前記血小板外形の丸さを示す特徴量であり、前記内部構造物の特徴量は、前記血小板の開放小管系の面積比と、当該開放小管系の拡張度と、前記血小板の濃染領域の面積比を含む、
    ことを特徴とする細胞評価プログラム。
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