CN114736284A - 一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制药领域，具体公开了一种从尿液中提取β2‑微球蛋白的方法。一种从尿液中提取β2‑微球蛋白的方法，包括以下步骤：步骤1），向尿液中加入牛血清白蛋白、硫酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、茶多酚、葡聚糖，混匀，形成原液；步骤2），将原液通过高通量透析器进行透析，收取滤液，得预处理液；步骤3），将预处理液通过低通量透析器进行透析，滤出水分，至剩余液体体积为预处理液体积的1%‑2%，得β2‑微球蛋白浓缩液；步骤4），将β2‑微球蛋白浓缩液进行纯化，得β2‑微球蛋白成品。本发明具有从尿液中提取β2‑微球蛋白且微球蛋白活性较佳的效果。

Description

一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，尤其是涉及一种从尿液中提取β2微球蛋白的方法。

背景技术

β2-微球蛋白是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，分子质量为11800，是由99个氨基酸组成的单链多肽。广泛存在与血液、尿液、脑脊液、唾液、初乳中。

临床上检测血或尿中的β2-微球蛋白浓度为临床肾功能测定、肾移植成活、糖尿病肾病、重金属镉、汞中毒以及某些恶性肿瘤的临床诊断提供较早、可靠和灵敏的指标。

β2-微球蛋白在检测及生物制药领域均有着十分广阔的应用前景，但目前缺乏量产β2-微球蛋白的技术，导致β2-微球蛋白较为珍贵。

医院中有许多病患由于行动不便或各种特殊情况，导致排尿时无法前往洗手间进行，而是通过容器将尿液收集后再废弃，由于尿液中含有β2-微球蛋白，将尿液废弃是十分浪费的，但现有技术中，从尿液中提取β2-微球蛋白的技术目前还较为空白，因此还有改善空间。

发明内容

为了从尿液中提取β2-微球蛋白，本申请提供一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法。

本申请提供的一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法采用如下的技术方案：

一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤1)，向尿液中加入牛血清白蛋白、硫酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、茶多酚、葡聚糖，混匀，形成原液；

步骤2)，将原液通过高通量透析器进行透析，收取滤液，得预处理液；

步骤3)，将预处理液通过低通量透析器进行透析，滤出水分，至剩余液体体积为预处理液体积的1％-2％，得β2-微球蛋白浓缩液；

步骤4)，将β2-微球蛋白浓缩液进行纯化，得β2-微球蛋白成品。

通过采用上述技术方案，通过从尿液中提取β2-微球蛋白，充分利用医院中收集的病患尿液，且一些特殊病患，如上尿路感染的病患，尿液中的β2-微球蛋白含量较高，使得从尿液中提取得到的β2-微球蛋白数量较多，产量较高，具有较高的经济价值。

通过向尿液中加入牛血清白蛋白、硫酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、茶多酚、葡聚糖，有效保护尿液中的β2-微球蛋白，使得尿液中的β2-微球蛋白保持活性，使得提取得到的产品质量较佳。

优选的，所述高通量透析器的超滤系数为25-26mL/h/mmHg。

通过采用上述技术方案，通过具体选择超滤系数，使得大分子杂质过滤效果较佳，且效率较高，较好地控制成本，具有更高的经济价值。

优选的，所述低通量透析器的超滤系数为5-6mL/h/mmHg。

通过采用上述技术方案，通过具体选择超滤系数，使得小分子杂质过滤效果较佳，是最终产品的纯度较高，品质更好。

优选的，所述步骤3)中，滤出水分，至剩余液体体积为预处理液体积的1.5％。

通过采用上述技术方案，通过具体选择剩余液体的体积，保证杂质过滤的效果，进一步提高最终产品的纯度，品质更高。

优选的，所述步骤1)中，牛血清白蛋白的投入质量为尿液质量的2-3％、硫酸镁的投入质量为尿液质量的1％-2％、聚乙烯吡咯烷酮的投入质量为尿液质量的2％-3％、茶多酚的投入质量为尿液质量的0.5-0.7％、葡聚糖的投入质量为尿液质量的0.3-0.5％。

通过采用上述技术方案，通过具体选择牛血清白蛋白、硫酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、茶多酚、葡聚糖投入量的范围，使得对β2-微球蛋白的保护效果较佳，减少蛋白失活的发生，制得的终产物质量较好。

优选的，所述步骤1)中，牛血清白蛋白的投入质量为尿液质量的2.6％、硫酸镁的投入质量为尿液质量的1.3％、聚乙烯吡咯烷酮的投入质量为尿液质量的2.2％、茶多酚的投入质量为尿液质量的0.6％、葡聚糖的投入质量为尿液质量的0.4％。

通过采用上述技术方案，通过具体选择牛血清白蛋白、硫酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、茶多酚、葡聚糖的投入量，使得对β2-微球蛋白的保护效果更佳，使得蛋白不易失活，制得的终产物质量更好。

优选的，所述步骤4)中，采用超滤分离纯化装置对微球蛋白浓缩液进行超滤分离纯化。

通过采用上述技术方案，通过超滤分离纯化，使得微球蛋白中的杂质更少，而且有效去除内毒素，制得的产品质量较高，应用较广。

优选的，所述超滤分离纯化装置的切割分子量为30000-40000。

通过采用上述技术方案，通过具体选择切割分子量的范围，使得超滤效率较高，同时内毒素清除效果较好，终产物的内毒素含量较低，有效提高产品品质，产品应用范围更广。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、由于本申请通过从尿液中提取β2-微球蛋白，充分利用医院中收集的病患尿液，且一些特殊病患，如上尿路感染的病患，尿液中的β2-微球蛋白含量较高，使得从尿液中提取得到的β2-微球蛋白数量较多，产量较高，具有较高的经济价值。

2、本申请中优选通过向尿液中加入牛血清白蛋白、硫酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、茶多酚、葡聚糖，有效保护尿液中的β2-微球蛋白，使得尿液中的β2-微球蛋白保持活性，使得提取得到的产品质量较佳。

3、本申请中优选通过具体选择牛血清白蛋白、硫酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、茶多酚、葡聚糖的投入量，使得对β2-微球蛋白的保护效果更佳，使得蛋白不易失活，制得的终产物质量更好。

具体实施方式

以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。

实施例1

一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤1)，称取20g牛血清白蛋白、100g硫酸镁、200g聚乙烯吡咯烷酮、50g茶多酚、30g葡聚糖，搅拌均匀，制得蛋白保护组合物，从医院收集病患尿液，并在尿液排出后的1小时内加入蛋白保护液，每100g尿液加入4g蛋白保护组合物，搅拌均匀，疯狂存放，获得原液。

步骤2)，将原液通过高通量透析器进行透析，高通量透析器的超滤系数为25mL/h/mmHg，取滤液，获得预处理液。

步骤3)，将预处理也通过低通量透析器进行透析，低通量透析器的超滤系数为5mL/h/mmHg，滤出水分，至剩余液体的体积为预处理液体积的1％，收取剩余液体，获得β2-微球蛋白浓缩液。

步骤4)，将β2-微球蛋白浓缩液通过超滤管进行超滤分离纯化，超滤管中超滤膜的切割分子量为30000，收集超滤液，得纯化β2-微球蛋白浓缩液，将纯化β2-微球蛋白浓缩液通过冷冻干燥机进行干燥，得β2-微球蛋白冻干粉。

实施例2

一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤1)，称取26g牛血清白蛋白、130g硫酸镁、220g聚乙烯吡咯烷酮、60g茶多酚、40g葡聚糖，搅拌均匀，制得蛋白保护组合物，从医院收集病患尿液，并在尿液排出后的1小时内加入蛋白保护液，每100g尿液加入4.76g蛋白保护组合物，搅拌均匀，疯狂存放，获得原液。

步骤2)，将原液通过高通量透析器进行透析，高通量透析器的超滤系数为25mL/h/mmHg，取滤液，获得预处理液。

步骤3)，将预处理也通过低通量透析器进行透析，低通量透析器的超滤系数为5mL/h/mmHg，滤出水分，至剩余液体的体积为预处理液体积的1.5％，收取剩余液体，获得β2-微球蛋白浓缩液。

步骤4)，将β2-微球蛋白浓缩液通过超滤管进行超滤分离纯化，超滤管中超滤膜的切割分子量为30000，收集超滤液，得纯化β2-微球蛋白浓缩液，将纯化β2-微球蛋白浓缩液通过冷冻干燥机进行干燥，得β2-微球蛋白冻干粉。

实施例3

一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤1)，称取30g牛血清白蛋白、200g硫酸镁、300g聚乙烯吡咯烷酮、70g茶多酚、50g葡聚糖，搅拌均匀，制得蛋白保护组合物，从医院收集病患尿液，并在尿液排出后的1小时内加入蛋白保护液，每100g尿液加入6.5g蛋白保护组合物，搅拌均匀，疯狂存放，获得原液。

步骤2)，将原液通过高通量透析器进行透析，高通量透析器的超滤系数为26mL/h/mmHg，取滤液，获得预处理液。

步骤3)，将预处理也通过低通量透析器进行透析，低通量透析器的超滤系数为6mL/h/mmHg，滤出水分，至剩余液体的体积为预处理液体积的2％，收取剩余液体，获得β2-微球蛋白浓缩液。

步骤4)，将β2-微球蛋白浓缩液通过超滤管进行超滤分离纯化，超滤管中超滤膜的切割分子量为40000，收集超滤液，得纯化β2-微球蛋白浓缩液，将纯化β2-微球蛋白浓缩液通过冷冻干燥机进行干燥，得β2-微球蛋白冻干粉。

对比例1

一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤1)，称取400g葡聚糖，搅拌均匀，制得蛋白保护组合物，从医院收集病患尿液，并在尿液排出后的1小时内加入蛋白保护液，每100g尿液加入4g蛋白保护组合物，搅拌均匀，疯狂存放，获得原液。

步骤2)，将原液通过高通量透析器进行透析，高通量透析器的超滤系数为25mL/h/mmHg，取滤液，获得预处理液。

步骤3)，将预处理也通过低通量透析器进行透析，低通量透析器的超滤系数为5mL/h/mmHg，滤出水分，至剩余液体的体积为预处理液体积的1％，收取剩余液体，获得β2-微球蛋白浓缩液。

步骤4)，将β2-微球蛋白浓缩液通过超滤管进行超滤分离纯化，超滤管中超滤膜的切割分子量为30000，收集超滤液，得纯化β2-微球蛋白浓缩液，将纯化β2-微球蛋白浓缩液通过冷冻干燥机进行干燥，得β2-微球蛋白冻干粉。

实验1

称量各实施例及对比例的β2-微球蛋白冻干粉10g，投入100g去离子水中，搅拌30s，静置1h，得β2-微球蛋白溶液试样。

取球面状筛网，筛网底部压成平面，使筛网能稳定放置于桌面，筛网为8000目筛网，称量筛网重量，记为初始重量，将β2-微球蛋白溶液试样通过筛网过滤，将筛网静置干燥24h，称量干燥后的筛网重量，记为含蛋白重量。

按以下公式计算失活蛋白占比。

失活蛋白占比(％)＝(含蛋白重量-初始重量)÷10×100％。

由于具有活性的的β2-微球蛋白溶解度较高，若蛋白质全部保持活力，则理论上，10g的冻干粉会全部溶解在100g去离子水中，而失活的β2-微球蛋白由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。

通过筛网截留沉淀，并一同称量，使得含蛋白重量为筛网重量与失活的β2-微球蛋白重量之和，通过上式计算，即可算出沉淀的重量占投入量的百分比，即认定为失活蛋白占比。

实验2

称量各实施例及对比例的β2-微球蛋白冻干粉1g，投入10g无热原水中，搅拌30s，静置1h，得β2-微球蛋白溶液试样。

取1mlβ2-微球蛋白溶液试样加入凝胶法快速内毒素检测试剂盒中，轻轻摇匀至完全溶解，避免产生气泡，垂直放入37℃恒温水浴箱中放置30min，观察试管中是否形成坚实凝胶，若为坚实凝胶则为阳性，若不呈凝胶或虽生成凝胶但不能保持完整并且能从管壁滑脱则为阴性。

凝胶法快速内毒素检测试剂盒购置与科德角国际生物医学科技(北京)有限公司，型号为PSD25010T，灵敏度标示值为0.25EU/ml。

若结果呈阳性则证明β2-微球蛋白溶液试样中内毒素含量大于0.25EU/ml，若结果呈阴性则证明β2-微球蛋白溶液试样中内毒素含量小于0.25EU/ml。

实验3

取1mgβ2-微球蛋白冻干粉溶解于1L去离子水中，搅拌均匀，形成β2-微球蛋白理论浓度为1mg/L的β2-微球蛋白溶液试样。

采用放射免疫法检测β2-微球蛋白溶液试样中β2-微球蛋白的浓度，得β2-微球蛋白实际浓度，采用下式计算β2-微球蛋白冻干粉中β2-微球蛋白的含量。

β2-微球蛋白含量(％)＝β2-微球蛋白实际浓度÷β2-微球蛋白理论浓度×100％

实验1-3的具体减少数据详见表2。

表2

根据表2中实施例1与对比例1的数据对比可得，实施例1由于采用了牛血清白蛋白、硫酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、茶多酚、葡聚糖的复配组合物对β2-微球蛋白进行保护，使得β2-微球蛋白更好的保持活性，失活占比较少，从而使得检测到的β2-微球蛋白含量更高，证明实施例1提前得到的β2-微球蛋白具有更好的活性，质量更佳。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1），向尿液中加入牛血清白蛋白、硫酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、茶多酚、葡聚糖，混匀，形成原液；

步骤2），将原液通过高通量透析器进行透析，收取滤液，得预处理液；

步骤3），将预处理液通过低通量透析器进行透析，滤出水分，至剩余液体体积为预处理液体积的1%-2%，得β2-微球蛋白浓缩液；

步骤4），将β2-微球蛋白浓缩液进行纯化，得β2-微球蛋白成品。

2.根据权利要求1所述的一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，其特征在于：所述高通量透析器的超滤系数为25-26mL/h/mmHg。

3.根据权利要求2所述的一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，其特征在于：所述低通量透析器的超滤系数为5-6mL/h/mmHg。

4.根据权利要求1所述的一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，其特征在于：所述步骤3）中，滤出水分，至剩余液体体积为预处理液体积的1.5%。

5.根据权利要求1所述的一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1）中，牛血清白蛋白的投入质量为尿液质量的2-3%、硫酸镁的投入质量为尿液质量的1%-2%、聚乙烯吡咯烷酮的投入质量为尿液质量的2%-3%、茶多酚的投入质量为尿液质量的0.5-0.7%、葡聚糖的投入质量为尿液质量的0.3-0.5%。

6.根据权利要求5所述的一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1）中，牛血清白蛋白的投入质量为尿液质量的2.6%、硫酸镁的投入质量为尿液质量的1.3%、聚乙烯吡咯烷酮的投入质量为尿液质量的2.2%、茶多酚的投入质量为尿液质量的0.6%、葡聚糖的投入质量为尿液质量的0.4%。

7.根据权利要求1所述的一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，其特征在于：所述步骤4）中，采用超滤分离纯化装置对微球蛋白浓缩液进行超滤分离纯化。

8.根据权利要求7所述的一种从尿液中提取β2-微球蛋白的方法，其特征在于：所述超滤分离纯化装置的切割分子量为20000-30000。