SE451850B - Sett att framstella ett glykoprotein med kend formaga att stimulera bildning och differentiering av humana granulocyter - Google Patents

Description

15 _w ZS 30 35 40 2 451 850 [Nakaaki Osawa et al, Acta Hematologica Japonica, vol. 42, nr 2, 237 (1979)]. Bland dessa metoder är de förstnämnda två metoder n '. ,som eventuellt skulle kunna ge CSP som lämpar sig för farmaceutisk användning. Konventionella metoder för utnyttjande av dessa celler utgöres emellertid av experimentella metoder för framställning av små mängder av CSF och lämpar sig ej för framställning i stor skala. ' Dessutom utgör serum vid framställning av CSF enligt konventionella metoder en oundgänglig beståndsdel i mediet för odling av cellerna (om serum ej förekommer i mediet bildas ej CSF) och bovinserum el- ler fetalt kalvserum har konventionellt använts. För undvikandeå av biverkningar orsakade av främmande proteiner som ingår i dessa medier är det nödvändigt att proteinerna avlägsnas efter odling " av cellerna eller att humanserum användes. Avlägsnandet av sådana proteiner från CSF bildat i mediet fordrar en besvärlig teknik och är svår att genomföra under det att humanserum uppvisar den olägen- heten att det är dyrt, vilket medför dryga framställningskostnader.

Trots det faktum att användning av CSF såsom ett farmaceutiskt medel och såsom ett diagnostiskt reagens är känd har hittills inget förfarande utvecklats för framställning av en CSF-produkt,som ej' uppvisar några biverkningan i stor skala och till låg kostnad.

' Ett syfte med föreliggande uppfinning är följaktligen till- handahållande av ett förfarande som medger framställning i stor Skflla av CSF som ej uppvisar nägra biverkningar och som kan använ- das såsom botemedel för human granulocytopeni och såsom ett diag- nostiskt reagens för myelogen leukemi.

Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för framställ- ning av en känd substans som kan stimulera bildningen och diffe- rentieringen av humana granulopoietinstamceller, genom odling av perifera leukocyter från en frisk människa, karakteriserat av od- ling av åtminstone 105 monocyter och makrofager från perifert blod från en frisk människa per ml syntetiskt vätskemedium för vävnads- odling, som innehåller åtminstone 0,1 pg, per ml av mediet, av ett första glykoprotein separerat från human urin, och som har en känd förmåga att stimulera bildningen av humana granulocyter, eller åt- minstone 500 enheter, per ml av mediet, av ett andra glykoprotein, separerat från human urin och som har en känd förmåga att stimule- ra bildningen av musmakrofager och -granulocyter, varigenom den ak- tiva substansen bildas i mediet och utvinning av den aktiva sub- stansen från mediet.

Glykoproteinet som kan stimulera bildningen av humana granu- locyter (betecknas hädanefter glykoprotein (H)) som har isolerats 1/ 1D 15 20 25 30 35 40 s - i 451 850 ur human urin och som användes enligt uppfinningen beskrivs närmare i den japanska patentskriften T40,7Û7/79, den västftyska Offenlegungs- schrift 2 910 745 och den brittiska patentskriften 2 016 477.

Ett glykoproteín som kan stimulera bildning av musmakrofager och -granulocyter [betecknas hädanefter glykoprotein (M1], som har isolerats ur human urin har beskrivits såson1ett känt sialínsyra- haltigtglykoprotein av Stanley och Metcalf, Australian Journal of Experimental Biological Medical Science, 47, 467-483 (1969); Stanley et al, Federation Proceedings, 34, nr 13, 2272-2278 (197S)f Laukel et al, Journal of Cellular Physiology, 94, 21:30 (1978) och i flera andra skrifter. I Det syntetiska mediet för vävnadsodling som användes enligt--__ uppfinningen kan utgöras av ett kommersiellt syntetiskt medium för- användning vid vävnadsodling eller cellodling, exempelvis då McCoy's SA-medium [McCoy, T.A., Maxwe1l,_M., och Kruse, P.F.: Proc.

Soc. Exper. Biol. and Med., 100: 115-118 (1959), säljes av Gibco Co.], näringsblandning HAMF-10 [Ham. R.G., Exp. Cell Res., 29: 515-S26, säljes av Gibco Co.], RPM1-1640 [lwakata, S., Grace J.T.

Jr., N.Y.J. of Med., 64/18: 2279-2282 (september 15, 1964), säljes av Nissui Seiyaku Co.], eller av aminosyrakompletterat Eagle's MEM-medium [Éagle, H., Science 130: 432 (1959), säljes av Nissui Seíyaku Co.]. ~ ' .

Förfarandet enligt uppfinningen beskrives närmare i det föl- jande. ' ' (1) Isolering av monocyter och makrofager .

Blod tillvaratogs från venen från friska individer me- delst en hepariniserad spruta och infördes i ett sterilt provrör som fick stå vid rumstemperatur under 1-2 timmar. Bfterföljande steg genomfördes alla under aseptiska betingelser. Efter att pro-- vet har fått stå tillvaratogs det övre leukocytskiktet, tvättades en gång med ett syntetiskt medium för vävnadsodling och utsattes för densítetsgradientcentrifugutfällning [Mahmood, T. och W.A.

Robinson, Blood, 51, nr 5,879-887 (19781] för fraktioneringtiïlett skikt innehållande monocyter, makrofager och lymfocyter och ett annat skikt innehållande granulocyter. Det förstnämnda skiktet tillvaratogs för erhållande av en cellfraktion. Cellfraktionen uppslammades í ett kommersiellt syntetiskt medium för vävnadsod- ling (betecknas i det följande helt enkelt medium) och centrífuge- rades för avlägsnande och bortkastande av övervätskan. Sålunda tillvaratagna celler tvättades genom tillsats av samma medium som använts ovan. Tvättningen upprepades åtminstone tvâ gånger. De 10 15 20 25 30 35 40 451 850 4 tvättade cellerna uppslammades i en liten volym av samma medium. En 'del av erhållen suspension uttogs och antalet celler uppmättes med en automatisk blodcellräknare. Förhållandet av antalet monocyter och makrofager till lymfocyter bestämdes genom mikroskopisk undersökning av ett utstruket prov behandlat_med Wright-Giemsa-färg. Cellsuspen- sionen ströks ut över en Petri-skål tillverkad av glas eller av plast så att antalet ympprover (monocyter och makrofager) kan uppgå till 105-107 per skål, försattes där- efter med ett kommersiellt syntetiskt medium för vävnadsodling kom- föreskrivet värde, företrädesvis då pletterat med 5-20 % (volymprocent baserat på mediet; samma sak gäl- ler i det följande) av serum och fick stå vid 3700 i fuktig atmosfär av 5 %-C02 i luft under 1-2 timmar. Under den period provet fick stå; hâftade monocyter och makrofager vid bottenytan av skålen under det att lymfocyter förblev uppslammade i mediet» Mediet förkastades där- efter och skålen tvättades flera gånger genom tillsats av ett medium som ej innehöll serum eller en fysiologisk saltlösning. Efter behand- lingen har de flesta av lymfocyterna avlägsnats då däremot monocyter och makrofager förblev vidhäftade bdttenytan av skålen. Vid mikrosko- pisk undersökning visade det sig att 95 % eller mer av cellerna som häftade vid bottenytan utgjordes av monocyter och makrofager och att antalet uppgick till 1o5-1o7per skål. (2) Odling av monocyter och makrofager Till ovannämnda odlingsskâl sattes ett syntetiskt medium med eller utan serumtillsats och innehållande åtminstone 0,1 pg/ml (medium) av glykoprotein (H) eller glykoprotein (H)-haltig frak- tion, eller åtminstone 500 enheter/ml (medium) av glykoprotein _ (M) eller en glykoprotein (M)-haltig fraktion (glykoproteinenheten beskrivas senare) sålunda att populationsdensiteten av monocyter och makrofager kan bli åtminstone 105/ml (medium). Det ympade mediet inkuberades vid 37°C i en fuktig atmosfär av 5 % C02 i luft under 1-7 dagar för framställning av CSF i mediet. Det synte- tiska mediet som användes ovan utgjordes av det ovannämnda kommer- siella mediet för vävnadsodlingn I De optimala betingelserna för framställningen av CSF enligt _ uppfinningen med avseende på odlingsvaraktighet, mängden av glyko- protein som skall tillsättas, mängden av celler som skall ympas, mängden av serum som skall inneslutas och typen av medium beskri- ves senare i utföringsexemplen.

Vid framställning av CSF för farmaceutisk användning enligt uppfinningen användes ett medium kompletterat med humanserum eller ett serumfrítt medium för undvikande av biverkningar orsakade av 10 15 20 25 30 35 40 5, 451 sso främmande proteiner. Vid användning av CSF för användning såsom ett diagnostiskt reagens kan däremot ett medium vartill bovinserum eller fetalt kalvserum tíllsatts användas. Det är också möjligt att använda en odlingskohri stället för odlíngsskålen. Vidare kan sådana monocyter och makrofager som har undergått odling användas_ på nytt. _ i ' (3) Glykoprotein som skall sättas till ett medium Glykoproteinet som användes i förfarandet enligt uppfin- ningen är ett sådant som har isolerats ur human urin och som kan stimulera bildningen av humana granulocyter eller musmakrofager och -granulocyter eller en fraktion innehållande ett sådant glyko- protein.

Glykoproteinet som kan stimulera bildningen av humana granulo- cyter kan erhållas såsom beskrives i den japanska patentskriften 140,70?/79 och i de övriga patentskrifterna, såsom beskrives i det följande.

Färsk urin tillvaratogs från friska individer och justerades till pH 6-9, och företrädesvis 7-8, med utspädd sur eller alkalisk lösning och centrifugerades för avlägsnande av föroreningar ingåen- de i urinen. Sålunda erhållen övervätska bringades i kontakt med ett kiselhaltigt adsorptíonsmedel, exempelvis kiselgel, kiselgel- -magnesiumsilikat, diatomacéjord, kiselglas eller bentonit och de adsorberade komponenterna späddes med en alkalisk lösning av före- trädesvis pH 9 eller högre. Den alkaliska lösningen som användes för elueringen är ej specifik utan är företrädesvis en vattenhal- tig lösning av ammoniumhydroxid, natriumhydroxid eller liknande i en koncentration av 0,3-1,5 M. Sålunda erhållet eluat justera- des till pH 7-8 och justerades med ett neutralt salt, exempelvis ammoniumsulfat, till 70 % mättnad, för utsaltning av den aktiva substansen, varigenom en råfraktion innehållande glykoprotein er- hölls. ' Denna råfraktion löses på nytt i en liten mängd av en alkalisk lösning, som befriats från lågmolekylära substanser uppvisande en molekylvikt av 10 000 eller lägre genom ultrafiltrering och bring- ades i kontakt med en katjonbytare (exempelvis karboximetyldextran, karboximetylcellulosa eller fosfocellulosa) för avlägsnande av föroreningarna ingående i lösningen. Före denna kontakt ekvilibre- rades såväl råfraktionen innehållande glykoprotein som jonbytaren till pH 6-8 med en företrädesvis 0,01-0,15 M buffertlösníng så att kontakten kunde genomföras under betingelser av nästan neutralt 10 15 20 25. 30 35 40 451 850 6 pH-värde. Det mesta av glykoproteinet passerar genom jonbytaren utan att adsorberas. Efter koncentrering ekvilibrerades det kon- centrerade utflödet med en utspädd buffertlösning av pH 6-8 och påfördes en anjonbytarkolonn (exempelvis DEAE-cellulosa) ekvíli- brerad med samma buffert som ovan för adsorptíon av glykoproteinet på kolonnen. Det adsorberade glykoproteinet eluerades genom så * kallad lineär koncentrationsgradientelueringnæd användning av en 0,1-0,3 M saltlösning, exempelvis en natriumkloridlösning. Glyko- proteínet eluerades vid en saltkoncentration av 0,1 M eller högre men perfekt separation är svår att uppnå. Utflödesfraktionerna vid 0,1-0,3 M saltkoncentrationer sammanslogs och eventuellt av- saltades den sammanslagna fraktionen och koncentrerades (denna fraktion betecknas fraktion A). Fraktíonen A kan användas såsom sådan i förfarandet enligt uppfinningen.

Det är också möjligt att glykoproteinfraktionen innan den ut- sättes för den lineära koncentrationsgradientelueringen renas ge- nom adsorption på en anjonbytare och stegvis eluering med 0,1-0,3 M saltlösning. I För att ytterligare rening skall uppnås utsättes fraktion A erhållen.ovan för gelfiltreringskromatografi på en höggradígt för- nätad polymer-gel uppvisande ett vattenåtervinningsvårde av G-1so enar Biogeiß' P-1oo; de ak- tiva substanserna framkallas med en 0,05-0,1 M saltlösningsbuffert och fraktioner uppvisande ett relativt utflödesvärde av 1,11-1,60, och företrädesvis 1,11-1,45, tillvaratages, avsaltas och koncen- treras eller lyofiliseras (denna fraktion betecknas fraktion B).

Den glykoproteinhaltíga fraktionen B som erhållits på detta sätt kan också användas i förfarandet enligt uppfinningen. Den re- 10-20 ml/g, exempelvis Sephade lativa utflödesvolymen som hänvisas till utgöres av den volym som uttryckes av förhållanden Ve/V0 (varvid Ve betecknar volymen av lösningsmedel som fordras för eluering av substansen i kolonnen och V0 betecknar gelkolonnens porvolym).

För ytterligare rening löstes den halvrenade substansen som erhållits ovan i en utspädd buffertlösning innehållande 1,0-2,0 M salt, exempelvis en fosfatbuffertlösning vid pH 6,0-8,0, och företrädesvis 6,0-7,0, innehållande 1,0-2,0 M natriumklorid och utsattes för affínitetskromatografi med en sockeraffinitetsadsor- bent, exempelvis concanavalin A - Sepharose 4B (erhållen från Pharmacia Fine Chemical) som har ekvilibrerats med samma buffert- lösning. Glykoproteinet som adsorberats på affinitetskolonnen 10 15 20 25 30 35 451 850 elueras med en 1,0-2,0 M saltlösning i utspädd buffert vid pH 6,0-8,0, och företrädesvis 6,0-7,o,.inneha11anae zo-100 mn sacka- rid [exempelvis zx~metyl-D-glukosidj. Fraktionerna innehållande glykoprotein kombineras och om nödvändigt avsaltas dessa och kon- centreras eller lyofilíseras.Denna fraktion kan också användas i föreliggande förfarande. ' För uppnående av ytterligare rening kan denna fraktion utsät- tas för preparativ zonelektrofores med användning av ett bärarme- dium som utgöres av exempelvis en polyakrylamidgel eller agargel, pH 7,0-9,0 och en höggradigt renad glykoproteinfraktion utvínnes från bärarmediet med en utspädd saltlösning under kylning. Denna fraktion avsaltas och koncentreras eller lyofiliseras.Det förenade glykoproteinet kan också användas i förfarandet enligt uppfinningen.

Glykoproteinet som användes i föreliggande förfarande, som stimulerar bildningen av musgranulocyter och ~makrofager har be- skrivits i tidigare nämnda litteratur. Framställningsförfarandet enligt Stanley och Metcalf, enligt Stanley et al och enligt Laukel et al beskrives närmare i exempel 6, 5 respektive 7 i det följande.

Den biologiska aktiviteten av glykoproteinberedningarna mot musbenmärgceller undersöktes på följande sätt och uttrycktes såsom "enheter". Till fe- talt kalvserum, O,3'% agar och 1 x 105 benmärgsceller från möss av typ C57B1/6J kas eller av en 1 ml McCoy's 5A-medium kompletterat med 20 % sattes 0,1 ml av glykoprotein som skulle undersö- fraktíon innehållande detta. Det glykoproteinhal- tiga mediet som framställts sålunda infördes i en Petri-plastskâl med 35 mm diameter och inkuberades vid 37oC i fuktig atmosfär av 5 % des antalet diskreta kolonier som var C02 i luft under 7 dagar. Efter fullbordad inkubering räkna- och en innehöll 50 eller flera celler medelst ett inverterat mikroskop. Den biologiska ak- tiviteten av ett prov som bildar en koloni antages utgöra en en- het. För utvärdering av reningsgraden av ett glykoproteinprov be- räknades den specifika aktiviteten enligt följande ekvation: enhet av provet mängd glykoprotein eller fraktion innehållande glykoprotein (mg) Specifik aktivitet = Den specifika aktiviteten ökar med ökande reningsgrad. Glyko- proteinet eller den glykoproteinhaltiga fraktionen som sättes till mediet enligt föreliggande förfarande kan utgöras av ett renat sådant uppvisande en hög specifik aktivitet men utgöres företrädes- 10 15 20 25- 30 40 451 sso 0 8 vis av ett sådant uppvisande en ganska lâg aktivitet som erhålles under reningsförloppet. Mängderna av glykoprotein (H) och (M) some skall sättas till mediet är åtminstone 0,1 pg, och företrädesvis 10-100 pg/1 ml medium respektive åtminstone 500 enheter, och före- trädesvis 1000 enheter eller mer/ml medium. ' (4) Utvinning av den aktiva substansen ur det konditionerade ' mediet Det konditionerade mediet innehållande CSF som framställts såsom beskrivits ovan tillvaratogs från Petri-skålen och centrifu- gerades vid 1000-2000 g under 5-10 minuter för erhållande av en övervätska som innehöll höggradigt aktivt CSF.

Denna övervätska är användbar för framställning av ett kli- niskt diagnostiskt reagens eller ett referensreagens för testning av bildningen av kolonier av human granulopoietinstamceller. För detta ändamål justerades aktiviteten av övervätskan sålunda att 0,1 ml av övervätskan kunde innehålla en CSF-aktivitet som år tillräcklig för bildning av åtminstone 100 humana granulocytkolo- nier, filtrerades genom ett membranfilter, fylldes aseptiskt i en behållare och denna förseglades hermetiskt för erhållande av ett flytande reagens. Ett reagens i pulverform kan framställas genom aseptisk lyofilísering av ovannämnda steríla fíltrat.

För farmaceutísk användning díalyseras ett konditionerat me- dium erhållet genom användning av ett serumfritt medium eller ett medium kompletterat med humanserum mot vatten för avlägsnande av mediumbeståndsdelar och steriliserades genom membranfiltrering.

Eventuellt koncentrerades filtratet, fylldes aseptiskt i en behål- lare och denna förseglades hermetiskt för erhållande av en farma- ceutisk beredning i flytande form. Det är också möjligt att erhål- la en farmaceutisk beredning i pulverform genom sterilisering av den díalyserade lösningen genom membranfiltrering och aseptisk lyofilísering.

För ytterligare rening av CSF för farmaceutisk användning separerades ovannämnda övervätska i en högmolekylär fraktion (molekylvikt överstigande 5000 eller 10 000) och en lågmolekylär fraktion (molekylvikt understigande 5000 eller 10 000) medelst ett ultrafiltreringsmembran (molekylviktuteslutning 5000 eller 10 000). Fastän bägge fraktíonerna innehöll CSF förekom 90 % mer av CSF i den högmolekylära fraktionen. eller En farmaceutisk produkt kan erhållas genom koncentrering av den lågmolekylära fraktionen i vakuum. Koncentratet av den hög- 10 15 20 25- 30 40 9 451 aso molekylärafraktionen löstes i en 0,01-0,1 M buffertlösning (pH 6,0-8,0) och bringades i kontakt med ett anjonbytarharts, exempelvis DEAE-cellulosa, DEAE-Sephadefæ eller QAE-Sephade§®, som har ekvilíbrerats med nämnda buffertlösning för adsorption av CSF på hartset. Adsorberat CSF på hartset eluerades med 0,1-0,3 M buffertlösning (pH 6,0-8,0] för erhållande av en renad produkt.

Nämnda eluat kan renas ytterligare genom koncentrering och efterföljande molekylsiktkromatografi genom gelfiltrering. Gelen för gelfiltreringen kan utgöras av vilken som helst av följande: kommersiell Sephade§® G-150,'Biogef® P-100 och Ultrogef®.ACA-44.

När CSF-aktiviteten åstadkommes genom användning av ett serumfritt medium kan behandlingen med ett anjonbytarharts uteläm- nas och reningen genomföras direkt genom gelfiltreringskromatogra- fi. En lämplig framkallningsbuffertlösning för gelfiltreringskro- matografi är 0,01-0,3 M buffertlösning (pH 6,0-8,0). CSF-aktivi- tetsfraktionerna som erhålles genom gelfiltrering sammanslàs och de sammanslagna fraktflmærna koncentreras, avsaltas och lyofilise- ras för åstadkommande av en renad CSF~produkt.

De renade CSF-produkterna som erhållits ovan analyserades med avseende på förorenande proteiner genom ímmunoelektrofores med an- vändning av humant antíserum och bovinantiserum. Spårmängder av globulinliknande humanproteiner och serumalbumin och globulinlik- nande proteiner som bägge förmodligen härstammade från fetalt kalvserum detekterades i CSF-produkterna erhållna från ett medium kompletterat med fetalt kalvserum. Eftersom absolut inga sådana proteínhaltiga substanser kan detekteras i CSF framställt i serum« fritt medium kan detta däremot användas såsom en farmaceutisk be- redning som är fri från biverkningar.

För injektioner användes de flytande farmaceutiska produkter- na såsom sådana och de pulverformiga produkterna löses lämpligen i sterilt vatten, steril fysiologisk saltlösning eller liknande före användning.

Den farmaceutiska produkten som framställts med föreliggande förfarande administreras till en patient med granulocytopeni i en effektiv dos överstigande 77,8 mg/kg kroppsvikt,dag.

Testexempel 1. på inkubationsperioden.

I detta exempel beskrives experiment med avseende (1) Isolering av monocyter och makrofager och framställning av glykoprotein Monocyter och makrofager isolerades såsom beskrives i 10 15 20 ZS. 10 451 850 följande exempel 1 - (1). Glykoproteinerna som användes i detta experiment framställdes såsom beskrives i-följande exempel 1 - (2) och exempel 5 - (2). Glykoprotein (H) framställt såsom i exempel 1 - (2) utgjordes av en höggradigt renad produkt i slutreningssta- diet och glykoprotein (M) framställt såsom i exempel 5 - (2) ut- gjordes av en produkt av standardrenhetsgrad: specifik aktivitet 180 000).

(Z) Inkubering av monocyter och makrofager W Två medier vart och ett innehållande 100 pg/ml av glyko- protein (H) och två glykoproteinfria medier framställdes. Såsom medier användes serumfritt McCoy's SA medium och kompletterat McCoy's SA medium innehållande 20 % fetalt kalvserum.

Till varje Petri-skål inhållande monocyter och makrofager vidhäftande botten sattes vart och ett av de fyra medierna i en mängd av 106 monocyter och makrofagerper ml medium. Varje medium inkuberades på samma sätt som i exempel 1 - (3). En förutbestämd volym av mediet uttogs från varje skål före inkubering och efter inkubationsperioder av 1, 3, 5 och 7 dagar.

Detta förfarande upprepades förutom attglykoprotein (M) an- vändes í en mängd av 1000 enheter/ml medium i stället för nämnda mängd av glykoprotein (H). (3) Undersökning av CSF i konditionerat medium CFS-aktiviteten för varje konditionerat medium undersök- tes genom bildningen av kolonier av humana benmärgceller. Benmär- gen uttogs från sternum av friska individer medelst en heparinise- rad spruta efter sternalpunktur. Den uttagna benmärgen centrifuge- rades vid 1000 g under 10 minuter för tillvaratagande av den gula hinnan. Den gula hinnan tvättades med MacCoy's SA medium, uppslam- 30 35 40 mades i McCoy's SA medium innehållande 20 % serum, ströks ut i en Petri-skål, försattes med flera mg/ml medium av ett pulverformigt karbonyljärn som hade utsatts för torrluftsterilisering och fick stå i en ínkuberingsanordning vid 37°C under 1-2 timmar. Efter att det hade fått stå fixerades fagocytcellerna som hade fagocy- terat partiklarna av karbonyljärn vid botten av Petri-skålen me- delst en magnet och överliggande cellsuspension tillvaratogs. De uppslammade cellerna är icke vidhäftande, icke-fagocytiska ben- märgceller och användes för bestämning av CSF-aktiviteten. Dessa benmärgceller tvättades genom centrifugering och uppslammades i en liten volym av mediet. Antalet kärninnehållande celler i sus- pensionen räknades efter behandling med en ättiksyra-gentaínfärg. 10 1* 451 sso De icke vidhäftande, icke-fagocytiska kärninnehållande celler- na sattes till McCoy's SA medium innehållande 0,3 % agar och 20 % fetalt kalvserum så att mediet innehöll 2 x 105C8ller/ml medium.

Efter tillsats av det konditionerade mediet ifen mängd av 0,1 ml/ml medium inkuberades det ympade mediet vid 3700 i fuktig atmos- fär av 5 %_CO2 i luft under 10 dagar. Efter inkubering räknades antalet kolonier bland bildade cellaggregat under ett mikroskop (härvid avses med uttrycket "koloni" ett cellaggregat innehållande 40 celler eller fler). CFS-aktiviteten uttrycks i antalet kolonier och användes såsom ett mått på bildningen av CSF. Resultaten anges i tabell 1. labell 1 Qdlíngs- CSF-aktivitet (antal kolonier) per 0,1 ml betinge1_ konditionerat medium mha» ser Éïïïëïfiïïfiïïåm Sfl“m*“tm“fim tions- period Glykoj 'Ingen glyko- Glykof š:š:2iš¶yk°' (dagar) protein- protein- protein- tillsats tillsats tillsats tillsats Glykoprotein (H) Före V inkubation . _O 0 0 0 1 13ï3 3¿1 z¿1 0 3 116ï4 z4ï3 zsïz 1ï1 s 11733 zsï1 2oï1 o 7 9sï1 16f4 1sï1 o Glykoprotein (M) Före inkubatíon 0 O 0 0 1 zoïs 6ï4 o o 1 3 ssïe z9ïs ssï4 sï1 5 sßïs søï4 soïe 4ï1 1 6934 1sïz z3ï4 zï1 10 15 20 12 451 850 Såsom framgår av tabell 1 visar det sig att genom tillsats av vardera glykoproteinet blev CSF-bildningen nästan maximal på den tredje inkubatíonsdagen i varje medium. I mediet innehållande 20 % fetalt kalvserum blev CSF-bildningen avsevärt större i när- varo av glykoprotein än i frånvaro av glykoprotein (konventionell metod). I det serumfria mediet bildades CSF när glykoprotein till- sattes under det att CSF knappast bildades när glykoprotein ej tillsattes." Av dessa resultat är det uppenbart att vid framställning av CSF genom odling av monocyter och makrofager in vitro stimulerar dessa glykoproteiner bildningen av CSF vare sig mediet innehåller serum eller ej. Det visade sig också att en lämplig inkubations- period är3-7 dagar, och företrädesvis då 3 dagar. Det bör framhål- las att när monocyter och makrofager ej ympades detekterades ingen CSF-aktivitet i det konditionerade mediet vare sig glykoprotein var närvarande eller ej.

Testexempel 2. Experiment genomfördes i detta exempel med avse- ende på mängden av glykoproteín som tillsattes mediet" Medier framställdes genom tillsats av samma glykoproteiner (H) och (M) som använts i testexempel 1 till McCoy's SA medium kompletterat med 20 % fetalt kalvserum och till serumfritt McCoy's 5A medium. För fallet glykoproteín (H) var mängden som tillsattes _ mediet 0,1, 1,0, 10,0 eller 100 pg/ml medium. För fallet glykopro- 25, 30 tein (M) var tillsatt mängd 100, 500, 1000 eller 2000 enheter/ml medium. Varje medium som framställts sålunda hälldes över i Petri- skålen innehållande vidhäftade monocyter och makrofager och ínku- berades under 3 dagar på samma sätt som i testexempel 1. CSF-akti- viteten för varje konditionerat medium undersöktes såsom i test-' exempel 1 för undersökning av CSP-bildningen. Prov som erhållits genom ínkubering av varje medium utan tillsats av glykoprotein användes såsom kontroll. Erhållna resultat anges i tabell 2. 10 15 13 _ 451 850 Iabell 2 Tillsatt mängd CSF-aktivitet (antal kolonier)-per 0,1 ml glykoprotein konditionerat medium Medium innehållande Serumfritt ' 20 % fetalt kalvserum medium , Glykoprotein (H) I (pg/ml) 0 (kontroll) 24 ï 3 1 ï 1 0,1 51 ï 2 9 f 1 1,0 116 ï zs É 2 10 0 166 ï 10 ss f 3 100,0 170 f s so 1 4 Glykoprotein (M) (enheter/ml) 0 tkontroii) 21 i z i 1 100 za ï 6 f 3 500 96 i 10 13 i 6 1000 129 ï s 49 ï 6 2000 170 3 ss ï s Såsom framgår av tabell 2 ökade CSF-bildningen genom tillsatsen av vardera glykoproteinet med ökad mängd tillsatt glykoprotein.

Med hänsyn till dessa resultat samt tidigare resultat angivna i tabell 1 (resultat erhållna genom 3 dagars inkubation) kan det an- tagas att CSF-bildning ökas väsentligt genom närvaro av 0,1 pg glykoprotein (H) eller 500 enheter glykoprotein (M) i 1 ml medium.

Enligt föreliggande förfarande är följaktligen mängden glykoprotéin som skall sättas till 1 ml medium åtminstone 0,1 pg, och företrädes- vis 10-100 pg, för glykoprotein (H) och åtminstone_500 enheter, och företrädesvis 1000 enheter eller mer, för glykoprotein (M).

Testexempel 3. på mängden monocyter och makrofager som mediet ympades med.

En serie av konditionerade medier framställdes genom upprep- I detta exempel genomfördes experiment med avseende ning av förfarandet enligt testexempel 1 förutom att antalet mono- cyter och makrofager som ympades i 1 ml medium var 0, 103, 104, 105 eller 106; 1 pg av glykoprotein (H) eller 500 enheter av glyko- protein (M) sattes till 1 ml McCoy's SA medium, kompletterat med 20 1 kubationsperioden var 3 dagar. Erhållna konditionerade medier fetalt kalvserum eller serumfritt McCoy's SA medium; och in- 451 850 14 undersöktes med avseende på CSF-aktivitet för undersökning av I bildningen av CSF på samma sätt som vid testexempel 1. Försöksre- sultaten finns angivna i tabell 3.

Tabell 3 Antal inkuberade I CFS-aktivitet (antal koloníer) per celler 0,1 ml konditionerat medium (antal/ml) Medium innehållande Serumfritt 20 % fetalt kalvserum medium Medium innehållande glykoprotein (H) 0 0 0 3 10 13 3 1 0 104 zo É z 6 3 1 105 116 f 4 zs É 2 106 1ss É 7 69 ï 5 Medium innehållande glykoproteín (M) 0 0 D _1o3 19 ¿ 6 o 104 29 É 10' s ¿ 105 ss ï 31 ï 106 169 É 74 ï Såsom framgår av tabell 3 bildades en stor mängd CSF i vilket S som helst av i detta experiment använda medier när åtminstone 105 celler ingick i 1 ml av mediet. Enligt föreliggande förfarande är' det följaktligen önskvärt att åtminstone 105 monocyter och makro-- fager inkuberas i 1 ml av mediet.

Testexemgel 4. 10 med avseende på CSF-bildning i flera medier.

Med avseende på CSF-bildning jämfördes fyra kommersiellt till~ gängliga medier för vävnadsodlíng eller cellodling med varandra.

Använda medier i detta experiment innefattade McCoy's SA medium (Gibco Co.), näringsblandning HAMF-10 (Gibco Co.), RPMI-1640 15 (Nissuí Seiyaku Co.) och Eagle's MEM medium kompletterat med amino- syror (Nissui Seiyaku Co.).

I detta exempel genomfördes jämförande experiment _Till vart och ett av medierna som ej innehöll tillsatt serum sattes 1,0 pg/ml medium av glykoprotein (H) eller 500 enheter/ml medium av glykoprotein (M). De framställda medierna inkuberades 20 under 3 dagar på samma sätt som i testexempel 1.

De konditionerade 15 451 ssn medierna undersöktes med avseende på CSF-aktivitet på samma sätt som i testexempel 1 för undersökning av CSF-bildningen. Erhållna resultat framgår av tabell 4.

Tabell 4 -CFS-aktivitet (antal kolonier) per 051 ml konditionerat medium Medium Glïïoproteín (H)- Glïïoprotein (M)- ti sats ti sats Mccoy's SA 69 3 s ss-ï 6 Hmm- w N ïz veïs RPM: - 1640 _75 3 3 s1 i 1 MEM 48 f 1 46 f 5 Av tabell 4 är det uppenbart att vilket som helst av dessa fyra medier kan användas för genomförande av förfarandet enligt uppfinningen fastän CSF-bildningen är något lägre i MEM-mediet.

Testexempel 5. I detta exempel genomfördes experiment med avse- _ ende på mängden serum som sattes till mediet.

Konditionerade medier erhölls på samma sätt som i testexempel 1 förutom att sådana medier användes som hade framställts genom tillsats till McCoy's SA medium av 0, 5, 10, 20 eller 30 % av hu- manserum (Green Cross Co) eller av fetalt kalvserum (Flow Labora- tory Co) som bägge hade upphettats vid 58°C under 50 minuter, följt av 1 pg/ml medium av glykoprotein (H) eller 500 enheter/ml medium _ av glykoprotein (M); antalet monocyter och makrofager som ympades i varje medium var 105/ml; och inkubationsperioden var 3 dagar.

De konditionerade medierna som erhölls undersöktes med avseende på CSF-aktivitet på samma sätt som í testexempel 1 för undersök- ning av CSF-bildningen. Resultaten anges i tabell 5. 10 15 20 16 451 850 Iabeii 5 Tillsatt mängd CSF-aktivitet (antal kolonier) serum (%] per 0,1 ml konditionerat medium Humanserum- nFetalt kalvserum- _ tillsats tillsats Medium innehållande 4 glykoprotein (H) inge: 25 f z zs ï 2 s ss ï 1_ 43 É 1 10 120 f s 98 ï 3 zo 150 ï 3 116 ï 4 so 141 ïgz 108 f z Medium innehållande 0 glykoprotein (M) inget 21 É s 21 É s 5 49 ï 6 51 É 4 10 109 ï 5 se ï 2 20 124 ï 7 102 f 6 30 123 i s 92 ï 5 Såsom framgår av tabell 5 visade sig CSF-bildningen öka med ökad mängd av vardera serumet som sattes till mediet. Fastän CSF framställes enligt uppfinningen i serumfritt medium kan bovinseru- met eller fetalt kalvserum sättas till mediet när framställning av stora mängder CSF fordras för användning såsom ett reagens. Den effektiva mängden av serum som tillsättes i detta syfte är åtmin- stone 5 %, och företrädesvis 10 % Testexempel 6. ende på tillsatsen av en glykoproteinhaltig fraktion och en hög- gradigt renad fraktion. eller mer.

I detta exempel genomfördes experiment med avse- _ I testexempel 1-5 användes renat glykoprotein såsom den ak- tiva substansen uppvisande en stimulerande effekt på bildningen av humana granulocyter (fall I) och dessutom användes glykoprotein av standardrenhetsgrad (specifik aktivitet 180 000) såsom aktiv substans uppvisande stimulerande effekt på bildningen av musmakro- -fager och -granulocyter (fall II). Följande experiment som genom- fördes på nedan beskrivet sätt visar att enligt förfarandet en- ligt uppfinningen kan ett halvrenat material användas i stället för det renade glykoproteinet i fall I och att en mindre höggra- digt renad fraktion såväl som ett höggradigt renat material kan 10 15 20 25 30 17 451 850 användas i stället för glykoproteinet av standardrenhetsgrad i fall Il.- 0 i De glykoproteinhaltiga fraktionerna som användes i experimen- tet motsvarande fall I utgjordes av fraktioner A och B framställda såsom beskrives i exempel 1 i det följande. Dessa fraktioner sat- tes var och en till serumfritt McCoy's SA medium i varierande ' mängder av 0, 0,5, 1,0, 5,0 och 10 mg/ml motsvarande 0, 8,3, 16,6, 83,3 respektive 166,6 pg/ml medium uttryckt såsom aktivt glyko- protein i fraktion A och 0, 41,7, 83,4, 417 respektive 834 pg/ml medium uttryckt såsom aktivt glykoprotein i fraktion B. Antalet monocyter och makrofager som ympades i varje medium var 105/ml och inkubationstiden var 3 dagar. Konditionerade medier erhölls genom inkubation under för övrigt samma betingelser som i test- exempel 1.

Eftersom fraktionerna A och B innehöll humanserumalbumin ut- söndrat i urin framställdes kontrollprover genom tillsats av human- serumalbumin (Sigma Co) till McCoy's 5 A medium i en mängd motsva- rande den som ingick i medierna framställda ovan; inkubationsbe- tingelserna var desamma som beskrivits ovan.

Varje konditionerat medium undersöktes med avseende på CSF- aktiviteten på samma sätt som i testexempel 1 för undersökning av bildningen av CSF. Erhållna resultat framgår av tabell 6.

Såsmnför fall II var glykoproteinmaterialen som användes i experi- menten fraktion C (specifik aktivitet 21 000), fraktion D (speci- fik aktivitet 54 000) och höggradigt renat material (specifik ak- tivitet 1 240 000), vilka beskrives i exempel 5 och framställdes såsom anges i exempel 5. Konditionerade medier erhölls genom upp- repande av ovan beskrivna experimentella förlopp som användes för fall I förutom att fraktionerna C och D och det höggradigt renade materialet (se exempel S) var och en sattes till medierna i varie- rande mängder av 0, 100, 500, 1000 och 2000 enheter/ml medium i stället för mängderna som angivits för fraktionerna A och B (se exempel 1) och kontrollproverna med användning av humanserumalbu- bin utelämnades. Erhållna resultat framgår av tabell 6. 10 15 20 18 451 850 irabe11 6 Tillsätt mängd CFS-aktivitet (antal kolonier) per 0,1 ml konditionerat medium - Glykoprotein från Fraktion A Praktion B Kontroll exem el 1 ~ (gg/ml) inget 0 0 . D 0,5. 60 É 1 59 f 1 4 ï 1 1,0 121 f 1 114 f 1 6 ï 2 5,0 170 É 3 103 É 3 14 ï 2 10,0 148 É 2 90 f 4 26 ï 1 G1 k t ' f å . . 0 . exšmggïoseln r n Fraktion C Fraktion D Hoggraâigt fena. (enheter/ml) I material inget É 1 z É 1 2 f 1 100 f 2 10 f 4 s f 2 500 36 É 6 37 ï 4 10 ï 3 1000 74 3 5 66 f s 21 f 4 2000 122 ï s 113 É 6 44 ï 9 Effekten av reningsgraden på glykoprotein uppvisande en sti- mulerande effekt på bildningen av humana granulocyter: CSF-bild- ningen i ett medium med tillsats av fraktion A eller B var högre än i kontrollmedíet vilket indikerar att glykoprotein stimulerar CSF-bildningen. I jämförelse med exemplet visat i tabell Z, varvid 10 pg/ml glykoprotein tillsatts det serumfria mediet var CSF-bildÄ ningen högre i exemplet visat i tabell 6, varvid 0,5 mg/ml av fraktion A (8,3 pg/ml uttryckt i glykoprotein) tillsatts fastän en liten mängd glykoprotein tillsattes i det senare exemplet. Detta synes bero på inverkan av serumalbumin och andra icke kända be- ståndsdelar i human urin ingående i fraktion A.

I Genom jämförelse av mediet vartill fraktion A satts med det vartill fraktion B satts med avseende på CSF-bildning framgår det att när den tillsatta mängden är 0,5 eller 1,0 mg/ml är bägge fraktionerna jämförbara med varandra men vid högre halter uppvisar rfraktion B lägre CSF-bildning. Detta beror förmodligen på att hal- ten av serumalbumin från human urin är större i A än i B och på att tillsatsen av fraktion B i en större mängd än 5 mg/ml medför tillsats av glykoprotein i överskott. Om man betraktar bägge dessa resultat kan man förmoda att serumalbumin och liknande som ingår 10 15 20 25 30 35 40 19 451 850 i humant urin och glykoproteinet verkar synergistiskt vid främjan- de av CSP-bildning och att en maximal CSP-bildning uppnås när cirka 100 pg/ml glykoprotein sättes till mediet.

Vad beträffar glykoproteinet uppvisande en stimulerande effekt på bildningen av musmakrofager och -granulocyter (fall II) framgår det av tabell 6 att i samtliga fall ökar CSF-bildningen approxima- " tivt i proportion med mängden av glykoprotein som satts till mediet.

I jämförelse med resultaten som anges i tabell 2 som erhållits med användning av ett serumfritt medium var CSF~bildningen högre för fallet som beskríves i föreliggande exempel varvid fraktion C eller D användes fastän mängden glykoprotein som satts till mediet är samma i det förstnämnda fallet. Detta synes bero på inverkan av serumalbumin och liknande som ingår i fraktionerna C och D som härstammar från human urin. Av resultaten erhållna genom tillsats av ett höggradígt renat glykoproteinmaterial är det uppenbart att fastän CSF-bildningen ökar med ökningen av glykoproteinmaterialet är ökningen mindre än för fallen med fraktionerna C och B och ma- terial av standardreningsgrad (tabell 2). Av dessa resultat kan man förmoda att i serumfritt medium spelar serumalbumin och andra substanser härstammande från human urin samma roll som den av se- på CSP-bildning.

I samtliga fall bör man följaktligen för att genomföra förfa- rum med avseende randet enligt uppfinningen på ett fördelaktigt sätt företrädesvis sätta till mediet ett rått glykoprotein snarare än ett renat glyko- protein. Vid tillsats av ett rätt glykoproteinmaterial tillsättes detta i en mängd av åtminstone 0,1 pg/ml medium för fall I eller av åtminstone 500 enheter/ml medium för fall Il.

Testexempel 7. ende på effektiv dos, etc.

I detta exempel genomfördes experiment med avse- Den effektiva dosen och den akut toxiska dosen (LD50) av CSF framställt enligt förfarandet enligt uppfinningen bestämdes genom följande djurförsök.

Ett konditionerat medium framställt på samma Sätt som i exempel 3 steríliserades genom membranfiltrering, filtrerades där- efter genom ett ultrafiltreríngsmembran (molekylvikt som uteslötsz 10 000) koncentrerades, avsaltades och lyofiliserades för erhållan- de av CSF i pulverform. Efter testning med samma förfarande som använts i testexempel 1 visade humana benmärgceller vara 4500/mg. Såsom jämförelse upprepades sig antalet bildade kolonier med testet med användning av benmärgceller från en mus av typ CSH/He 10 15 20 451 aso - 2° och antalet bildade kolonier med musbenmärgcellerna visade sig vara 7000/mg. 80 hanmöss av typ CSH/He (6 veckor gamla och med en medel- kroppsvikt av 20 g) uppdelades slumpvisí ïóundergrupper om vardera 5 medlemmar. Undergrupperna sammanställdes slumpvis under bildning av 4 grupper vardera innefattande 4 undergrupper. _ ' CSF som erhållits ovan löstes i steril fysiologisk saltlös- ning för erhållande av 3 lösningar av 1 mg/0,1 ml (för grupp I), 2 mg/0,1 ml (för grupp II) och 4 mg/0,1 ml (för grupp III). Varje mus administrerades subkutant med lösningen i en dos av 0,1 ml/mus, dag under 5 dagar i följd. Efter 1, 3, 7 och 11 dagar från begyn- nande administrering uttogs blodprover från fem möss ur en under- grupp i varje grupp (undergrupperna varifrån blodproverna hade tillvaratagits undantogs från ytterligare testning). Antalet leuko- cyter i perifert blod räknades med en automatisk blodcellräknare och antalet granulocyter räknades under mikroskop på Wright-Giemsas färgade utstrykningsprover för bestämning av ökningen av antalet leukocyter och granulocyter beroende på administrering av CSF. En grupp (grupp I) administrerades med 0,1 ml av en steril fysiolo- gisk saltlösning som ej innehöll CSF och behandlades på samma sätt som ovan och användes såsom kontrollgrupp. Experimentresultaten finns sammanställda i tabell 7. 451 850 21 wwßâ m How wwHm>HmwuE Hmwws wøwcm Eom HæHH:m®HwxmwHww @wHm> .N OH x moHn mEE H Hmm NI H@HH®uwoHn HmHmHcw Hmm :owHm> HsHw@cmmwHmoH HoHwwHm mc>Hmm< .H "wmH:zHmE:: _ w Hm HHmH mH Homw “MH Hm» _ZHHmwH QH Hm: m HNQH w Hmfl æfl mm HH .HHÄQH mfläm ago mflšH mïä mi; :ÄH MÅ? H wfö HHNH 3:; oHHwm _12. mflmw mHNH »Ham m mflow æflmm :H3 mHHm æHmH :Hmm »Hi Qwflmm H 1 flæmwwmv .H .H .H .H LH ÉHSQ xofiswmfiø lomzmq loflsxsmø aæoozfimu voH:ßmmø pzuozßma uoazmmfis Qæoozfl@A A@@¶H Hc J>H HHH HH SHPHHHHQV: H HHHEG ./ H HHÉmH 10 15 20 25' 30 35 40 451 san 22 I jämförelse med grupp I (kontroll) visade av CSF-administre- rade grupper grupp II en tvåfaldig förhöjning av antalet leukocy- ter och en nästan tre gånger förhöjning av antalet granulocyter efter ll dagar från påbörjad test (6 dagar efter avslutad admini- strering). I jämförelse med grupp l visade grupp IV en avsevärd förhöjning av cirka 4,5 gånger antalet leukocyter och cirka 8 gånger antalet granulocyter. Av dessa resultat kan en effektiv dos för möss förmodas vara 50 mg/kg kroppsvikt, dag. Eftersom koloníbildningsaktiviteten av CS? som utnyttjades i detta experi- ment är högre i musbenmärgceller än i humanbenmärgceller medelst en faktor 1,556 kan en effektiv dos för en patient med granule- cytopeni som uppvisar en effekt på humanbenmärgceller ekvivalent med effekten i möss beräknas utgöra 77,8 mg/kg kroppsvikt, dag.

Den akuta toxiciteten av CSF framställd enligt uppfinningen testades med användning av samma CSF som använts i ovanstående test med avseende på administrerad dos och möss av typ CSH/He (6-8 veckor gamla och med en medelkroppsvikt av 2024 g). Inga dödsfall inträffade i en grupp (5 handjur och 5 hondjur) som ad- ministrerats med 4,0 g CSF/kg kroppsvikt. Följaktligen är den akuta toxiciteten allt för svag för att kunna bestämmas med ovan- stående test.

Exempel 1 (1) lsolering av monocyter odrmakrofager 200 ml av perifert blod från normala människor till- varatogs i en bloduppsamlingsbehällare innehållande 1000 enheter heparin och fick blandas samman under försiktig omröring. Det hepariniserade blodet överfördes till en steril glascylinder med 20 mm diamter och 200 ml volym och fick stå under 2 timmar vid rumstemperatur. Efter att det hela fått stå tillvaratogs det övre leukocytskiktet försiktigt med en pipett, späddes med serumfrítt McCoy's EA medium till dubbel ursprunglig volym, centrifugerades vid.l500 g under lS minuter. Övervätskan förkastades och sedimen- tet uppslammades i 20 ml McCoy“s SA medium, hälldes över på en natriummetrizoatlösning (densitet d = 1,077) i ett centrifugrör och centrifugerades vid 400 g under 30 minuter. Det vita skiktet innehållande monocyter, makrofager och lymfocyter i botten av det övre skiktet tillvaratogs med en pipett, tvättades genom tillsats av McCoy's SA medium, centrífugerades vid 1500 g under 10 minuter och övervätskan förkastadeeq Denna behandling upprepades ytterli- a gare två gånger. Sålunda erhålln celler uppslammades i 20 ml w 10 15 20. 25' 50 35 40 Z” 451 sso McCoy's SA medium och en portion användes för räkning av antalet celler med en automatisk blodcellräknare (Toa manufacturing Co).

Ett utstrykníngsprov av suspensionen bereddes, färgades med Wright- Gíemsas färg och antalet leukocyter såväl som antalet monocyter och makrofager räknades morfologiskt för bestämning av cellförhål- landet-Förhållandet av monocyter och makrofager visade sig vara 25,5 procent.

En 5 ml alíkvot del av suspensionen placerades i var och en av fyra Petri-skålar med 15 cm diameter, försattes med 30 ml McCoy's SA medium kompletterat med 10 % fetalt kalvserum och fick stå vid 37°C under 2 timmar i en fuktig atmosfär av 5 % koldioxid i luft. Efter att det hela fått stå förkastades mediet och 30 ml av McCoy's SA medium tillsattes och efter relativt kraftig skak- ning förkastades mediet för avlägsnande av lymfocyter. Förhållan- det av monocyter och makrofager som återstod bestämdes genom samma testförfarande som använts ovan och visade sig vara 95 % skål. i varje (2) Framställning av glykoprotein Glykoprotein framställdes på följande sätt i enlighet med förfarandet som beskrives i den japanska patentskriften 14,707/79 samt i övriga skrifter angivnafovan. 400 liter färsk urin tillvaratogs från normala människor och justerades till pH 8 med 10 % fugerades vid 15 000 g i en kontinuerlig centrifugering vid OOC, natriumhydroxidlösning och centri- varigenom olösligt material avlägsnades och övervätskan tillvara- togs. Overvätskan justerades till pH 7 med 10-procentig klorväte- syra och fick passera genom en kolonn (10 cm x 80 cm) packad med kiselgel. Komponenterna adsorberade på kišelgelen, eluerades med 40 liter 5-procentigt ammoniakvatten. Sålunda erhållet eluat jus- terades till pH 7,5 med 1 N svavelsyra, försattes med pulverfor- migt ammoniumsulfat till 70-procentig mättnad, fick stå vid 0°C över natten och bildad fällning tillvaratogs genom filtrering.

Fällningen löstes i 2 liter S-procenfigt ammoniakvatten, placerades i ett dialysrör (Visking Co) och dialyserades noggrant mot 0,05 M fosfatbuffertlösning (pH 6,5). Den dialyserade lös- ningen kompletterades till 10 liter med nämnda buffertlösning och fick passera genom en CM Sephadex C-50 jonbytarkolonn (40 cm X 40 cm) som hade ekvilibrerats med 0,05 M/fosfatbuffertlösning.

Föroreníngarna avlägsnades genom adsorption på jonbytarkolonnen och utflödet tillvaratogs. 10 15 20 25' 30 35 40 451 sso 24 10 liter av nämnda utflöde koncentrerades med användning av en Diaflow ihålig-fiberkoncentrationsanordning (typ DC-30, Amícon Co) och koncentratet dialyserades mot 0,1 M tris-HCl buffertlös- ning (pH 7,0) över natten vid 5°C. Den dialyserade lösningen kom- pletterades till 1 liter med samma buffertlösníng och fick passera genom en DEAE~ce1lulosakolonn (4,0 cm x 40 cm) som hade ekvilibre- rats med samma buffertlösning. Efter tvättning med 0,1 M tris-HCl buffertlösning eluerades de adsorberade komponenterna med 0,1 M tris-HCl buffertlösning (pH 7,0) innehållande 0,3 M natriumklorid.

Eluatet tillvaratogs och dialyserades mot 0,1 M tris-HCl buffert- lösning (pH 7,0).

Den dialyserade lösningen fick åter passera genom DEAE-cellu- losakolonnen (4,0 cm X 40 cm) som hade aktiverats genom ekvilíbre- ring med samma buffertlösníng och eluerades genom líneär koncen- tratíonsgradienteluering av NaCl (kloridjonkoncentrationsgradient 0,1-0,3 M) för tillvaratagande av fraktioner eluerade vid kloríd- jonkoncentrationer från 0,15 till 0,25 M. De sammanslagna fraktio- nerna försattes med pulverformigt ammoniumsulfat till 70-procen- tig mättnad och bildad fällning tillvaratogs, löstes i en liten mängd 0,1 M trís-HCl buffertlösning (pH 7,0) och dialyserades mot samma buffert för tillvaratagande av den dialyserade lösningen [fraktion A). 20 ml av ovanstående dialyserade lösning framkallades på en Sephadeég G-150 kolonn (4,0 cm x 60 cm) som hade ekvilibrerats med 0,1 M tris-HCl buffert (pH 7,0) och fraktionerna motsvarande ett relativt utflödesvärde av 1,11-1,45 tillvaratogs. Den kombi- nerade fraktionen dialyserades noggrant mot destillerat vatten och den dialyserade lösningen lyofiliserades för erhållande av cirka 500 mg av ett pulver (fraktion B). 200 mg av detta pulver löstes i en 0,02 M fosfatbuffertlös- ning (pH 7,0) innehållande 1,0 M natriumklorid och anbringades på 4B affinítetskolonn (100 ml) som hade ekvilibrerats med samma buffertlösning. Kolonnen tvättades noggrant med 0,02 M fosfatbuffert (pH 7,0) innehållande 1,0 M natriumklorid och eluerades därefter med en 0,02 M fosfatbuffert (pH 7,0) innehållande 50 mM qymetyl-D-glukosid och 1,0 M natrium- kloríd. Eluatet dialyserades mot destillerat vatten och den dia- lyserade lösningen lyofiliserades. en concanavalin A-Sepharose Vidare löstes cirka 50 mg av det lyofiliserade pulvret som erhållits ovan i 1 ml av en 0,125 M tris-glycínbuffert (pH 6,8) 10 15 20 25- 30 35 40 25 451 850 innehållande 10 % glycerol och utsattes för elektrofores vid 10 mA under kylning i en preparatív elektroforesapparat (Fuji Kabara-II av Fuji Riken Co) med användning av 8-procentig akrylamidgel (pH 8,9; 20 mm x 25 mm). Fraktionen med en relativ rörlighet av 0,46 utvanns med en 0,025 M tris-glycinbuffertlösning (pH 8,3), díalyserades därefter mot destillerat vatten och den dialyserade lösningen lyofiliserades för erhållande av cirka 10 mg glykopro- tein. Genom upprepning av detta förfarande erhölls cirka 30 mg glykoprotein. (3) Odling av monocyter och makrofager Ovan erhållet glykoprotein sattes till 30 ml av ett kom- pletterat McCoy's SA medium innehållande 20 % fetalt kalvserum i en mängd av 100 pg/ml medium och 30 ml av det beredda mediet häll- des i Petri-skålar som innehöll vidhäftade makrofager och monocy- ter, såsom beskrivits i stycket (1) av detta exempel. Antalet monocyter och makrofager i mediet var 106/ml medium. Det framställ- da mediet inkuberades vid 37°C under 3 dagar i en fuktig atmosfär av 5 % C02 i luft för erhållande av ett konditionerat medium inne- hållande CSF. (4) Rening av CSF i det konditionerade mediet Det tillvaratagna mediet centrifugerades (2000 g) vid 2°C under 10 minuter för tillvaratagandeßav cirka 120 ml av den klara övervätskan, som koncentrerades genom ultrafiltreringsmem- bran (Amícon Co; molekylviktsuteslutning 10 000). Till koncentra- tet sattes 100 ml av en 0,05 M tris-HC1 buffertlösning (pH 7,2) och det hela koncentrerades åter till 5 ml.

Erhållen lösning anbringades på en DDAE-cellulosakolonn (2,0 cm x 60 cm) som hade ekvilibrerats med 0,05 M tris-HC1 buf- fert (pH 7,0) och CSF eluerades av NaCl (0-3 M). Den eluerade aktiva fraktíonen uppsamlades och med lineär gradientkoncentration koncentrerades medelst ovannämnda ultrafiltrerimšfmembranapparat.

Den koncentrerade lösningen påfördes en Sephadex G-150 kolonn (2,0 cm x 90 cm) som hade ekvílibrerats med en 0,05 M tris-HCl buffertlösning (pH 7,0) och framkallades därefter med samma buf- fertlösning för tillvaratagande av fraktionerna motsvarande en molekylvikt av 65 000 - 90 000 och fraktionerna motsvarande en molekylvikt av 30 000 - 60 000. Dessa fraktioner kombinerades och koncentrerades medelst ultrafi1treringsmembranapparaten. Den kon- centrerade lösningen försattes med destilïerat vatten, avsaltades och koncentrerades för erhållande av cirka 5 ml av en lösning .r 10 15 20 2& '30 40 451 sso _ 26 innehållande renat CSP. Denna lösning visade sig ha en aktivitet motsvarande bildning av 41 000 kolonier av human-granulocyter per ml, vilket bestämdes på samma sätt som i testexempel 1.

Exempel Z. _ _ På samma sätt som i exempel 1 isolerades monocyter och makro- fager från humant perifert blod och behandlades för framställning ' av renat glykoprotein. Med användning av ett medium framställt genom tillsats av renat glykoprotein till serumfritt McCoy's SA medium i en mängd av 100 pg/ml medium erhölls cirka 5 ml av en lösning innehållande renat CSF på ett sätt likartat det i exempel 1. Denna lösning uppvisade en aktivitet motsvarande bildning av 16 000 human-granulocytkolonier per ml lösning vilket fastställdes 'på samma sätt som i testexempel 1.

Exempel 3.

På likartat sätt som i exempel 1 separerades monocyter och makrofager från humant perifert blod och behandlades för fram- ställning av daiglykoproteinhaltiga fraktionen (fraktion A). Med användning av ett medium framställt genom tillsats av denna frak- tion till serumfritt McCoy's SA medium i en mängd av 5 mg (83,3 mg uttryckt i glykoprotein)/ml medium erhölls cirka 120 ml av ett konditionerat medium. Det konditionerade mediet dialyserades mot destillerat vatten och den dialyserade lösningen koncentrerades genom vakuumíndunstning vid låga temperaturer för erhållande av cirka 5 ml av en CSF-haltig lösning. Denna lösning uppvisade en aktivitet motsvarande bildning av 36 700 human-granulocytkolonier/ ml lösning vilket fastställdes på samma sätt som i testexempel 1.- Exempel 4.

På likartat sätt som i exempel 1 separerades monocyter och makrofager från humant perifert blod och behandlades för framställ- ning av en glykoproteinhaltig fraktion (fraktion B). Med använd- ning av ett medium framställt genom tillsats av denna fraktion till McCoy's SA medium innehållande 10 % humant serum i en mängd av 1 mg (83,3 pg uttryckt i glykoprotein)/ml medium erhölls cirka S ml av en renad CSF-haltig lösning på ett sätt likartat det i exempel 1. Denna lösning uppvisade en aktivitet motsvarande bild- ning av 43 200 human-granulocytkolonier per ml av lösningen vilket 'fastställdes på samma sätt som i testexempel 1.

Exempel 5. (1) Framställning av glykoprotein Enligt förfarandetenlígt Stanley et al som beskrivits <5 10 15 20 25. 30 35 40 'va1ingA-Sepharose 27* 451 sso tidigare framställdes glykoprotein och glykoproteinhaltiga frak- tioner på följande sätt. n 400 liter färsk urin tíllvaratagen från normala människor díalyserades mot vatten genom ett ultrafiltreringsmembran. Den díalyserade lösningen justerades till pH 7,4 och fick passera ge- nom en DEAE-cellulosakolonn (20 cm x 15 cm) som hade ekvílibrerats' med en 0,03 M tris-HCl buffertlösníng (pH 7,4), för att de aktiva substanserna skulle kunna adsorberas på kolonnen. De adsorberade aktiva substanserna tvättades med 20 liter av en 0,1 M tris-HCl buffertlösning innehållande 0,04 M natríumkloríd, eluerades där- efter med 20 liter av 0,1 M tris-HCl buffertlösning (pH 7,0) inne- hållande 0,15 M natriumklorid och eluatet dialyserades mot destil- lerat vatten (fraktion C).

En kalciumfosfatgel sattes till ovanstående díalyserade lös- ning med ett förhållande av 58 ml gel/g protein för att de aktiva substanserna skulle kunna adsorberas på gelen. Kalciumfosfatgelen tillvaratogs genom filtrering, tvättades två gånger med 20 liter av en 0,005 M fosfatbuffert (pH 6,5) och eluerades med 5 liter av 0,025 M fosfatbuffert. Eluatet centrifugerades vid 12 000 g under 10 minuter för tillvaratagande av övervätskan. Overvätskan dialy- serades mot destillerat vatten och den dialyserade lösningen kon- centrerades till cirka 50 ml genom vakuumavdrivning. Koncentratet ekvilíbrerades med en 0,1 M trís-HCl buffert, påfördes en DEAE-cel- lulosakolonn (2,5 cm x 90 cm) som hade ekvílibrerats med samma buffert och eluerades med en 0,1 M tris-HCl buffertlösning inne- hållande natríumklorid genom líneär kloridkoncentrationsgradíent- - elueringsteknik (natriumkloridkoncentrationsgradient 0-0,15 M).

Fraktionerna innehållande glykoproteinet tillvaratogs och koncen- trerades medelst ett ultrafiltreringsmembran (fraktion D).

Erhållet koncentrat utmmtesifir gelfíltrering med användning av en Biogel P-100 kolonn (2,5 cm x 110 cm), som hade ekvilibre- rats med en 0,03 M tris-HC1 buffertlösning för erhållande av 230 mg av glykoprotein (produkt av standardrenhetsgrad). 100 mg av produkten av standardrenhetsgrad löstes i 0,1 M acetatbuffertlösníng (pH 6,0) innehållande 1,0 M NaC1, 0,001 M MgC12, 0,001 M MnC12 och 0,001 M CaCl2 och påfördes en concana- 4B kolonn (36 cm x 1,0 cm) som hade ekvilibre- rats med samma buffertlösning och eluerades med 0,1 M ¿X-metyl-D- glukosíd-lösning för erhållande av 8 mg glykoproteín (höggradigt renad produkt). 451 aso 1 2? Den biologiska aktiviteten på musbenmärgceller av glykoproteh1 av olika renhetsgrad undersöktes med ovan angiven metod. Resulta- ten finns sammanställda i tabell 8.

Tabell 8 Prov ' g Specifik aktivitet Halvrenad produkt n Fraknion A 21 ooo Fraktion B 54 000 Standardrenad produkt 180 000 Högren produkt 1 240 000 (2) Odling av monocyter och makrofager; och rening av CFS S i konditionerat medium. _ _ Förfarandena enligt exempel 1 - (3) och 1 - (4) upprepa- des förutom att 1000 enheter/ml medium av standardrent glykopro- tein användes i stället för högrent glykoprotein. Därvid erhölls cirka 5 ml av en renad CSF-haltig lösning som uppvisade en aktivi- 10 tet motsvarande bildning av 35 000 human-granulocytkolonier per ml av lösningen.

Exempel 6. .

Cirka 5 ml av en renad CSF-haltig lösning erhölls genom upp- repande av förfarandet enligt exempel 5 förutom att ett glykopro- 15 tein framställt på följande sätt enligt förfarandet enligt Stanley och Metcalf användes i stället för glykoproteinet som framställts, enligt förfarandet enligt Stanley et al. Den renade CSF-haltiga lösningen som erhölls i föreliggande exempel uppvisade en aktivi- tet motsvarande bildning av 9800 human-granulocytkolonier per ml 20 lösning. 20 liter av human urin dialyserades mot kranvatten vid rums- temperatur under 8-12 timmar. Till den dialyserade lösningen sat- tes 75 g av DEAE-cellulosa ekvilibrerad med vatten och 100 ml av en 1,0 M trís-HCl buffert (pH 7,0). Erhållen blandning blandades '25 noggrant för att allt glykoproteín skulle adsorberas på DEAE-cel- lulosan. Efter avlägsnande av övervätskan tvättades DEAE-cellulo- -san tre gånger med 0,1 M tris-HC1 buffert (pH 7,0) innehållande 0,05 M natriumkloríd. Därefter eluerades adsorberat glykoproteín med 300 ml 0,1 M tris-HCI buffert (pH 7,0) innehållande 0,5 M 30 natriumklorid (detta förfarande upprepades sex gånger). Eluatet 19 vp 10 15 20 25' 30 40 29 451 ssoe koncentrerades genom vakuumavdrívning vid 40°C och dialyserades mot 0,1 M tris-HCl buffert (pH 730). Den dialyserade lösningen påfördes en DEAE-cellulosakolonn (2,3 cm x 44 cm) som hade ekvili- brerats med 0,] M tris-HCl buffert (pH 7,0) för att glykoproteinet skulle adsorberas på DEAE-cellulosan. Efter tvättning av kolonnen med samma buffert innehållande 0,05 M natriumklorid eluerades ad- sorberat glykoprotein med natriumkloridkoncentrationsgradientelue- ringsteknik med användning av 0,1-0,5 M natriumklorid i samma buf- fert. Eluatet dialyserades mot vatten och den dialyserade lösning- en koncentrerades genom vakuumavdrívning och lyofiliserades. Det lyofiliserade materialet löstes i 0,1 M tris-HCl buffert (pH 7,0) och påfördes en Sephade GÅ150 kolonn (2,3 cm x 150 cm) som hade ekvilibrerats med samma buffert för tillvaratagande av glykopro- teinfraktionen. Denna fraktion dialyserades och lyofiliserades för erhållande av cirka 12 mg av ett pulver uppvisande en specifik aktivitet av cirka 36 000 på musbenmärgceller.

Exempel 7. I Monocyter och makrofager separerades från humant perifert blod på samma sätt som i exempel 1. En glykoproteinhaltig fraktion framställdes på nedan beskrivet sätt enligt ovan angivna förfaran- de av Laukel et al och sattes till serumfritt McCoy's SA medium i en mängd av 2000 enheter/ml medium. Med användning av detta me- dium genomfördes odling på ett sätt likartat det som beskrivits i exempel 5 för erhållande av 120 ml av ett konditionerat medium.

Det konditionerade medíumet dialyserades mot destillerat vatten och den dialyserade lösningen koncentrerades genom vakuumavdriv- ning vid låg temperatur vilket gav cirka 5 ml av en CSF-haltig lösning som uppvisade en aktivitet motsvarande bildning av 29 000 human-granulocytkolonier per ml av lösningen vilket undersöktes på samma sätt som beskrivits i testexempel 1. 50 liter av human urin dialyserades mot rinnande kranvatten medelst en ultrafiltreringsmembranapparat (CL 100 från Asahi Kasei Co). Den dialyserade lösningen fick passera genom en DEAE-cellu- losakolonn (10 cm x 30 cm) som hade ekvilibrerats med 0,05 M tris-HCl buffert (pH 7,3) för att glykoproteinet skulle adsorbe- ras på DEAE-cellulosan. Efter tvättning av kolonnen med 0,05 M 'tris-HCl buffert (pH 7,3) kompletterad med 0,05 M natríumklorid eluerades glykoproteinet med samma buffert kompletterat med 0,3 M natriumklorid. Eluatet dialyserades mot 0,05 M tris-HCl buffert (pH 8,0) kompletterat med 0,5 M NaCl, 2 mM CaCl2 och 2 mM MgCl2. 10 15 30 451 850 Den dialyserade lösningen anbringades på en concanavalin A-Sepharose 4B kolonn (2,6 cm x-40 cm) som hade ekvílibrerats med samma buffert för att glykoproteinet skulle adsorberas på kolonnen.

Efter tvättning av kolonnen med samma buffert eluerades glykopro- teinet med samma buffert kompletterad med 0,15 M q7mety1-D-manno- sid. Eluatet koncentrerades genom ultrafiltrering för erhållande ' ° av cirka 7 ml av en fraktion innehållande 6 mg uttryckt i protein av glykoprotein i 1 ml. Den specifika aktiviteten av denna fraktion 1 var cirka 20 000 på musbenmärgceller.

Exempel 8.

Monocyter och makrofager separerades från humant perifert blod på samma sätt som beskrivits i exempel 1. En glykoproteinhal- tig fraktion (fraktion D) framställdes på samma sätt som i exempel 5 och sattes till McCoy's 5 A medium kompletterat med 10 % human- serum i en mängd av 2000 enheter/ml medium. Med användning av detta .medium erhölls cirka 5 ml av en renad CSP-haltig lösning på sätt tlikartat det i exempel 5. Denna lösning uppvisade en aktivitet mot- svarande bildning av 24 000 human-granulocytkolonier per ml av lösningen vilket fastställdes på samma sätt som i testexempel 1.

Claims (5)

10 15 20 25 ä, i 4510 ssn

1. Förfarande för framställning av en känd substans, som kan stimulera bildning och differentiering av human-granulo- poietinstamceller, genom odling av perifera leukocyter från en frisk människa, k ä n n e t e c k n a t tone 105 monocyter och makrofager från perifert blod från en frisk människa per ml syntetiskt vätekemedium för vävnadsod- ling, som innehåller åtminstone 0,1 pg, per ml av mediet, av ett första glykoprotein separerat fran human urin, och som har en känd förmåga att stimulera bildningen av humana granulocy- ter, eller åtminstone 500 enheter, per ml av mediet, av ett andra glykoprotein, separerat från human urin och som har en känd förmåga att stimulera bildningen av musmakrofager och. -granulocyter, varigenom den aktiva substansen bildas i mediet och utvinning av den aktiva substansen från mediet.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att odlingen genomföras i närvaro av serum.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att mängden av serum utgör åtminstone 5 2 baserat pa volymen av mediet.

4. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att odlingen genomföras i frånvaro av serum.

5. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att glykoproteinet utgöres av ett partiellt renat mate- rial atföljt av fràn urin härstammande proteiner. av odling av åtmins-