JP2787220B2

JP2787220B2 - ウィルス感染防御剤

Info

Publication number: JP2787220B2
Application number: JP1053679A
Authority: JP
Inventors: 功博川▲崎▼; 博子礒田; 守正谷本; 俊一堂迫; 重明田中
Original assignee: Tokai University
Current assignee: Tokai University
Priority date: 1989-03-08
Filing date: 1989-03-08
Publication date: 1998-08-13
Anticipated expiration: 2013-08-13
Also published as: JPH02233619A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、特定の鉄結合性蛋白質を有効成分とするウ
ィルス感染防御剤に関する。

従来技術ウィルス性疾患は、現在、医療分野に残された最大の
課題の一つである。これまでに多数の抗ウィルス剤につ
いての研究が行われてきたが、ウィルスが細菌の増殖機
能に依って増殖するため、薬剤による治療は困難であっ
た。これまでに、ウィルス性疾患に治療効果を示す薬剤
として認められているものは、インフルエンザA_z型に対
するアマンタジン、単純ヘルペスウィルスによる脳炎、
帯状発疹に対するアシクロピル及びビダラピンがあるだ
けである。この内アマンタジンは、我国においては抗ウ
ィルス剤としての使用は認められていない。

又、最近では、HIVによる感染症、いわゆるAIDSが問
題となり、多数の化合物がスクリーニングにかけられ、
その結果、アジドチミジン（AZT）がAIDS感染者に対し
て延命効果を示すことが確認され、HIV感染者の治療に
使用されている。しかし、これらの薬剤は高価であり、
又副作用も強く、その治療スペクトルも限定されてお
り、抗ウィルス剤としては、まだ問題をかかえている。

一方、抗ウィルス剤として最近注目を集めているもの
にインターフェロンがある。インターフェロンは、1957
年に発見された物質であり、ウィルスの細胞への感染を
防御する物質として研究が進められた。インターフェロ
ンは、白血球や、線維芽細胞を培養することにより得ら
れるが、最近では遺伝子組換による大量生産も可能とな
った。インターフェロンを抗ウィルス剤として使用する
方法としては、経鼻投与により、呼吸系の感染、例え
ば、インフルエンザの治療に応用する報告などが見られ
るが、体内の代謝や動態が不明であり、臨床上の有効性
を確認するまでに至っていない。又、遺伝子組換による
大量生産が可能になったとはいえ、インターフェロンの
生産コストは高価であり、インフルエンザ等の一般的な
ウィルス疾患の治療や感染防御の用途に供するには、ま
だ高価である。

現在のところ、ウィルス性疾患に対する対策としては
感染を予防するワクチンの投与が最も普及している。こ
れには各ウィルスをなんらかの方法で弱毒化した生ワク
チンやウィルスのホルマリン処理により作成した不活性
化ワクチン、ウィルスの抗原部分のみを精製したコンポ
ーネントワクチンがある。これらのワクチンにより大部
分の疾患については予防が可能となっている。しかし、
最も代表的なウィルス性疾患であるインフルエンザを例
にとった場合、ワクチンによる感染予防は困難である。
インフルエンザウィルスは、ウィルス表面のエンペロー
プと呼ぶ部分に抗原が存在し、この抗原をワクチンとし
て使用しているが、この抗原部分はしばしば変異し、変
異型のウィルスに対しては、旧型のワクチン投与では、
何ら効果を示さないことが明らかとなっている。又、HI
Vのように、ワクチンとしての抗原が不明なウィルス
や、臓器移植後の免疫抑制剤投与による免疫機能低下時
にしばしば発症するサイトロメガロウィルス感染症など
に対してはワクチンによる感染防御は困難である。

近年、ウィルス学の研究が進み、ウィルスの感染にお
いては、細胞表面に存在するウィルスレセプターにウィ
ルスが結合し、この部分から細胞内へウィルスが侵入す
ることが明らかとなった。例えば、HIVはT₄リンパ球の
表面に存在するCD₄レセプターに結合する。このためCD₄
を大量に血中に投与することにより、AIDSの発病を防止
することが可能となると言われている。このようにウィ
ルスとウィルスレセプターの研究は新しいウィルス治療
剤の開発の可能性を示している。

インフルエンザウィルスは、ウィルス表面にヘマグル
チニンと呼ばれる赤血球を凝集させる酵素蛋白を持って
いる。このヘマグルチニンがウィルス抗原を決定する重
要な因子である。このヘマグルチニンは一般には、H₁、
H₂、H₃と３つのタイプが知られているが、しばしばこの
型が変異する。このためワクチンの効果が低下するので
ある。ヘマグルチニンはインフルエンザが細胞に感染す
る際に、細胞膜表面に存在するシアル酸結合型糖鎖を認
識して結合し細胞への侵入を開始するが、この細胞への
結合性を赤血球の凝集反応を指標として評価することが
できる。したがって、赤血球凝集阻止を示すような糖鎖
構造を有するものであれば、インフルエンザウィルスの
細胞への結合を阻害し、感染を防止し、さらに感染後の
他の細胞への伝播を防御できる。

既に、本発明者らは特開昭23−284133号公報に開示し
たように、インフルエンザウィルスの感染を防御する物
質を得て特許出願を行った。又、山川らは、ヒト血球よ
り、インフルエンザウィルスの示す赤血球凝集を阻害す
る物質を単離し、これがシアル酸を構成糖に持つ糖蛋白
質であることを明らかにしている（山川他、「生化学」
31巻416〜421頁1959年）。しかし、ウィルスのレセプタ
ー結合阻害と糖蛋白質との規則性は未だ明らかになって
いない。

発明が解決しようとする課題上述したように、ウィルスの感染を防御するにあたっ
ての重要な因子としては、ウィルスの結合する細胞表面
のレセプターと、これに拮抗する物質が挙げられる。イ
ンフルエンザウィルスを例にとると種々のレセプターが
確認されている。

「蛋白質・核酸・酵素vol.23,117〜135頁、1988年」
には、ヘマグルチニンとレセプターについて開示されて
いる。これらによれば、必ずしも糖蛋白質、糖脂質の糖
鎖構造とレセプターの役割については一定の法則性を見
出し得ない。

本発明者らは、ウィルスの感染防御について鋭意研究
を進めた結果、シアル酸及びマンノースを糖鎖構造中に
持つ特定の鉄結合性蛋白質が各種ウィルスのレセプター
と拮抗し、ウィルス感染を防止することを見出した。

したがって、本発明は特定の鉄結合性蛋白質を有効成
分とするウィルス感染防御剤の提供を課題とする。

課題を解決するための手段本発明は、オボトランスフェリン、オボトランスフェ
リンの部分酵素加水分解物又はラクトフェリンの部分酵
素加水分解物を有効成分とするウィルス感染防御剤に関
する。

本発明における部分酵素加水分解物の原料として用い
るラクトフェリンは、一般には、哺乳動物の乳汁から分
離される鉄結合性蛋白質であるが、本発明の実施におい
ては、どのような種、由来のものでも差し支えない。
又、必要に応じて、遺伝子組換により生産した糖蛋白質
を使用することもできる。現在、最も安価でかつ容易に
入手できるものとしては牛乳より分離したものである。
牛乳より分離する場合は、特開昭61−145200号公報に開
示された抗ラクトフェリン抗体を使用する方法等が採用
し得る。

また、オボトランスフェリンは、ニワトリ卵白中に含
まれる分子量約77,000〜87,000の糖蛋白質で鉄結合性の
蛋白質である。オボトランスフェリンを得るためには、
公知のクロマトグラフィー等の分離精製が可能である。
例えば、カルボキシメチルセルロースによる方法（ギャ
リアン他「ジャーナル・オブ・フードサイエンス」45
巻、460頁、1980年）、金属固定化親和クロマトグラフ
ィーを用いる方法（アルーマシキ他「アグリカルチャル
・バイオロジカルケミストリー」51巻、2881〜2887頁、
1987年）等の方法を採用し得る。

上述のようにして得られたラクトフェリンまたはオボ
トランスフェリンをプロテアーゼにより部分酵素加水分
解したものも本発明においては使用し得る。ラクトフェ
リン並びにオボトランスフェリンを部分酵素加水分解す
る場合には、ウィルス感染防御能を維持しかつ、部分酵
素加水分解による効果を奏するためには、分解率を60％
以下に止めることが好ましい。

上述したようにオボトランスフェリン、その部分酵素
加水分解物あるいはラクトフェリンの部分酵素加水分解
物は、ウィルス感染防御剤として、単独あるいは混合し
て使用することができる。ウィルス感染防御剤としての
使用は、経口、経皮、注射剤等の投与が可能であり、そ
れぞれの投与経路に応じた製剤化が可能である。

本発明をサイトメガロウィルス（CVM）の感染予防或
は治療の目的に使用する場合には、前記有効成分が投与
組成物1g当り0.1μｇ以上の量で存在していることが効
果上必要である。

又、これらの蛋白質あるいはその部分酵素加水分解物
を滅菌する場合には、0.45μｍ以下のメンブランフィル
ターによる濾過滅菌をすることができる。

本発明に係るオボトランスフェリン及び原料のラクト
フェリンは、それぞれ卵白、牛乳中に含まれており、そ
の安全性も確認されている。

次に本発明のウィルス感染防御効果について、インフ
ルエンザウィルスによる赤血球凝集を阻止する反応（H
I）を例にした試験例で説明する。

試験例１オボトランスフェリン、その部分酵素加水分解物及びラ
クトフェリンの部分酵素加水分解物によるインフルエン
ザウィルスHI活性測定法インフルエンザウィルスとして以下のウィルスを対象
とした。

テンカ生研より入手した不活性インフルエンザウィル
ス、A/山形/120/86（H₁N₁）、A/新潟/102/81（H₃N₂）、
A/四川／α/87/（H₃N₂）、A/福岡/C29/85（H₃N₂）、B/
長崎/1/87、B/シンガポール/222/79、及び静岡薬科大学
より譲渡された不活化されていないインフルエンザウィ
ルスA/PR/8/34（H₁N₁）、及びA/愛知/2/68（H₃N₂）。

これらのウィルスのヒヨコ安定化赤血球（武田薬品工
業製）に対する凝集反応阻止（HI）活性を測定した。HI
活性は、上述した山川らの方法（「生化学」31巻、416
〜421頁）に準じて測定した。

測定に供したサンプルは、オボトランスフェリン（oT
f）、その部分酵素加水分解物、並びに牛ラクトフェリ
ン（bLf）、ヒトラクトフェリン（hLf）及び山羊ラクト
フェリン（gLf）の部分酵素加水分解物である。部分酵
素加水分解は、トリプシンにより20％、40％、60％、80
％の分解率で部分酵素加水分解したものである。結果は
表１に示す通りであった。

表１に示した通り、いずれのサンプルも強いHI活性を
示した。又、A/山形/120/86はヒヨコ赤血球を凝集させ
なかった。尚、表１の（Ａ）はヒヨコ安定化赤血球を対
象とし、（Ｂ）はヒトＯ型赤血球を対象としたものであ
る。

試験例２ oTf,並びにoTf,bLf,hLf及びgLfの部分酵素加水分解物の
赤血球への非特異的吸着の有無確認試験試験例１で使用した各サンプルを生理食塩水に溶解
し、0.5％（w/v）の濃度に調製した。この溶液に、試験
例１で調製したヒトＯ型赤血球、又はヒヨコ安定化赤血
球を加え、赤血球濃度が１％（v/v）、又は10％となる
ように懸濁させた。これを時々撹拌しながら１時間室温
で放置した後、1500rpmで10分間遠心し、その上清につ
いて、試験例１と同様の手順によりHI活性を測定した。

結果は表２に示す通り、このような処理を行っても各
サンプルの示すHI活性に変化は認められなかった。

試験例１及び２の結果から、オボトランスフェリン、
及びその部分酵素加水分解物あるいはラクトフェリンの
部分酵素加水分解物は、ウィルスによる赤血球の凝集を
阻害し、又、その効果は赤血球への非特異的な吸着によ
って起るものではなく、ウィルスのヘマグルチニンと各
有効成分が特異的に親和することにより起るものと推定
された。更に、前記物質とウィルスの親和性は、ウィル
ス抗原の変異に影響されないことが確認された。尚、表
中の（Ａ）はヒヨコ安定化赤血球を対象とし、（Ｂ）は
ヒトＯ型赤血球を対象としたものである。

以下に実施例及び参考例を示し、さらに本発明を具体
的に説明する。

参考例１ラクトフェリン及びトランスフェリンの調製（１）bLfの調製：ウシラクトフェリン（bLf）は、「ジャーナル・オブ
・ディリイ・サイエンス」20巻、752〜759頁（1987年）
に開示された抗ウシラクトフェリンモノクローナル抗体
アフィニティーカラムを用い牛乳より調製した。

脱脂乳を抗ウシラクトフェリンモノクローナル抗体ア
フィニティーカラムに負荷し、ウシラクトフェリン（bL
f）を吸着させ、次いで、pH7.3のリン酸緩衝生理食塩水
（PBS）で十分洗浄した。

その後、0.5M食塩を含むpH7.3のリン酸緩衝液で洗浄
し、さらに、0.2M酢酸ナトリウム緩衝液（pH3.7、0.15M
食塩を含む）でカラムに吸着したbLfを溶出した。溶出
後pHを中性付近に調整し、脱イオン水に対し３日間透析
した後、凍結乾燥し、bLfを得た。得られたbLfは電気泳
動により純度を確認したが単一のバンドを示した。

（２）hLfの調製：ヒトラクトフェリン（hLf）は、ヘパリン−セファロ
ースCL−6Bカラムを用い人乳より調製した。脱脂人乳を
ヘパリン−セファロースCL−6Bカラムに負荷し、脱脂人
乳中のhLfをカラム内に吸着させ、その後pH7.3の0.01M
リン酸緩衝液で洗浄した。次いで、1.0M食塩を含むpH7.
3の0.01Mリン酸緩衝液でカラム内に吸着したhLfを溶出
した。さらに、溶出液を脱イオン水に対し３日間透析し
た後、凍結乾燥し、hLfを得た。

得られたhLfは、電気泳動により純度を確認したが、9
8％以上の純度を示した。

（３）oTfの調製：卵白に硫安を2.5Mとなるように加えて蛋白質を沈澱さ
せた。遠心により沈澱を集め、pH6.0の0.01Mリン酸緩衝
液に再溶解させ、ジエチルアミノエチルセルロースカラ
ムに負荷した。卵白中のoTfをカラムに吸着させた後、p
H6.0の0.01Mリン酸緩衝液で洗浄し、次いで、0.1Mの食
塩を含むpH6.0のリン酸緩衝液でoTfを溶出した。溶出液
を集め、脱イオン水に対して３日間透析し、その後凍結
乾燥によりoTfを得た。得られたoTfを電気泳動により純
度を確認したが、95％以上の純度を示した。

実施例１インフルエンザウィルスの感染防御：試験例１に使用した不活化されていないインフルエン
ザウィルスA/PR/8/34及びA/愛知/2/68を段階的に希釈
し、５個のニワトリ10日卵に0.1mlずつ尿液腔内に接種
し、３日後、個々の卵の尿液50μｌをとり、これを0.5
％ヒヨコ安定化赤血球と混合、撹拌し、赤血球の凝集に
よって感染率を決定した。100％の感染率を示した希釈
倍率のウィルス希釈液の0.1mlに参考例１（３）で得たo
Tfをそれぞれ2.0mg、1.0mg、0.5mgづつを溶解し、室温
で30分間インキュベートした後、ニワトリ10日卵に0.1m
lずつ尿液腔内に接種した。３日後、個々の卵の尿液50
μｌをとり、赤血球凝集反応により感染率を決定した。
１群５個の卵を使用し各群の感染率を得た。

又、参考例１で得たbLf、hLf、oTfの部分酵素加水分
解物についても同様にして感染防御効果を測定した。

結果は表３に示す通りであり、各サンプルとも有意に
インフルエンザウィルスに対して強い感染防御効果を示
した。

実施例２ oTfによるCMV増殖阻止試験：実施例１（３）で得たoTfを２％血清添加MEM倍地に5m
g/mlとなるように溶解し、0.45μｍのフィルターで濾過
滅菌しストック溶液とした。このストック溶液を必要に
応じ、２％血清添加MEM倍地により希釈して用いた。希
釈したoTfとヒトCMV（Towne株）を１時間インキュベー
トした後、ヒト胎児繊維芽細胞（HEL細胞）にCMVを感染
させた。

次いで、上記感染HEL細胞をそれぞれoTf希釈液と同じ
濃度に調整したoTf含有軟寒天倍地（0.8％ソフトアガ
ー、ディフコ社製）で培養し、９日目に出現したプラー
クを数え比較した。軟寒天倍地は３日毎に重層した。

一方、軟寒天倍地中にoTfを含まない条件でも同様に
試験を行い、生成するプラークを数えた。

表４に示すように、0.5mg/mlの濃度のoTfでほぼ完全
にCMVの増殖を抑制した。

発明の効果以上述べた通り、本発明に係るoTf、その部分酵素加
水分解物あるいはLfの部分酵素加水分解物は明らかにウ
ィルスの感染を防御し、かつ治療効果も示すことから、
本発明はウィルス感染防御剤として有効に利用できる。
また、特に本発明のこれらの有効成分はインフルエンザ
ウィルスの抗原変化に影響されないことが明らかであ
り、広範な予防効果も期待できる。さらに、本発明に係
る上記物質は食品中に含まれている成分であり、安全で
かつ低コストで供給可能である。

したがって、本発明の実施により、安全でかつ広範な
ウィルスに対して感染防御効果を有するウィルス感染防
御剤が安定にかつ安価に供給される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者堂迫俊一埼玉県浦和市北浦和５丁目15番39―616 号 (72)発明者田中重明神奈川県綾瀬市小園1431―６ (56)参考文献特開平１−233226（ＪＰ，Ａ) 日本小児科学会雑誌、第88巻、第７号（昭和59年）、Ｐ1581−（195）−1582 （196）抄録Ａ−43 小児科臨床、第39巻、第６号（1986）、Ｐ1287−1293 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 38/00 - 38/58 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】オボトランスフェリン、オボトランスフェ
リンの部分酵素加水分解物及びラクトフェリンの部分酵
素加水分解物よりなる群から選択される少なくとも１種
の物質を有効成分とするウィルス感染防御剤。
【請求項２】酵素分解率を60％以下にしたオボトランス
フェリンの部分酵素加水分解物又はラクトフェリンの部
分酵素加水分解物を用いる請求項（１）に記載のウィル
ス感染防御剤。
【請求項３】ウィルスがインフルエンザウィルスもしく
はサイトメガロウィルスである請求項（１）又は（２）
に記載のウィルス感染防御剤。