SE451844B - Glykoprotein, forfarande for framstellning derav samt terapeutiskt medel innehallande nemnda glykoprotein - Google Patents

Description

"451 844 2 10 20 25 30 35 de senaste åren försökt utveckla terapeutiska substanser för be- handling av leukopeni som är mer effektiva och har mindre biverk- ningar. Det var känt, att en kolonistimulerande faktor (i det följande benämnd CSF) stimulerar proliferation och differentie- ring av benmärgsceller. CSF verkar på benmärgscellerna och sti- mulerar proliferation och differentiering under bildande av gra- nulocyter eller makrofager. Det är en väsentlig egenskap hos märg- celler, vid odling in vitro, att de bildar granulocyt-celler mak- rofagcellaggregat (benämnes i det följande granulocyt-cèller.mak- rofagkoloni) genom samtidig proliferation och differentiering [ïchikawa, Y., Proceedings of the National Academy of Science, Vol. 56, p. H88 (l966); Metcalf, D., Experimental Hematology, Vol. l, p. 185 (l97§]. Eftersom CSF inducerar granulocyt- och makrofagkolonier från benmärgceller, har några forskare föresla- git, att CSF bör betraktas som separata faktorer, d v s en gra- nulocytinducerande faktor och Hlmflkffiffigífldufißfflfidfi faktor EStan- ley, E.R.et al, Journal of Experimental Medicine, Vol. 1H3, p 631 (l976¶ . Dessa faktorer analyseras emellertid vanligen till- sammans som CSF vid in vitro-analys av benmärgsceller från mus.

Många faktorer som stimulerar bildandet av kolonier in vitro av benmärgsceller från mus har isolerats från olika källor, såsom serum, urin, olika organextrakt, media konditionerade av olika vävnader och cellinjer, kroppsvätskor såsom serum och urin; kon- ditionerade media av celler såsom leukocyter, och vävnader [Éhe- rldan, J.w., Journal of cell Physiology, vol. 78, p H51 (l97l].

CSF som har effekt på benmärgsceller från människa har isolerats från humana källor, d v s olika organextrakt, serum, media kon- ditionerade av vävnader[Metcalf, D. och Moare, M.A.S., "Cíba Foundation Symposium 13, Haemopoietic Stem Cells", p. 157, Else- vier Excerpta Medica, Holland (l973Ü. Varje CSF som erhållits från olika organ, olika celler och konditioneríngsmedia därför är emellertid ej en enda substans som är gemensam för samtliga källor. Exempelvis är molekylvikten för CSF som erhållits från media konditionerade av humana placentaceller 30 000 dalton [Eur- gess, A.W. et al, Blood, Vol. H9, p. 575 (l97Z], under det att CSF från humanserum är Ä5 000 dalton Kšhan, S.H. et al, British Journal of Haematology, Volym 20, p. 329 (l97lfl. Två typer av CSF med molekylvikt på 35 000 respektive mindre än l 300 isole- rades ur media som konditionerats av humana leukocyter lšrice, G-B- et al, B100d, V01- 32, P- 331 (l97}Ã]. Vidare har varje CSF Uï l-J \11 20 25 30 \)J UI 3 451 844 olika aktivitet, varvid några verkar på respektive typ av celler som tillvëxer och differentieras till granulocyt eller makrofag, andra på båda typerna av celler. CSF som isolerats från olika källor anses därför vara ämnen som skiljer sig från varandra :hetcalf och Moore, loc. cit., (l97}j .

Det är också känt, att det i urin från människa förekom- mer en typ av CSF som kan stimulera benmärgsceller frân_mus att bilda kolonier av granulocyter och makrofager in vitro 'Stanley, al., Federation Proceedings, Vol. 34, p. 2272 (l§75); Stanly, E.R.

Medical Science, Vol. H7, p. H67 (l969?. Här rapporterades att E.R. et och Netcalf, D., Journal of Experimental Biology and denna CSF har en molekylvikt av 45.00OJoch stimulerar prolifera- tion och differentiering av benmärgsceller från mus att bilda en makrofag dominant koloni. I motsats till denna stimulerande ver- kan på bennärgsceller från mus stimulerar den knappast bildandet av granulocyt- eller makrofagkolonier av benmärgsceller från män- niska utan stimulerar konsekvent bildandet av samlingar. I denna be- skrivning avses med "koloni" och "samling" vad gäller benmärgscel- ler från människa, cellaggregat som~innehåller H0 eller fler cel- ler respektive 3 till färre än H0 celler, enligt Metcalfs defini- l57 (l97")- Vid undersökning av substanser med CSF-aktivitet i urin tion (Metcalf, D., Experimental Hematology, Vol. 2, p. frân människa har man nu funnit och isolerat i rent tillstånd ett nytt HGI-glykoprotein, som till skillnad från tidigare kända CSF, har en molekylvikt av ca 85 000 och med effekt på benmärgsceller från både människa och mus vad gäller bildandet av rena granulo- cytkolonier in vitro. Man har vidare lyckats rena HGI-glykoprotein som isolerats från urin från människa som överraskande har effekt på humana benmärgsceller och stimulerar proliferation och diffe- rentiering av rena granulocytkolonier (benämnas i det följande i- bland biologisk aktivitet). Vidare identifierades detta HGI-gly- koprotein, en preparativ metod med god reproducerbarhet utveck- lades och användningar hittades, vilket ledde till föreliggande uppfinning.

Ett syfte med föreliggande uppfinning är att åstadkomma en ny CSF.

Ett annat syfte med uppfinningen är att åstadkomma ett för- farande för framställning av denna nya CSF.

Ytterligare ett syfte med uppfinningen är att åstadkomma ett terapeutiskt medel för leukopeni, som innehåller den nya CSF. 451 844 f* 10 15 20 25 30 35 Enligt föreliggande uppfinning erhålles ett glykoprotein kännetecknat därav, att det stimulerar benmärgceller från människa att bilda konoier av granulocyter och vilket glykprotein har föl- jande fysikaliska och kemiska egenskaper: (a) löslighetzlösligt i vatten, något lösligt i kloroform och olösligt i etylalkohol och aceton: (b) specifik optisk vridning: /ÛWÉO = 0 f 000 (0,25*procentig vattenhaltig lösning); (c) pH; 5,0-6,0 (1-viktprocentig vattenhaltíg lösning); (d) isoelektrisk punkt: pH 4,7 f 0,2; (e) termostabilitet: vid upphettning vid 60+: 0,5°C i 30 minuter i 1-procentig vattenhaltig lösnign går den stimulerande effekten på proliferation och differentiering av humanogranulocyter full- ständigt förlorad; (f) elektrofores: den relativa rörligheten är0,25 vid elektro- fores som utnyttjar natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel; (g) infraröd absorption: karakteristisk absorption vid följan- de vågtal (cm_1):3600-3200 (stark absorption), 1700-1600 (stark absorption), 1550 (medium absorption), 1430-1380 (medium absorp- tion) och 1150-1000 (brett band); (h) färgreaktíon: färger karakteristiska för sackarider erhål- les vid(X-naFtol-svavelsyrareaktionen, indol-svavelsyrareak- tionen, antron-svavelsyrarektionen och fenol-svavelsyrareak- tionen; färger karakterisktiska för polypeptidbindning och ami- nosyror erhålles vid Lowry-Folin's reaktion och vid ninhydrin- reaktionen efter hydrolys med saltsyra; (i) aminosyror, som ingår i proteindelen, prolin, aspargin- syra, treonin, serin, glutaminsyra, glycin, alanin, valín, metionin, isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, lysin, histidin, tryptofan och arginin; (J) färg och form: väsentligen vit och amorf; (k) sockersammansättning av polysackariddelen: 10,0-13,0 vikt- procent uttryckt som glykos av neutrala socker, 3,0-7,0 vikt- procent sialinsyror och 1 viktprocent andra aminosocker: (1) viktförhållande mellan protein och polysackarid: 75-B5:13,0-20,0; (m) elementaranalysz 42,3-47,3 % kol, 5,7-7,8 % väte, 9,6-14,3 % kväve, 34,4-39,4 % syre och 0,2 % eller mindre svavel; och 10 15 20 25 30 35 40 5 451 844 (n) molekylvikt: 75 ÛÛÛ till 90 000 dalton, bestämd genom gelfiltrering, varvid glykoproteinet erhållits från urin från frisk människa, vilken urin först koncentrerats med avseende på däri förekommande proteiner, som därefter bringats i kon- takt med en katjonbytare och därefter med en anjonbytare, aktivt material sedan eluerats, eluatet underkastats gelfiiltreríngs- kromatografi, därifrån uppsamlade fraktioner underkastats sockeraffinitetskromatografi och det adsorberade aktiva mate- rialet eluerats, eluatet underkastats preparativ zonelektro- fores och det aktiva materialet eluerats.

HGI-glykoproteinet enligt uppfinningen framställes genom koncentrering av proteiner som finns i urin från människa, bring- ande av dessa urinproteiner u 1 kontakt med katjonbytare för. av- lägsnande av föroreningar genom adsorbtion på jonbytaren, bringan- det av flödet i kontakt med en anjonbytare för adsorbtion av det aktiva materialet, eluering av det aktiva materialet med en salin- lösning genom en linjär koncentrationsgradíent-eluering, utsättan- de av eluatet för gelfiltreringskromatografi på en höggradigt tvär- bunden polymergel för utvecklande av det aktiva materialet, upp- med ett relativt utflöde av 1,11 till 1,60, affinitetskromatografering av de uppsamlade fraktionerna med ett adsorbtionsmedel med affinitet till socker för adsorbering av det aktiva materialet, eluering av det adsorberade aktiva materialet med en 20-lO0mM sackaridlösning, utsättande av eluatet för pre- parativ zon-elektrofores, eluering av det aktiva materialet med samling av fraktioner salinlösning och återvinning av det aktiva materialet i ren form.

Uppfinningen beskrives nedan i detalj.

Ett typiskt förfarande för framställning av HGI-glykopro- tein enligt uppfinningen utföres på följande sätt. Färsk urin som erhållits från normala människor ställes på pH 6-9, lämpligen 7-8, med utspädda sura eller alkaliska lösningar och centrifugeras där- efter för avlägsnande av olösligt material som finns i urinen. Det överstående skiktet bringas i kontakt med ett kiselhaltigt adsorp- tionsmedel såsom silikagel, silikagel-magnesiumsilikat, diatoma- céjord, kvartsglas eller bentonit och de adsorberade beståndsde- larna eluerades med en alkalisk lösning med ett pH av lämpligen 9 eller högre. Den alkaliska lösning som användes till elueringen är ej specifik, utan kan lämpligen utgöras av en vattenlösning av ammoniumhydroxid, natriumhydroxid eller liknande i en koncentra- tion av O,5 - 1,5 M. Det så erhållna eluatet ställes på pH 7-8 med 451 844 10 15 20 25 30 35 40 syralösning och försättes med ett neutralt salt, såsom ammoniumsul- fatï till en mättnad av 70 Z för utsaltning av den aktiva substan- sen, varigenom erhålles en rå proteinfaktion som innehåller HGI- glykoproteinet.

Ovanstående råa proteinfraktion återupplöses i en liten mängd av en alkalisk lösning, befrias från lågmolekylära ämnen ge- nom ultrafiltrering, spädes med en salinbuffertlösning och bríngas i kontakt med en katjonbytare (t ex karboximetyldextran, karboxi- metylcellulosa eller fosfocellulosa) för avlägsnande av de förore- ningar som finns i denna lösning. Ovanstående kontakt utföres vid neutralt pH och den råa fraktionen av HGI-glykoprotein och katjon- bytaren har inställts på pH 6-8 lämpligen med 0,01 - 0,15 M salin- buffertlösningar före kontakten. Det mesta av HGI-glykoproteinet I passerar genom katjonbytaren utan adsorption efter koncentrering, det koncentrerade flödet ekvílibreras med en utspädd buffertlös- ning av pH 6 - 8 och utsättes för jonbytarkromatografi med en_anjon- bytare, t ex DEAE-cellulosa, som ekvílibrerats med samma buffert, varvid HGI-glykoproteinet adsorberas på anjonbytaren. Därefter elu- eras det adsorberade HGI-glykoproteinet genom s k linjär koncentra- - 0,3 M salinlös- ningar såsom natriumklorid. HGI-glykoproteinet elueras vid en salt- koncentration av 0,1 M eller högre men en perfekt separering är svår. Flödesfraktionerna vid en saltkoncentration av 0,1 - 0,3 M tionsgradient eluering under användning av 0,1 uppsamlas och utsättes, om så erfordras, för avsaltning och koncen- trering.

Det är också möjligt att använda stegvis eluering med 0,1 - 0,5 M salinlösning för att eluera HGI-glykoproteinet från jonbyta- ren.

För ytterligare rening utsättes den ovan erhållna samman- slagna fraktionen för gelfiltreringskromatografi på en höggradigt tvärbunden polymergel med ett vattenåtervinningsvärde av 10 - 20 ml/g såsom Sephadex ® G-150 eller Biogel ® P-100 och de aktiva sub- stanserna utvecklas med en 0,05 - 0,1 M salinbuffertlösning. Frak- tioner med en relativ flödesvolym av l,ll till 1,60, lämpligen l,ll till l,H5, uppsamlas, avsaltas och koncentreras eller lyofiliseras.

De så erhållna, halvrenade substanserna som innehåller HGI-glykoprotein kan användas som farmacevtika.

Den relativa flödesvolym som omnämndes här är en volym som kan uttryckas med hjälp av förhållandet Ve/Vo (där Ve betecknar volymen av lösningsmedel som erfordras för att eluera den substans 10 15 20 25 30 35 40 451 844 som finns i kolonnen och Vo betecknar hålvolymen i kolonnen).

För ytterligare rening löses de halvrenade substanser som erhållits ovan i en utspädd salinbuffertlösning av 1,0 - 2,0 M, såsom en fosfatbuffertlösning av pH 6,0 - 8,0, lämpligen 6,0 - 7,0, som innehåller 1,0 - 2,0 M NaCl och utsättas för affinitetskromato- grafi med absorbtionsmedel med affinitet till socker, såsom konkana- valin A-Sepharose 4 B (från Fine Chemical Laboratory), som ekvi- librerats med samma buffertlösning. Det HGI-glykoprotein som ad- sorberats på affinitetskolonnen elueras med en 1,0 - 2,0 M salin i utspädd buffert som innehåller 20 ~ 100 mmflsackarider i utspädd buffertlösning som innehåller 1,0 - 2,0 M salt vid pH 6,0 - 8,0, t ex är sackariden a-methyl-D-glukosid eller liknande vid pH 6,0 - 8.0, lämpligen 6,0 - 7,0. De fraktioner som innehåller HGI- gly- koprotein uppsamlas och avsaltas och koncentreras eller lyofilí- seras, om så erfordras.

För ytterligare rening av HGI-glykoproteinet genom elektro- fores, utsättes den sammanslagna fraktion som erhållits från affi- nitetskromatograferingen för en preparativ zon-elektrofores med användning av en akrylamidgel eller agarosgel som bärare, vid pH 7,0 - 9,0 och det höggradigt renade HGI-glykoproteinet åter- vinnes från bäraren med en utspädd salinlösning under kylning, avsaltas och koncentreras eller lyofiliseras.

Enligt föreliggande uppfinning blir det möjligt att åter- vinna urokinas,kailikrein och lysozym från människa under fram- ställningen av HGI-giykoproteinet.

Det så erhållna HGI-glykoproteinet är ett pulver med vit eller svagt brun färg, som är smaklöst, luktlöst och någpt_hygrø- skopiskt och som har de fysikaliska och kemiska egenskaper som beskrives nedan.

Fig. l visar infraröd absorbtionsspektrum för HGI-glyko- proteinet; fig. 2 visar sambandet mellan den relativa rörlighe- ten i elektrofores och molekylvikten; fig. 3 visar ultraviolett absorbtionsspektrum för HGI-glykoproteinet; och fig. 4 visar för- hållandet mellan den tillsatta mängden HGI-glykoprotein och an- talet kolonier som utvecklas vid analys in vitro.

De fysikaliska och kemiska egenskaperna bestämdes på prov nr 6 i exempel l (beskrives nedan). (1) Molekylvikt Molekylvikten av HGI-glykoproteinet enligt uppfinningen visade sig vara ca 85.000 dalton mätt genom natrium-dodecylsul- 451 844 10 15 20 fat-polyakrylamidgel-elektrofores och 75 000 till 90 000 dalton mätt genom gelfiltrering med hjälp av Sephadex ® G-150. Det mest troliga molekylviktsområdet synes följaktligen vara från 75 000 till 90 000 dalton. (2) Löslighet Lösligheten av HGI-glykoproteinet i olika lösningsmedel anges i tabell l.

Tabell 1 Lösningsmedel Löslighet Vatten Lösligt Etylalkohol Olösligt Aceton Olösligt Kloroform Något lösligt l M natriumkloridlösning Lösligt io 'z saaka-nošlösning Lösiigt Det är dessutom lättlösligt i en utspädd salinlösning, så- som en utspädd fosfatlösning eller en utspädd trisaminometanlös- ning. Det är också lösligt i en utspädd salinlösning i pH-områ- det från 1 till 12. (3) pH pH-värdet för en enprocentig vattenlösning av HGI-glyko- proteinet är 5,0 till 6,0, d v s i det sura området. (4) Specifik optisk vridning Den optiska vridningen mättes på en 0,25 %-ig vattenlös- ning av HGI-glykoprotein vid 20 OC. Den specifika optiska vrid- ningenïo] 23 visade sig ligga i området 0 i 40. (5) IR-absorptionsspektrum IR-absorptionsspektrum för HGI-glykoproteinet mätt enligt metoden med KBr-pelletter visas i fig. l. De karakteristiska ab- sorptionsbanden anges i tabell 2. w l-' \J| 20 R) k!! 50 35 451 844 9 Absorptíonsí Grad av Kommentar vågtal (cm ) absorption 3600 - 3200 Stark Det breda absorptíons- bandet synes härröra från t v-OH-grupper som bildar-olika gra- der av vätebindningar. 1700 - 1600 Stark Det breda absorptíons- - - bandet synts härröra 1590 Medium fråÄ -co -CNH-bina- ningar i protein- fragment lü}O - 1580 Medium 1150 - 1000 Medium Det breda absorptions- bandet synes härröra från -C-C-C-bindningar i polysackarídfragment. (6) Isoelektrisk punkt 7 Den isoelektriska punkten för HGI-glykoproteinet är pH (7) Färgreaktíon 5,7 1 0,2, mätt genom ísoelektrisk fokusering på polyakrylamid- gel.

Olika färgreaktioner undersöktes på HGI-glykoprotein löst vatten. Erhållna resultat anges i tabell 3.

Tabell 3 Färg reaktion Utvecklad Kommentar ' färg Lowry-Folín's reaktion Blå Peptidbindningar Ninhydrinreaktion (hyd- Violett a-aminosyror rolyserag med 6N HCl vid 110 C i 22 timmar) u-Naftol-svavelsyrareak- Violett Sackaríder tion (Molischß s reak- tion) Indol-svavelsyrareaktion Brun " (Dische's reaktion) Antron-svavelsyrareaktion Mörkgrön " Fenol-svavelsyrareaktion Brun " 451 844 (8) Termostabilitet 1D Efter upphettning av en l %-ig vattenlösning av HGI-gly- koprotein vid 60 1 0,5 OC i 30 min kunde CSF~aktiviteten ej läng- re påvisas. (9) Aminosyrasammansättning av proteinfragmentet HGI-glykoprotein hydrolyserades med lN saltsyra vid 110 OC och aminosyrasammansättningen av proteinfragmentet bestämdes med kIl hjälp av en autoanalysator för aminosyror, varvid de resultat som anges i tabell U erhölls. 13 Tabell M Aminesyra Vikt % Mole (13) Pralin _ 3,2 0,392 -; Asparaginsyra 3,3 1,038 "“ Treonin 0 331 Serin 11,9 l:596 Glutaminsyra 13,8 1,322 Glycin ll 0 2 066 Aiïnin âíš 11155 Va in ' 0,771 Metionin 2:5 0,256 20 Iscleucin 2,5 0,269 Leucin 7,0 0,753 Tyrosin 5,8 0,ü5l Fenylalanin 12,8 1,050 Lysin 2 2 0,212 Histiain 1:0 0,091 Tryptofan spår - 2; Arginin " - “ Ammonium 0,5 Av tabell U framgår att proteinfragmentet av HGI-glykopro- teinet är sammansatt av 17 aminosyror, varav sura och neutrala ami- 30 nosyror dominerar, under det att basiska aminosyror utgör bestånds- delar i mindre mängd. Det är också ett av kännetecknen att över 70 % av de totala aminosyrorna är linjära aminosyror omfattande asparaginsyra, treonin, serin, glutaminsyra, glycin, alanin, va- lin och leucín. 35 . (10) Elektrofores _ Enligt Laemuli's metod Ehature, volym 227, p 680 (l970ï och under användning av en natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel elektroforetiserades samtidigt HGI-glykoproteinet som visar ett enda band i ett läge med relativ rörlighet av 0,25, trypsininhibi- tor (molekylvixt 21 500), ovalbumin (molekylvikt 43 000), humant \.7'I | .l \,_ï| 20 25 30 451 844 11 serumalbumin monomer (molekylvikt 65 000) och humant serumalbumin dimer (molekylvikt 150 OOO). Med hjälp av förflyttningen av sub- stanserna med kända molekylvikter och densamma för HGI-glykopro- teinet, visade sig molekylvikten av det sistnämnda vara ca 85 000 (fig. 2). I fig. 2 betecknar a, D, c och Ö trypsininhibitor, oval- bumin, humant serumalbumimonomer respektive humant serumalbumindi- mer, och pilen betecknar HGI-glykoproteinet. _ (ll) UV-absorptionsspektrum UV-absorptionsspektrum för HGI-glykoproteinet, mätt på en 0,1 5-ig vattenlösning i en 1 cm silikacell, visas i fig 5. Det visar maximal absorption vid 280 nm och terminal absorption i 1 % váglängdsomrâdet kortare än 250 nm. Den optiska densiteten E ICF vid 280 nm är 5,8. (12) Sockersammansättning av polysaccaridfragmentet Neutrala socker bestämdes genom fenol-svavelsyrareaktio- nen, sialinsyror genom warren's tiobarbitalmetod Journal of Bio- iogieai cnemistry, vo1.__234, p. 1971 (1959LÉ , den aminosocker genåom Elson-Eergans metod Vikten av neutrala socker uttrycktes med hjälp av glukos. Resul- taten var följande: neutrala socker: 10,0 - 15,0 %; siaiinsyror: 5,0 - 7,0 %; aminosockerl mindre än 1,0 %; total mängd socker: 13,0 - 20,0 %. (15) Förhållande mellan protein och polysackarid Proteinhalten i HGI-glykoproteinet är 75 - 85 2, bestämt enligt Kieldahls semimikroförfarande. Den totala sockerhalten är 15,0 - 20,0 %, såsom angivits ovan. (14) Elementaranalys Resultaten av elementaranalys för HGI-glykoprotein är följ- ande: C, 42,5 - 47,5 %; H, 5,7 - 7,8 %; N, 9,6 - 14,5 %; 0, 54,4 - 59,4 %; S mindre än 0,2 %.

HGI-glykoproteinet med angivna fysikaliska och kemiska egenskaper har förmåga att stimulera proliferation och differen- tiering av granulocyter från både människa och mus såsom framgår av försök 1 (beskrives senare) och visar ingen akut toxicitet, vilket framgår av försök 4 (beskrives senare). Såsom framgår av resultaten av försök 5 (beskrives senare) kan det vidare an- vändas som leukopeni-kemoterapeutika.

HGI-glykoprotein som framställts av urin från människa en- ligt ovanstående förfarande lyofiliseras aseptiskt i glaskärl och förslutes hermetiskt. Det är också möjligt att före lyofili- :Biochemical Journal, Vol.27, p. l ZA (1933) .' 10 20 BO 35 451 844 12 seringen försätta HGI-glykoproteinet med en vattenlösning som in- nehåller humant serumalbumin som stabilisator och en aminosyra eller sackarin som solubiliserande hjälpmedel; den erhållna lös- ningen steriliseras genom membranfiltrering och lyofiliseras där- efter aseptiskt. Före användning brytes förseglingen på glaskär- let och HGI-glykoproteinet löses genom tillsats av steriliserad fysiologisk salinlösning, sterilt vatten eller en steril isoto- nisk lösning. Den erhållna lösningen administreras till patienter med leukopeni genom intravenös, intramuskulär eller subkutan injektion.

Av resultaten av försök l och 2 (beskrives senare) fram- går att den effektiva dosen är 0,75 mg eller mer, lämpligen 0,75 - 2,2U mg, per dygn per kg kroppsvik“. Halvrenade produkter, fram- ställda i större skala, med en specifik biologisk aktivitet av 35.000 enheter/mg eller mer såsom de som innehåller HGI-glykopro- tein motsvarande prov nr N och nr 5 i exempel l (beskrives senare) kan också användas som farmacevtika.

Effekten av HGI-glykoprotein på proliferationen och di-- ferentieringen av granulccyter beskrives nedan i dezalj.

Försök l timulerande verkan på proliferation och differentiering av granulcCyter från mus och människa in vitro.

I varje petriskål av plast med en diameter av 35 mm pla- cerades l ml McCoy's 5A medium innehållande 0,05, 5,1, 0,15 eller 0,2 ug HGI-glykoprotein (prov nr 6 i exempel l), 20 % fetalt kalv- serum, 0,3 % agar och 7,5 x l0u benmärgsceller från mus eller 25 x 10 benmärgsceller från normala individer eller patienter med järnbristanemi. Medíet i petriskålen inkuberades i en fuktad at- mosfär med 5 % C02 vid 37 OC i 7 - 9 dagar. Skillnaden i antalet tillförda celler mellan mus och människa berodde på ett större antal stamceller vid mus. Efter inkubation, räknades antalet dis- kreta kolonier innehållande mer än 50 celler för mus och mer än H0 celler för människa med ett omvänt mikroskop. För morfologisk analys av kolonier, plockades några av dessa upp med mikrohemato- kritrör och färgades med 0,6 % orceini H0 % ättiksyra. De resul- tat som erhölls visas i fig. U. Fig. H visar förhållandet mellan dosen av HGI-glykoprotein och antalet kolonier som bildades in vitro. I fig. H avser -0-0- benmärgsceller från mus och -0-ë- ben- märgsceller från människa. _ Såsom framgår av fig. U stimulerar HGI-glykoprotein prolí- v» u: \J'| |.-| UI 20 25 30 *55 1; 451 844 feration och differentiering av benmärgsceller från mus och männi- ska, som bildar kolonier och det finns ett dos-svar-förhållande mellan HGI-glykoprotein och antalet bildade kolonier.

Vid morfologisk analys av de celler som bildar kolonierna, iakttogs att dessa celler samtliga var mogna granulocyter.

Såsom angivits ovan har HGI-glykoprotein effekt på benmärgs- celler från både människa och mus vad gäller bildandet av kolonier av granuloßyter, varvid antalet kolonier är proportionellt mot do- sen HGI-glykoprotein, och det finns ett bestämt förhållande vid. bildandet av kolonier av benmärgsceller mellan mus och människa.

Därför användes vid samtliga följande försök endast benmärgsceller :ß rån mus.

Sïimulerande verkna på proliferation och differentiering av granulcßyter in vivo.

Sextio CSYBL hanmöss (genomsnittlig kroppsvikt 20 g) dela- des slumpvis i sex grupper med vardera tio möss. Till en grupp, som fungerade som kontroll, administrerades subkutant 0,0U mg/mus humant serum albumin löst i 0,2 ml steril normal salinlösning, en gång om dagen under tre på varandra följande dagar. De återstående fem försöksgrupperna, d v s grupperna l, 2, 3, 4 och 5, försattes subkutant med 0,005, 0,01, 0,02, 0,03 respektive 0,04 mg/mus HGI- glykoprotein (prov nr 6 i exempel l som beskrives senare) vart och ett löst i 0,2 ml steril normal salinlösning, en gång om dagen under tre på varandra följande dagar.

Blodprov togs från vena.coccygea. i varje mus före admini- strationen och 2, 4, 6, 8 och 10 dagar efter administrationen.

Leukocyterna i varje blodprov färgades med l % gentiana violett lösning och leukccytantalet räknades med en räknekammare enligt Bürker-Türk.

Vidare ströks varje blodprov av på ett objektglas, färga- des med Wright-Giemsalösning, varefter mängden granulocyter i leukccyter mättes under ett mikroskop.

Antalet granulocytšr beräknades enligt följande formel: ) (antalet leukocyter i l mm x (mängden granulocyter i leukocyter) = antalet granulocyter i l mmš.

Erhållna resultat visas i tabell 5. \}1 IJ \J'1 20 30 35 451 844 11 Tabell 5 rupp Kon- 1 2 3 4 5 Ä ^ troll - 0 OS (m8) 0 0,005 0,01 0,02 0,03 0,011 Dygn 0 1150 1152 1155 1150 11118 1125 2 380 1120 550 600 775 B00 11 372 590 800 1100 11100 11120 6 380 595 1100 1800 2200 2100 s 1110 1100 620 750 950 971 10 1130 1110 1170 1160 1165 #50 “* Varje siffervärde betecknar det genomsnittliga antalet 3 för tio möss. granulccyter per mm Såsom framgår av tabell 5 började antalet granulocyter i de försöksgrupper som administrerats med 0,01 - 0,0H mg/mus av HGI-glykoproteinet att öka efter två dagars administration och uppgick till 5 - 6 gånger värdet för kontrollgruppen efter 6 da- gar.

Granulccytantalet minskade och återgick till normal nivå efter tio dagar. Då den dagliga dosen ökades till över 0,02 mg skedde ingen signifikant ökning av granulccyter motsvarande den ökande dosen HGI-glykoprotein.

Dessa resultat tyder på att granulocytos kan åstadkommas i tillräcklig mängd genom daglig injektion av 0,01 mg eller mer, l lämpligen 0,01 - 0,03 mg, HGI-glykoprotein till en mus (genomsnitt- Å lig kroppsvikt ca 20 E) _ Eftersom den stimulerande effekten av HGI-glykoprotein på benmärgsceller från mus in vitro är i genom- snitt ca 1,5 ggr högre än effekten på benmärgsceller från människa (försök l) blir emellertid den effektiva dosen för människa sanno- likt 1,5 ggr högre än densamma för mus som bestämts in vivo i för- 10 15 20 en }0 (ekvivalent med l 15 451 844 sök 2. Den effektiva dagliga dosen per kg kroppsvikt för människa uppskattas följaktligen till 0,75 mg eller mer lämpligen 0,75 - 2,2ü mg.

Försök 3 Skyddsverkan av HGI-glykoproteín vid leukopeni som orsakats av karcinostatiska substanser. ' ' 30 C57 BL-hanmöss med en ålder av H-5 veckor, delades slumpvis i tre grupper med tio möss. Till kontrollgruppen admini- strerades genom intraperitoneal injektion 30 mg/kg kroppsvikt lo LD5o) Qytosin-D-arabinosid löst i 0,2 ml steril normal salinlösning, en gång om dagen under lä på varandra följande dagar. Dessutom administrerades subkutant en gång om dagen under lå på varandra följande dagar 0,2 ml/mus av en steril normal salin- lösning. Till en annan grupp (HGI-leukoprotein administrerad grupp) administrerades Qytosin-D-arabinosíd på samma sätt som i kontroll- gruppen. Dessutom administrerades 0,03 mg/mus HGI-glykoprotein (prov nr 6 i exempel l som beskrives senare) subkutant en gång om dagen i lü på varandra följande dagar.Till den återstående gruppen (Cepharantine-administrerad grupp) administrerades cytosin-D-arabino- sid på samma sätt som i kontrollgruppen och dessutom administrera- des subkutant 0,5 mg/mus Cefarantine (Kakan Pharmaceuticals'Co;; användes konventionellt mot leukopeni) löst i 0,2 ml steril nor- mal salinlösning, en gång om dagen under lä på varandra följande dagar.

Blodprov uppsamlades från vena coccygaapå varje mus för administreringen och 2, U, 6, 8, 10, 12 och lü dagar efter admini- streringen. Antalet leukocyter mättes:æm i försök 2 och den pro- centuella minskningen av antalet leukoeyter efter administreringen erhölls genom att antalet före administreringen sattes till 100.

Resultaten anges i tabell 6. 16 451 844 .QWCE Ofiæ LÛQ ®Ü§W>H@UÜE ämm LW ®UÄm>H®M%fiw mfiLÜ> n.fl@ mm m.m~ OHH @.@= Q» fifi 0.0» wofi @,@~ mflfl n.mm ow NH @.@@ :OH c.@æ QNH m.m@ mm GH M.fi> Qfifi o.@@ ONH m~n> OHH w O.@æ QNH cßww ønfi O.@æ QNH @ @.@w CWH fi.mæ ßwfl m.mw mmfi = n.nw mwfi o.ow owfi @.@æ omfi N wcfizmagmficfiëum oofl omfi Cod Qmfi GQH omfi _ _ wßmh ,wcHn æc www “än a: www nxwcwï ncmpæcoxzmq nxwcwz acmuæooxsmq uxwcwz xuæooxswq nmmßm aELU;;$fl:@EÉä ußäwhæwfiCflEUd HHOhnCO¥ QQSLU c:~@:c%æ:zæc c~æ»oLQoxaaw|Ho: c Hfiwsmk LT] ,._J \ |'I 20 25 30 35 17 451 844 Jämfört med kontrollgruppen uppvisade den HGE-glykoprotein- administrerade gruppen en markerat förebyggande effekt på reduk- tionen av antalet leukocyter efter tio dygn efter det att HGI-gly- koproteinadministreringen påbörjats, vilken effekt är jämförbar eller överlägsen effekten av Cepharantine. Pa det fjortonde dygnet efter påbörjandet av administreringen hade leukccytantalet i kon- :rollgruppen minskats till H6,6 %, under det att det för den HGI- glykoproteinadministrerade gruppen var 73,3 ä, en mindre minsk- ning än för den Cepharantineadministrerade gruppen. Det synes där- för vara troligt att HGI-glykoproteinet är effektiv: vid terapi av human leukopeni.

Det bekräftades också att HGI-glykoproteinet är effektivt, då andra karcinostatiska substanser som t ex 5-fluorouracil och daunomycin, administrerades, som man vet orsakar en minskning av antalet leukocyter på liknande sätt som cytosín-D-arabinosíd. Ing- en förebyggande effekt på minskningen av leukoßytantalet kunde iakttas, då humant serumalbumin undersöktes på samma sätt som be- skrivits ovan.

Försök H Aktut toxicitet av HGI-glykoproteinet.

Den akuta toxiQiteten av HGI-glykoprotein som framställts i exempel l (prov nr H och nr 6) undersöktes på Cšqâl hanmöss en- ligt den av Lichied och Wilcoxon beskrivna metoden Journal of __ Pharmacology and Experimental Therapeutics, vol. 99: P 99 (l9H9) .

Inget fall med dödlig utgång påträffades efter administration av H 000 mg/kg kroppsvikt eller intravenös admini- stration av 2 000 mg/kg kroppsvikt. Det var följaktligen praktiskt omöjligt att uppskatta LD50 ; LD50 Vië Subkutan in; intraperitoneal á ekïion låg över U 000 mg/kg kroppsvikt och LD50 vid intravenös injektion låg över 000 mg/kg kroppsvikt.

Fyrahundra liter färsk urin som erhållits från normala män- niskor ställdes på pH 8 med 10 %-ig natriumhydroxid och centrifu- gerades med hjälp av en kontinuerlig centrifugering vid 15 000 G vid 0 OC för att avlägsna olösligt material. Den överstående vät- skan ställdes på pH 7 med 10 % saltsyra och bringades att passe- ra igenom en silikagelkolonn (10 X 80 cm). De substanser som ad- sorberats på silikagelen eluerades med H0 liter 5 %-ig ammonium- lösning. Den eluerade lösningen ställdes på pH 7,5 med l N svavel- syra och försattes med ammoniumsulfat till en mättnad av 70 %, var- 20 30 451 844 18 efter den fick stå vid 0 OC över natten. Fällningen uppsamlades genom filtrering, löstes i 2 liter 5 É-ig ammoniumlösning, pla- cerades i cellofanrör (Visking Co.) och dialyserades mot en 0,05 M fosfatbuffertlösning (pH 6,5). Den dialyserade lösningen gavs en volym av 10 liter genom tillsats av samma buffertlösning och fick passera genom en CM Sefadex C-50 ®jonbytarkolonn (4,0 x H0 cm) som ekvilibrerats med 0,05 M fosfatbuffertlösning (pH 6,5), för ad- sorption av föroreningar på jonbytarhartset. Tio liter av utflö- det koncentrerades med hjälp av en DIAFLO ®ultrafiltreringsappa- rat med ihåliga fibrer (Amicon DC-30, USA, avstängd molekylvikt ca 10 G90). Den koncentrerade lösningen dialyserades mot 0,1 M tris -H01 buffert (pH 7,0) vid 5 OC över natten. Den dialyserade lösningen gavs en volym av l liter med samma buffertlösning (den erhållna lösningen hänvisas till som prov nr 1).

Ovanstående lösning bringades att passera genom DEAE-cellu- losakolonnen (H,0 x H0 cm) som ekvilibrerats med 0,l M trís-HCl buffert (pH 7,0) och kolonnen tvättades med en tillräcklig volym 0,1 M tris-H01 buffert (pH 7,0). Den laddade kolonnen eluerades stegvis med 0,1 M tris-HCl buffertlösning (pH 7,0) som innehöll 0,5 M natriumklorid. De fraktioner som har förmåga åstadkom- ma proliferation och differentiering av granulocyter, vilket pro- vades på samma sätt som i försök 1, uppsamlades och dialyserades mot 0,1 M tris?-HCl buffert (pH 7,0)(denna lösning hänvisas till som prov nr 2). v-fš att Den dialyserade lösningen fick ånyo passera igenom DEAE cellulosakolonnen (U,0 x H0 cm) som ekvilibrerats med 0,1 M trisf HCl buffert (pH 7,0) och den laddade kolonnen utsattes för en lin- jär koncentrationsgradient eluering med natriumklorid (0 till 0,5 M). De aktiva fraktionerna uppsamlades och försattes med ammo- niumsulfat till en mättnad av 70 %. Fällningarna uppsamlades ge- nom centrifugering och löstes i en liten volym 0,1 M tris-H01 buffert (pH 7,0) och dialyserades mot samma buffertlösning (denna dialyserade lösning benämnas prov nr 3).

Tjugu ml av den dialyserade lösningen påfördes en Sefadex ® G-150 kolonn (Ä,0 x 60-cm) som ekvilibrerades med 0,1 M tris ~HCl buffert (pH 7,0) och de fraktioner som erhölls vid ett förhållande Ve/Vo av l,ll - 1,H5 uppsamlades. Den sammanslagna fraktionen dia- lyserades noggrant mot destilleratvatten vid 5 OC och den dialyse- rade lösningen lyofiliserades för framställning av ca 500 mg av ett pulver (detta halvrenade HGI-glykoprotein benämnes prov nr U).

KM |..4 CJ |_.| \H 25 30 451 844 19 Tvåhundra mg av det halvrenade HGI-glykoproteinet löstes i 0,02 M fcsfatbuffert (pH 7,0) innehållande 1,0 M natriumklorid och fick passera igenom 100 ml konkanavalin A-Sepharose ÄB affini- tetskolonn som ekvilibrerats. med samma buffert. Efter noggrann tvättning av kolonnen med samma buffert eluerades HGI-glukopro- teinet med 0,02 M fosfatbuffert (pH 7,0) innehållande 50 mM a- metyl-D-glukosidoch 1,0 M natriumklorid. De fraktioner som kan åstadkomma proliferation och differentiering av granulccyter in vitro uppsamlades och dialyserades mot destilieratvattsn. Den dialvserade lösningen lyofiliserades (detta betecknas som prov Ca 30 mg av öetovan angivna lyofiliserade pulvret löstes i l ml 0,125 M tris -glycinbuffert (pH 6,8) innehållande 10 % gly- cerol. Den erhållna lösningen utsattes för elektrofores vid 10 mA under kylning med hjälp av en preparativ elektroforesapparat (typ Fuji Kabára ll från Fuji Riken Co., Japan) under användning av 5 %-ig akrylamidgel (pH 8,9; 20 mm x 25 mm). Frakticnen med en relativ rörlighet av 0,H6 âtervanns med 0,025 M tris-glycinbuff- ert (pH 8,3) och dialyserades mot destillerat vatten. Den dialy- serade lösningen lyofiliserades varvid erhölls ca 10 mg av HGI- ,g glykoproteinet (betecknas prov nr 6).

Proven nr l till nr 6 som erhållits vid olika steg av fram- ställningen undersöktes med avseende på förmågan att åstadkomma proliferation och differentiering av benmärgsceller från både människa och mus på liknande sätt som i försök l. ñGI-glykopro- teinet eller en fraktion som innehåller detta sattes till mediet i en mängd som är nödvändig för att bilda 200 kolonier per skål.

Den specifika aktiviteten beräknades med hjälp av följande for- mel, där en enhet motsvarar en bildad koloniz; specifik aktivitet (enheter/mg)= antal bildade kolonier (enheter) proteinhalt (mg) i analyserat prov Resultaten anges i tabell T. 20 451 844 m.~wH= Q.m~HH æqæflw .tå @.mfi. ømnwmwcwcøm ooo oww ooo oæfl ooo mn com m cnvm m oofl 4._-@&&YLwuwcccV =o;fi>«Jxm xfiufiomaw rzugzzwš :æ;; ;a«He;æ:;mE:@n >m w>Hm:< iaf.

H.@=wn >.~ow Nnmfiw m.~= ømnwwwcficmm _. | «||.|!|.l||.|||||| wsš cmpu Lmfifiwumwnmëcmn >m wæHmc< OQO OOO H OQO OHN ooo Nm OQO HH com z Dum ^mE\Lm@m:cwv @@@fi>fi»xw xfigflvwaw w Lz m Lz : Lz M Lz N Lz >onm > Hfimßmä 20 25 50 451 844 21 Exempel 2 Till 100 mg HGI-glykoproteinpulver (prov nr 6) som erhållits på samma sätt som i exempel 1, sattes 100 ml av en vattenlösning SOM innehöll 5 % humant serumalbumin (Sigma Co., USA) och l % gly- cin (Wako Pure Chemicals Co., Japan). Den erhållna lösningen ste- riliseras i ett filtreringssystem från Millipore (Millipore Co., USA) försett med membranfilter med en porstorlek av 0,H5 pm. Den steriliserade lösningen fylldes aseptiskt i portioner på ml i glaskärl som steriliserats genom upphettning vid 170 OC i två tim.

Efter lyofiliseringen förseglades glaskärlen hermetiskt. På detta sätt erhölls 95 flaskor med ett terapeutiskt medel :ot leukopeni, varvid varje flaska innehöll 1 mg HGI-g1yk0pr0tein_ Exempel 3 Pâ samma sätt som i exempel 1 framställdes en liter av en koncentrerad lösning som innehöll HGI-glykoprotein, analog med prov nr 1, av l 000 l färsk urin som erhållits från normala män~ niskor. Denna koncentrerade lösning späddes med 10 1 0,1 M tris- HCl buffert (pH 7,0). Efter noggrann omröring omkoncentrerades den utspädda lösningen till ca 1/10 av den ursprungliga volymen genom användning av en DIAFLO ® ultrafiltreringsapparat med ihå- liga fibrer. Den koncentrerade lösningen sattes till 5 l 0,1 M tris -HCl (pH 7,0) och 5 liter DEAE cellulosasuspension'som inne- höll 300 g DEAE cellulosa baserad på torrvikten, som ekvilibre- rate med 0,1 M tris -HC1 buffert (pH 7,0). Blandningfln omrördes i 30 min, fick stå i 10 min och filtrerades under vakuum på en Büchner-tratt för uppsamling av DEAE-cellulosan. Den uppsamlade DEAE-cellulosan mättades med 10 1 0,1 M tris -HC1 buffert (pH 7,0) och uppsamlades genom filtrering på samma sätt som ovan. DEÅE'0@l' lulosantvättades vidare med 10 1 0,1 M tris -HCl buffert (pH 7,0) som innehöll 0,05 M natriumklorid och uppsamlades på samma sätt som ovan. Till den så behandlade DEAE-cellulosan sattes 10 1 0,1 M tris -HCl buffert (pH 7,0) som innehöll 0,5 M natriumklorid och det hela omrördes för frigöring av HGI-glykoproteinet från DEAE- cellulosan. Blandningen filtrerades på samma sätt som ovan och den filtrerade lösningen uppsamlades. Den filtrerade lösningen avsal- tades genom DIAFLO ® fiber ultrafiltrering. Den avsaltade lösningen lyofiliserades och gav ca 15 g av ett pulver. Pulvret löstes i 150 ml destillerat vatten och anbringades på en Sefadex ® G-150 kolonn (6,0 x 80 cm) som ekvilibrerats med 0,1 M tris- HCl buffert (pH 7,0). De fraktioner som motsvarade Ve/Vo förhållanden av 1,11 - a \l1 p: UI EG f\) UI 50 kr' \ H 451 844 22 1,60 uppsamlades. Den sammanslagna fraktionen dialyserades nog- grannt mot destillerat vatten. Den dialyserade lösningen koncen- trerades med hjälp av en DIAFLO ® koncentreringsapparat (typ DC-2) med ihåliga fibrer till ett koncentrat på ca 100 ml som innehöll ca 3 g rått SGI-glykoprotein. Till den koncentrerade-lösningen sattes l g glycin (Wako Pure Chemicals Co.) och 5 g serumalbumin (Sigma Co.). Den erhållna lösningen steriliserades genom filtre- ring på samma sätt som i exempel 1 och fylldes aseptiskt på flas- kor i portioner på 2,5 ml. Efter aseptisk lyofilisering försegla- des flaskorna hermetiskt. Härigenom erhölls H0 flaskor med ett terapeutiskt medel mot leukopeni, varvid varje flaska innehöll ca 3,8 mg av HGI-glykoproteinet.

På grund av den kliniska användningen av HGI-glykoproteinet enligt uppfinningen är det mycket viktigt att patogena virus som finns i urin och som kan orsaka hepatit och endemiska sjukdomar avlägsnas från ett läkemedel som framställts av HGI-glykoprotei- net liksom andra läkemedelstillsatser med humanblodelement. Då ett läkemedel som tillverkas av urin från människa administreras till patienter utan föregående behandling som avlägsnar eller in- aktiverar virus, finns alltid en risk för virusinfektioner. Det- ta gäller också för HGI-glykoproteinet enligt uppfinningen. För att undvika risken av virusinfektioner orsakade av viral kontami- nering måste en första undersökning göras av den som utgångsma- terial använda urinen så att viruskontaminerad urin kan uteslu- tas. Även om detta har visat sig vara effektivt i en viss grad för att förhindra virusinfektion är det dock omöjligt att använ- da en sådan praxis i industrin där man samtidigt behandlar urin som erhållits från flera tiotusentals personer.

Serumproteiner framställda från humanplasma för medicinska ändamål är också utsatta för problem med virusinfektion. Sedan man fann att den virusinfektion som orsakas av serumalbuminmedel kan förhindras genom värmebehandling vid 60 OC lO tim, utan dena- turering, har samtliga serumalbuminmedel underkastats en liknande värmebehandling och blivit säkra för klinisk användning. Dessa värmebehandlingar utnyttjas därför också vid framställningen av andra humanserumproteinmedel.

För att en väpmebehanaling vid 60°C i 10 tim skall kunna använ- das måste de behandlade läkemedelsbeståndsdelarna vara stabila under dessa betingelser. För detta ändamål har man funnit olika stabilisatorer. Bland de substanser som ej kan klara av en sådan w, 2 .1 20 451 844 värmebehandling kan vissa göras värmebeständiga i närvaro av en stabilisator. För att stabilisera humanserumproteiner mot värme- behandling har vissa typer av aminosyror eller sackarider använts 23 vid den fysiologiskt isotoniskakoncentrationen eller lägre. Även_om det är önskvärt att inaktivera virus genom värmebehandling av HGI-glykoproteinet, går den biologiska aktiviteten av HGI-glyko- proteinet förlorad genom en värmebehandling vid 60 °C_i 10 tim.

Det har nu visat sig, att HGI-glykoproteinet i vattenlösning får en förbättrad värmestabilitet och blir resistent mot den ovan angivna värmebehandlingen utan att dess kännetecknande egenskaper förloras under följande betingelser. HGI-glykoproteinet är stabilt vid värmebehandling vid pH 5 - 9, då albumin finns närvarande i lösningen i en mängd av över 2 2 eller då koncentrationen av HGI- glykoprotein i lösningen är så hög som 70 mg/ml eller högre, el- ler proteiner från urin från människa finns närvarande i en kon- centration av 70 mg/ml eller högre.

Enligt föreliggande uppfinning erhålles HGI-glykoprotein som utsatts för en inaktiveringsbehandling för virus som kontaminerar EGI-glykoproteínet. Inaktiveringsbehandlingen omfattar en upphett- ning av en vattenlösning av HGI-glykoproteinet, som stabiliserats W me: värme på följande sätt, vid so °c :iii 70 °c, lämpligen 55 °c :iii 65 °c i 8 till 50 tim, lämpligen 8 - 12 tim, een via et: pa av 5 till 9.

Då albumin användes som stabilisator, är reníngsgraden av det HGI-glykoprotein som finns i vattenlösningen ej avgörande men HGI-glykoproteinfraktioner med en renhetsgrad som motsvarar den- samma för proven nr 4 till nr 6 i exempel 1 föredrages. Koncentra- tionen av HGI-glykoproteinet i den vattenlösning som skall värme- behandlas är 0,1 % (vikt/volym, d v s antalet viktenheter i lO0 volymenheter; detta gäller i det följande för samtliga vattenlös- ningar) eller högre, lämpligen 0,5 till 15 %. Vattenlösningen Stäl- lesÉpå=pH 5 - 9, lämpligen 6 - 8, genom tillsats av en syra- eller alkalilösning, lämpligen en buffertlösning. Det albuminpreparat som användes enligt uppfinningen kan härröra från humanserum eller humanplacenta, som båda lämpligen renatsför medicinsk användning och har en renhet av 80 % eller högre, vilket framgår av elektro- fores. Mängden albumin som skall sättas till den HGI-glykoprotein- haltiga vattenlösningen är 2,0 % eller mer, lämpligen 10 - 20 %.

Den övre gränsen för den mängd albumin som skall tillsättes är ej fast utan den lämpliga mängden beror på den tillåtna mängden albu- 451 844 min i slutprodukten. 24 Användningen av albumin med humant ursprung för stabilisering av HGI-glykoproteinet mot värme utesluter risken för kontaminering av slutprodukten med antigena substanser och möjliggör en effek- tiv stabilisering av HGI-glykoproteinet mot upphettning. Eftersom albumin gör glykoproteinpreparat stabila vid lagring, är det ej nödvändigt att avlägsna albuminet efter värmebehandlingen sä länge UT som en lämplig mängd användes vid värmebehandlingen. Värmebehand- lingen enligt uppfinningen är därför ett effektivt steg som skall _: innefattas i förfarandet för framställning av HGI-glykoproteinet och utgör förvisso en del av det industriella framställningsför- farandet som omfattar ett steg för inaktivering av virus.

Försök 5 ffekten av värmebehandling i närvaro av albumin på virus- 5.4 \J I infektiviteten undersöktes under användning av olika virus som har möjlighet att kontaminera EGI-glykoproteinpreparat.

HGI-glykoprotein som framställts på samma sätt som prov nr U i exempel l löstes i vatten för framställning av en lösning av 100 mg/ml. Denna lösning ympades med 0,2 ml av en virussuspension 20 (med en virusinfektionsdos av l x 105 - l x 106/0,2 ml mätt en- ligt en metod som beskrivas nedan) av vattkoppsvirus, påssjukevi- rus, mässlingsvirus, herpesvirus, chikungunyavirus, japansk en- cefalitvirus, rödahundvirus, poliovirus, coxsackievirus eller echovirus följt av 0, 20, l00 eller 200 mg/ml humant serum albu- 25 min (Sigma Chemical Co.). Den erhållna lösningen ställdes på pH 7,0 med 0,1 M tris-HCl buffert, värmebehandlades därefter vid 60 OC i l0 timmar, kyldes sedan omedelbart i iskallt vatten, av- saltades, steriliserades genom membranfiltrering och lyofilisera- des, varvid ett pulver erhölls. Den biologiska aktiviteten och 30 virusinfektionen analyserades med hjälp av följande metoder och jämfördes med desamma före värmebehandlingen.

Analysen av biologisk aktivitet utfördes genom att som para- meter observerades kolonibildningen av benmärgsceller från mus in vitro. I varje petriskâl av plast med en diameter av 35 mm 35 placerades 1,0 ml kompletterat McCoy's 5A medium som innehåller 20 % feäalt kalvserum, 10 % (0,1 ml) prov, 0,3 % agar, 7,5 x l0u benmärgsceller från mus och 10 % (0,1 ml) prov, varvid koncentra- tionen av varje prov gjorts lika. Efter 7 dagars inkubation i en fuktad atmosfär med 5 % C02 räknades diskreta kolonier innehållan- de mer än 50 celler med ett omvänt mikroskop. Förhållandet (i %) ...i |..: UI 29 25 451 844 mellan antalet kolonier som bildats efter värmebehandlingen och det som bildats före värmebehandlingen kallades återvunnen biolo- gisk aktivitet.

Virusinfektionsdosen bestämdes på följande sätt. Vattkopps- virus transplanterades successivt i HeLa - celler och den plaque- bildande enheten virolegy, vel. 36, pp. 171: - 179 (1968f bestäm.- des för samma cell. Successiva transplanteringar av båssiukevirus, mässlingsvirusoch japansk encefalitvirus utfördes med VEROceller och av policvirus, coxsackievirus och echovirus med HeLa celler.

Infektiviteten för varje virus analyserades genom bestämning av den infekziva dosen för 50 % av vävnadskulturen -national Insti- zuze of Health, Japan (utg. ) "Experimental Virolcgy", Maruzen Co., Tokyo, 196; varvid den sytopatiska effekten användes som indika- tor. Observationsperioden var tio dagar.

Herpesvirus och chikungunyavirus transplanterades successivt i FL celler respektive VERO-celler, och den plaquebildande enheten bestämdes ("Experimental Virology", loc. cit.) Rödahundvirus transplanterades successivt i BHK-21 celler och den plaque-bildande enheten bestämdes med VERO-celler.

Erhâllna resultat anges i tabell 8. a 451 844 26 5 o 7.2 o S. SH Soficoš o Ûofl ...oz og E, 9: oom HE fc HE fino :ETÉC Two cofioxæocfi man .Hmåc :ofloxwu :mm Lmfi: :aëznfim »uoflšflozm lmzk; lofloz .Hmorå |c.nw:.:> |ofiox Hmomš. . xwflwoficïo . . Lšfiwm ocmës: >w cwcczïomaæ acficoowcaafi. nmvrš wcficuuwcma: wuwz cofiomnucmocox w Hfiwndå \JI 25 30 451 844 27 Såsom framgår av tabell 8 hade virusinfektiviteten fullstän- digt gått förlorad i varje prov efter värmebehandlingen vid 60 OC i tio timmar, vare sig albumin tillsatts eller ej. Detta faktum tyder på att också andra virus kan inaktiveras genom värmebehand- lingen enligt uppfinningen. Det visade sig, att den biologiska aktiviteten av HGI-glykoproteinet kunde bevaras i de prov som in- nehöll albumin, vilket bekräftade tillräckligt effektiv. att en tillsats av albumin är Resultaten av en värmebehandling under andra betingelser liknade de som angivits ovan. 1 nästa försök varierades pä-värdet av vattenlösningen av HGI-glykoprotein som innehöll albumin för en undersökning av änd- ringen av den biologiska aktiviteten efter värmebehandling.

Försök 6 Samma HGI-glykoprotein som användes i försök 5 löstes i vat- ten för framställning av en vattenlösning av 20 mg/ml. Till lös- ningen sattes l0O mg/ml humant serumalbumin (Sigma Co.). Lösning- arna som täckte pH-omrâdet 2 till 10 framställdes i intervall på en enhet på följande sätt; pH 2 - 6, 0,1 M citronsyra-natriumfos- fatbuffert, pH 7 ~ 10, 0,1 M tris- HCl buffert. Varje prov upp- hettades vid 60 ÛC i tio timmar can den återstående biologiska aktiviteten analyserades på samma sätt som i försök 5. Förhållan- det (i %) mellan antalet kolonier som bildats efter värmebehand- lingen och det som bildats före värmebehandlingen betecknades â- tervunnen biologisk aktivitet. Erhállna resultat anges i tabell 9. Den biologiska aktiviteten av HGI-glykoproteinet beverades an- märkningsvärt i pH-området 5 till 9, vilket visar att en inställ- ning av pH för HGI-glykoproteinlösningen i detta omrâde är nöd- vändig före värmebehandlingen.

UI 451 844 28 Tabell 9 . Antal kolonier Återvunnen bio- ph per 0,1 ml logisk aktivitet Före värme- _ behandling 86 100,0 2 0 0 B O 0 H 0 G 5 82 95,3 6 95 111,6 7 116 137,2 8 100 116,5 9 68 79,1 10 0 0 Vid ett annat försök som oeskrives senare ställdes en vat- tenlösning som innehöll minst 70 mg/ml HGI-glykoprotein på pH 2 - 10 med en syra- eller alkalilösning och den återvunna biologiska ak ivíteten efter värmebehandling undersöktes. Det visade sig att återvinningen av biologisk aktivitet var ca H0 - 50 5 vid ett pH i omrâdet 5 - 9, under det att den biologiska aktivite- ten av en vattenlösning av HGI-glykoproteinlösningen vid ett pH lägre än 5 eller högre än 9 helt försvunnit efter värmebehand- lingen.

Försök 7 Beroendet av effekten av värmebehandlingen på koncentratio- nen av HGI-glykoproteinet i vattenlösning undersöktes.

Ett renat HG1-glykoprotein analogt med prov nr 6 i exempel 1 löstes i vatten och ställdes på pH 7,0 med 0,1 M tris-»H01 buffert. Lösningen ställdes vidare på en slutkoncentration av 10, 50, 60, 70, 80, 100, 150 respektive 200 mg/ml. Varje lösning upphettades till 60 OC i tio timmar, kyldes därefter omedelbart i isvatten, steriliserades genom filtrering och lyofiliserades.

Den biologiska aktiviteten av varje prov analyserades på samma sätt som i försök 5. Erhållna resultat anges i tabell 10. 20 451 844 29 Tabell 10 Koncentration av Antal kolonier Ätervunnen biologisk HGI-glykoprotein per 0,1 ml aktivitet (mg/ml) 10 0 0 50 31 25,H 60 35 28,2 70 MM 55,5 80 50 U0,3 100 5 41,1 150 55 42,7 200 56 55,2 Före värmebe- lgh 100,0 handling Som framgår av tabell 10 var, då koncentrationen av HGI-gly- koprotein är 50 mg/ml, den återvunna biologiska aktiviteten efter värmebehandling 25,U %. Det visade sig, att man för att återvinna en biologisk aktivitet av minst 35 % efter värmebehandling måste ha en koncentration av HGI-glykoprotein som är minst 70 mg/ml, lämpligen 100 - 200 mg/ml.

Försök 8 Samma HGI-glykoprotein som användes i försök 5 löstes i vat- ten, ställdes pâolika pH-värden inom området 2 - 10 genom tillsats av 0,01 M citronsyra/natriumfosfatbuffert för pH-området 2 - 6 och 0,1 M trís ~HCl buffert för pH området 7 - 10 och varje lös- ning inställdes på en slutkoncentration av 100 mg/ml med destille- rat vatten, upphettades vid 60 OC i 10 tim, kyldes därefter ome- delbart i isvatten och undersöktes, som i försök 5, med avseende på biologisk aktivitet efter värmebehandling. En del av ovanståen- de lösning (pH U,5) före inställning av pH användes Swïkontroll.

Erhållna resultat anges i tabell ll. k: \H f\_1 CD f\7 \ 31 451 844 30 Tabell ll Antal kolonier Återvunnen biologisk pH per 0,1 ml aktivitet (%) Före värmebe- 136 lCC handling 2 Ü C B 0 C C O 5 51 3?,5 6 511 39,? 7 59 Ä3,3 8 63 146,5 9 *9 35,Û 10 O C pH eg inställt G C Såsom visas i tabell ll var då pH för HGI-glykoproteinlös- ningen låg i området från 5 till 9, återvinningen av biologisk aktivitet 36,0 - H6,3 %. Om pH var under 5 eller över 9, förlo- rades den biologiska aktiviteten fullständigt. Av resultaten av försöken 7 och 8 framgick att vid värmebehandling av HGI-glyko- proteinlösningen koncentrationen av HGI-glykoprotein bör vara minst 7% mg/ml och pH ligga i området från 5 till 9.

Försök 9 Förfarandet enligt försök 5 upprepades förutom att HGI-gly- koproteinet löstes i vatten i en koncentration av 230 mg/ml vat- ten; serumalbumin ej tillsattes och lösningen installdes på pH 7,0.

Efter värmebehandlíngen bestämdes endast virusinfektionsdosen som vid försök 5. I provet visade sig virusaktiviteten ha försvunnit helt. Resultatet tyder på att andra virus än de som användes ock- så kan inaktiveras genom värmebehandlingen enligt uppfinningen.

Ovan angivna virusinaktiveringsmetod genom upphettning med en stabilisator skall tillämpas på ett HGI-glykoprotein med en viss renhetsgrad. Man har nu därför försökt att åstadkomma ett praktiskt Uï |...| (J |..| UI 20 25 30 _55 451 844 31 förfarande som kan användas för framställning av renat HGI-glyko- protein. Härvid har framkommit att en HGI-glykoproteinlösning som innehåller minst 70 mg/ml av ett protein som härrör från urin an- vänt som utgångsmaterial är en värmebeständig lösning som är lämp- lig för ändamålet. Detta nya förfarande för stahilisering av HGI- glykoproteinlösningen mot upphettning beskrives nedan i detalj.

En liter färsk urin som erhållits från normala-människor in- nehåller i allmänhet 30 - 50 mg proteiner. Sådana proteiner kon- centrerades på känt sätt genom ultrafiltrering, jonbyteskromato- grafi, adserption på silikagel, utsaltning eller en komsination av dessa metoder. Proteiner från urin inklusive HGI-glykoproteinet koncentrerades vidare i vakuum för inställning av proteinnalten på minst 70 mg/ml, lämpligen 100 till 150 mg/ml. Om proteinhalten 1 den HGI-glykoproteinhaltiga fraktionen är under 70 mg/ml, blir förlusten av biologisk aktivitet av HGI-glykoproteinet vid upp- nettning icke önskvärt stor. Även om varje rå fraktion som inne- håller 70 mg/ml eller mer proteiner från urin lämpar sig för än- damålet, är en rå fraktion som erhållits vid ovanstående förfa- rande för framställning av HGI-glykoprotein enligt uppfinningen att föredra vid det nya stabiliseringsförfarandet. Den råa frak- tionen inställes på en halt proteiner från urin av minst 70 mg/ml och på pH 5 till 9 lämpligen pH 6 till 8.

Den så erhållna värmestabiliserade HGI-glykoproteinlösningen eller, om så erfordras, efter att den renats enligt ovan beskriv- na förfarande, värmebehandlas under ovan angivna betingelser, varvid erhålles en fraktion som är klar att användas som läkeme- del eller en produkt med ovan angivna fysikaliska ocn kemiska e- genskaper.

Försök l0 Förfarandetiexempel 1 upprepades för framställning av enlHGI- glykoproteinhaltig fraktion analog med prov nr 1, förutom följande modifiering: Den fällning som bildades genom utsaltning med ammo- niumsulfat till 70 % mättnad uppdelades i åtta delar. Varje del löstes i vatten och ställdes på pH 7,0 med 0,1 M tris- ICl buffert.

De8_lösningarna ställdes på en slutlig proteinhalt av 10, 50, 60, 70, 80, 100, 150 resp 200 mg/ml. Varje lösning uppdelades vidare i två grupper. Dena ena gruppen värmebehandlades i 60 OC i 10 tim och den andra upphettades ej. Samtliga lösningsprov renades ytter- ligare, såsom beskrivits i exempel l, till nivån av prov nr H i exempel l. Härigenom erhölls två serier av prov med olika protein- ísk aktivltet i tabell 32 _ ) ej behandlats. dersöktes med avseende på biolog 451 844 halt, varav den ena serien (försöksprov) värmebehandlats och den andra (kontrollnrov Varje prov un på samma sätt som i försök 5. Erhållna resultat anges m.~0H Hsa cow wa @.w@H “wa ewa me n.NCH ANH oøfi zfifiä 9: å H. m _o~ o. E m.mm mo om fifi >oLmmxnwL®m m.Oæ om om OH .

AIN: m: OH m 1 ßnfi ccm w 1 :NH ewa N 1 æflfi cofi e 1 .ffi. cæ m - :OH os w | mfifl om >ohQHHonu:oz | Hae om m | wcfi ca H ez|:§1i=~wl.;@»~»wwwm||:===.:.=:«a ~.@ »wa ^Hs\mav Lz xnaäcfisas :::::>;c@< Lsfizcficx ~m@:< Qfimzcfioaoam >oLL _: - ,-i!I:1||l:i:|5|:i au. | . :Ii-s I.

NH *Massa _ \T1 |._| \)I 20 25 30 35 451 844 33 Exempel M Förfarandet i exempel 1 upprepades flera gånger varvid er- hölls 100 mg HGI-glykoprotein med en renhet motsvarande prov nr 6. Till 100 mg av det så erhållna renade HGI-glykoproteinet sat- tes l00 ml 10 %~igt humanserumprotein (Green Cross Co., Japan) som stabilisator. Den erhållna lösningen ställdes på pH 6,8 med 10 %-ig natriumhydroxidlösning, upphettades vid 60 çC i 10 tim, kyldes därefter omedelbart i isvatten och steriliserades med Millipore filtreringssystem (Millipore Co.) med membranfilter med en porstorlek av O,H5 um. Vardera l ml steriliserad lösning fylldes aseptiskt i portioner av l ml i glaskärl som sterilise- rats genom upphettning vid 180 OC i 2 tim. Efter lyofilísering under aseptiska betingelser förseglades glaskärlen hermetiskt, varvid erhölls 97 glaskärl som vardera innehöll 1 mg av ett pre- parat innehållande värmebehandlat HGI-glykoprotein.

Ovan erhållna preparat testades med avseende på biologisk aktivitet och virusinfektiositet på samma sätt som i försök 5.

'Den biologiska aktiviteten var jämförbar med densamma för ett obehandlat prov och någon virusinfektiös aktivitet kunde ej på- visas.

Exempel 5 Ettusen liter färsk urin som erhållits från normala människor behandlades på samma sätt som i exempel l. Flödet från CM Sephadex C-50 jonbytarkolonnen koncentrerades till 1 liter av en rå HGI- glykoproteinlösning. Till det råa koncentratet sattes 10 liter 0,1 M tris 101 buffert (pH 7,0), det hela omrördes noggrant och koncentrerades därefter till ca en tiondel med hjä-p av en DIAFLO ultrafiltreringsapparat med ihåliga fibrer. Till koncentratet sat- tes 5 liter 0,1 M :rie-Hcl buffert (pH 7,0) och 5 liter DEAE- cellulosasuspension (300 g DEAE cellulosa, torrvikt) som ekvili- brerats med 0,1 M trisz-H01 buffert (pH 7,0). Blandningen omrör- des i 50 min och filtrerades efter att den fått stå under vakuum för uppsamling av DEAE-cellulosa. Så erhålle' DBAE-cellulosa tvät- ® tades genom tillsats av tio liter 0,1 M tris -H01 buffert (DH 7,0).

DEAE-cellulosan uppsamlades genom filtrering under vakuum, tvätta- des ånyo med 10 liter 0,1 M tris-H01 buffert innehållande 0,05 M natriumklorid och filtrerades under vakuum för uppsamling av DEAE- cellulosan. Till DEAE-cellulosan sattes “lo liter 0,1 M tris-HCl' buffert (pH 7,0) innehållande 0,3 M natriumklorid och det hela om- rördes för eluering av den HGI-glykoproteinhaltiga fraktionen från \J1 ~ - 1 .Lu l-J kn h) CD 25 30 35 451 844 3, DEAE-cellulcsan. Eluatet avsaltades genom användning av DIAFLO® ultrafiltreringsapparat med ihåliga fibrer (typ DC-30). Den av- saltade fraktionen lyofiliserades, varvid erhölls ca 15 g av ett pulver. Pulvret löstes i 150 ml destillerat vatten och anbringa- des pa en Sephadex® G-150 kolonn (6,0 X 80 cm), som ekvilibreraçs med 0,1 M tris-HCl buffert (pH 7,0). De fraktioner som motsvarar Ve/Vo-förhållanden av 1,11 - 1,60 uppsamlades. Den sammanslagna fraktionen dialyserades noggrant mot destillerat vatten och den . _ Ü . , _ Ü _ _ _ _.^® dialyseraoe losningen koncentreraoes genom anvansning av DiArso ß P ultralilt eringsapparat med ihåliga fibrer (typ DC-2), varvid er- nclls 100 ml av ett koncentrat innehållande ca 3 g rått HG2-gly- kcprctein. l0 g pulverformigt albumin från humanplacenta med en renhet av 98 %, bestämd genom elektrofores, löstes i det ovan erhållna koncentratet. Den erhållna lösningen ställdes på pH 6,5 med en 10 %-ig vattenlösning av natriumhydroxid, steriliserades genom trering som i exempel H, fylldes aseptiskt i portioner på 2,5 ml i glasflaskor, lyofiliserades aseptiskt och förseglades her- metiskt, varvid erhölls HO preparatflaskor som vardera innehöll ca 5,8 mg värmebehandlat HGI-glykoprotein.

Ovanstående preparat testades med avseende på biologisk ak- tivitet och viral infektiosítet på samma sätt som i försök 5. Den biologiska aktiviteten var jämförbar med densamma för ett prepa- rat som icke värmebehandlats och någon viral infektiositet kunde ej påvisas.

Exempel 6 Fyrahundra liter färsk urin som hopsamlats från normala män- niskor ställdes på pH 8 med 10 %-ig natriumhydroxidlösning och centrifugerades under kylning vid 10 OC med hjälp av en kontinu- erlig centrifug vid 15 000 G för avlägsnande av olösligt material.

Den överstående vätskan ställdes på pH 7 med 10 2-ig saltsyra och bringades att passera igenom en silikagelkolonn (10 x 30 cm). De substanser som adsorberades på silikagelen eluerades med NO liter 5 %-ig ammoniumlösning. Eluatet ställdes på pH 7,5 med 1 N sva- velsyra och försattes med ammoniumsulfat till en mättnad av 70 %, fick stå över natten vid 0 OC och bildad fällning uppsamlades ge- nom filtrering. Fällningen löstes i 2 liter 5 %-ig ammoniumlösning, placerades i cellofanrör (Vishking Co.) och dialyserades noggrant mot 0,05 M fosfatbuffert (pH 6,5). Den dialyserade lösningen gavs en volym av 10 liter med samma buffert och fick passera igenom 10 H UI 20 30 451 844 35 CM Sephadex® C-50 jonbytarkolonnen (H0 x HO cm), som ekvilibrerats med 0,05 M fosfatbuffert (pH 6,5), för avlägsnande av förorening- arna genom adsorption. Tio liter av flödet koncentrerades med hjälp av en DIAFLO® ultrafiltreringsapparat med ihåliga fibrer (Amicon Co., typ DC-30) och koncentratet dialyserades mot 0,1 M tris ~HCl buffert (pH 7,0) vid 5 OC över natten på liknande sätt som beskrivits ovan. ' Den dialyserade lösningen gavs en volym av en liter med samma buffert och fick passera igenom DEAE-cellulosakolonnen (4,0 x M0 cm) som ekvilibrerats med samma buffert. Kolonnen :vättades noggrant med 0,1 M tris-HCl buffert (pH 7,0) och eluerades där- efter med 0,1 M tris--HCl buffert (pH 7,0) innehållande 0,3 E natriumkloríd. De fraktioner som kan stimulera proliferationen och dífferentieringen av benmärgsceller från mus in vitro, som analyserats på samma sätt som i försök 5,uppsamlades. Den samman- slagna fraktionen dialyserades mot 0,1 M tris- HCl buffert (pH 7,0). Den dialyserade lösningen fick ånyo passera igenom DEAE- cellulosakclonnen (ü,O x M0 cm) som ekvilibrerats med samma buf- fert. Kolonnen eluerades genom en linjär koncentrationsgradient- eluering med natriumklorid (C till 0,3 M). De fraktioner som har en stimulerande verkan på proliferationen och differentieringen av granulocyter uppsamlades och blandades med ammoniumsulfat till en mättnad av 70 %. Den bildade fällningen uppsamlades, löstes i en liten mängd 0,1 M tris -H01 buffert (pH 7,0) och dialyserades mot samma buffert.

'Am Tjugu ml av den dialyserade lösningen påfördes en Sephadex® G-150 kolonn (H,0 X 60 cm) som ekvilibrerats med 0,1 M tris - HC1 buffert (pH 7,0) och de flödesfraktioner som erhållits vid Ve/Vo förhållanden av l,ll - 1,45 uppsamlades. Den sammanslagna fraktionen dislyserades noggrant mot destillerat vatten och den dialyserade lösningen lyofiliserades, varvid erhölls ca 500 mg av ett pulver.

Tvâhundra mg av ovanstående pulver löstes i 0,02 N fosfat- buffert (pH 7,0) innehållande 1,0 M natriumklorid och fick passe- ra igenom en kolonn som innehöll 100 ml konkanavalin A-Sefaros ® UB (Fine Chemical Laboratory), som ekvilibrerats med samma buffert.

Kolonnen tvättades noggrant med 0,02 M fosfatbuffert (pH 7,0) in- nehållande 1,0 M natriumklorid och eluerades därefter med en 0,02 M fosfatbuffert (pH 7,0) innehållande 50 mN u-metyl-D-glykosid och 1,0 M natriumklorid. De fraktioner som har en stimulerande effekt 20 25 30 451 844 x pá proliferatíonen och differentieringen av granulccyter, vilket analyserades enligt den metod som beskrivits i försök 5 uppsamla- des och dialyserades mot destillerat vatten. Den dialyserade lös- ningen lyofiliserades.

Ca 50 mg av det lyofiliserade pulver som erhållits ovan lös- tes i l ml 0,125 M tris- glyßinbuffert (pH 6,8) som innehöll 10 % glycerol och utsattes för elektrofores vid 10 mA under kylning.

Med hjälp av en apparat för preparativ elektrofores (typ Fuji Kabara II från Fuji Riken Co., Japan) under användning av 8 % akrylamidgel (pH 8,9; 20 mm x 25 mm). Fraktionen mad sn rela- tiv rörlighet av 0,ü6 âtervanns med 0,025 M tris--glyein bu”fert (pä 8,5), oialyserades därefter mot destillerat vatten och den dialyserade lösningen lyofiliserades, varvid erhölls ca 10 mg HGI-glykoprotein.

Ovanstående förfarande upprepades ett antal gånger och ca 1 g HGI-glykoprotein erhölls. Ett gram av det så erhållna EGE- glykoproteinet löstes fullständigt i tio ml vatten och ställdes på pä 6,8 med en 10 %-ig vattenlösning av natriumhydrcxid. Den erhållna lösningen upphettades vid 60 OC i tio timmar, kyldes därefter i isva ten, späddes 10-faldigt med steri t vatten och steriliserades genom filtrering med ett Millipore filtrerings- system (Millipore Co.) försett med membranfilter med en porstor- lek av 0,ü5 um. Vardera l ml av den steriliserade lösningen fyll- des aseptiskt i glasflaskor som steriliserats genom upphettning vid 180 OC i 2 timmar. Efter aseptisk lyofilisering förseglades flaskorna hermetiskt. Härigenom erhölls ca 97 glasflaskor som var och en innehöll 10 mg av ett värmebehandlat HGI-glykoprctein- preparat.

Ovanstående preparat testades med avseende på biologisk akti- vitet och viral infektiositet på samma sätt som i försöken 5 och 7. Den biologiska aktiviteten var ca H0 % av densamma för pre- paratet före värmebehandlingen och någon viral aktivitet kunde ej påvisas.

Exempel 7 Ett tusen liter färsk urin som erhållits från normala männi- skor behandlades på liknande sätt som i exempel 6 och 2,5 liter av en vattenlösning innehållande det råa HGI-glykoproteínet er- hölls från utflödet av en CM Sefadex ® C-50 kolonn. Till lösning- en sattes 25 liter 0,1 M tris-HCl buffert (pH 7,0). Efter nog- grann omröring koncentrerades lösningen till ca l/25 av den ur- U1 |__| CJ |..| KJ! 25 50 .35 451 844 37 sprungliga volymen med hjälp av en DIAFLO® ultrafiltreringsapparat med ihåliga fibrer. Till koncentratet sattes 5 liter 0,1 M tris- HCI buffert och 5 liter DBAE cellulosasuspensíon (300 g DEAE-cel1u- losa i torrt tillstånd) som ekvilibrerats med O,l H tris- HCl buf- fert (pH 7,0). Blandningen omrördes i 50 min, fick stå och filtre- rades under vakuum för uppsamling av DEAE-cellulosan, Den uppsam- lade DEAE-cellulosan tvättades genom tillsats av tio liter 0,1 M tris -H01 buffert (pH 7,0), filtrerades under vakuum, tvëttades med C,l M tris -H01 buffert (pä 7,0) som innehöll 0,05 E natrium- klorid och filtrerades under vakuum. Den så behandlade ïEAE-ce1lu- losan omrördes i tio liter 0,1 M tris-HCl buffert (pä 7,6) inne- hållande 0,5 H natriumklorid för eluering av den EGI-glykoprotein- haltiga fraktionen från DEAE-cellulosan. Eluatet_avsal:ades genom användning av en DIAFLO® ultrafiltreringsapparat med ihå- liga fibrer (typ DC-30). Efter lyofilisering erhölls ca 15 g av ett pulver.

Det ovan erhållna lyofiliserade pulvret löstes i 153 ml des- tillerat vatten och påfördes en Sephadex® G-150 kolonn (6,0 x 80 cm) som ekvilibrerats med 0,1 M tris-HCl buffert (pä 7,0).

De HGI-glykoproteinhaltiga fraktioner som erhållits vid Ve/Vo förhållanden av 1,11 - 1,60 uppsamlades och dialyserades nog- grant mot destillerat vatten.

Den dialyserade lösningen koncentrerades genom användning av en DIAFLO® ultrafiltreringsapparat med ihåliga fibrer (typ DC-2) varvid erhölls 30 ml av ett koncentrat innehållande ca 3 g rått HGI-glykoprotein. Koncentratet ställdes på pH 6,8 med natrium- hydroxid och upphettades under samma betingelser som i exempel 6. Det värmebehandlade koncentratet steriliserades genom filtre- ring och fylldes aseptiskt i portioner på 1,0 ml i glasflaskor.

Efter aseptisk lyofilisering förseglades glasflaskorna herme- tiskt. Härigenom erhölls 30 flaskor som vardera innehöll 5,2 mg av det värmebehandlade HGI-glykoproteinpreparatet.

Ovanstående preparat undersöktes med avseende på biologisk aktivitet och viral infektiositet enligt samma metod som i för- söken 5 och 7. Den biologiska aktiviteten var ca HO % av densam- ma före värmebehandlingen och någon virusaktivitet kunde ej på- visas.

Exempel 8 Förfarandet enligt exempel l upprepades, varvid erhölls Ca-500 må (ca 26 mg aktiv substans) HGI-glykoproteinpulver \}'1 1 'l 25 35 451 844 38 motsvarande prov nr H, förutom att följande steg utfördes före dialyseringen av den 5 %-iga vattenhaltiga ammoniaklösningen av den fällning som erhållits vid 70 % mättnad av ammoniumsulfat.

Ca 20 g av den fällning som bildades löstes i vatten och gavs en volym av 200 ml (100 mg/ml proteinkoncentration). Den erhåll- na lösningen upphettades vid 60 O C i 10 tim och kyldes därefter i isvatten för framställning av en fraktion innehållande värme- behandlat HGI-glykoprotein. Denna fraktion dialyserades på samma sätt som i exempel 1. Den biologiska aktiviteten av det erhållna pulverformiga HGI-glykoproteinet var jämförbart med densamma för fraktionen före värmebehandlingen och någon viral aktivitet kun- de ej påvisas.

Exempel 9 Ca H50 mg av ett pulver motsvarande prov nr H i exempel 1 och innehållande 23,5 mg HGI-glykoprotein erhölls genom en upprep- ning av förfarandet i exempel 1, förutom följande modifiering. _ ._ U _ U _ _ . _ _ o Tio liter av den utstrommanoe vattenlosningen :rån Ch Sepnaoexfl jonbytarkolonnen koncentrerades med hjälp av en DIAPLO® ultrafil- treringsapparat med ihåliga fibrer till en proteinkoncentration av 70 mg/ml. Den koncentrerade vattenlösningen upphettades vid 60 OC tio timmar och kyldes därefter i isvatten. Det olösliga material som bildades avlägsnades och vattenlösningen placerades i cellofanrör (Visking Co.) och dialyserades mot 0,1 M tris -H01 buffert (pH 7,0) vid 5 OC. Den dialyserade lösningen gavs en vo- lym av 1 liter med samma buffert, varvid erhölls en lösning mot- svarande prov nr 1 i exempel 1.

Den biologiska aktiviteten av det erhållna HGI-glykoprotein~ pulvret var väsentligen jämförbar med densamma för det pulver som erhölls utan värmebehandling. Någon viral aktivitet kunde ej påvisas.

Exempel 10 Ca 500 mg av ett pulver motsvarande prov nr U i exempel 1 och innehållande ca 26 mg HGI-glykoprotein erhölls genom en upp- repning av förfarandet i exempel 1, bortsett från följande modi- fiering.

Den fällning som erhölls genom utsaltning av flödet från DEAE- cellulosakolonnen med ammoniumsulfat löstes i 0,1 M tris -HCl-buf- fert till en proteinhalt av 150 mg/ml. Den erhållna lösningen upp- hettades vid 60 OC i 10 tim och kyldes i isvatten. Efter det att den bildade fällningen avlägsnats genom filtrering dialyserades \I1 |..| CJ p: \.\I 20 25 BO 55 451 844 39 vattenlösningen mot 0,1 M tris -HCl buffert för framställning av en dialyserad lösning som användes i stället för prov nr 3 i exempel l.

Den biologiska aktiviteten av det HGI-glykoproteinhaltiga pulver som slutligen erhölls var väsentligen jämförbar med den- samma för det preparat som erhölls utan värmebehandling. Någon viral aktivitet kunde ej påvisas. ' Exempel ll Femtio liter färsk urin som erhållits från normala människor neutraliserades med en tioprocentig natriumhydroxid-lösning och centrifugerades med hjälp av en kontinuerlig centrifug med kyl- v-- anordning som kördes vid 10 000 G. Den överstâende vätskan kon- . . _ .H , e _ centreraoes omedelbart tio gånger med hjalp av en EIAFUO ultra- fi treringsapparat med ihâ iga fibrer (Aminon Co., typ DC-30, Efter försedd med ett molekylviktsavskiljande l0 000 membran). illsats av 50 liter vatten koncentrerades lösningen ånyo för framställning av 3 liter koncentrat. Den koncentrerade urinen koncentrerades vidare med hjälp av en roterande vakuumindunstare, varvid erhölls ca 50 ml av ett koncentrat med en proteinhalt av 70 mg/ml. Koncentratet upphettades vid 60 1 0,5 OC i tic timmar och kyldes hastigt för framställning av en värmebehandlad HGI- glykoproteinhaltig fraktion. Efter det att bildat olöslig: mate- rial avlägsnats gavs koncentratet en volym av 5 liter med 0,1 M tris- HCl buffert (pH 7,0) och bringades att passera genom DEAE- cellulosakolonnen (U,0 x H0 cm), som ekvilibrerats med 0,l M tris- HCl buffert, så att HGI-glykoproteinet adsorberades på DEAE-cellulosan. Kolonnen tvättades noggrant med 0,1 M tris- HCl buffert (pH 7,0) och eluerades med 0,1 M tris--HCl buffert (pH 7,0) som innehöll 0,3 M natriumklorid. Därefter upprepades för- farandet enligt exempel 1, förutom att det ovan erhållna eluatet användes i stället för den 5 %~iga vattenhaltiga ammoniumlösningen av fällningen som erhölls vid 70 % mättnad med ammoniumsulfat. På så sätt erhölls ca 200 g HGI-glykoproteinpulver motsvarande prov nr H genom en upprepning av förfarandet enligt exempel 1.

Den biologiska aktiviteten av det slutligen erhållna HGI-gly- koproteinpulvret var väsentligen jämförbar med densamma för det preparat som erhölls utan värmebehandling. Någon viral aktivitet kunde ej påvisas.

Exempel 12 Förfarandet enligt exempel l upprepades för uppsamling av den kl! 451 844 40 fraktion som motsvarar prov nr 3 i exempel 1. Fraktionen koncen- trerades till en proteinhalt av 70 mg/ml och upphettades vid 60 CC i 10 tim. Därefter kyldes fraktionen i isvatten, befriades från bildad fällning och behandlades på samma sätt som i exempel 1, varvid erhölls ca 10 mg av ett HGI-glykoproteinpulver motsvarande prov nr š i exempel l. _ Den biologiska aktiviteten av det slutligen erhållna HGI-gly- kopreteinpulvret var väsentligen jämförbar med densamma för pre- parazet ezan värmebenandling.

Claims (5)

451 844 f-ü ~,_

1. Glykoprotein, k ä n n e t e c k n a t därav, att I det stimulerar benmärgceller fràn människa att bilda kolonier av granulocyter och vilket glykoprotein har följande fysika- liska och kemiska egenskaper: _ (a) löslighet:lösligt i vatten, nagot lösligt i kloroform och olösligt i etylalkohol och aceton; (b) specifik optisk vridning: Zïfiåo = 0 f 400 (0,25 procentig vattenhaltig lösning>; (c) pH; 5,0-6,0 (1 viktprocentig vattenhaltig lösning); (d) isoelektrisk punkt: pH 4,7 I 0,2; (e) termostsbilitet: vid upphettning vid 601 0,5°C i 30 minu- ter i 1-procentig vattenhaltig lösning går den stimulerande effekten pà proliferation och differentiering av humanogranu- locyter fullständigt förlorad; (f) elektrofores: den relativa rörligheten är 0,25 vid elekt- rofores som utnyttjar natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel; (g) infraröd absorption: karakteristisk absorption vid följan- de vágtal (cm"1):3600-3200 (stark absorption), 1700-1600 (stark absorption), 1550 (medium absorption), 1430-1360 (medi- um absorption) och 1150-1000 (brett band); (h) färgreaktion: färger karakteristiska för sackarider erhal- les vid W-naftol-svavelsyrareaktionen, indo1-svavelsyrareak- tionen, antron-svavelsyrareaktionen och fenol-svavelsyrareak- tionen; färger karakteristiska för polypeptidbindning och aminosyror erhålles vid Lowry-Folin's reaktion och vid ninhyd- rinreaktionen efter hydrolys med saltsyra; (i) aminosyror, som ingar i proteindelen, prolin, asparagin- syra, treonin, serin, glutaminsyra, glycin, alanin, valin, metionin, isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, lysin, histidin, tryptofan och arginin; (j) färg och form: väsentligen vit och amorf; (k) sockersammansättning av polysackariddelen: 10,0-13,0 viktprocent uttryckt som glykos av neutrala socker, 3,0-7,0 viktprocent sialinsyror och 1 viktprocent andra aminosocker: (1) viktförhallande mellan protein och polysackarid: 75-85:13,0-20,0; (m) elementaranalys: 42,3-47,3 % kol, 5,7~7,B X väte, 9,6-14,3 1 kväve, 34,4-39,4 % syre och 0,2 % eller mindre svavel; och 451 844 4% (n) molekylvikt: 75 000 till 90 000 dalton, bestämd genom gelfiltrering, varvid glykoproteinet erhållits fràn urin fràn frisk människa, vilken urin först koncentrsrats med avseende på däri förekommande proteiner, som därefter bringats i kon- takt med en katjonbytare och därefter med en anjonbytare, aktivt material sedan eluerats, eluatet underkastats gelfilt- reringskromatografi, därifrån uppeamlade fraktioner underkas- tats sockeraffinitetskromatografi och det adeorberade aktiva materialet eluerats, eluatet underkastats preparativ zonelekt- rofores och det aktiva materialet eluerats.

2. Terapeutiskt medel för leukopeni, k ä n n e t e c k - n a t därav, att det omfattar minst 500 000 enheter glykopro- tein såsom aktiv komponent och utdrygningsmedel, vilket glyko- protein stimulerar benmärgcellen fràn människa att bilda kolonier av granulocyter och vilket glykoprotein har följande fysikaliska och kemiska egenskaper: (a) löslighetzlösligt i vatten, nagot lösligt i kloroform och olösligt i etylalkohol och aceton; (b) specifik optisk vridning: ÅQYÉÛ = Ü 2 400 (Ü,25 procentíg vattenhaltig lösning); (c) pH; 5,0-6,0 (1 viktprocentig vattenhaltig lösning); (d) isoelektrisk punkt: pH 4,7 I 0,2; (e) termostabilitet: vid upphettning vid 50: 0,5°C i 30 minu- ter i 1-procentig vattenhaltig lösning gar den stimulerande effekten pa proliferation och differentiering av humanogranu- locyter fullständigt förlorad; (f) elektrofores: den relativa rörligheten är 0,25 vid elekt- rofores som utnyttjar natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel; (g) infraröd absorption: karakteristisk absorption vid följan- de vàgtal (cm'1):3600-3200 (stark absorption), 1700-1600 (stark absorption), 1550 (medium absorption), 1430-1380 (medi- um absorption) och 1150-1000 (brett band); (h) färgreaktion: färger karakteristiska för sackarider erhal- les vid N-naftol-svavelsyrareaktionen, indol-svavelsyrareak- tionen, antron-svavelsyrareaktionen och fenol-svave1syrareak- tionen; färger karakteristiska för polypeptidbindning och aminosyror erhålles vid Lowry-Folin's reaktion och vid ninhyd- rinreaktionen efter hydrolys med saltsyra; (i) aminosyror, som ingàr i proteindelen, prolin, asparagin- syra, treonin, serin, glutaminsyra, glycin, alanin, valin, (q 451 844 G5 metionin, isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, lysin, histidin, tryptofan och arginin; (j) färg och form: väsentligen vit och amorf; (k) sockersammansättning av polysackariddelen: 10,0-13,0 viktprocent uttryckt som glykos av neutrala socker, 3,0-7,0 viktprocent aialinsyror och 1 viktprocent andra aminosocker: (1) viktförhállande mellan protein och pclysackarid: 75-85:13,0-20,0; (m) elementaranalys: 42,3-47,3 X kol, 5,7-7,8 X väte, 9,6-14,3 X kväve, 34,4-39,4 X syre och 0,2 % eller mindre svavel; och in) molekylvikt: 75 000 till 90 000 dalton, bestämd genom gelfiltrering, varvid glykoproteinet erhållits från urin fran frisk människa, vilken urin först koncentrerats med avseende pa däri förekommande proteiner, som därefter bringats i kon- takt med en katjonbytare och därefter med en anjonbytare, aktivt material sedan eluerats, eluatet underkastats gelfilt- reringekromatografi, därifrån uppsamlade fraktioner underkas- tats sockeraffinitetekromatografi och det adsorberade aktiva materialet eluerats, eluatet underkastats preparativ zonelekt- rofores och det aktiva materialet eluerats.

3. Terapeutiskt medel för leukopeni enligt krav 2, k ä n n e t e c kn a t därav, att den virala infektiositeten eliminerats.

4. Terapeutiskt medel för leukopeni enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att glykoproteinet har en specifik biologisk aktivitet av minst 35 000 enheter/mg.

5. Förfarande för framställning av ett glykoprotein som stimulerar benmärgceller fran människa att bilda kolonier av granulocyter, vilket protein har följande fysikaliska och kemiska egenskaper: (a) löslighetzlösligt i vatten, nagot lösligt i kloroform och olösligt i etylalkohol och aceton; specifik optisk vridning: Zoíšß = 0 3 40°c (0,25 procentig vattenhaltig lösning); (c) pH; 5,0-6,0 (1 viktprocentig vattenhaltig lösning); (d) isoelektrísk punkt: pH 4,7 1 0,2; (e) termostabilitetz vid upphettning vid 60: 0,5°C i 30 minu- ter i 1~procentig vattenhaltig lösning gar den stimulerande effekten pa proliferation och differentiering av humanogranu- locyter fullständigt förlorad; ._4151 844 411 if) elektrofores: den relativa rörligheten är 0,25 vid elekt- rofores som utnyttjar natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel; (g) infraröd absorption: karakteristisk absorption vid följan- de vàgtal (cm'1):3600-3200 (stark absorption), 1700-1600 (stark absorption), 1550 (medium absorption), 1430-1380 (medi- um absorption) och 1150-1000 (brett band); _ (h) färgreaktion: färger karakteristiska för sackarider erhål- les vid drnaftol-svavelsyrareaktionen, indol-svavelsyrareak~ tionen, antron-svavelsyrareaktionen och fenol-svavelsyrareak- tionen; färger karakteristiska för polypeptidbindning och aminosyror erhålles vid Lowry~Fo1in's reaktion och vid ninhyd- rinreaktionen efter hydrolys med saltsyra; (i) aminosyror, som ingar i proteindelen, prolin, asparagin- syra, treonin, serin, glutaminsyra, glycin, alanin, valin, metionin, isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, lysin, histidin, tryptofan och arginin; (j) färg och form: väsentligen vit och amorf; (k) sockersammansättning av polysackariddelen: 10,0-13,0 viktprocent uttryckt som glykos av neutrala socker, 3,0-7,0 viktprocent sialinsyror och 1 viktprocent andra aminosocker: (1) viktförhallande mellan protein och polysackarid: 75-85:13,0-20,0; (m) elementaranalys: 42,3-47,3 % kol, 5,7-7,6 X väte, 9,6-14,3 X kväve, 34,4-39,4 X syre och 0,2 X eller mindre svavel; och (n) molekylvikt: 75 000 till 90 000 dalton, bestämd genom gelfiltrering, k ä n n e t e c k n a t därav, att urin fràn frisk människa koncentreras med avseende på däri förekommande proteiner, dessa proteiner bringas i kontakt med en katjonby- tare för avlägsnande av föroreningar genom adsorption pà jonbytaren, flödet bringas i kontakt med en anjonbytare för adsorption av det aktiva materialet, aktivt material elueras med en saltlösning enligt linjär koncentrationsgradientelue- ring, eluatet underkastas gelfiltreringskromatografi pà en höggradigt tvärbunden polymergel för framkallning av det aktiva materialet, fraktioner med ett relativt flöde 1,11 till 1,60 uopsamlas, de uppsamlade fraktionerna underkastas affini- tetskromatografi med ett adsorptionsmedel med affinitet till socker för att adsorbera det aktiva materialet, det adsorbera- de aktiva materialet elueras med en 20-100 mM sackaridlösning, eluatet underkastas preparativ zonelektrofores, det aktiva u,