JPH01221324A - ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤 - Google Patents
ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、造血器疾患治療剤に関し、さらに詳しくは造
血器疾患に対する(’!髄移植前後に本発明からなるヒ
ト単球−マクロファージコロニー刺激因子を投与し、ヒ
ト単゛球−マクロファージ系細胞及びその幹細胞に作用
して、単球−マクロファージの分化増殖を促進する造血
器疾患治療剤に関するものである。
血器疾患に対する(’!髄移植前後に本発明からなるヒ
ト単球−マクロファージコロニー刺激因子を投与し、ヒ
ト単゛球−マクロファージ系細胞及びその幹細胞に作用
して、単球−マクロファージの分化増殖を促進する造血
器疾患治療剤に関するものである。
[従来技術1
コロニー刺激因子(以下C8Fと略記する)は、哺乳動
物の造血組織、例えば骨髄などに存在する造血幹細胞の
分化・増殖を刺激する造血因子であり、多くのC8Fは
糖蛋白質から成っている。これまで、単球−マクロファ
ージ系幹細胞に作用する因子(M −CS F又はC3
F−1)、顆粒球−単球系V?細胞に作用1因子(GM
−C8F)、顆粒球系V?矧胞に作用する因子(G−C
8F)、史に顆粒球、単球、赤血球及び巨核球に共通な
多能竹斡細胞に作用暖る因子(Mu I t 1−C3
F。
物の造血組織、例えば骨髄などに存在する造血幹細胞の
分化・増殖を刺激する造血因子であり、多くのC8Fは
糖蛋白質から成っている。これまで、単球−マクロファ
ージ系幹細胞に作用する因子(M −CS F又はC3
F−1)、顆粒球−単球系V?細胞に作用1因子(GM
−C8F)、顆粒球系V?矧胞に作用する因子(G−C
8F)、史に顆粒球、単球、赤血球及び巨核球に共通な
多能竹斡細胞に作用暖る因子(Mu I t 1−C3
F。
インターロイ1ンー3又はIL−3)の4棒が知られて
いる。
いる。
1)髄移植の目的は免疫適格細胞、造面m胞の欠陥があ
る黒石に正常に機能する当該細胞の幹細胞(f′1髄)
を移植し、機能の再構築を図ろうと4るところにある。
る黒石に正常に機能する当該細胞の幹細胞(f′1髄)
を移植し、機能の再構築を図ろうと4るところにある。
したがって造血組織や免疫適格細胞の原発性、二次性の
欠陥、欠損があるーbのは勿論対象となるが、最近では
悪性腫瘍に対する免疫抑制療法に際し、損傷をう6」だ
これらの組織、細胞を再構築づることにより、より強力
な抗RΦ瘍効果を朋1)するという1」的に広く用いら
れている。
欠陥、欠損があるーbのは勿論対象となるが、最近では
悪性腫瘍に対する免疫抑制療法に際し、損傷をう6」だ
これらの組織、細胞を再構築づることにより、より強力
な抗RΦ瘍効果を朋1)するという1」的に広く用いら
れている。
ft fc[i移植の対象となる疾患には原Q性免疫不
全症、再生不ロ性貧面、進行性逍仏性血液lll胞機能
異常があることは勿論であり、造血器腫瘍である急性白
血病、慢性白血病、悪性リンパ師、形質細胞腫や進行性
固形腫瘍などもある。このように合口造血器疾患の治療
において、(1髄移植は強力な手段となっているが、移
植された骨髄の機能発揮が不」−分であるため感染症、
間質性肺炎、G V HD等の問題がある。
全症、再生不ロ性貧面、進行性逍仏性血液lll胞機能
異常があることは勿論であり、造血器腫瘍である急性白
血病、慢性白血病、悪性リンパ師、形質細胞腫や進行性
固形腫瘍などもある。このように合口造血器疾患の治療
において、(1髄移植は強力な手段となっているが、移
植された骨髄の機能発揮が不」−分であるため感染症、
間質性肺炎、G V HD等の問題がある。
骨髄移植後にa3けるt’+ u機能の発揮を[]的と
した物質としてはHG l−糖蛋白質(正岡徹、特開昭
62−36326)及びGM−C3F (^、14゜t
4ienhuisら、Journal of Cl1
nicalInvesteoation、 80巻、5
73−577頁、1987年)が報告されている。
した物質としてはHG l−糖蛋白質(正岡徹、特開昭
62−36326)及びGM−C3F (^、14゜t
4ienhuisら、Journal of Cl1
nicalInvesteoation、 80巻、5
73−577頁、1987年)が報告されている。
[発明が解決しようとする問題点1
’IF、血器疾患に対する骨髄移植療法は、血中の白血
球レベルがかなり低い状態で行われ、移植後も白血球の
低レベル状態がかなり長期間続く。この闇、患名は感染
症等の危険にさらされる。そこで、白血球のレベルを移
植後すばやく1脣させるため、白血球の産生を促進する
ことを目的として検詞を行った結果、本発明に係るヒ]
・単球−マクロファージコロニー刺激因子を骨髄移植前
後に投与することによって血中の白血球レベルの■−常
値への復帰が〒急に起こることを見出して本発明を完成
した。
球レベルがかなり低い状態で行われ、移植後も白血球の
低レベル状態がかなり長期間続く。この闇、患名は感染
症等の危険にさらされる。そこで、白血球のレベルを移
植後すばやく1脣させるため、白血球の産生を促進する
ことを目的として検詞を行った結果、本発明に係るヒ]
・単球−マクロファージコロニー刺激因子を骨髄移植前
後に投与することによって血中の白血球レベルの■−常
値への復帰が〒急に起こることを見出して本発明を完成
した。
即ら、本発明は、ヒト単球−マクロファージコロニー1
1m因子を有効成分とする造血器疾患治療剤を提供する
ムのであり、また、有効成分であるヒ1〜甲球−マクロ
ファージコ〇ニー刺激因子が哺乳動物の単球−マク〔1
フアージ系細胞及びその幹細胞に作用して、単球−マク
ロファージの分化・増殖を刺激する造血器疾患治療剤を
提供するものである。
1m因子を有効成分とする造血器疾患治療剤を提供する
ムのであり、また、有効成分であるヒ1〜甲球−マクロ
ファージコ〇ニー刺激因子が哺乳動物の単球−マク〔1
フアージ系細胞及びその幹細胞に作用して、単球−マク
ロファージの分化・増殖を刺激する造血器疾患治療剤を
提供するものである。
更に、本発明は、イj効°成分であるヒト単球−マクロ
ファージコロニー1dllyl因子人尿・ヒト単球−マ
クL]ファージコロニー刺激因子H生細胞の培養液又は
ヒ1−単球−マクロフアージコロニー刺激因子遺伝子組
換え細胞の培養液から得られる造血器疾患治療剤を提供
し、更にまた下記の理化学的性質を有する哺乳動物の単
球−マク【]ファージコロニー形成刺激因子を有効成分
とする造血器疾患治療剤を提供するものである。この因
子は本出願人の1人により既に特許出願(特願昭62−
178697号)され、その製造方法及び理化学的性質
は同出願にgT綱に記載されている。
ファージコロニー1dllyl因子人尿・ヒト単球−マ
クL]ファージコロニー刺激因子H生細胞の培養液又は
ヒ1−単球−マクロフアージコロニー刺激因子遺伝子組
換え細胞の培養液から得られる造血器疾患治療剤を提供
し、更にまた下記の理化学的性質を有する哺乳動物の単
球−マク【]ファージコロニー形成刺激因子を有効成分
とする造血器疾患治療剤を提供するものである。この因
子は本出願人の1人により既に特許出願(特願昭62−
178697号)され、その製造方法及び理化学的性質
は同出願にgT綱に記載されている。
a)分子式
同一のサブユニットから成るホモ2量体であって、ドデ
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で測定した分子量が70゜000〜90.000ダル1
〜ンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させた
勺ブコニッ1−についてドデシル・硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミド電気泳動法で測定した分子間は35゜O
OO〜45.000ダルトンである。
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で測定した分子量が70゜000〜90.000ダル1
〜ンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させた
勺ブコニッ1−についてドデシル・硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミド電気泳動法で測定した分子間は35゜O
OO〜45.000ダルトンである。
b)Ij′ブユニットのアミノ酸配列
ホモ2量体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
214乃至238個のアミノ酸配シ1を右し、122番
目及び140番目のアスパラギンはそれぞれ7スバラギ
ン(Asn)−x−スレオニン(Thr)/セリン(S
e r )で表される典型的なN−グリコシド結合部
位を有する。
214乃至238個のアミノ酸配シ1を右し、122番
目及び140番目のアスパラギンはそれぞれ7スバラギ
ン(Asn)−x−スレオニン(Thr)/セリン(S
e r )で表される典型的なN−グリコシド結合部
位を有する。
ここでXは任意のアミノ酸を示す。
C)等電点
ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気vK!ll法で測定した等電点
(pl)は3.1〜3.7である。
ース密度勾配等電点電気vK!ll法で測定した等電点
(pl)は3.1〜3.7である。
d)糖鎖の構成単糖
加水分解優tS速液体クロマトグラフィーで分析したと
ころ、同定された糖鎖の構成生詰は、マンノース、ガラ
クトース、N−ア廿チルガラクl−’)ミン及びN−ア
セデルノイラミン酸である。
ころ、同定された糖鎖の構成生詰は、マンノース、ガラ
クトース、N−ア廿チルガラクl−’)ミン及びN−ア
セデルノイラミン酸である。
e)円二色性スペクトル
円二色性分散81による遠紫外部CDスペクトルは波長
208 nm及び222n−にそれぞれ極小ピークがあ
りα−ヘリックス構造を含んでいる。
208 nm及び222n−にそれぞれ極小ピークがあ
りα−ヘリックス構造を含んでいる。
t) 熱安定性
60±0.5℃で60分闇加熱しても生物活性tよ失わ
れない。
れない。
g) 赤外線吸収スペクトル
波数1680z 、1200Ql−1、及び1130
m に弾痕吸収、波数15401−1、1430cI
I 及び1070a−’に中度吸収を示す赤外線吸収ス
ペクトラムを有する。
m に弾痕吸収、波数15401−1、1430cI
I 及び1070a−’に中度吸収を示す赤外線吸収ス
ペクトラムを有する。
本発明の上記理化学的性質を有するC8Fは、C3F−
1と同様に糖鎖を含む二本のポリペプチドがジスルフィ
ド結合し、生物学的に活性なホモ2量体から構成されて
いて分子量は、70.000〜90.000ダルトンで
あり、C3F−1の分子量より大きい。更に、本発明の
C8Fを構成しているサブユニットのポリペプチドは、
少なくとも214乃至238個のアミノ酸から成り、分
子量21,400ダルトンであり、C3F−1のそれの
14.000〜17.000ダルトンよりも大きい。ま
た、ナプユニットのアミノ酸配列をC3F−1と比較す
ると、NH2−末端の1番から149番目までのアミノ
酸配列は同じであったが、150番から214乃至23
8番目までのアミノ酸配列はC3F−1のcDNAから
推定されるものと、異なっており、C3F−1遺伝子−
しにコードされていなかった。従って、本発明のC8F
は、公知のC3F−1と別個な因子であることが判明し
た。また、前記公知の1−IGI−糖蛋白質、GM−C
8Fとは生物学的活性及び理化学的性状が全く異なって
いる。
1と同様に糖鎖を含む二本のポリペプチドがジスルフィ
ド結合し、生物学的に活性なホモ2量体から構成されて
いて分子量は、70.000〜90.000ダルトンで
あり、C3F−1の分子量より大きい。更に、本発明の
C8Fを構成しているサブユニットのポリペプチドは、
少なくとも214乃至238個のアミノ酸から成り、分
子量21,400ダルトンであり、C3F−1のそれの
14.000〜17.000ダルトンよりも大きい。ま
た、ナプユニットのアミノ酸配列をC3F−1と比較す
ると、NH2−末端の1番から149番目までのアミノ
酸配列は同じであったが、150番から214乃至23
8番目までのアミノ酸配列はC3F−1のcDNAから
推定されるものと、異なっており、C3F−1遺伝子−
しにコードされていなかった。従って、本発明のC8F
は、公知のC3F−1と別個な因子であることが判明し
た。また、前記公知の1−IGI−糖蛋白質、GM−C
8Fとは生物学的活性及び理化学的性状が全く異なって
いる。
[発明の具体的/に説明]
(1)造血各疾患治療剤の製造方法
本発明の上記理化学的性質を右する造血各疾患治療剤は
、例えば次のようにしてIJ mされる。健康人の尿を
pH8,0・〜9.0に調整し、尿中の粘性物質を沈澱
・除去し、モの上澄を分子部10゜000〜50,00
0ダル1−ンを通過させる限外濾過膜を用いて濃縮と脱
塩を行う。少なくとも200侶以上に濃縮(蛋白質温度
として1%(Wハ)以上)した模p11を6.5〜7.
5に調整し、60℃で10時間加熱処理(ウィルス等の
不活化)する。形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオ
ン交換体、例えばDEAE−セル0−ス等に有効成分を
吸着させる。
、例えば次のようにしてIJ mされる。健康人の尿を
pH8,0・〜9.0に調整し、尿中の粘性物質を沈澱
・除去し、モの上澄を分子部10゜000〜50,00
0ダル1−ンを通過させる限外濾過膜を用いて濃縮と脱
塩を行う。少なくとも200侶以上に濃縮(蛋白質温度
として1%(Wハ)以上)した模p11を6.5〜7.
5に調整し、60℃で10時間加熱処理(ウィルス等の
不活化)する。形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオ
ン交換体、例えばDEAE−セル0−ス等に有効成分を
吸着させる。
次に0.05〜0.1Mの緩衝液(pH5,5〜7.5
)で該イオン交換体を洗浄した後0.2M〜0.4Mの
!1笥液(pH5,5〜7.5)で有効成分を溶出する
。該溶出液を必要ならば限外濾過膜で濃縮し、1M〜4
Mの塩類、例えば硫安、食塩等を含有Jる緩衝液(pH
6,5〜7.5)で平衡化させゲル濾過剤、例えば5c
phacrylO8−300(Pharmaciaネ1
製)でゲル濾過し、分子吊範凹が70.000〜150
,000ダルトンの両分を回収する。次に該両分を上記
1M〜4MJ:A含有緩衝液で平衡化させた疎水性親和
体、例えばPhcnyl−3cpharose” (P
har+nacia社製)に吸着させ、0.5M〜1.
0Mの塩含有緩衝液(0116,5〜7.5)で溶出す
る。該溶出液を限外濾過膜で濃縮し、高速液体ゲル濾過
カラム、例えばTSKG−30008W (東洋費達製
)でゲル濾過し、分子量範囲が70.000〜150.
000ダルトンの両分を回収する。法両分を再度、濃縮
し、0.1%トリフルA口酢酸(TFΔ)溶液(1)I
11〜2)で平衡化した高速液体逆相カラム、例えばt
l−Pore■214TP(パイバック社製)に吸着さ
せ、0.1%TEAを含む溶剤、例えばアセトニトリル
又はイソプロパノールの直s9ga勾配溶出法により溶
出する。活性画分を回収し凍結乾燥する。このようにし
て得られた本発明のCS F剤は、比活性1×108単
位■・蛋白質以上をイiする純粋な物質である。次に凍
結乾燥画分に111球−マクロファージ刺激因子の安定
剤としての人血清アルブミン、糖類を含む″W衝液(p
116□5〜7.5)を加え溶解調製し無菌濾過した後
、無菌的に凍結乾燥し造血各疾患治療剤を製造づる。
)で該イオン交換体を洗浄した後0.2M〜0.4Mの
!1笥液(pH5,5〜7.5)で有効成分を溶出する
。該溶出液を必要ならば限外濾過膜で濃縮し、1M〜4
Mの塩類、例えば硫安、食塩等を含有Jる緩衝液(pH
6,5〜7.5)で平衡化させゲル濾過剤、例えば5c
phacrylO8−300(Pharmaciaネ1
製)でゲル濾過し、分子吊範凹が70.000〜150
,000ダルトンの両分を回収する。次に該両分を上記
1M〜4MJ:A含有緩衝液で平衡化させた疎水性親和
体、例えばPhcnyl−3cpharose” (P
har+nacia社製)に吸着させ、0.5M〜1.
0Mの塩含有緩衝液(0116,5〜7.5)で溶出す
る。該溶出液を限外濾過膜で濃縮し、高速液体ゲル濾過
カラム、例えばTSKG−30008W (東洋費達製
)でゲル濾過し、分子量範囲が70.000〜150.
000ダルトンの両分を回収する。法両分を再度、濃縮
し、0.1%トリフルA口酢酸(TFΔ)溶液(1)I
11〜2)で平衡化した高速液体逆相カラム、例えばt
l−Pore■214TP(パイバック社製)に吸着さ
せ、0.1%TEAを含む溶剤、例えばアセトニトリル
又はイソプロパノールの直s9ga勾配溶出法により溶
出する。活性画分を回収し凍結乾燥する。このようにし
て得られた本発明のCS F剤は、比活性1×108単
位■・蛋白質以上をイiする純粋な物質である。次に凍
結乾燥画分に111球−マクロファージ刺激因子の安定
剤としての人血清アルブミン、糖類を含む″W衝液(p
116□5〜7.5)を加え溶解調製し無菌濾過した後
、無菌的に凍結乾燥し造血各疾患治療剤を製造づる。
本発明の造血各疾患治療剤のWIA造例を参考例とし、
参り例1より得られた治療剤の生物学的活性を実施例と
して次に示す。
参り例1より得られた治療剤の生物学的活性を実施例と
して次に示す。
参考例1
廿−i;j、、人の尿1000LをpH8,5に調整し
、沈澱物を濾過除去し、分画分子ff150.000ダ
ルトンの限外濾過膜(アミコン社、1]10 X 50
)でm縮と脱塩を行った。次に、濃縮液をpH17,
0に調整し、密封容器中で60℃、10時間加熱殺菌し
た。殺菌後、遠心分11t(5,000xg 30分聞
)して沈澱物を除去した後、0.02Mリン酸緩衝液(
pH7,2)で平衡化したDEAE−セルロースと混合
し、吸着させた。1)EAE−セルロースを0.02M
リンMM衝液、0.05M食塩添加0.02Mリン酸緩
衝液(pH17,2)で洗浄した後、0.25M食塩添
加リンvi緩衝液(pH7,2>で溶出させた。溶出液
を限外濾過膜(アミコン社HIOPIO)で濃縮して、
5ephacryl S −300(ファルマシア社、
直径20α×高さ80α)を用い、IMla安添加緩自
液(pH7,2)でゲル濾過した。ゲル濾過での分子量
範囲70.000〜150.000ダルトンの両分をL
記1M硫安添加緩衝液で平衡化したPhenyl−3e
pharose 4 Bカラム(ファルマシア社製直
径10×長さ20 cyr )に吸着させ、次いで0.
5M硫安添加a衝液(pH17,2)で溶出させた。溶
出液を限外濾過膜(アミコン社製1−11 P 10)
で濃縮して、TSKG−3000SWカラム(東洋曹″
a製、径2,5X60Cj+)で^速液体りロマトグラ
フィーにかけ、分子量範囲70,000〜150.00
0ダルトンの両分を得た。この両分を重度濃縮し、1l
i−Pore 214 ’r P (パイダツクネ1、
径2.2×長さ25 cm )の逆相カラムで0.1%
トリノルオi〕酢酸を含む、アセトニトリルO−100
%(pH2,0)の直線濃度勾配による高速液体クロマ
トグラフィにかけC8Fを溶出し、凍結乾燥し本発明の
C8F約411I!J@−得た。この方法を反復して実
施し本発明のC3F20IIQを得た。次に凍結乾燥画
分に本発明のC8Fの安定剤としくの入面□清アルブミ
ン、糖類を含むリン耐α171(ρ117.2)を加え
溶解調製した掛、孔拌0.22μmのメンブランノイル
ターを装着した濾過除菌装置(ミリボア社製)を用いて
濾過して除菌し、あらかじめ180℃2時間乾熱滅菌し
たガラス製バイアル瓶へ11IIずつ無菌的に分注し、
無菌的に凍結乾燥し、バイアル瓶を密封し、本発明のC
5Fを含む造血器疾忠治療剤約500本を得た。
、沈澱物を濾過除去し、分画分子ff150.000ダ
ルトンの限外濾過膜(アミコン社、1]10 X 50
)でm縮と脱塩を行った。次に、濃縮液をpH17,
0に調整し、密封容器中で60℃、10時間加熱殺菌し
た。殺菌後、遠心分11t(5,000xg 30分聞
)して沈澱物を除去した後、0.02Mリン酸緩衝液(
pH7,2)で平衡化したDEAE−セルロースと混合
し、吸着させた。1)EAE−セルロースを0.02M
リンMM衝液、0.05M食塩添加0.02Mリン酸緩
衝液(pH17,2)で洗浄した後、0.25M食塩添
加リンvi緩衝液(pH7,2>で溶出させた。溶出液
を限外濾過膜(アミコン社HIOPIO)で濃縮して、
5ephacryl S −300(ファルマシア社、
直径20α×高さ80α)を用い、IMla安添加緩自
液(pH7,2)でゲル濾過した。ゲル濾過での分子量
範囲70.000〜150.000ダルトンの両分をL
記1M硫安添加緩衝液で平衡化したPhenyl−3e
pharose 4 Bカラム(ファルマシア社製直
径10×長さ20 cyr )に吸着させ、次いで0.
5M硫安添加a衝液(pH17,2)で溶出させた。溶
出液を限外濾過膜(アミコン社製1−11 P 10)
で濃縮して、TSKG−3000SWカラム(東洋曹″
a製、径2,5X60Cj+)で^速液体りロマトグラ
フィーにかけ、分子量範囲70,000〜150.00
0ダルトンの両分を得た。この両分を重度濃縮し、1l
i−Pore 214 ’r P (パイダツクネ1、
径2.2×長さ25 cm )の逆相カラムで0.1%
トリノルオi〕酢酸を含む、アセトニトリルO−100
%(pH2,0)の直線濃度勾配による高速液体クロマ
トグラフィにかけC8Fを溶出し、凍結乾燥し本発明の
C8F約411I!J@−得た。この方法を反復して実
施し本発明のC3F20IIQを得た。次に凍結乾燥画
分に本発明のC8Fの安定剤としくの入面□清アルブミ
ン、糖類を含むリン耐α171(ρ117.2)を加え
溶解調製した掛、孔拌0.22μmのメンブランノイル
ターを装着した濾過除菌装置(ミリボア社製)を用いて
濾過して除菌し、あらかじめ180℃2時間乾熱滅菌し
たガラス製バイアル瓶へ11IIずつ無菌的に分注し、
無菌的に凍結乾燥し、バイアル瓶を密封し、本発明のC
5Fを含む造血器疾忠治療剤約500本を得た。
参考例2
参化例1の方法にお&N テ5ephacryl S
−300を丁5KG3.0OO3W(東洋四速’!J)
、Phenyl−3epharose 4 B
を r S K phenyl −5P W(東洋舎
達製)にかえて、全て^速液体り0マドグラフイーによ
り精製した本発明のC8Fを実施例1と同様な方法で無
菌濾過、凍結乾燥し、本発明のC8Fを含む造+fh器
疾患治療剤約500本を得た。゛ 実施例1 コ[lニー刺激活性及び比活性本発明のC8
Fのコロニー刺激活性は、1nvitroのマウス骨[
1胞による単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法ぐ測
定した。試料を0.3%寒天、20%牛脂児血清(Fe
2)及びマウス骨髄細胞1×105個を含むHcCoy
’s 5A培地1−と況合し、7.5%C02通気下、
37℃で7日111培養した。培養後、50個以上の細
胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニー数を計
測した。
−300を丁5KG3.0OO3W(東洋四速’!J)
、Phenyl−3epharose 4 B
を r S K phenyl −5P W(東洋舎
達製)にかえて、全て^速液体り0マドグラフイーによ
り精製した本発明のC8Fを実施例1と同様な方法で無
菌濾過、凍結乾燥し、本発明のC8Fを含む造+fh器
疾患治療剤約500本を得た。゛ 実施例1 コ[lニー刺激活性及び比活性本発明のC8
Fのコロニー刺激活性は、1nvitroのマウス骨[
1胞による単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法ぐ測
定した。試料を0.3%寒天、20%牛脂児血清(Fe
2)及びマウス骨髄細胞1×105個を含むHcCoy
’s 5A培地1−と況合し、7.5%C02通気下、
37℃で7日111培養した。培養後、50個以上の細
胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニー数を計
測した。
コロニー刺激活性はψ位で表現し、1甲位は1コロニー
を形成させるのに必要なC3FIltと規定した。また
比活性はC3F蛋白質lay当り形成されるコロニー数
(11位)で表わした。その結果、本発明のC8Fは、
1.4×108単位/#9・蛋0賀の比活性をtrシて
いた。形成されたコロニーをへ7トキシリン一1オラン
染色して形態学的に分類したところ、95%以上のコロ
ニーが単球−マクロファージから形成されていた。
を形成させるのに必要なC3FIltと規定した。また
比活性はC3F蛋白質lay当り形成されるコロニー数
(11位)で表わした。その結果、本発明のC8Fは、
1.4×108単位/#9・蛋0賀の比活性をtrシて
いた。形成されたコロニーをへ7トキシリン一1オラン
染色して形態学的に分類したところ、95%以上のコロ
ニーが単球−マクロファージから形成されていた。
実施例2 in vivoにおG−するマウス告髄…
球−マクロファージ系幹細胞(CFU−M)増殖促進作
用 057BLマウス(5匹/群)に対して体重I Ky当
り0(生理食塩液)、80×104単位、160×10
単位、320xlO’11位及び640X10’11
位のコロニー刺激活性を右する本治療剤を101回、M
続3日間腹腔内に投与した。投与終了の翌日に、各マウ
スより大111(1骨髄及び牌臓を摘出し、骨髄及び牌
臓中の単球−マクロファージ系幹細胞(CFLJ−M)
数を、1,000単位のC3Fを刺激因子とする前記軟
寒天平板法によるコロニー形成試験で測定した。その結
果は第1表及び第2表に示すとおりであった。
球−マクロファージ系幹細胞(CFU−M)増殖促進作
用 057BLマウス(5匹/群)に対して体重I Ky当
り0(生理食塩液)、80×104単位、160×10
単位、320xlO’11位及び640X10’11
位のコロニー刺激活性を右する本治療剤を101回、M
続3日間腹腔内に投与した。投与終了の翌日に、各マウ
スより大111(1骨髄及び牌臓を摘出し、骨髄及び牌
臓中の単球−マクロファージ系幹細胞(CFLJ−M)
数を、1,000単位のC3Fを刺激因子とする前記軟
寒天平板法によるコロニー形成試験で測定した。その結
果は第1表及び第2表に示すとおりであった。
第1表 マウス骨髄CFLJ−Ml!殖促進作用0)°
は1%の危険率で有意の芹が有ることを示す。
は1%の危険率で有意の芹が有ることを示す。
第2表 マウス牌臓CFU−M増幀錠進作用Q1)°は
1%の危険率で有意の差が有ることを示J0 第1表及び第2表に示す如く、80X104単位/に9
体重の薬剤投!jにより、f)髄及び牌臓でのCF U
−Mの増加が認められ、160X104単位/ K9
9体重上の投Ljでは顕著な増加が認められた。
1%の危険率で有意の差が有ることを示J0 第1表及び第2表に示す如く、80X104単位/に9
体重の薬剤投!jにより、f)髄及び牌臓でのCF U
−Mの増加が認められ、160X104単位/ K9
9体重上の投Ljでは顕著な増加が認められた。
実施例3 骨髄移植マウスに対する回復促進作用BAL
B/cマウス(5匹/群)に600Oを7.8Gy全身
照躬した後同系マウスの骨I8細胞をマウス当り1.0
X106個尾静脈より移植した。
B/cマウス(5匹/群)に600Oを7.8Gy全身
照躬した後同系マウスの骨I8細胞をマウス当り1.0
X106個尾静脈より移植した。
本治療剤を60CO照射ll7t5日間マウスに対し体
重I Kg当りO(生理食塩水)及び640X10’単
位1日1回、腹腔内に投与した。骨髄移植後7日、14
日、及び21日Bkマウス尾静脈より採血した末梢白血
球数を計測し、また骨髄移植後14日及び21日Bk各
マウスより大腿骨及び牌臓を摘出し、骨髄及び牌臓中の
単球−マクロファージ系斡細胞(CFU−M)数を1.
000単位のにSFを刺激因子とする前記軟寒天平板法
によるコロニー形成法で測定した。(の結果は第1図及
び第3表に示す。対照群はO単位(生理食塩水)投与群
を示す。
重I Kg当りO(生理食塩水)及び640X10’単
位1日1回、腹腔内に投与した。骨髄移植後7日、14
日、及び21日Bkマウス尾静脈より採血した末梢白血
球数を計測し、また骨髄移植後14日及び21日Bk各
マウスより大腿骨及び牌臓を摘出し、骨髄及び牌臓中の
単球−マクロファージ系斡細胞(CFU−M)数を1.
000単位のにSFを刺激因子とする前記軟寒天平板法
によるコロニー形成法で測定した。(の結果は第1図及
び第3表に示す。対照群はO単位(生理食塩水)投与群
を示す。
第3表 骨髄移植マウスの骨髄及び牌臓中のCF tJ
−M回復促進作用 (11)CFLJ−M数は大腿骨及び稗臓当りの数を示
°は5%の危険率で有意の差が有ることを示す。
−M回復促進作用 (11)CFLJ−M数は大腿骨及び稗臓当りの数を示
°は5%の危険率で有意の差が有ることを示す。
第1図及び第3表に示す如く本治療剤には骨髄移植した
マウスの白血球数及び骨髄、詩臓中の単球−ンクロファ
ージ系9?細胞(CF U −M )の顕若な回復促進
作用が認められた。
マウスの白血球数及び骨髄、詩臓中の単球−ンクロファ
ージ系9?細胞(CF U −M )の顕若な回復促進
作用が認められた。
実施P144 低濃度骨髄移植マウスに対する死亡率
低下作用 BALB/C?ウス(10匹/群)に60coを全身照
射した優同系マウスの骨髄細胞をマウス当り2X10’
個尾静脈より移植した。本治療剤を骨髄移植前5日間又
は骨髄移植後5日間マウスに対し体重I Kg当り、6
40X10’単位1日1回腹腔内投ちした。前者を前投
与群後者を後段Lj群とし、本治療剤を投与しない群を
対照群とした。
低下作用 BALB/C?ウス(10匹/群)に60coを全身照
射した優同系マウスの骨髄細胞をマウス当り2X10’
個尾静脈より移植した。本治療剤を骨髄移植前5日間又
は骨髄移植後5日間マウスに対し体重I Kg当り、6
40X10’単位1日1回腹腔内投ちした。前者を前投
与群後者を後段Lj群とし、本治療剤を投与しない群を
対照群とした。
骨髄移植後14日間のマウス死亡率を観察した。
その結果を第2図に示す。
第2図に示す如く本治療剤を低濃度骨髄移植マウスに骨
髄移植前後投与する事によりその死亡率を著しく低下せ
しめた。
髄移植前後投与する事によりその死亡率を著しく低下せ
しめた。
第1図は60CO照射マウスに骨髄移植した後、本発明
の造血器疾患治療剤を投与した場合の白血球同復促進作
用を末梢自白球数を経時的にカウントすることにより示
1゜ 0・・・治療剤投与群 ・・・・対照(’J理食塩水投与群) ・・
・・・5%の危険率で右息差のあることを示づ。 第2図は、骨髄移植sinを第1図より少なくした場合
、移植前及び後にそれぞれ本発明の造血器疾患治療剤を
投与した11のマウスの死亡率低重作用を経時的に示す
。 0・・・前投与群 Δ・・・後投与群 ・・・・対照群
の造血器疾患治療剤を投与した場合の白血球同復促進作
用を末梢自白球数を経時的にカウントすることにより示
1゜ 0・・・治療剤投与群 ・・・・対照(’J理食塩水投与群) ・・
・・・5%の危険率で右息差のあることを示づ。 第2図は、骨髄移植sinを第1図より少なくした場合
、移植前及び後にそれぞれ本発明の造血器疾患治療剤を
投与した11のマウスの死亡率低重作用を経時的に示す
。 0・・・前投与群 Δ・・・後投与群 ・・・・対照群
Claims (5)
- (1)ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有
効成分とする造血器疾患治療剤。 - (2)ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子が哺
乳動物の単球−マクロファージ系細胞及びその幹細胞に
作用して、単球−マクロファージの分化・増殖を刺激す
る特許請求の範囲第1項記載の造血器疾患治療剤。 - (3)ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子が人
尿、ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子産生細
胞の培養液又はヒト単球−マクロファージコロニー刺激
因子遺伝子組換え細胞の培養液から得られる特許請求の
範囲第1項又は第2項記載の造血器疾患治療剤。 - (4)ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子が次
の理化学的性質を有するものであることを特徴とする特
許請求の範囲第1項乃至第3項いずれかに記載の造血器
疾患治療剤。 a)分子量 同一のサブユニットから成るホモ2量体であつて、ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で
測定した分子量が70,000〜90,000ダルトン
であり、還元剤で解離させて生物活性を消失させたサブ
ユニットについてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミド電気泳動法で測定した分子量は35,000〜4
5,000ダルトンである。 b)サブユニットのアミノ酸配列 ホモ2量体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
214乃至238個のアミノ酸配列を有し、122番目
及び140番目のアスパラギンはそれぞれアスパラギン
(Asn)−x−スレオニン(Thr)/セリン(Se
r)で表される典型的なN−グリコシド結合部位を有す
る。 ここでxは任意のアミノ酸を示す。 【遺伝子配列があります】 c)等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシユクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点(pI
)は3.1〜3.7である。 d)糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析したとこ
ろ、同定された糖鎖の構成単糖は、マンノース、ガラク
トース、N−アセチルガラクトサミン及びN−アセチル
ノイラミン酸である。 e)円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部CDスペクトルは波長2
08nm及び222nmにそれぞれ極小ピークがありα
−ヘリックス構造を含んでいる。 f)熱安定性 60±0.5℃で60分間加熱しても生物活性は失われ
ない。 g)赤外線吸収スペクトル 波数1680cm^−^1、1200cm^−^1、及
び1130cm^−^1に強度吸収、波数1540cm
^−^1、1430cm^−^1及び1070cm^−
^1に中度吸収を示す赤外線吸収スペクトラムを有する
。 - (5)造血器疾患に対する骨髄移植療法において用いら
れることを特徴とする特許請求の範囲第1項乃至第4項
に記載の造血器疾患治療剤。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63046705A JPH0610137B2 (ja) | 1988-02-29 | 1988-02-29 | ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤 |
CA000592172A CA1336679C (en) | 1988-02-29 | 1989-02-27 | Remedy for hematopoietic tissue diseases comprising human monocytic macrophage colony stimulating factor as active ingredient |
KR1019890002285A KR890012665A (ko) | 1988-02-29 | 1989-02-27 | 활성성분으로서 사람 단구성 대식세포 콜로니 자극인자를 함유하는 조혈조직질환의 치료제 |
EP19890103432 EP0331088A3 (en) | 1988-02-29 | 1989-02-27 | Remedy for hematopoietic tissue diseases comprising human monocytic macrophage colony stimulating factor as active ingredient |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63046705A JPH0610137B2 (ja) | 1988-02-29 | 1988-02-29 | ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01221324A true JPH01221324A (ja) | 1989-09-04 |
JPH0610137B2 JPH0610137B2 (ja) | 1994-02-09 |
Family
ID=12754780
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63046705A Expired - Fee Related JPH0610137B2 (ja) | 1988-02-29 | 1988-02-29 | ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0331088A3 (ja) |
JP (1) | JPH0610137B2 (ja) |
KR (1) | KR890012665A (ja) |
CA (1) | CA1336679C (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991008754A1 (en) * | 1989-12-13 | 1991-06-27 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Medicinal application of m-csf |
US5714140A (en) * | 1989-12-13 | 1998-02-03 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for inhibiting the production of bioactive IL-1 by administering M-CSF |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU4931093A (en) * | 1992-09-22 | 1994-04-12 | Genetics Institute Inc. | Highly concentrated mcsf compositions |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6434998A (en) * | 1986-10-31 | 1989-02-06 | Denki Kagaku Kogyo Kk | Human urine derived csf and production thereof |
JPH022391A (ja) * | 1988-02-08 | 1990-01-08 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | ヒトm―csf及びその製造法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1986004587A1 (en) * | 1985-02-05 | 1986-08-14 | Cetus Corporation | Purification of native colony stimulating factor-1 |
JPH0753667B2 (ja) * | 1985-08-09 | 1995-06-07 | 新技術開発事業団 | 骨髄移植療法補助剤 |
EP0307402B1 (en) * | 1986-05-06 | 1993-08-11 | Genetics Institute, Inc. | Production of m-csf |
WO1988003173A2 (en) * | 1986-10-24 | 1988-05-05 | Cetus Corporation | New forms of colony stimulating factor-1 |
DE3777623D1 (de) * | 1986-12-07 | 1992-04-23 | Morinaga Milk Industry Co Ltd | Kolonie-stimulierender faktor und verfahren zu seiner herstellung. |
-
1988
- 1988-02-29 JP JP63046705A patent/JPH0610137B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-02-27 EP EP19890103432 patent/EP0331088A3/en not_active Withdrawn
- 1989-02-27 KR KR1019890002285A patent/KR890012665A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-02-27 CA CA000592172A patent/CA1336679C/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPS6434998A (en) * | 1986-10-31 | 1989-02-06 | Denki Kagaku Kogyo Kk | Human urine derived csf and production thereof |
JPH022391A (ja) * | 1988-02-08 | 1990-01-08 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | ヒトm―csf及びその製造法 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO1991008754A1 (en) * | 1989-12-13 | 1991-06-27 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Medicinal application of m-csf |
US5714140A (en) * | 1989-12-13 | 1998-02-03 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for inhibiting the production of bioactive IL-1 by administering M-CSF |
US5837230A (en) * | 1989-12-13 | 1998-11-17 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Methods of treating allergies with M-CSF |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR890012665A (ko) | 1989-09-18 |
JPH0610137B2 (ja) | 1994-02-09 |
EP0331088A2 (en) | 1989-09-06 |
EP0331088A3 (en) | 1991-11-13 |
CA1336679C (en) | 1995-08-15 |
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