RU2272810C2 - Средство для активации стволовых клеток - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к лекарственным препаратам, содержащим антигены и антитела. Средство представлено ксеногенными поликлональными иммуноглобулинами класса IgG со средней молекулярной массой 150 кДа, полученными как гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов CD34+ стволовых клеток. Средство направлено на весь комплекс антигенных детерминант на поверхности и внутри CD34+ стволовых клеток, что приводит к их активации при использовании средства в количествах 10^-4-10^-6 мг. 1 табл.

Description

Заявляемое изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам, содержащим антигены и антитела, в частности иммуноглобулины. Оно может быть использовано для активации эндогенных и экзогенных стволовых клеток.

Стволовые клетки человека используются в современной медицине при лечении многих заболеваний, в частности онкологических, кардиологических и ряда других. Стволовые клетки могут быть подучены из костного мозга, а также из пуповинной и периферической крови и из эмбриональных тканей. Эффект от трансплантации стволовых клеток дозозависим. Так при трансплантации стволовых клеток пуповинной крови минимальная эффективная доза для реципиента с массой тела менее 10 кг составляет 5×10⁸ клеток, а для реципиента с массой тела более 50 кг 25×10⁸ клеток и более (Романенко Н.А. Заготовка и хранение ядросодержащих клеток пуповинной крови человека. Автореф.дисс.канд.мед.наук. С-Петербург, 2000, 24 с.). Дозозависимость указанной процедуры вызывает необходимость получения большого количества стволовых клеток или при ограниченном их количестве необходимость использования искусственных стимуляторов их деятельности в организме реципиента. Стимуляторами активности стволовых клеток являются, например, колониестимулирующие факторы, такие как интерлейкин-3, эритропоэтин и т.п.

Известен рекомбинантный человеческий грануломоноцитарный колониестимулирующий фактор, представляющий собой flt3 лиганды тирозинкиназных рецепторов ("Лейкомакс" фирмы Pharma Service Inc.). Указанный препарат стимулирует пролиферацию гемопоэтических родоначальных клеток-предшественников грануломоноцитов из-за его сходства с природным макрофагальным колониестимулирующим фактором и фактором стволовых клеток (S.D.Liman et al. Cloning of the human homologue of the murine flt3 ligand: a growth factor for early hematopoietic progenitor cells. Progress in Growth Factors, 1995, vol.1, N1, p.42-45). Он предназначен для лечения лейкопении, вызванной противоопухолевой химиотерапией, апластической анемии, инфекции (включая ВИЧ), для ускорения восстановления миелоидного кроветворения после трансплантации аллогенного костного мозга и др.

Однако при лечении Лейкомаксом наблюдается большое количество побочных реакций и осложнений, включая лихорадку, диарею, рвоту, реакции в местах инъекций, цереброваскулярные нарушения, дезориентацию, судороги, нарушение ритма сердца, отек легких и т.д.

Также известны моноклональные антитела к антигену СД34+, которые позволяют выявлять in vitro стволовые кроветворные СД34+ клетки по одному данному антигену. Указанные антитела получают с использованием гибридомной технологии (Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. С-Петербург, 1998, 156 с.). Однако они позволяют распознавать на поверхности стволовых клеток только один рецептор к L-селектину, который обеспечивает прикрепление стволовых клеток к эндотелию кровеносных сосудов и строме костного мозга. Моноклональные антитела к антигену СД34 используются только в лабораторной практике.

Наиболее близким по механизму действия к заявляемому средству для активации стволовых клеток является препарат Филгастрим (Нейпоген) фирмы F.Hoffman-la Roshe, представляющий собой гликопротеин, состоящий из 175 аминокислот и имеющий молекулярную массу 187-189 килоДальтон (кДа), полученный экспрессией человеческого гена 5gdl-g31 в геном Е.coli. В отличие от природного стимулятора кроветворения он содержит дополнительную аминокислоту - метионин. Филгастрим укорачивает время созревания нейтрофилов из клеток-предшественников с 5 до 1 дня, ускоряет выход зрелых нейтрофилов из костного мозга в кровь (B.Lord et al. Proc. of the National Academy of Sci. of USA, 1992, 86, p.9499-9503), усиливает хемотаксис нейтрофилов (S.P.Colgan et al., Experim.Hematology, 1992, 20, p.1229-1234). Его применяют при стандартной цитостатической химиотерапии, пересадке костного мозга, для мобилизации природного колониестимулирующего фактора, при хронических нейтропениях, для ускорения заживления ран и т.д.

Однако применение Филгастрима вызывает осложнения: боли в костях, увеличение селезенки, кожные реакции и т.д. Кроме того, стоимость курса лечения Филгастримом достаточно высока и составляет 1500-3000 долларов США.

Технический результат, достигаемый в заявляемом изобретении, заключается в получении средства, направленно действующего на весь комплекс антигенных детерминант на поверхности и внутри стволовых клеток, что приводит к их активации.

Указанная цель достигается тем, что средство для активации стволовых клеток на основе гликопротеина в качестве последнего включает в себя ксеногенные или аллогенные поликлональные иммуноглобулины класса IgG с молекулярной массой 150 кДа, содержащие 65-85 мас.% иммуноглобулина IgG1, 23-30 мас.% иммуноглобулина IgG2, 0,00001-8,0 мас.% иммуноглобулина IgG3 и 0,00001-4,0 мас.% иммуноглобулина IgG4, полученные как гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов стволовых клеток.

Иммуноглобулииы класса G, подклассов IgG1-lgG4 имеют одинаковые константные регионы с постоянной последовательностью аминокислот и различные вариабельные участки; они различаются между собой по основным эффекторным характеристикам, однако все способны в отличие от иммуноглобулинов других классов проникать через плацентарный барьер, образуемый совокупностью мембран клеток, составляющих ткани плаценты. Выработанные, как результат гуморального иммунного ответа на весь комплекс антигенов стволовых клеток, они, как показали наши исследования, стимулируют процессы жизнедеятельности в стволовых клетках, что проявляется в активации синтеза ДНК в ядрах стволовых клеток и, как следствие, - во вступлении этих клеток в митотический цикл, что обеспечивает образование родоначальных клеток, например кроветворных, и зрелых, например, клеток крови.

Заявляемое средство может быть получено следующим образом.

Антиген, в качестве которого используются донорские стволовые клетки, вводят животному или человеку для его иммунизации в дозе (0,5-10)×10⁷ клеток на иммунизаторную инъекцию или 0,005-10 мг, в расчете на белок, на 1 кг массы тела иммунизируемого объекта. В качестве иммунизируемого животного могут быть использованы любые биологические объекты, способные к гуморальному иммунному ответу на введение чужеродного белка, например домашний и крупный рогатый скот. Первая инъекция антигена производится в полном адъюванте Фрейнда или иного стимулятора иммунного ответа. Последующие инъекции (3-10) введений проводят с интервалом 2-7 дней, чтобы весь курс иммунизации занимал 20-50 дней. У иммунизированного объекта забирают кровь в стерильную посуду без использования стабилизаторов и антикоагулянтов. Норма забора крови у животного не превышает 10% массы его тела, у человека - не более 400 мл. После осаждения форменных элементов крови и формирования сгустка надосадочную жидкость переносят в другой стерильный сосуд. Иммуноглобулиновые фракции выделяют из надосадочной жидкости, например высаливанием сульфатом аммония, осадок отделяют, растворяют в дистиллированной воде и разделяют на фракции при помощи хроматографической колонки. Фракцию, соответствующую классу IgG, вымывают специальным элюатом, после чего очищают диализом через полупроницаемую мембрану. Очищенный раствор иммуноглобулинов класса IgG стерилизуют фильтрацией через фильтры с последовательно уменьшающимся диаметром пор (последний фильтр имеет диаметр пор не более 0,22 мкм). Жидкий стерильный препарат дозированно разливают в стерильные стеклянные емкости, например ампулы удобного для последующего использования рабочего объема, и лиофильно высушивают в вакууме или атмосфере инертного газа до остаточной влажности 3 - 5%. Герметически укупоренные емкости (запаянные ампулы), каждая из которых содержит разовую дозу средства для стимуляции стволовых клеток, маркируют и хранят при температуре не выше 4°С, не допуская попадания прямых солнечных лучей и ультрафиолета в течение срока, не превышающего 24 месяца.

В качестве источника антигенного материала - донорских стволовых клеток, например, человека могут быть использованы мезенхимальные ткани периостальных, эндостальных и интерстициальных пространств костного мозга, а также любые органы и ткани, содержащие стволовые клетки, в частности пуповинная кровь, полученная как после естественных родов, так и после кесарева сечения. Клетки отделяются от остальных, не являющихся стволовыми, известными методами, например центрифугированием при различных градиентах плотности. Среди отсепарированных клеток должно быть не менее 80% СД34+ клеток. Клетки используют сразу или хранят в замороженном виде до употребления.

Далее изобретение иллюстрируется конкретным примером.

Пример.

Иммунизации подвергли здоровую козу с массой тела 25 кг. В четырех различных точках тела ей ввели 10⁷ клеток антигена - стволовых клеток, выделенных из пуповинной крови, предварительно эмульгировав их в полном адъюванте Фрейнда. Всего было введено 8 мл смеси по 2,0 мл в каждую точку.

Спустя 14 дней вводили парентерально без адъюванта 6 раз такое же количество стволовых клеток с интервалами между инъекциями 2-4 дня. Суммарная доза антигена за весь цикл иммунизации составила 7×10⁷ клеток.

Контроль титра антител (иммуноглобулинов) к стволовым клеткам проводили перед каждой инъекцией, начиная с четвертой. Титр антител к антигенам стволовых клеток увеличивался в сыворотке козы следующим образом: 1:400 перед пятой инъекцией, 1:1200 перед шестой и 1:2000 перед эксфузией крови.

На 14 день после последнего введения антигена осуществляли эксфузию крови из яремной вены животного. Кровь в количестве 250 мл взяли без консерванта. Отделение сыворотки от сгустка и форменных элементов крови производилось центрифугированием при скорости 3000 об/мин в течение 30 минут. Из сыворотки крови осадили полиглобулиновую фракцию добавлением насыщенного раствора сульфата аммония. Надосадочную жидкость отделили центрифугированием, осадок растворили в дистиллированной воде; концентрация белка в растворе составила 5 мг/мл. Раствор ввели в хроматографическую колонку и после разделения по фракциям конечный продукт элюировали 0,025М трис-HCl рН 7,8-0,15М трис-HCl-буфером с рН 7,8, собирая порцию, соответствующую классу IgG. Раствор подвергали диализу через полупроницаемую мембрану против дистиллированной воды в течение 2 суток. После диализа раствор иммуноглобулинов стерилизовали фильтрацией, пропуская его через миллипоровские фильтры с диаметром пор на последнем фильтре 0,22 мкм. Жидкий стерильный препарат разливали по 1,0 мл в ампулы; содержание белка в каждой ампуле составило 5 мг (одна доза). Сушку лиофилизацией проводили в режиме лиофилизации иммуноглобулинов (от -60°С до 37°С). Ампулы герметически запаивали и хранили при 4°С до использования.

Титр антител в готовом препарате составил 1:1200 к антигенам стволовых кроветворных клеток. Остаточная влажность 3 мас.%.

Лиофилизированный препарат представляет собой белую пористую массу, гигроскопичную, растворимую без остатка в воде или физиологическом растворе в течение 60 сек при комнатной температуре. Растворенный в исходном объеме растворителя (1,0 мл) препарат слегка опалесцирует.

Препарат исследовался на стерильность, токсичность и апирогенность в соответствии с регламентированными методиками. Специфическую безвредность определяли по его способности вызывать гемагглютинацию и тромбоагглютинацию в соответствующих тестах, а также лимфоцитотоксичность в микролимфоцитотоксическом тесте по методу Терасаки (Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. С-Петербург, 1998, 156 с.), при действии на форменные элементы крови концентрациями заявляемого средства для стимуляции стволовых клеток, аналогичных тем, которые возникают при введении разовой дозы в организм человека. В испытуемых разведениях препарат не обладал токсическими свойствами. Морфологические исследования при световой и электронной микроскопии не выявили токсических признаков - вакуолизации и нарушения структуры цитоплазмы, ее окраски стандартными красителями и сохранность целостности органелл клеток.

Специфическую активность полученного средства определяли следующим образом.

Клетки костного мозга получали путем пункции подвздошной кости больных (больной А, диагноз острый лимфоидный лейкоз; больной В, диагноз острый миелоидный лейкоз; наблюдение С, здоровый донор костного мозга. Пробы по 500000 ядросодержащих клеток костного мозга помещали в питательную среду для поддержания жизнеспособности клеток. Природный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор вырабатывался клетками, выполняющими роль фидера. В опытные образцы в стерильных условиях добавляли раствор заявляемого средства; при этом концентрация его в отдельных пробах каждой серии составляла 10^-4, 10^-5, 10^-6 мг на пробу. В каждой серии исследований были сделаны контрольные образцы. В три контрольные пробы N1 к клеткам от каждого больного ввели соответствующие количества иммуноглобулина сыворотки неиммунной козы, выделенные по такой же технологии, что и заявляемое средство. В контрольные пробы N2 вводили стерильный изотонический раствор хлорида натрия.

После культивирования в течение 7 дней при температуре 37°С в атмосфере 6% углекислого газа подсчитывали число колоний (агрегаты, содержащие более 20 клеток) и кластеров (менее 20 клеток) в каждой пробе. Результаты представлены в таблице.

Таблица Специфическая активность средства для активации стволовых клеток
Серия	Концентрация IgG,мг/пробу	Больной А		Больной В		Наблюдение С
		Число колоний	Число кластеров	Число колоний	Число кластеров	Число колоний	Число кластеров
Опыт	10-4	99	60	90	110	41	293
	10-5	101	63	93	115	37	212
	10-6	100	62	92	117	39	215
Контроль №1	10-4	63	34	73	94	23	190
	10-5	62	37	68	90	25	188
	10-6	65	39	71	92	21	187
Контроль №2	-	60	38	70	91	21	200

Как видно из таблицы, заявляемое средство во всех испытанных концентрациях оказывает стимулирующее действие на ростовые функции костно-мозговых клеток, увеличивая более чем на 30% по сравнению с контрольными образцами число выросших клеточных агломератов.

Такие же количества гликопротеина (иммуноглобулина сыворотки неиммунной козы), не обладающего свойствами заявляемого вещества (контроль N1), не вызывают усиления роста стволовых клеток костного мозга.

Claims (1)

1. Средство для активации стволовых клеток на основе гликопротеина, отличающееся тем, что в качестве гликопротеина средство представлено поликлональными иммуноглобулинами класса IgG со средней молекулярной массой 150 кДа, полученными как гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов CD34+ стволовых клеток.