JPH03503640A - 血液処理の方法および手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血液処理の方法及び手段 本発明は、個体（人または動物）から採取された全血サンプルを、予防又は治療 目的のため、全血液サンプルを採取した同じ個体に再投与するように工夫された 免疫刺激性血液生成物を製造するための生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）処理方法及 び手段に関する。

発明の背景 人間（あるいは動物）の生体の、外部からの「侵入物」に対する免疫防御組織は きわめて複雑で、多くの問題が未解決のまま残っている。たとえば癌やリューマ チなどの病気を起こす要因の多くが全く未解明である。その一方で、異常細胞を 修復するために免疫学的に何が起こるのか、すなわち生体の免疫組織がどのよう に作用するのかについての知識は相当明らかにされてきた。特に、リンフ才力イ ンと称される内在的物質、中でもインターフェロンおよびインターロイキン、そ の構造、そしてその免疫防御組織に重要な機能の発見は、工業的規模でのバイオ テクノロジーを用いた組換え体製造のスタートであり、以来、広範な臨床プログ ラムに多大な投資が行われてきた。

この種の組換え体の千年以上の使用を経て、この種の物質が遺伝子工学的技術で 製造された場合には、期待されたほどの結果を生じないことが一般的に認められ るようになった。特に、この種の物質を使用することによって得られる治療効果 は他の治療と同程度であるのに、反対に副作用の方がかなり重大である。

また、多くの物質、たとえばいわゆるマイトジェンおよび／または抗原が、上述 したように各種の腫瘍のような多くの異なる（「インターフェロン感受性の」） 疾患を予防および治療する上で多大な効果を発揮する可能性が極めて高いと考え られている腫瘍殺生物質、たとえばＴＮＰ　、リンフ才力イン、たとえばγ−イ ンターフェロンおよびインターロイキン、たとえばインターロイキン■（ニレ− ■）の生成を刺激することも知られている。

本出願人のＰＣＴ出願第Ｐ　ＣＴ／Ｓ　Ｅ８４１００２２２号には、γ−インタ ーフェロンおよび／またはインターロイキンに感受性の疾患を治療するための製 剤を製造および使用する上での問題に対しての全く新しいアプローチが開示され ている。上記刊行物に記載されている発明は、マイトジェンが特にγ−インター フェロンの容器内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での生成を誘導できるというそれ自体周 知の事実に基づくものであった。このアプローチは２つの必須の工程を含んでい た。すなわち、一方で、それ以前に一般的であったように、選ばれた血液成分の みを使用するかわりに、全血が容器内でのマイトジェンとの培養（Ｉｎｃｕｂａ ｔｉｏｎ）に使用され、他方で、マイトジェンとの培養（１ｎｃｕｂａｔｉｏｎ ）でマイトジェンを分離することによりインターフェロンを含有するようになっ た後、サンプルが、サンプルを採取した本人である患者に再投与するという２つ の工程である。いいかえると、この治療は種特有であるばかりでなく個体特有（ 組織内に自然（正常）派生する）のものであった。この方法は多くの利点を有し ており、たとえば、血液の提供者と被提供者が別々の個体である場合の血液組成 の違いに起因する合併症や副作用の危険性を防止することができる。自然派生的 手法のもう一つの重要な利点は、刺激を受けた細胞が患者自身の細胞であり、そ の結果、刺激によって腫瘍殺生物質の最適混合物が得られることである。さらに この方法はかなり単純、迅速、安価で、この方法を用いるとγ−インターフェロ ン製剤の有する不安定性の問題が解決されるか、あるいは相当減少する。また、 自然派生的治療の結果、このような高収率のインターフェロンの生成が行われた ことは、癌患者のような疾病状態にある患者ではインターフェロンの生成能力が 低下していることが知られていたので、極めて予想外のことであワた。

バイオテクノロジーで製造した物質を上述のように使用した結果が思わしくなか った経験を踏まえて、ローゼンバーグ教授（Ｐｒｏｆ　、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ） らは、癌患者から、極めて複雑な手法を使用して、一群の精選された重要な白血 球を単離し、次にこの精選された白血球を、上述の組換え体によって生成された 物質（インターロイキン２）を用いて刺激した（たとえば、ローゼンバーグＣＭ 、Ｒｏｓ−ｅｎｂｅｒｇ）ら、「リンフ才力インで賦活されたキラー細胞、イン ターロイキン２中で培養されたリンパ球による新鮮で同系の天然キラーに対して 耐性のマウス腫瘍細胞の溶解（Ｌｙｍｐｈｏｋｌｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｋ １１ｌｅｒ　ｃｅｌｌｓ、１ｙｓｉｓ　ｏｆ　ｆｒ−ｅｓｈ　　ｓｙｎｇｅｎｅ ｉｃ　　ｎａｔｕｒａｌ　　ｋ１＋１ｅｒ　　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　　ｍｕｒｉ ｎｅ　　ｔｕｍ。

−ｕｒ　　ｃｅｌｌｓ　　ｂｙ　　１ｙｓｐｈｏｃｙｔｅｓ　　ｃｕｌｔｕｒｅ ｄ　　１ｎ　　１ｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　　２）」、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ ｅｓ、）４４　：　１９４６−１９５３．１９８４を参照されたい。この文献は 本明細書中に参考文献として引用加入する。）。現在、世界中の多くの研究チー ムがこの手法（ＬＡＫ細胞療法と称される）を改善するべく、特に、望ましくな い副作用を軽減するべくとり組んでいる。

このいわゆる自然派生的血液処理はいくつかの点で有利であることが立証され、 更にこれ以上の続行の必要性がある。たとえば、この方法を研究室以外でも実用 的かつ経済的に使用できるようにするには、患者の血球のもっと良い刺激方法お よび手段を見出すことが望ましい。

背景技術のさらに別の例が欧州特許（Ａ２）第１４７８８９号、欧州特許（Ａ２ ）第１０７１１９号、欧州特許（Ａ２）第７９２２１号、および米国特許第４５ ５１４３５号に開示されている。このうち最初に挙げた文献は、一般に、精製白 血球の刺激に関するもので、白血球を、Ｔ細胞と結合可能な不溶性の抗腫瘍性免 疫細胞誘導性材料と接触させることによって刺激を行う。ここで上記材料は、不 溶性担体に共有結合させたリガンドを含む。刺激は、免疫抑制細胞（サプレッサ ーＴ細胞、マクロファージ）を除去した後に行うことができる。

欧州特許（Ａ２）第１０７１１９号には、抗腫瘍性効果を有しており、ダラム陰 性細菌の細胞壁から誘導されたリポ多糖類から構成され、モしてアミノ基または カルボキシル基を含有する不溶性担体によって固定化された特定の血液処理用材 料が開示されている。リポ多糖類のこの変性によって、リポ多糖類の致死毒性が 低減されたとされている。

欧州特許（Ａ２）第７９２２１号には、特に固定化したプロティンＡ　（Ｐｒｏ ｔｅｉｎ　Ａ）を使用して患者の血漿から免疫複合体（イムノグロブリン）を除 去し、特異的抗腫瘍抗体の生成を促すことが開示されている。米国特許第４５５ １４３５号も血液からの免疫複合体の除去に関するものである。

発明の概要 本発明は、上掲のＰＣＴ出願に開示された自然派生的刺激という基本概念、すな わち特定の個体から血液サンプルを採取し、サンプルを容器内で適当なマイトジ ェンとともにインキュベートシ、そしてインキュベートした血液サンプルまたは その一部を、サンプルを採取したその同一個体に再投与する工程からなる方法を 、さらに発展させたものである。

本発明の第一の側面は、人が極めて高い割合で、１種以上の免疫刺激性物質、す なわち（本発明で定義するところの）マイトジェンに対する抗体を保持している という洞察に基づいている。たとえば、ヒトの約７０％がマイトジェンであるブ ドウ球菌エンテロトキシンＡ　（Ｓｔａ−ｐｈ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　Ａ− ！３ＥＡ）に対する抗体を保持しているという複数の有力な指摘がなされており 、他のマイトジェンに対する抗体も一般的である。この種の抗体は、対応するマ イトジェンの血球（細胞）刺激能力を完全に消失させるか、少なくとも激しく抑 制する。本発明のこの第一の側面では、この問題の抗マイトジェン抗体の、血球 含有血液サンプルからの除去を、この抗体による容器内でのサンプルの刺激に先 立って行うことが提案される。

「・血球を含有する血液サンプル」という表現、およびその類似表現は、本明細 書および付随する請求の範囲で使用する場合には第一義的には全血を意味するが 、この表現は、マイトジェンで刺激されうる細胞、特に単球および／またはＢ細 胞を含有する細胞を含む血液分画または血液成分をも包含する。「マイトジェン 」という表現は広義に解されるべきで、生きた血球と接触した際に血球細胞の免 疫防御を刺激することができる任意の物質または薬剤、あるいはその部分または 分画を包含する（酵素によって、あるいは組換え技術によって生成されたマイト ジェンとして活性の成分も包含する）。（この種の物質は、刊行物によっては、 「マイトジェン」、「抗原」、「免疫刺激物質」、「免疫誘導物質」などと称さ れることもある。） 本発明は、抗マイトジェン抗体を上述したように予め分離しておくと、血球を効 果的に刺激するのに必要なマイトジェンの量（抗マイトジェン抗体の存在下でも 免疫刺激が可能な場合）が劇的に低減することを明らかにしたものである。マイ トジェンとしてＳＥＡを使用する場合を一例として挙げると、本発明にしたがっ て抗ＳＥＡ抗体を実質的に含有しない製剤を製造した場合には、血球１個あたり ５ＥＡ２ないし３分子のみで、効果的な細胞刺激を十分誘発させることができる 。

本発明の第二の側面は、培養した血球含有血液サンプルからの、マイトジェンの 新規な分離方法に関する。この本発明の第二の側面では、この分離を、マイトジ ェン含有サンプルを、サンプルの刺激に使用したマイトジェンに特異的な抗体と 接触させることによって行う。ここで上記抗体はサンプルから分離可能な担体に 結合されており、マイトジェンは、担体に結合されたこの対応する抗マイトジェ ン抗体に吸着される。この分離方法は、上述のＰＣＴ出願に開示された分離方法 と比較して、いくつかの本質的な利点を有している。

本発明の別の側面は、上述の方法の片方または両方を実施するキットに関する。

上記キットは、血液サンプル入口と血液サンプル出口とを備えた少なくとも１個 の血液容器、上記出口内に設けられた分離手段、および上記血液サンプルを上記 の少なくとも１個の血液容器内で、少なくとも１種のマイトジェンとしての活性 を有する物質と接触させる手段から構成され、上記分離手段は、上記出口から出 てゆく刺激済み血液サンプルがマイトジェンとしての活性を実質的に有さないよ うに、上記血液サンプルから上記マイトジェン物質を分離しうるちのである。

本発明のさらに別の側面では、上述の抗マイトジェン抗体の予備分離を行うと、 血球の刺激を、インターフェロン、インターロイキンおよび／または他のリンフ 才力インが容器内で生成されるまで必ずしも継続する必要がなく、マイトジェン およびマイトジェンの血球との反応条件を適切に選択することによって、容器内 での過程の間に血球の免疫刺激能力を「ブライミング」するだけで、血球が最適 な成長培地、すなわち血液提供者自身の血液システムに返還されたときに、血球 が上述の防御物質の生成を開始できるようにすることができることを見出した。

したがって、「容器内での刺激」という用語（および類似の表現）は、本明細書 および請求の範囲で使用される場合には、（さきに説明したような）容器内での 腫瘍殺生物質の実際の生成ばかりでなく、上記物質のその後の生体内ｉｎ　ｖｉ ｖｏ　）　　（患者への再投与後）での生成を可能とする血球の容器内でのプラ イミングをも包含すると解されるべきである。後者の場合には容器内での刺激は 極めて短時間、たとえば２，３秒から５ないし１０分程度とすることができる。

この実施態様では、ＭＨＣｎに対する強固な特異性を有するマイトジェンが特に 有用である。血液提供者−被提供者の体外での時間がこのように短くてすむこと が、本発明のさらなる重要な利点現在のところ最も好適なマイトジェンはＳＥＡ で、これは前述したように、抗ＳＥＡ抗体が存在しなければ極めて有用なマイト ジェンであるが、他の任意の免疫刺激性マイトジェン、たとえばＳＥＡ％ＳＥＢ などのマイトジェンとして活性のフラグメント、特にＳＥＡと同様にＭＨＣｎ、 特に単球および／またはＢ細胞のような補助細胞上のＭＨＯＩＩに強い特異性を 有するマイトジェンを使用することも本発明の範囲に包含される（ＭＨＣ−主要 組織適合遺伝子複合体）。

本発明の特に重要な実施態様では、人体に対する毒性がないと思われる、２種の ＳＥＡのマイトジェンとしての活性を有するフラグメントの片方または両方を使 用する。言いかえると、マイトジェンとしてこの種のＳＥＡのフラグメントを使 用する場合には、免疫刺激した血液からのマイトジェンの分離を、免疫刺激した 血液の患者への再投与に先立って行うことが、絶対的に必要なわけではない。

この種のＳＥＡのフラグメント（Ｆ、およびＦ３と称される）は、ノスコバ（Ｎ ｏｓｋｏｖａ　Ｖ、　　Ｐ、　）ら、国際生化学雑誌（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｂｌｏｃｈ ｅｍ）、第１６巻第２号第２０１−６頁、１９８４、およびエツエブチュク（Ｙ ｕ、Ｖ、Ｅｚｅｐｃｈ−ｕｋ）ら、国際生化学雑誌（Ｉｎｔ、Ｊ　、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ）、第１８巻、第５号、第４８５−８８頁、１９８６に記載されており、こ れらの２種の刊行物は参考文献として本明細書中に引用加入する。

しかしマイトジェンは、患者に対する毒性が通常極めて強い。したがって通常は 、患者に血球を再投与する前に、血球からマイトジェンを完全に除去しておくこ とが特に必要である。本発明のこの側面についての好適な実施態様では、マイト ジェンは、マイトジェンとしての活性を実質的に損うことなく、マイトジェンと （たとえば共有結合によって）結合することが可能な物質でマイトジェンを標識 し、次に、標識したマイトジェンを、上記標識用物質と強力に結合することがで きる物質を用いて血球から除去する。特に好適な実施態様では、標識したマイト ジェンは、ビオチニル化（ビオチンで標識）したマイトジェン、特にビオチニル 化したＳＥＡまたはその活性のフラグメント（ＳＥＡ−Ｂ）である。ビオチンに 対する極めて高い親和性を有することが知られているアビジンも、担体上に固定 化した場合には、ビオチニル化したマイトジェンを免疫刺激した血液サンプルか ら除去する上での好適な物質となる。したがって、ビオチニル化したマイトジェ ン、たとえば５ＥＡ−Ｂの定量的な除去を、適当な担体、たとえばアガロース担 体のような多糖類型の担体に固定化したアビジンへの吸着によって行うことが可 能である。担体は、通常ビーズまたは同様の粒子の形状を有し、任意の好都合な 分離技術、たとえば濾過、クロマトグラフィーによる分離などによって、処理済 みの血液サンプルから除去することができる。あるいは、他の方法として血液バ ッグなどの内壁をアビジンの担体として用いることも可能である。

マイトジェンとの培養（１ｎｃｕｂａｔｉｏｎ）に先立って抗マイトジェン物質 を除去する現在好ましい方法としては、抗マイトジェン結合性物質を、粒径が血 球より大きく、したがって通常のフィルターでうまく分離できるソリッドの担体 に固定化することである。担体は、たとえば多糖類、たとえば市販のアガロース から構成することがでえた全血とするのが好ましい。

抗マイトジェン物質の除去も、マイトジェンの刺激も、バッチ方式で懸濁液とし て（比較的注意深く）撹拌することによって行うのが好適である。

本発明の処理キットでは、現在のところ、容器として通常の血液分離装置などで 使用されているのとほぼ同じ種類のバッグを使用するのが好ましい。２種の異っ た実施態様のキットの例が添付した図面に例示しである。

図面の説明 第１図は、本発明で使用する血液バッグシステムの第一の実施態様を図示したも のである。

第２図は、本発明で使用する血液バッグシステムの第二の実施態様を図示したも のである。

第３図は、治療を行わなかったウサギに移植したｖＸ２腫瘍の腫瘍の大きさの推 移を示す図である。

第４図は、種々の治療を行ったウサギについて、腫瘍の発達を示す図である。

第５図は、本発明にしたがって治療を行った動物と対照群とを、生存率について 比較した図である。

図面のうち第１図は、どのように患者から全血を採取し、たとえば通常のヘパリ ン処理した血液バッグ（「全血」）に集めるかを示す。この血液バッグはさらに 、抗マイトジェン抗体結合性粒子の入うた第二の血液バッグ（「固定化したマイ トジェン」）に連結されているか、連結が可能である。この抗マイトジェン結合 性粒子は、血液サンプルから除去する抗マイトジェン抗体（たとえば抗ＳＥＡ抗 体）に特異的なマイトジェン（たとえば５ＥＡ）とするのが好ましく、この特異 的なマイトジェンを、適当な担体、たとえばアガロースビーズに固定化するのが 好ましい。この担体は血球より相当大きくするのが好ましく、たとえば、白血球 が約７μｍであるのに対し、約２００μｍとする。このバッグ中での割合は、全 血９部あたりビーズ１部程度とするのが好適である。抗マイトジェン抗体をビー ズに結合させるには、通常バッグの中味を約３０公理合すれば十分である。上述 したように、処理時間は相当程度短時間とすることができ、特に、腫瘍殺生物質 をその後生体内で生成させるための血球のブライミングのみが目的である場合に は、さきにも説明したように相当な短縮が可能である。

次に、懸濁液は、血球／全血は通すが抗マイトジェン抗体結合性ビーズを通さな いフィルターを通り、次の血液バッグ（「マイトジェン」）に血液バッグをしご いて入れる。混合／撹拌を適当な時間、通常使用成分に応じて約１時間から２， ３日にわたって行うことにより、バッグ中での細胞の刺激／リンフ才力インの生 成を進行させる。しかし、刺激の時間はさきにも説明したように、これよりはる かに短時間とすることができる。使用したマイトジェンが患者に有害でないと考 えられる場合には（たとえばマイトジェンとして活性であるが無毒であるＳＥＡ フラグメントＦ１＋　Ｆ３の場合）、この製剤がこの時点で患者に投与される（ 実線）。さもない場合には、マイトジェンは、たとえばこの製剤をさらに別の血 液バッグ（「固定化した抗マイトジェン抗体」）を通過させることによって除去 される。この血液バッグ中では、「固定化したマイトジェン」の血液バッグで進 行したのと同様の過程を経て、マイトジェンの捕集が適当な担体上に固定化され た抗マイトジェン抗体によって行われる。

第１図の破線で示すように、担体／ビーズを第二のフィルターによって捕集し、 次にこの刺激剤血液製剤を患者に再投与する。

第２図は本発明の別の実施態様を例示するもので、この実施態様では、第１図の 実施態様で使用した数個の血液バッグのかわりに、単一の血液バッグを使用する ことができる。第２図のＡの位置に示すように、所定量の全血サンプルを患者か ら採取し、「血液バッグ」と表示した処・環バッグに入れる。「血液バッグ」へ の血液サンプルの採取は、直接行っても、別の血液バッグ（「全血」）を経て行 ってもよい。図示した「血液バッグ」は血液入口と血液出口とを有するものとし て示してあり、後者には分離手段、たとえばフィルターＦが設けである。Ｂの位 置には、「血液バッグ」に抗体結合性物質として所定量の対応マイトジェンを担 体に固定化したものを導入する工程が示しである。現在のところ好適なマイトジ ェン−担体の組合せは、５ＥＡ−ビオチン−アビジン−多糖類型担体である。Ｃ の位置には、次の工程として、Ｂの位置からの血液サンプルを刺激する工程が示 してあり、この刺激は、適当な形状のマイトジェンを「血液バッグ」（工程Ｂの 間に血液から除去された抗体が結合した５ＥＡ−担体マトリックスがまだ入りで いる）に加えることによって行う。現在のところ、この実施態様で好適なマイト ジェンは、ビオチニル化したＳＥＡ　（ＳＥＡ−ビオチン）である。抗マイトジ ェンを含有しない血液サンプルの、工程Ｃで加えたマイトジェンとの培養（１ｎ ｃｕｂａｔ１ｏｎ）は、血球に所望の刺激／ブライミングを行うのに適当な時間 行う。Ｄの位置は、次の工程として、「血液バッグｊ中の過剰のマイトジェンを 吸着するのに十分な量の担体をさらに加える工程が示しである。上述の好適な実 施態様では、工程りの担体はアビジン−担体で、このうちアビジンの部分が５Ｅ Ａ−ビオチンのビオチンの部分を急速かつ強固に吸収する。最後に、工程りから の血液サンプルを、フィルターＦを通して「血液バッグ」から取出し、患者に再 投与する。ここでフィルターＦは、上述の担体が「血液バッグ」中に残存するよ うなものを選択する。

ある状況で有用である可能性のあるもっと単純な方法を、第２図の破線で示す。

この実施態様は処理工程Ｂのみを含み、この工程の後、処理済み血液サンプルを 患者に（工程りと同じく）フィルターを経由して再投与する。

この実施態様は、担体との結合にもかかわらず有用なマイトジエン活性をなお保 持している坦体−マイトジェン複合体を使用する場合に用いることができる。こ の実施態様を実施する場合には、担体に固定化したマイトジェンの添加量を、血 液サンプル中に含まれる抗マイトジェン抗体の除去と、血球の所望の刺激の療法 を行う上で十分なものとする必要がある。

本発明にしたがって操作を行った場合に得られる存利な結果を、以下のウサギで の試験でさらに例示する。

ＶＸ２腫瘍を存するウサギの全血を １、動物：白ウサギ（雄）、体重２．２−３．０）ｃｇ２、腫瘍：ＶＸ２腫瘍（ ウィルス株化細胞）３、ＶＸ２腫瘍を有するウサギ ・細胞懸濁液（５０μｇ１細胞５Ｘ１０６個）を肝臓の外側の左葉に直接注射す る。

方　　法 １、ＶＸ２を有するウサギから、接種の２週間後に、３ｍｌの全血を、ヘパリン の入った滅菌チューブに採取する。

２、滅菌チューブに５ＥＡ−セファロース・マイクロビーズ（１００ｍｌ）また はセファロース０−アビジン−ビオチン−５ＥＡを加える。チューブを４℃で３ ０分間注意深く振とうする。

３、（２）で得られた混合物をＮｅｔ　（８０ｍ）の入つたカラムに９に入れ、 その後カラムを１　ｍｌの塩類溶液で洗浄する。最終容積は４　ｍｌである。

４、（３）で得られた全血にＳＥＡ、５ＥＡ−ビオチン、ＳＥＡのフラグメント 、またはＳＥＡのフラグメント−ビオチン（１および１０ｎｇ／全血１ｍ１）を 加え、サンプルを３７℃で６時間インキュベー、トする。

５、（４）で得られた全血を、ＳＥＡまたはＳＥＡのフラグメントの除去を行っ た後、または行わずに、同じウサギに注射して戻す。

６、この手順を３日毎に繰返す。

植えつける。２週間後、腫瘍は成長して、測定誤差の生じるおそれなしに測定が 十分に可能な大きさとなっている（第１図）。実験は２つの異った部分、すなわ ち、腫瘍の大きさを判定する第１部と、長期の治療を行う第２部に分けて行った 。第２部では、対照群のウサギの高い死亡率にかんがみ、腫瘍の組織病理学的検 査のみを行った（第３図参照）。対照群のウサギは、肺への転移のために通常４ −６週間後に死亡する。

第１部 １回目の治療を腫瘍細胞の植えつけの２週間後に行い、２回目の治療をさらに３ 日後に行い、さらに治療を続ける。ウサギを２週間の治療の後に殺し、肝臓の合 計重量ならびに腫瘍の大きさを測定する。動物を４　（２＋２）週後に殺す理由 は、使用したＶＸ２の株化細胞が極めて悪性で、それ以上待つと肝臓全体が腫瘍 によって占められてしまう（測定不能となる）からである。

第２部 １回目の治療を腫瘍細胞の植え２けの２週間後に行い、２回目の治療をさらに３ 日後に行い、さらに治療を続ける。この処理群のウサギは４週間の治療の後に殺 す。対照群のウサギは６週後にはすべて死亡している。この群では生存率と組織 病理学的所見のみを調べることができた。

実　　験 実際は以下の群を用いて実施した。

１、治療は一切行わず、塩類溶液の注射のみを行った対照群。

２、アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）を用いた治療。

３．５ＥＡ−セファロース０を用いて血液サンプルから抗ＳＥＡ抗体を除去し、 次に全血をＳＥＡで刺激し、そしてＳＥＡの除去を行わずに血液を注射。

４、刺激の後に抗ＳＥＡ抗体−セファロースのを用いてＳＥＡを除去した以外は 上記３と同様。

５．５ＥＡ−ビオチン−アビジン−セファロースのビーズを用いて血液サンプル から抗ＳＥＡ抗体を除去し、次に５ＥＡ−ビオチンで全血を刺激し、そして刺激 の後に、５ＥＡ−ビオチンをアビジン−セファロース０ビーズに結合させること により５ＥＡ−ビオチンを除去し、そして血液を分離してから、ウサギに再度注 射。

６、ブロックを行う抗ＳＥＡ抗体の除去を行わずに、血液サンプルを５ＥＡ−ビ オチン、ＳＥＡ、ＳＥＡのフラグメントで刺激。

結　　果 １、対照群とアドリアマイシンのウサギでは、腫瘍の大きさの減縮はみられなか った（第４図参照）。

２、ブロックを行うＳＥＡに対する抗体の除去を行わなかった群のウサギでは、 腫瘍の大きさの減縮はみられなかった（第２図参照）。

３、ブロックを行う抗体を除去してからＳＥＡ、ＳＥＡサギでは、腫瘍の大きさ が相当減縮し、生存率が増大した（第２および３図参照）。

４、上記（３）と同様に抗体を除去してから刺激を行ったウサギの組織病理学的 検査では、腫瘍が壊死しており、腫瘍の周囲にマイクロファージ状の細胞が観察 された。

対照群のウサギ、およびブロックを行う抗ＳＥＡ抗体の除去を行わなかったウサ ギでは、憤死領域はみられず、マクロファージ状の細胞を見出すこともできなか った。

投与量を変化させた予備的研究 予備的研究では、ＶＸ２腫瘍細胞を上述のようにして３つの群（各群に３匹ずつ ）のウサギに植えつけた。対照群では治療を行わず、本発明の方法にしたがって ＳＥＡで処理した第一群の適用量を１　ｎｇ／血液血液１占ｌ、第二群の適用量 をＬｏｎｇ／血液１ｍ血液１丸ｌ治療を植えつけの一週間後に開始し、ウサギを 週二回ずつ４週間にわたって治療し、その後膜した。腫瘍の大きさおよび外観を 調べることができた。１０　ｎｇ／　ｍｌを適用した群の腫瘍の大きさおよび外 観は、対照群とほぼ同じであった。

（腫瘍中央部にごく小さな自発的憤死が認められた）。

ｌｏｇ／ｍｌのみを適用した群では腫瘍の大きさが相当減縮し、腫瘍が強度に憤 死していた。

予備的に得られたこの結果から、少なすぎも多すぎもしない中位の適用量を用い ると本発明の最良の効果が得られる可能があることが示唆される。

食ｔ　１ｆａＪｐ−ＪｌｔＪＩＥ内Ｑ？＆＃／ＦＩＧＵＲＥ３ 国際調査報告 □１＾、−−１陶　ＰＣＴ／ＳＥ８９１００２０Ｂ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．特定の個体から採取した血球を含有する血液サンプル、特に血球を含有する 全血サンプルを、容器内でマイトジェンとともにインキュベートして、同一個体 に再投与するための血液製剤を製造することにより、免疫刺激性製剤を製造する 方法において、さらに、容器内での上記マイトジェンとの上記インキュベーレヨ ンを行う前に、上記血液サンプルから、上記マイトジェンに対する抗体を除去す る工程を含むことを特徴とする免疫刺激性製剤の製造方法。
2. ２．上記マイトジェンに対する上記抗体の上記血液サンプルからの除去を、血液 サンプルを、対応するマイトジェン、その活性誘導体、または活性で固定化形状 のマイトジェンと接触させることによって行う請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．上記マイトジェンが、補助細胞、たとえば単球および／またはＢ細胞上のＭ ＨＣＩＩに対して強い特異性を有する請求の範囲第１項または第２項記載の方法 。
4. ４．上記マイトジェンが、ＳＥＡ、ＳＥＢ、およびそれらのフラグメント、特に マイトジェンとしての活性を有し、人体に対して実質的に無毒なフラグメントよ りなる群から選ばれる請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか一項に記載の方法 。
5. ５．上記マイトジェンが、マイトジェンとしての活性を有しつつ、人体に対して 実質的に無毒であり、そして上記の再投与される血液製剤が上記のマイトジェン を含有する請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．上記血液サンプルの上記の容器内でのインキュべーションが、その後の生体 内での腫瘍殺生物質の生成のための、容器内でのプライミングである請求の範囲 第１項乃至第５項のいずれか一項に記載の方法。
7. ７．マイトジェンとともにインキュベートした血球含有血液サンプルからマイト ジェンを分離する方法において、上記マイトジェン含有血液サンプルを、上記マ イトジェンに特異的な抗体と接触させて、上記マイトジェンを上記抗体と結合さ せ、そして上記血液サンプルから、上記抗体を上記抗体に結合したマイトジェン とともに分離する工程を含むことを特徴とするマイトジェンの分離方法。
8. ８．上記抗体が、上記血液サンプルより粒径が実質的に大きい担体に固定化され ている請求の範囲第５項記載の方法。
9. ９．血液サンプルの入口と血液サンプルの出口を有する少なくとも１個の血液容 器、上記出口内に設けられた分離手段、および上記の少なくとも１個の血液容器 内で、上記血液サンプルを、少なくとも１腫のマイトジェンとしての活性を有す る物質と接触させる手段から構成され、上記分離手段が、上記出口から出てゆく 処理済血液サンプルがマイトジェンとしての活性を実質的に有さないように、上 記血液サンプルから上記マイトジェン物質を分離しうるものである、請求の範囲 第１項乃至第８項のいずれか一項記載の方法を実施するための血液処理キット。
10. １０．さらに、上記血液製剤を、血液サンプルを採取した個体に再投与する工程 を含む請求の範囲第１項乃至第６項のいずれか一項に記載の方法。