JP3215309B2 - 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の製造方法 - Google Patents
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の製造方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、安全で毒性及び副
作用がなく、免疫機能の低下及び腫瘍の治療に優れた効
果を有する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ）の製造方法及び顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子誘導剤に関する。
作用がなく、免疫機能の低下及び腫瘍の治療に優れた効
果を有する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ）の製造方法及び顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子誘導剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
（以下、ＧＭ−ＣＳＦともいう。）は造血系のサイトカ
インの一種であるコロニー刺激因子（ＣＳＦ）の一種で
あり、前駆細胞から顆粒球やマクロファージの分化・増
殖を促進する因子である。
（以下、ＧＭ−ＣＳＦともいう。）は造血系のサイトカ
インの一種であるコロニー刺激因子（ＣＳＦ）の一種で
あり、前駆細胞から顆粒球やマクロファージの分化・増
殖を促進する因子である。
【０００３】ＧＭ−ＣＳＦはマイトジェンや抗原などで
刺激されたＴ細胞ばかりでなくインターロイキン１（Ｉ
Ｌ−１）や、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）で刺激された腺維
芽細胞や内皮細胞によっても生産される。ＧＭ−ＣＳＦ
の生物活性は、骨髄で好中球、マクロファージ、好酸球
またはその混合したコロニーを形成させることである。
しかし、赤芽球や巨核球を含むコロニーの形成も促進さ
せることが知られており、ＩＬ−３とともに多種類の前
駆細胞に作用できるものと考えられている。このＧＭ−
ＣＳＦの分化促進作用は濃度依存的で、低濃度ではマク
ロファージコロニーを、中程度では顆粒球と好酸球、高
濃度で巨核球コロニーを形成させる。
刺激されたＴ細胞ばかりでなくインターロイキン１（Ｉ
Ｌ−１）や、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）で刺激された腺維
芽細胞や内皮細胞によっても生産される。ＧＭ−ＣＳＦ
の生物活性は、骨髄で好中球、マクロファージ、好酸球
またはその混合したコロニーを形成させることである。
しかし、赤芽球や巨核球を含むコロニーの形成も促進さ
せることが知られており、ＩＬ−３とともに多種類の前
駆細胞に作用できるものと考えられている。このＧＭ−
ＣＳＦの分化促進作用は濃度依存的で、低濃度ではマク
ロファージコロニーを、中程度では顆粒球と好酸球、高
濃度で巨核球コロニーを形成させる。
【０００４】また、ＧＭ−ＣＳＦによって、末梢血中の
好中球が活性化されることが知られるようになった。す
なわち、好中球の活性化酸素の発生を促進し、抗体依存
性細胞傷害作用を高める。さらに、マクロファージ／単
球にもＧＭ−ＣＳＦが作用し、ＩＬ−１やＴＮＦの産
生、分泌を促進し、マクロファージのがん細胞キラー活
性を高める。
好中球が活性化されることが知られるようになった。す
なわち、好中球の活性化酸素の発生を促進し、抗体依存
性細胞傷害作用を高める。さらに、マクロファージ／単
球にもＧＭ−ＣＳＦが作用し、ＩＬ−１やＴＮＦの産
生、分泌を促進し、マクロファージのがん細胞キラー活
性を高める。
【０００５】ＧＭ−ＣＳＦは、骨髄芽球が関わる疾患の
治療に主として用いられる。例えば、エイズ患者の白血
球減少症や再生不良性貧血、リンパ系悪性腫瘍患者の骨
髄移植に伴う白血球減少症などがある。また、悪性腫瘍
に対する放射線治療や化学療法後の血球減少症に対して
も用いられている。ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球やマクロフ
ァージ系のみならず、赤血球系および巨核球系前駆細胞
にも作用して、それらの分化・増殖を調節しているの
で、骨髄異形成性症候群（myelodysplastic syndrome,
ＭＤＳ）の治療に対しても、ＧＭ−ＣＳＦの効果が期待
されている。
治療に主として用いられる。例えば、エイズ患者の白血
球減少症や再生不良性貧血、リンパ系悪性腫瘍患者の骨
髄移植に伴う白血球減少症などがある。また、悪性腫瘍
に対する放射線治療や化学療法後の血球減少症に対して
も用いられている。ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球やマクロフ
ァージ系のみならず、赤血球系および巨核球系前駆細胞
にも作用して、それらの分化・増殖を調節しているの
で、骨髄異形成性症候群（myelodysplastic syndrome,
ＭＤＳ）の治療に対しても、ＧＭ−ＣＳＦの効果が期待
されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトのリン
パ球から分泌される天然型の顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を大量に取得できる効率
的な方法と、すぐれた顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子誘導剤を提供することを目的とするものである。
パ球から分泌される天然型の顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を大量に取得できる効率
的な方法と、すぐれた顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子誘導剤を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
の本発明は、健康な人から採取した血液から分離される
リンパ球を特別の誘導剤の存在下で培養し、大量に分泌
された顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−
ＣＳＦ）を回収することからなるＧＭ−ＣＳＦの生産方
法に関する。
の本発明は、健康な人から採取した血液から分離される
リンパ球を特別の誘導剤の存在下で培養し、大量に分泌
された顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−
ＣＳＦ）を回収することからなるＧＭ−ＣＳＦの生産方
法に関する。
【０００８】より詳細には、本発明は、健康人の血液中
のリンパ球をＣＭＰ（Calboxy methyl-Pachyymaran、以
下ＣＭＰという）を主として含有する誘導剤、又は、場
合によってさらに他の誘導剤をも含有する複合誘導剤の
存在下に培養することにより、大量に分泌されるＧＭ−
ＣＳＦを採取することを特徴とするＧＭ−ＣＳＦの製造
方法に関するものである。
のリンパ球をＣＭＰ（Calboxy methyl-Pachyymaran、以
下ＣＭＰという）を主として含有する誘導剤、又は、場
合によってさらに他の誘導剤をも含有する複合誘導剤の
存在下に培養することにより、大量に分泌されるＧＭ−
ＣＳＦを採取することを特徴とするＧＭ−ＣＳＦの製造
方法に関するものである。
【０００９】本発明は、誘導剤としてＣＭＰを含有する
ものを使用することを特徴とする上記ＧＭ−ＣＳＦの製
造方法に関する。
ものを使用することを特徴とする上記ＧＭ−ＣＳＦの製
造方法に関する。
【００１０】また、本発明は、前記誘導剤を使用した培
養を、培養液中のリンパ球濃度を５×１０6 〜８×１０
6 個／ｍ１に調製して行うことを特徴とするＧＭ−ＣＳ
Ｆの製造方法に関するものである。さらに、本発明は、
前記誘導剤を添加して行われる培養を２０〜２００時
間、好ましくは、少なくとも１６８時間実施し、ついで
培養液からＧＭ−ＣＳＦ含有上澄液を採取し、濾過精製
することを特徴とするＧＭ−ＣＳＦの製造方法に関す
る。
養を、培養液中のリンパ球濃度を５×１０6 〜８×１０
6 個／ｍ１に調製して行うことを特徴とするＧＭ−ＣＳ
Ｆの製造方法に関するものである。さらに、本発明は、
前記誘導剤を添加して行われる培養を２０〜２００時
間、好ましくは、少なくとも１６８時間実施し、ついで
培養液からＧＭ−ＣＳＦ含有上澄液を採取し、濾過精製
することを特徴とするＧＭ−ＣＳＦの製造方法に関す
る。
【００１１】また、本発明は、ＣＭＰからなる顆粒球マ
クロファージコロニー刺激因子の誘導剤に関する。
クロファージコロニー刺激因子の誘導剤に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明のＧＭ−ＣＳＦの製
造方法について詳細に説明する。本発明において使用さ
れるリンパ球は、健康人から採取した血液から得られる
白血球から分離されたものである。採取した血液からの
リンパ球の分離は、血液から遠心分離により白血球を採
取し、これを４倍に稀釈したＰＢＳ（比重１．０７７）
をリンパ球のバッファーにしてリンパ球を分離する。
造方法について詳細に説明する。本発明において使用さ
れるリンパ球は、健康人から採取した血液から得られる
白血球から分離されたものである。採取した血液からの
リンパ球の分離は、血液から遠心分離により白血球を採
取し、これを４倍に稀釈したＰＢＳ（比重１．０７７）
をリンパ球のバッファーにしてリンパ球を分離する。
【００１３】分離したリンパ球をＰＢＳ（ｐＨ７．４）
で２回洗浄し、次いで培養液で１回洗浄する方法等、当
業者に良く知られている方法を任意に採択して行われ
る。リンパ球の分離は採血から４８時間以内に行われる
のが好ましい。その際、生きているリンパ球の濃度は９
０％以上であることが好ましい。リンパ球の培養液中に
おける濃度は、培養液１ｍｌ中にリンパ球からなる細胞
数が（５〜８）×１０6 個となるように調製されて培養
される。
で２回洗浄し、次いで培養液で１回洗浄する方法等、当
業者に良く知られている方法を任意に採択して行われ
る。リンパ球の分離は採血から４８時間以内に行われる
のが好ましい。その際、生きているリンパ球の濃度は９
０％以上であることが好ましい。リンパ球の培養液中に
おける濃度は、培養液１ｍｌ中にリンパ球からなる細胞
数が（５〜８）×１０6 個となるように調製されて培養
される。
【００１４】本発明においてリンパ球の培養に使用され
る誘導剤は、主な成分として、フージャンシャミング菌
類研究所（FuJian Shanming Fungi Institute）より入
手したＣＭＰ（Calboxy methyl-Pachyymaran）を主成分
として含有する誘導剤であり、場合によって他の誘導剤
をも含有する誘導剤から構成される複合誘導剤として培
養液中に添加される。
る誘導剤は、主な成分として、フージャンシャミング菌
類研究所（FuJian Shanming Fungi Institute）より入
手したＣＭＰ（Calboxy methyl-Pachyymaran）を主成分
として含有する誘導剤であり、場合によって他の誘導剤
をも含有する誘導剤から構成される複合誘導剤として培
養液中に添加される。
【００１５】リンパ球の培養に使用される培養液として
は公知の種々の培養液が使用でき、また、これらに抗菌
性物質などを添加して調製した改変培養液も使用するこ
とができる。例えば、アメリカＧＩＢＣＯ社製の「ＲＰ
ＭＩ １６４０」培養液に、５％のＡＢ型血液の血清と
適当量のカナマイシン等を加えた改変細胞培養液等が使
用できる。β−ラクタム等の抗生物質の使用は好ましく
ない。
は公知の種々の培養液が使用でき、また、これらに抗菌
性物質などを添加して調製した改変培養液も使用するこ
とができる。例えば、アメリカＧＩＢＣＯ社製の「ＲＰ
ＭＩ １６４０」培養液に、５％のＡＢ型血液の血清と
適当量のカナマイシン等を加えた改変細胞培養液等が使
用できる。β−ラクタム等の抗生物質の使用は好ましく
ない。
【００１６】培養液中に添加される誘導剤の量は通常、
６０μｇ／ｍｌ以上で使用することが好ましい。添加量
の上限は特にないが、１００μｇ／ｍｌを越えて添加し
てもより以上の効果は望めない。しかし、６０μｇ／ｍ
ｌに満たないと、誘導効果が不十分となる場合がある。
６０μｇ／ｍｌ以上で使用することが好ましい。添加量
の上限は特にないが、１００μｇ／ｍｌを越えて添加し
てもより以上の効果は望めない。しかし、６０μｇ／ｍ
ｌに満たないと、誘導効果が不十分となる場合がある。
【００１７】本発明の方法は、前記の培養液を用いて、
培養液１ｍｌ中にリンパ球数が（５〜８）×１０6 個に
なるように調製した後に培養をおこなうものである。培
養は、リンパ球濃度を調製した培養液を、温度３７℃で
振動させながら約１２時間〜１５時間培養した後、前記
の誘導剤を添加し、さらに温度３７℃で約４０時間〜１
週間振動させながら培養し、ついで分泌されたＧＭ−Ｃ
ＳＦを含有する上澄を採取することによって行われる。
培養液１ｍｌ中にリンパ球数が（５〜８）×１０6 個に
なるように調製した後に培養をおこなうものである。培
養は、リンパ球濃度を調製した培養液を、温度３７℃で
振動させながら約１２時間〜１５時間培養した後、前記
の誘導剤を添加し、さらに温度３７℃で約４０時間〜１
週間振動させながら培養し、ついで分泌されたＧＭ−Ｃ
ＳＦを含有する上澄を採取することによって行われる。
【００１８】上記培養によって得られた培養液の上澄中
には、分泌されたＧＭ−ＣＳＦが存在するので、ろ過上
澄液を使用して無菌実験、発熱性試験、毒性試験及び安
全性試験に加えて、ＨＢｓＡｇ、ＨＣＶ、ＨＩＶ検出が
行われる。
には、分泌されたＧＭ−ＣＳＦが存在するので、ろ過上
澄液を使用して無菌実験、発熱性試験、毒性試験及び安
全性試験に加えて、ＨＢｓＡｇ、ＨＣＶ、ＨＩＶ検出が
行われる。
【００１９】得られた上澄液に対する各試験は次のよう
な方法で行われる。 無菌試験：『バイオ製品の無菌実験の規程』に従って行
う。グルコース肉汁、改良マーチン傾斜培地及び通常傾
斜培地の三種類の培地各２本で、それぞれ０．５ｍｌ／
本の上澄液を植えつけ、３７℃或いは２７℃で７〜１０
日間培養し、菌の成育がなければ合格とする。
な方法で行われる。 無菌試験：『バイオ製品の無菌実験の規程』に従って行
う。グルコース肉汁、改良マーチン傾斜培地及び通常傾
斜培地の三種類の培地各２本で、それぞれ０．５ｍｌ／
本の上澄液を植えつけ、３７℃或いは２７℃で７〜１０
日間培養し、菌の成育がなければ合格とする。
【００２０】発熱性試験：１９８８年１１月に決定した
「全国バイオ製品発熱性試験の改訂規程」に従って行
う。体重１．７〜２．５キロのウサギ（３匹）の静脈に
上澄液を注射する。注射する量はヒトの体重１キロ当た
りの臨床最大使用量の３倍で、３匹のいずれも注射した
後の体温が最初の体温より０．８℃を上回ってはならな
い。また、３匹の体温の上昇した合計が１．８℃を越え
てはならない。合計が１．８℃以下の場合に合格とす
る。
「全国バイオ製品発熱性試験の改訂規程」に従って行
う。体重１．７〜２．５キロのウサギ（３匹）の静脈に
上澄液を注射する。注射する量はヒトの体重１キロ当た
りの臨床最大使用量の３倍で、３匹のいずれも注射した
後の体温が最初の体温より０．８℃を上回ってはならな
い。また、３匹の体温の上昇した合計が１．８℃を越え
てはならない。合計が１．８℃以下の場合に合格とす
る。
【００２１】安全性試験：３匹のモルモット（体重３５
０〜４００グラム）の腹側の皮下に５ｍｌのＧＭ−ＣＳ
Ｆを注射し、７日間観察する。動物の健康状態が良好で
注射した局部に赤い腫れ、壊死が見られない場合、及び
体重の低下が見られなければ合格となる。この条件を満
たせない場合、５匹のモルモットで再度実験を行う。検
定の基準は上述通り。
０〜４００グラム）の腹側の皮下に５ｍｌのＧＭ−ＣＳ
Ｆを注射し、７日間観察する。動物の健康状態が良好で
注射した局部に赤い腫れ、壊死が見られない場合、及び
体重の低下が見られなければ合格となる。この条件を満
たせない場合、５匹のモルモットで再度実験を行う。検
定の基準は上述通り。
【００２２】マウスの毒性試験：実験用マウス（体重１
８〜２０グラム）５匹の腹腔内（或いは尾静脈）にＧＭ
−ＣＳＦを０．５ｍｌ注射する。３０分間は動物に明ら
かな異常反応が現れてはならない。７日間観察した結
果、動物が健康状態が良好で合計体重が増えているもの
は合格とする。もしこの条件が満たされていない場合、
１０匹の実験用マウスで、再度実験を行う。判定の基準
は上述通り。
８〜２０グラム）５匹の腹腔内（或いは尾静脈）にＧＭ
−ＣＳＦを０．５ｍｌ注射する。３０分間は動物に明ら
かな異常反応が現れてはならない。７日間観察した結
果、動物が健康状態が良好で合計体重が増えているもの
は合格とする。もしこの条件が満たされていない場合、
１０匹の実験用マウスで、再度実験を行う。判定の基準
は上述通り。
【００２３】力価の測定：骨髄ＣＦＵ−ＧＭ半固体寒天
培養法を採用。リンパ球分離バッファ（比重１．０７
７）で正常ヒトの骨髄のＭＮＣを分離し、十分に洗った
後、小牛血清２０％、ヒトＡＢ型血清１０％を含有する
１６４０培地で細胞濃度を調製する。４０℃前後で溶解
している３％寒天と適当な比率で２４穴プレートに注入
する。その細胞濃度を２×１０6 細胞／ｍｌとし、全て
の穴に０．２５ｍｌずつ加える。実験中は陰性対照（成
長刺激剤を加えていない培地）を設け、陽性対照穴に異
なる濃度に希釈した異なる力価を有するＧＭ−ＣＳＦ標
準品を加える。試験穴に濃度の異なるサンプルを加え
る。それぞれのグループに３セットづつ設け、水蒸気飽
和条件下、３７℃、５％ＣＯ2 の条件で７〜１４日間培
養し、結果を観察する。細胞数が５０個以上となれば１
コロニーとする。その（コロニーの数／２×１０6細
胞）を計算し、標準品と比較し測定用試薬のＧＭ−ＣＳ
Ｆの含有量（Ｕ／ｍｌ）を計算する。５００，０００Ｕ
／ｍｌ以上を合格とする。
培養法を採用。リンパ球分離バッファ（比重１．０７
７）で正常ヒトの骨髄のＭＮＣを分離し、十分に洗った
後、小牛血清２０％、ヒトＡＢ型血清１０％を含有する
１６４０培地で細胞濃度を調製する。４０℃前後で溶解
している３％寒天と適当な比率で２４穴プレートに注入
する。その細胞濃度を２×１０6 細胞／ｍｌとし、全て
の穴に０．２５ｍｌずつ加える。実験中は陰性対照（成
長刺激剤を加えていない培地）を設け、陽性対照穴に異
なる濃度に希釈した異なる力価を有するＧＭ−ＣＳＦ標
準品を加える。試験穴に濃度の異なるサンプルを加え
る。それぞれのグループに３セットづつ設け、水蒸気飽
和条件下、３７℃、５％ＣＯ2 の条件で７〜１４日間培
養し、結果を観察する。細胞数が５０個以上となれば１
コロニーとする。その（コロニーの数／２×１０6細
胞）を計算し、標準品と比較し測定用試薬のＧＭ−ＣＳ
Ｆの含有量（Ｕ／ｍｌ）を計算する。５００，０００Ｕ
／ｍｌ以上を合格とする。
【００２４】ＨＢｓＡｇ（Ｈｅｐａｔｉｓ Ｂ ｓｕｒ
ｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ：Ｂ型肝炎表面抗原）の検
出：ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｉｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕ
ｎｏｓｏｒｂａｎｔ ａｓｓａｙ）法により、測定結果
が陰性のものを合格とする。
ｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ：Ｂ型肝炎表面抗原）の検
出：ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｉｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕ
ｎｏｓｏｒｂａｎｔ ａｓｓａｙ）法により、測定結果
が陰性のものを合格とする。
【００２５】ＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕ
ｓ：Ｃ型肝炎ウイルス）の検出：ＥＬＩＳＡ法により、
ＨＣＶＡｂ（ＨＣＶ抗体）を測定し、陰性のものを合格
とする。
ｓ：Ｃ型肝炎ウイルス）の検出：ＥＬＩＳＡ法により、
ＨＣＶＡｂ（ＨＣＶ抗体）を測定し、陰性のものを合格
とする。
【００２６】ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆ
ｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：エイズウイルス）の検
出：ＱＷＢ実験（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｅｓｓ ｔｅ
ｓｔ）或いはＰＡ凝集反応法により測定し、陰性のもの
を合格とする。
ｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：エイズウイルス）の検
出：ＱＷＢ実験（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｅｓｓ ｔｅ
ｓｔ）或いはＰＡ凝集反応法により測定し、陰性のもの
を合格とする。
【００２７】これらの試験に合格した目的物に保護剤
（防腐剤・アルブミン）を加え、凍結乾燥して製品とす
ることができる。この作業は『凍結乾燥するヒトの血漿
製造及び検定規程』に従って行われる。得られた製品
は、次の基準を満たさなければならない。
（防腐剤・アルブミン）を加え、凍結乾燥して製品とす
ることができる。この作業は『凍結乾燥するヒトの血漿
製造及び検定規程』に従って行われる。得られた製品
は、次の基準を満たさなければならない。
【００２８】外観と性質：凍結乾燥した製品は、白色ま
たはクリーム色の粉末で、水を加え溶解した場合に透明
の液体となり、攪拌しても溶けない顆粒がないものに限
られる。液体は明りの下で澄んだ透明となり、沈殿物が
ないこと、またアンプルは密封でき、ひび割れや漏れが
ないものを合格とする。
たはクリーム色の粉末で、水を加え溶解した場合に透明
の液体となり、攪拌しても溶けない顆粒がないものに限
られる。液体は明りの下で澄んだ透明となり、沈殿物が
ないこと、またアンプルは密封でき、ひび割れや漏れが
ないものを合格とする。
【００２９】水分測定：『バイオ製品の化学検定規程』
に基づき、Ｐｈｉｘｉｕｓｈｉ水分測定法により凍結乾
燥製品の水分を測定する。水分が３％以下のものを合格
とする。
に基づき、Ｐｈｉｘｉｕｓｈｉ水分測定法により凍結乾
燥製品の水分を測定する。水分が３％以下のものを合格
とする。
【００３０】ＰＨ値：ＰＨ値は６．５〜７．５
【００３１】無菌試験：前記試験方法と同じ。
【００３２】発熱性試験：前記試験方法と同じ。
【００３３】安全性試験：前記試験方法と同じ。
【００３４】マウス毒性試験：前記試験方法と同じ。
【００３５】力価測定：前記試験方法と同じ。
【００３６】ＨＢｓＡｇ，ＨＣＶ，ＨＩＶ検出：前記試
験方法と同じ。
験方法と同じ。
【００３７】
【実施例】以下に、実施例にしたがって本発明をより詳
細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
【００３８】細胞源：体外の白血球は、市の血液センタ
ーから供与を受けた、Ｂ型、Ｃ型肝炎及びそのキャリア
のテストに陰性である健康人の血液から採取した。 試験細胞：われわれの研究所の血液疾患研究部門から、
正常人の骨髄サンプルの供与を受けた。
ーから供与を受けた、Ｂ型、Ｃ型肝炎及びそのキャリア
のテストに陰性である健康人の血液から採取した。 試験細胞：われわれの研究所の血液疾患研究部門から、
正常人の骨髄サンプルの供与を受けた。
【００３９】誘導剤：フージャンシャミング菌類研究所
（FuJian Shanming Fungi Institute）より入手したＣ
ＭＰ（Calboxymethyl-Pachyymaran）を使用した。培
地：ＧＩＢＣＯ社製の培養液「ＲＰＭＩ １６４０」
に、５％ＡＢ型血清、適量のヘパリンカルシウムグルコ
ース酸（ｈｅｐａｒｉｎ ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｃｏ
ｓｅ ａｃｉｄ）及びカナマイシンを加えて調製した。
（FuJian Shanming Fungi Institute）より入手したＣ
ＭＰ（Calboxymethyl-Pachyymaran）を使用した。培
地：ＧＩＢＣＯ社製の培養液「ＲＰＭＩ １６４０」
に、５％ＡＢ型血清、適量のヘパリンカルシウムグルコ
ース酸（ｈｅｐａｒｉｎ ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｃｏ
ｓｅ ａｃｉｄ）及びカナマイシンを加えて調製した。
【００４０】誘導方法：まず、採取した血液から遠心分
離により血漿を分離し、４倍に希釈したＰＢＳ（比重
１．０７７）を用いて白血球を回収し、ｐＨ７．４のＰ
ＢＳで２度洗い、さらに培養液で洗った後、細胞を計数
し、培養液を用いて細胞濃度を８×１０6 ／ｍｌに調整
した。これを、一夜振とう培養したのち、誘導剤を添加
してさらに培養を続けた。
離により血漿を分離し、４倍に希釈したＰＢＳ（比重
１．０７７）を用いて白血球を回収し、ｐＨ７．４のＰ
ＢＳで２度洗い、さらに培養液で洗った後、細胞を計数
し、培養液を用いて細胞濃度を８×１０6 ／ｍｌに調整
した。これを、一夜振とう培養したのち、誘導剤を添加
してさらに培養を続けた。
【００４１】上記の培養方法で７日間（１６８時間）培
養したのち、培養液の上澄液を回収し、濾過してバクテ
リアを取り除き、無菌試験、発熱性試験、安全性試験、
毒性試験、ＨＢｓＡｇ、ＨｃＡｂ、ＨＩＶの各試験を前
記したＧＭ−ＣＳＦ製造規定にしたがって行い、全ての
試験に陰性（−）であるものについてスーパーフィルタ
ーで濾過し、濃縮した。
養したのち、培養液の上澄液を回収し、濾過してバクテ
リアを取り除き、無菌試験、発熱性試験、安全性試験、
毒性試験、ＨＢｓＡｇ、ＨｃＡｂ、ＨＩＶの各試験を前
記したＧＭ−ＣＳＦ製造規定にしたがって行い、全ての
試験に陰性（−）であるものについてスーパーフィルタ
ーで濾過し、濃縮した。
【００４２】上記の培養方法で得られた３セットのＧＭ
−ＣＳＦ（１）、ＧＭ−ＣＳＦ（２）及びＧＭ−ＣＳＦ
（３）について、製品としての移送、貯蔵安定性を付与
するために、保護剤として３％マンニトールと０．５％
アルブミンを加えたのち、前記試験規定にしたがって試
験を行った。比較のために、３セットのＧＭ−ＣＳＦ
（１）、ＧＭ−ＣＳＦ（２）及びＧＭ−ＣＳＦ（３）の
製造において細胞源として使用された白血球のそれぞれ
について、誘導剤を添加せずに培養した培養液の上澄液
をスーパーフィルターで濾過し、３％マンニトールと
０．５％アルブミンを加えたのち同様の試験を行った。
結果を表１に示す。
−ＣＳＦ（１）、ＧＭ−ＣＳＦ（２）及びＧＭ−ＣＳＦ
（３）について、製品としての移送、貯蔵安定性を付与
するために、保護剤として３％マンニトールと０．５％
アルブミンを加えたのち、前記試験規定にしたがって試
験を行った。比較のために、３セットのＧＭ−ＣＳＦ
（１）、ＧＭ−ＣＳＦ（２）及びＧＭ−ＣＳＦ（３）の
製造において細胞源として使用された白血球のそれぞれ
について、誘導剤を添加せずに培養した培養液の上澄液
をスーパーフィルターで濾過し、３％マンニトールと
０．５％アルブミンを加えたのち同様の試験を行った。
結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】 ──────────────────────────────────── ヒトの血液のリンパ球により生産されるＧＭ−ＣＳＦの３組の試験結果 ──────────────────────────────────── 試験番号 ＧＭ−ＣＳＦ(1) ＧＭ−ＣＳＦ(2) ＧＭ−ＣＳＦ(3) ──────────────────────────────────── 細胞数 （×１０，０００／ｍｌ） ５８６ ５０５ ５９０ 外観 ピンク ピンク ピンク ＰＨ値 ７．５ ７．５ ７．５ 透明性 透 明 透 明 透 明 無菌試験 陰 性 陰 性 陰 性 発熱性試験 陰 性 陰 性 陰 性 毒性試験 陰 性 陰 性 陰 性 安全性試験 陰 性 陰 性 陰 性 毒性試験 陰 性 陰 性 陰 性 安全性試験 陰 性 陰 性 陰 性 ＨｂｓＡｇ試験 陰 性 陰 性 陰 性 ＨｃＶＡｂ試験 陰 性 陰 性 陰 性 ＨＩＶ試験 陰 性 陰 性 陰 性 誘導剤無添加培養液 の力価（Ｕ／ｍｌ） ２４３００ ４３８００ ３５１２０ 誘導剤添加培養液 の力価（Ｕ／ｍｌ） ８２８３６．８ ８０７１６．８ ８７０４０ ────────────────────────────────────
【００４４】表１の結果によれば、我々の方法、即ち主
としてＣＭＰ（漢方薬の有効成分である。）からなる誘
導剤の強力な誘導による培養方法は、高い力価を有する
ＧＭ−ＣＳＦを製造することができ、筋肉注射の水準品
として多数の臨床試験に使用し得る品質のＧＭ−ＣＳＦ
を製造することができることがわかる。
としてＣＭＰ（漢方薬の有効成分である。）からなる誘
導剤の強力な誘導による培養方法は、高い力価を有する
ＧＭ−ＣＳＦを製造することができ、筋肉注射の水準品
として多数の臨床試験に使用し得る品質のＧＭ−ＣＳＦ
を製造することができることがわかる。
【００４５】つぎに、前記の誘導剤を添加した培養方法
において、培養時間と生成ＧＭ−ＣＳＦの力価の関係を
見るために、培養時間４８時間、７２時間、１２０時間
及び１６８時間（７日）における培養液の力価の比較を
行った。結果を表２に示す。
において、培養時間と生成ＧＭ−ＣＳＦの力価の関係を
見るために、培養時間４８時間、７２時間、１２０時間
及び１６８時間（７日）における培養液の力価の比較を
行った。結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】 ────────────────────────────────── ＣＭＰにより誘導されたリンパ球により生成されたＧＭ−ＣＳＦ力価 ────────────────────────────────── 培養時間（時間） ＧＭ−ＣＳＦ（Ｕ／ｍｌ） ────────────────────────────────── ４８ ５１ ７２ ４０３２ １２０ ４０９６ １６８（７日） ８７４４９．６ ────────────────────────────────────
【００４７】表２から、ＣＭＰによって誘導されたリン
パ球が４８時間後にＧＭ−ＣＳＦの生産をはじめ、そし
て１６８時間後に８０．０００以上Ｕ／ｍｌ以上とな
り、最高値に達する。それ故、ＣＭＰによる誘導培養
は、１６８時間程度が最適であることが分かる。
パ球が４８時間後にＧＭ−ＣＳＦの生産をはじめ、そし
て１６８時間後に８０．０００以上Ｕ／ｍｌ以上とな
り、最高値に達する。それ故、ＣＭＰによる誘導培養
は、１６８時間程度が最適であることが分かる。
【００４８】（削除）
【００４９】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
健康人から採取したリンパ球より、ＣＭＰを主成分とす
る誘導剤を使用して、高品質のＧＭ−ＣＳＦを大量に生
産することができる。また、本発明の方法によってえら
れるＧＭ−ＣＳＦは、筋肉注射の水準品として多数の臨
床試験に使用し得る品質のＧＭ−ＣＳＦを製造すること
ができるものである。さらに、本発明の方法で得られる
ＧＭ−ＣＳＦはヒト意外の蛋白質を含有しておらず、副
作用も少ない。
健康人から採取したリンパ球より、ＣＭＰを主成分とす
る誘導剤を使用して、高品質のＧＭ−ＣＳＦを大量に生
産することができる。また、本発明の方法によってえら
れるＧＭ−ＣＳＦは、筋肉注射の水準品として多数の臨
床試験に使用し得る品質のＧＭ−ＣＳＦを製造すること
ができるものである。さらに、本発明の方法で得られる
ＧＭ−ＣＳＦはヒト意外の蛋白質を含有しておらず、副
作用も少ない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特表 平10−510147（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/02 C07K 14/535 C12N 5/00 - 5/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 健康人の血液中の白血球から分離したリ
ンパ球を、ＣＭＰを主成分とした誘導剤を添加した培養
液中で培養することを特徴とする顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子の製造方法。 - 【請求項２】 上記培養は、１６８時間以上行うことを
特徴とする請求項１記載の顆粒球マクロファージコロニ
ー刺激因子の製造方法。 - 【請求項３】 ＣＭＰを主成分とした顆粒球マクロファ
ージコロニー刺激因子用誘導剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31168795A JP3215309B2 (ja) | 1995-11-07 | 1995-11-07 | 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31168795A JP3215309B2 (ja) | 1995-11-07 | 1995-11-07 | 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09121884A JPH09121884A (ja) | 1997-05-13 |
| JP3215309B2 true JP3215309B2 (ja) | 2001-10-02 |
Family
ID=18020263
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31168795A Expired - Fee Related JP3215309B2 (ja) | 1995-11-07 | 1995-11-07 | 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3215309B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1081193C (zh) * | 1998-07-15 | 2002-03-20 | 王利亚 | 羧甲基茯苓聚糖的合成方法 |
| SK287315B6 (sk) | 2006-06-02 | 2010-06-07 | Biotika, A. S. | Spôsob izolácie polymyxínu B z vyfermentovanej pôdy |
| SK287293B6 (sk) | 2006-06-15 | 2010-05-07 | Biotika, A. S. | Spôsob fermentácie polymyxínu B pomocou produkčného mikroorganizmu Bacillus polymyxa |
| CN103484510B (zh) * | 2013-10-09 | 2015-10-28 | 武汉工程大学 | 一种羧甲基茯苓多糖的制备方法 |
| CN112225831B (zh) * | 2020-11-03 | 2022-03-01 | 华中农业大学 | 一种活性茯苓多糖、其制备方法及应用 |
-
1995
- 1995-11-07 JP JP31168795A patent/JP3215309B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09121884A (ja) | 1997-05-13 |
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