JPH06508613A - 自己移植の改良法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 自己移植の改良法 発明の分野 本発明は細胞減少治療（ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ　ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）を 受ける患者に、患者自身の造血細胞を移植する方法一般に関するものである。

特に、細胞減少治療により骨髄細胞の増殖抑圧を起こす患者から、骨髄または末 梢血液前駆細胞を治療に先だって取り出し、増殖因子存在下でｅｘ　ｖｉｖｏで 培養を続け、さらにこれを細胞減少治療と並行してまたは治療後に患者に再移植 し、こうした療法による骨髄細胞の増殖抑圧の効果を緩和する方法に関するもの である。さらに本発明は、前駆細胞をｅｘ　ｖｉｖｏで継続培養する際に用いる 、一種または複数の増殖因子を含んだ培地に関するものである。

背景技術 ガンの一般的な治療法には、様々な形の細胞減少治療がある。細胞減少治療には 活発に分裂する細胞に対して毒性をもつ電離放射線または化学毒性物質の投与が 挙げられる。こうした治療法の副作用は、細胞毒性が正常な細胞にも効果を及ぼ すことによるものであり、この副作用のため細胞減少治療の施療は制限される。

よく見られる副作用は骨髄細胞の増殖抑圧、すなわち、白血球、赤血球細胞、血 小板のちととなる骨髄細胞の損傷である。骨髄細胞の増殖抑圧の結果血球細胞が 不足し、中音は血球減少症を呈する。血球減少症の結果、密書は感染症および出 血を伴う身体不調にかかる危険性が高まる。

血球減少症は、ガン治療による罹病率、死亡率および投薬の量的制限の主たる要 因である。骨髄への損傷を少な（したままより多線量または多用量でのガン治療 を行うために、多（の臨床研究者により細胞減少治療の投与の方法および計画の 改変が行われてきた。骨髄前駆細胞を細胞減少治療の前に取り出して治療後に再 移植し、細胞減少治療による毒性から骨髄を守る骨髄移植法もそのための方法の １っである。前駆細胞を骨髄に移植すれば、これは成熟した血球細胞に分化し、 暖熱した血球細胞の細胞数の減少を補う。

高用量での投与による化学療法は、治療学的に見て有利な点が多い。なぜならこ うした療法では、標準的な量の投与での治療に比べ、転移性のガン、特に乳癌轡 者において治療目標とする反応が得られる率が高くなるからである。こうした高 用量での投与により、予後の良くない患者ですら症状がなく鎮静な状態が長時間 続くことが可能となる。しかしながら高用量での化学療法は毒性が強く、その結 果として起こる臨床での合併症の多くは、骨髄細胞の増殖抑圧の期間の延長を反 映した感染、出血を伴う身体不調、その他の効果に関連したものである。

ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）相同タンパク質（ サーグラモメチム、ｓａｒｇｒａｍｏｔ　ｉｓｍ）は現在合衆国において入手可 能で、骨髄移植後の造血細胞の回復を促進するのに用いられている薬剤である。

サーグラモメチム処理により、骨髄移植に伴う合併症の多くが低減した。

骨髄細胞および循環造血幹細胞の増殖については、様々な実験研究と細胞培養技 術を用いて解明されている。二種類のコロニー刺激因子、すなわちＧＭ−Ｃ３Ｆ と顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳ　Ｆ）が、循環造血前駆細胞およびその幹 細胞の増殖頻度を高めることが示されている。複数の研究（Ｇｉａｎｎｉ等Ｌａ ｎｃｅｔ３３４：５８９（１９８９）、５ｉｅｎａ′４ＰＢ１ｏｏｄ７４：１９ ０５（１９８９）、Ｍｏ１ｉｎｅ＊ｘ等Ｂ１ｏｏｄ７６：２１５３（１９９O） ） には、ＧＭ−Ｃ３Ｆのｉｎ　ｖｉｖｏ投与により腫瘍患者由来の末梢血液細胞の 細胞集団中への未成熟の幹細胞の移植の可能性と頻度を高められることが述べら れている。こうした手法は、骨髄前駆細胞を補充するためにＧＭ−Ｃ５Ｆを１ｎ ｖｉｖｏて投与し、後に造血前駆細胞を患者に投与することによって化学療法に よる骨髄細胞の増殖抑制の緩和することを目的とした試みを示すものである。

より具体的には、Ｇｉａｎｎｎｉ等は臨床学的研究として、高用量のシクロホス ファミド（７ｇ／ｍりを投与した患者に、患者自身の末梢血液幹細胞および骨髄 細胞の移植を行ったことを記載している。ＧＭ−Ｃ３Ｆを前駆細胞補充促進薬剤 として投与した後、末梢血液前駆細胞を回収した患者は、末梢血液細胞の補充に ＧＭ−Ｃ５Ｆを用いなかった患者よりも、迅速に血球減少から回復した。従って 、ＧＭ−Ｃ８Ｆの投与は、末梢血液前駆細胞の細胞数を増大させたといえる。こ の治療方法では、自己の骨髄細胞の移植を受けずに末梢血液幹細胞の補充だけを 受け化学寮法を施されたコントロール患者と比較して、この治療を受けた患者の 方がより迅速に造血細胞が回復するという結果が得られた。

高用量での化学療法と自己の骨髄移植とを受けるガン患者が、その後ＧＭ−Ｃ５ Ｆ処理を施された場合、同様の処理を行った記録上のコントロール患者に比べて 骨髄細胞の回復が早められることが示されている（Ｂｒａｎｄｔ等Ｎ、　Ｅｎｇ ｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１８　：８６９（１，９８８）、Ｎｅｍｕｎａｔｉｓ 等Ｂ１ｏｏｄ７２：８３４（１９８８））　。これらの研究によれば、化学療法 後顆粒球数が少なくとも０．５ｘｌＯ’／　Ｉになるまでの時間は、ＧＭ−Ｃ８ Ｆを投与された患者で短縮されている。顆粒球数の増大はＧＭ−Ｃ３Ｆ投与の間 がもっとも顕著である。ＧＭ−Ｃ３Ｆの投与を中断すると、被実験患者の白血球 数はコントロールのレベルまで低下する（Ｂｒａｎｄｔ等　前述）。

ＧＭ−Ｃ３Ｆは細胞減少治療後の自己骨髄移植の際にも用いることができる。

５ｏｃｉｎｓｋｉ等（Ｌａｎｃｅｔ３３１：１９４（１９８ｇ））は、細胞に毒 性のある化学療法後にＧＭ−Ｃ８Ｆを投与すると、造血前駆細胞の循環プールが およそ６０倍に増大すると報告している。他のグループは、循環血流中を循環す るヒト単核細胞で、特に化学療法による骨髄細胞の増殖抑圧から回復しつつある 時期の細胞を用いると、骨髄を完全に損傷させる（骨髄に対し毒性がきわめて高 い）処理の後でも、造血細胞を再構成することができると報告している（たとえ ばＢｅ１１等Ｈｅｍａｔｏ１．０ｎｃｏ１．５　＋４５（１９８７）を参照）。

Ｍａｓｏｎ等（Ｐｒｏｃ、＾ｍｅｒ、＾５ｓｏｃ、ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、３２ ：１９３（１９９１））はｉｎ　ｖｉｔｒ。

のインターロイキン−３（ＩＬ−３）が単独で、またはインターロイキン−６（ ＩＬ−６）とともに動いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでヒト血液前駆細胞由来コロニー 形成前駆細胞の細胞数を二倍に増やすと報告している。またＭａｓｏｎ等は、Ｇ Ｍ−Ｃ３Ｆはｉｎ　ｖｉｔｒｏでコロニー形成前駆細胞の増殖に働かないことも 報告している。このように患者自身の造血細胞の移植は、細胞減少治療からの回 復を早めるのに有効な手段であることが証明されている。自己造血細胞の移植法 を改良すれば、減少治療からの回復をさらに早めることが可能であり、より高用 量でより効果的な投与による細ｌｔ２！減少治療の実施を可能にさえする。本発 明は自己造血細胞の移植の改良法を提供する。

発明の概要 本発明は自己前駆細胞の移植を行う方法であって、（１）細胞減少治療に先だっ て患者から造血幹細胞を取り、（２）造血前駆細胞を増加させた集団から成る細 胞調製品を提供させるために、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ− Ｃ５Ｆ）、インターロイキン−３（Ｉ　Ｌ−３）　、スチール因子（ＳＦ）　、 ＧＭ−Ｃ８Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質、およびこれらの組み合わせからなるグ ループから選択されるｅｘ　ｖｉｖｏ増殖因子を用いて造血前駆細胞をｅｘ　ｖ ｉｖ。

で増加させ：　（３）用意した細胞集団を、細胞減少治療と並行してまたは治療 後に患者に投与する、ことからなる方法である。インターロイキン−１（ＩＬ− １αまたはＩＬ−１β）も他の増殖因子の少なくとも一つと組み合わせて、ｅｘ ｖｉｖｏの増殖因子として使用できる。前駆細胞は末梢血液を回収することによ り、または骨髄の体外移植組繊から得ることができる。

本発明の方法は、所望によりｉｎ　ＶｉｔｒＯでの予備的な治療法、すなわち造 血前駆細胞を補充するために、補充増殖因子を患者の末梢血液に投与することも 含まれる。こうした補充増殖因子は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ＳＦ、Ｇ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ− ３、ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質およびこれらの組み合わせからなる グループから選択される。

本発明の方法は、所望により、これに続（ｉｎ　ｖｉｖｏでの治療法、すなわち 密書自身の細胞集団を患者に移植した後、移植助長用増殖因子を患者に投与する ことによって移植の効率を高め、該細胞集団から移植した造血前駆細胞集団の増 殖を活性化することも含まれる。こうした移植助長用増殖因子は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ 、ＩＬ−３、ＳＦＳＧＭ−Ｃ８Ｆ／ｌ−３融合タンパク質およびこれらの組み合 わせからなるグループから選択される。

さらに、本発明は前駆細胞を増殖させる培地も含み、この培地は細胞増殖培地、 慰者自身の血清およびＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ５Ｆ、ＧＭ−Ｃ５Ｆ ／Ｉ　Ｌ−３融合タンパク質およびこれらの複合体からなるグループから選択さ れる増殖因子を含む。ただしここで挙げたグループ中でＩＬ−１は、池の増殖因 子の少な（とも一つと組み合わせなければ使用できない。

発明の詳細な説明 増殖因子はｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、骨髄の造血前駆細胞の増殖および増殖した 造血前駆細胞の末梢血液への移動を誘導する。末梢血液から回収される造血前駆 細胞は、細胞減少治療薬剤を投与された患者における造血細胞の増殖回復治療に 用いることができる。本発明は、末梢血液若しくは骨髄由来の造血前駆細胞のｅ ｘ　ｖｉｖｏにおける増殖因子処理を含み、この処理により細胞数を増やして、 注入または移植することが可能となる。さらに増殖因子は、移植された造血前駆 細胞の移植操作後の安定化と増殖を促進させる目的で用いることができる。細胞 減少治療を受ける患者において造血細胞が再構成されれば、高用量での細胞減少 治療（たとえば骨髄細胞の増殖抑圧を起こすような抗ガン化学療法薬や強度の放 射線療法など）を受ける患者に見られる、感染症および出血を伴う合併症などの 副作用を軽減することができる。

本発明は、患者の骨髄または末梢血液の前駆細胞を移植すると共に、ｅｘ　ｖｉ ｖｏおよび／またはｉｎ　ｖｉｖｏで増殖因子を投与することを含む。ｅｘｖｉ ｖｏの増殖因子すなわち細胞補充増殖因子と移植助長用増殖因子は、ＧＭ−Ｃ５ Ｆ、ＩＬ−３、ＳＦ、ＩＬ−１、ＧＭ−Ｃ８Ｆ／ＴＬ−３融合タンパク質および これらの組み合わせからなるグループから選択される。これらの中でＳＦとＧＭ −Ｃ８Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質とを組み合わせて用いるのが、ｅｘｖｉｖｏ の増殖因子として望ましい。またＩＬ−１（ＩＬ−１αとＩＬ−１βからなる） は池の増殖因子の少なくとも一つと組み合わせて投与する必要があり、そして、 ｅｘ　ｖｉｖｏの増殖因子として用いることが好ましい。

顆粒球マクロファー／コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ８Ｆ）については、その類似 体のポリペプチド（Ｌｅｕ２３）がＬＥＵＫＩＮＥの登録商標名で市販されてい て、臨床用に入手できる。このＧＭ−Ｃ５Ｆ類似体のヒトＬｅｕ２３組換えタン パク質を酵母で発現させたものの一般名称はサーグラモメチムである。ヒトＧＭ −Ｃ３Ｆの本来の配列のクローニングと発現については、Ｃａｎｔｒｅｌｌ等の Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡｃａｄＳｃｉ、じＳ＾８２：６２５０（１９８５） に記されている。

インターロイキン−３（［Ｌ−３）には主に二つの対立遺伝子変異（ａｌｌｅｌ ｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）がある。優性なヒトのアリルは、成熟したポリペプ チド（１９８８年６月３０日に公開されたＷ０８ｇ１０４６９１、および１９８ ７年１月２０日に提出された米国特許出目の位置にプロリンを持つようなＩＬ− ３をコードする。もう一つのＩＬ＝３のアリルは、成熟したポリペプチドの８残 基目の位置にセリンを持つ。

スチール因子（ＳＦ）は、マスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ ）　、Ｗｉｔリカンド（ＫＬ）とも呼ばれている。これらの名称はすべてｃｋｉ ｔ原癌遺原子遺伝子るリガンドを指すものである。ＳＦについてはＣｅ１ｌの１ ９９０年１０月５日の号の一連の７報の論文（ｆｉｌｌｉａｆｆｌｓ　ｅｔ　ａ ｌ、　、Ｃｅ１１６３：１６７、１９９０；　Ｃｏｐｅｌａｎｄｅｔ　ａｌ、、 Ｃｅ１１６３：１７５．１９９０；　Ｆｌａｎａｇａｎ　ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ、 Ｃｅ１１６３；１８５．１９９０；　Ｚｓｅｂ潤@ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１１６３：１９５，１９９０；　Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１６ ３：２０３．１９９０；　Ｚｅｂｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、ＣｅPｌ　６３二２１ ３、１９９０；　Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｃｅ１１６３：２２５．１９９ ０：および＾ｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１６３F２３５゜ １９９０）に記載されている。ＳＦの様々な組換え型の発現については、１９９ ０年９月２１日に提出された米国特許出願第０７１５８６．０７３号および１９ ９１年６月１２日に提出された米国特許出願第０７／７１３．７１５号に記載さ れており、その内容を参考文献として引用する。ＳＦは、初期段階の骨髄、リン パ系前駆細胞、そして、おそらくは最も未分化状態の造血幹細胞についても増殖 と補充を活性化することが発見された。

インターロイキン−１にはＩＬ−１αとＩＬ−１βの二つの型があることが発見 されティる（ｉｌａｒｃｈ等　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：６４１．１９８５）。Ｉ Ｌ−１αとＩＬ−１βはともにＩＬ−１受容体（■型とＩＩ型）に結合し、情報 を伝達する。ＩＬ−１αが前駆体、成熟型でともに活性を持つのに対し、ＩＬ− １βは成熟型のみが活性を持ち、前駆体には活性はない（Ｍａｒｃｈ等　前述） 。ＩＬ−１にはアミノ酸配列を改変した活性化型断片や類似体が存在し、またＩ Ｌ−１の一部を含みＩＬ−１としての生理活性を持つ融合タンパク質のような派 生化合物も存在する（Ｍｏｓｌｅｙ等Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳ＾８４　：４５７２．１９８７）。

ＧＭ−Ｃ３Ｆと【Ｌ−３の各部分を含んだ融合タンパク質については、１９９０ 年ＩＯ月１４日に提出された米国特許出願第０７１５６７、９８３号に記載され 、その内容を参考文献として引用する。ある特定のＧＭ−Ｃ３Ｆ／Ｉ　Ｌ−３融 合タンパク質（ＲＩＸＹ３２１）についてはＧＭ−Ｃ５Ｆ受容体および／または ＩＬ−３受容体と相互作用することが発見されている（Ｃｕｒｔｉｓ等　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８８：５８０９．１９９１） 。

ＰＩＸＹ３２１はＬｅｕ”Ａｓｐ”Ｇｌｕ３４ｈＧＭ−ＣＳ　Ｆ／Ｇｌｙ、　Ｓ ｅｒ　Ｇｌｙ、　Ｓｅｒ／Ｐｒｏ”　Ａｓｐ”Ａｓｐ１・ｈｌＬ−３なるＧＭ− Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質である。すなわちこのタンパク質は３カ所が置 換されたＧＭ−Ｃ３Ｆ領域と２カ所が置換されたＩＬ−３（８残基目がＰｒｏの 型）領域が、グリシンおよびセリン残基からなるリンカ−またはスペーサー領域 により融合された形である。造血前駆細胞をｅｘ　ｖｉｖＯで培養する際には、 ＳＦとＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質（たとえばＰＩＸＹ３２１）を組 み合わせた増殖因子を有効量用いるのが望ましい。

本発明の方法に用いられる増殖因子はポリペプチドである。補充増殖因子もしく は移植助長用増殖因子が使われる場合、皮下（ｓｃ）、静脈注射（ｉｖ）、腹膜 内（ｉｐ）、筋肉内（ｉｍ）、およびリンパ腺内（ｉｌ）を含めた、通常経路に よるｉｎ　ｖｉｖｏでのポリペプチド投与が望ましい。増殖因子のｉｎ　ｖｉｖ ｏ投与は皮下が最も望ましい。

増殖因子のｅｘ　ｖｉｖｏでの利用は、生理緩衝液もしくは培養培地中の末梢血 液もしくは骨髄からの造血前駆細胞の培養物に直接添加することによる。好適な 前駆細胞増加（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）させるための培地は、例えば、自己血清お よび抗生物質を供与された最少必須培地である。本発明の前駆細胞の増加用培地 は、自己血清およびできれば抗生物質を供与された最少必須培地などの培養培地 中に、１つ若しくは複数のｅｘ　ｖｉｖｏ増殖因子を含む。他の培養培地には、 例えば、ハンクス（Ｈａｎｋｓ）、マッコイズ（ＭｃＣｏｙｓ）、ＲＰＭＩ　１ ６４０最少必須培地（＋ｎｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｓｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉａ； ＭＥＭ）およびその他が含まれ、１％から２０％の自己血清およびできれば抗生 物質が含まれる。

補充増殖因子もしくは移植助長用増殖因子のｉｎ　ｖｉｖｏでの好適な投与量は 、ＳＦについては約１０μｇ／ｋｇ／日から約８００μｇ／ｋｇ／日、ＧＭ−Ｃ ８ＦおよびｒＬ−３については約１μｇ／ｋｇ／日から約１００μｇ／ｋｇ／日 ：そしてＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合蛋白質については約１μｇ／ｋｇ／日から 約１００μｇ／ｋｇ／日である。前駆細胞増加用培地におけるｅｘ　ｖｉｖ。

増殖因子の好適な濃度は、ＳＦについては約１ｎｇ／ｍ＋から約１０μｇ／ｍｌ ：ＧＭ−Ｃ８Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１およびＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合蛋白質 については約１０ｎｇ／ｍｌから約２００μｇ／ｍｌである。

前駆細胞は、骨髄および末梢血液から得られるヒト単核細胞から得ることができ る。前駆細胞は、例えば、フィコールハイバーク（Ｆｉｃｏｌｌ　ｔｌｙｐａｑ ｕｅ）’システムなどの密度勾配遠心によって末梢血液から分離できる。骨髄も しくは末梢血液から得られる造血前駆細胞を分離する別の方法は、未成熟なヒト 造血前駆細胞上のステージ特異的な抗原を認識する抗体で分離することを伴う。

ヒト造血前駆細胞の分離に関する抗体認識法のある実施例は、シビン（Ｃｉｖｉ ｎ）　、米国特許第５．０３５゜９９４号（その開示は本明細書中で参考に取り 入れられている）に記載されている。

特定の分離技術により造血前駆細胞を得れば、それを低温条件下で保存してもよ いし、本発明に従ってｅｘ　ｖｉｖｏで増加させてもよい。保存した細胞は後で 急速融解し、本発明に従ってｅｘ　ｖｉｖｏで増加させることができる。

増殖因子でｅｘ　ｖｉｖｏ処理した造血前駆細胞は、自己細胞移植によって患者 に再投与される。増殖因子存在下で最低１日から２週間まで、細胞をｅｘ　ｖｉ ｖｏ培養する。細胞は、増殖因子での増加前もしくは増殖因子での増加後も保存 して生存能力を保つことができる。細胞保存は液体窒素などの低温条件下で行う のが望ましい。保存されていた細胞は患者への投与前に洗浄する。増加させた細 胞を、細胞減少（ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）療法の終了に続いて、もしくは 細胞減少療法の終了後７２時間以内に投与する。細胞投与は通常、点滴により２ から５日かけて行う。約１０７から約１０＠の増加した単核細胞／ｋｇ（およそ １０１′の増加した前駆細胞／ｋｇ）を自己細胞移植のために患者に投与するこ とが望ましい。

好適には、造血前駆細胞を、およそ１週間ｅｘ　ｖｉｖｏで培養する。好適には 、増殖因子は、ＳＦおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合蛋白質の組み合わせであ る。ＧＭ−Ｃ５Ｆ／ＩＬ−３融合蛋白質がＰＩＸＹ３２１であることが最も望ま しい。好適には、補充増殖因子および移植助長用増殖因子はＳＦとＧＭ−Ｃ８Ｆ ／Ｉｔ−３融合蛋白質との組み合わせである。

好適な態様では、本発明の方法は、（以前のいかなる細胞減少療法からも回復し た後の）細胞減少療法前の患者に対する補充増殖因子を用いたｉｎ　ｖｉｖ。

治療、（患者の末梢血液および／若しくは骨髄から得られた）造血前駆細胞のＧ Ｍ−Ｃ８Ｆ／ｒＬ−３融合蛋白質とＳＦを組み合わせたｅｘ　ｖｉｖｏ増加、細 胞調製品（ｅｘ　ｖｉｖｏ処理された造血前駆細胞）の投与後の移植助長用増殖 因子を用いた患者の治療から成る。補充増殖因子のｉｎ　ｖｉｖｏ投与は、骨髄 中の、より未発達な造血前駆細胞の増殖を刺激し、末梢血液中に造血前駆細胞が 補充されるのを助ける。末梢血液前駆細胞、および／または、骨髄細胞は増加さ れ、後に、細胞減少療法に続いて造血回復のために用いられる。患者は、細胞調 製品を最後に投与して１から３日後から移植助長用増殖因子を用いて治療しても よい。移植助長用増殖因子は、造血前駆細胞の移植と増殖を促進する。造血機能 の回復は、感染、感染の疑惑および出血障害の減少に明らかなように、骨髄抑制 性（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）もしくは骨髄破壊性（ｍｙｅｌｏａｂ ｌａｔｉｖｅ）の細胞減少療法を施した中１者の病態の軽減を助ける。

正常な志願者のヒト末梢血液から得られた造血前駆細胞を、選択された単一の増 殖因子もしくは増殖因子の組み合わせを含む前駆細胞増加用培地中で培養するこ とにより、ｅｘ　ｖｉｖｏて増加した。選択された増殖因子の存在下で造血前駆 細胞を培養することにより、骨髄系列および赤血球系列の前駆細胞の増加（骨髄 性紙１１ａ　（ＧＭ−ＣＳ　Ｆ）および赤血球性細胞（ＢＦＵ−ｅ）に関するコ ロニーアッセイにより決定される）が見られた。本明細書中の実施例１は、種々 の前駆細胞増加用培地で培養した造血前駆細胞を利用した一連の実験データを提 供する。

実施例１て提供されるデータは、骨髄性細胞および赤血球性細胞の増加率（ｅｘ ｐａｎｓｉｏｎ　１ｎｄｅｘ）の増加を証明する。ＰＩＸＹ３２１、ＩＬ−３若 しくはＳＦ増殖因子を含む前駆細胞増加用培地は、添加される増殖因子を含まな い培地に比べ、骨髄性および赤血球性前駆細胞集団を大きく増加させることがで きた。ＳＦだけ含む培地、Ｐ　Ｉ　ＸＹ３２１りｌｔ含む培地、ＩＬ−１ａだけ 含む培地、Ｇ−Ｃ５Ｆだけ含む培地、ｒＬ−３だけ含む培地、またはＳＦとＩＬ −３若しくはＧ−Ｃ３ＦとＳＦの組み合わせを含む培地とさえ比較しても、ＳＦ とＰＩＸＹ３２１の組み合わせを含む培地は、−貫して大きな骨髄性および赤血 球性前駆細胞の増加を示した。池の特に有効な増殖因子の組み合わせは、骨髄性 および赤血球性前駆細胞の両方についてはＬＬ−１αとＰＩＸＹ３２１であった が、しかし、この組み合わせは骨髄性前駆細胞数を高い値に維持しなかった。従 って、ｅｘ　ｖｉｖｏ増殖因子もしくは増殖因子の組み合わせを用いｔこ、ｉｎ 　ｖｉｔｒｏでの造血前駆細胞の増加に関して特許請求される方法は、ヒト末梢 血液から得られる造血前駆細胞の少なくとも骨髄および赤血球系列集団の増加を 改善することができる。さらに言えば、ＰＩＸＹ３２１とＳＦという増殖因子の 組み合わせは特に有効であった。

本発明は、末梢血液もしくは骨髄からの造血前駆細胞を、増殖因子でｅｘ　ｖｉ ｖｏ処理することを含む。増殖因子は、ＧＭ−Ｃ８Ｆ、ＩＬ−３、ＳＦ、ＩＬ− １、ＧＭ−Ｃ５Ｆ／ＩＬ−３融合蛋白質およびこれらの組み合わせから成るグル ープから選択される。増殖因子を含む培地におけるｅｘ　ｖｉｖｏでの前駆細胞 の増加は、元々末梢血液もしくは骨髄から回収された造血前駆細胞の数を増加す ることができ、後に自己細胞移植において投与された時に、この増加された前駆 細胞の集団が骨髄および池の造血組織中に移植され増殖する能力を改善する。

自己細胞移植のための造血前駆細胞の集団を有意に増加するこの能力は、自己造 血細胞移植の改良技術を提供し、高い量の、若しくはより強力な細胞減少治療を 可能にする。増殖因子を用いたｅｘ　ｖｉｖｏ処理は、骨髄破壊性もしくは骨髄 抑制性の細胞減少治療法後の患者の造血機能回復を改善する。末梢血液もしくは 骨髄から得られた造血前駆細胞の処理はさらに、細胞減少治療剤についてより高 い投与量を可能にし、一方では患者に対する感染および出血障害の危険性を減少 させる。

それ故、本発明による自己細胞移植による造血機能回復の方法は、より高い量で の細胞減少治療に伴う病態（感染および出血障害）およびミエロトキシシティ− （ｍｙｅｌｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；骨髄毒性）を軽減するのを助け、現行の自己造 血細胞移植技術に改良をもたらす。以下の実施例は、造血前駆細胞増加のｉｎ　 ｖｉｔｒｏでのデータ、および造血機能回復と自己造血細胞移植に関する種々の 臨床学的治療処置を例示する。

実施例１ 本実施例は、一連の実験で、様々な増殖因子もしくは増殖因子の組み合わせを含 む前駆細胞増加用培地またはそれらを含まない培地を用いてｅｘ　ｖｉｖｏ増加 されたヒト造血前駆細胞に関して、増加比の比較を例示する。ヒト造血前駆細胞 は、正常な志願者の末梢血液から得た。

ヒト末梢血液を正常で健康な志願者から静脈採血により得て、ヘパリン処理した チューブに集めた。ヒストパーク（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）ゝ　（シグマ、セン トルイス）を用いた密度勾配遠心によって末梢血液から前駆細胞を得て、細胞の 単核の層を得た。ヒト造血前駆細胞の集団を含む単核細胞をリン酸塩緩衝食塩水 （Ｐ　Ｂ　Ｓ）で２回洗い、生きている細胞をトリバンブルーによる排除法によ って計数した。

２０％ウシ胎児血清を供与された１０ｍ１のスーパーマッコイズ培地中のおよそ １０７の生育細胞からｅｘ　ｖｉｖｏ培養液を作成した。この実験で増加される 細胞はその元の供与者に再投与されないので、この実験では自己血清の代わりに ウシ胎児血清が使われている点に注意するべきである。７％Ｃ０２，８％０１． ８５％空気の大気中で３７℃で、ペトリ皿中で細胞を培養し増加した。培養培地 は４日目に新しい増殖因子の入ったものに取り替えられた。

増殖因子は表１に従った濃度で培地に添加された：表１ 増殖因子　濃度 ＰＩＸＹ３２１　１１００ｎ／ｍ１ ＳＦ　１ａｇ／ｍ１ ＩＬ−３１１００ｎ／ｍｌ ［Ｌ−１ａ　１１００ｎ／ｍ１ Ｇ−Ｃ３Ｆ　１１００ｎ／ｍｌ 培養液中の前駆細胞は非接着性の傾向を示す。各コロニーアッセイに対して、各 培養液の５０％の非接着性細胞が得られた。遠心により細胞を培地から分離し、 ２回洗浄して、生きている細胞をトリパンブルーによる排除法によって計数した 。

２つのコロニーアッセイを行った。ＧＭ−ＣＦＵアッセイ（ルー（Ｌｕ）ら、Ｅ ｘｐ。

Ｈｅｍａｔｏｌ、　１３：９８９．１９８５　）により前駆細胞集団の骨髄性細 胞を測定し、ＢＦＵ−ｅアッセイ（ルーら、上記）により赤血球性細胞を測定し た。ＰＩＸＹ３２１　（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）若しくはＰＩＸＹ３２１＋エリスロポエ チン（ＢＦＵ−ｅ）の存在下で、生育細胞をメチルセルロースクローニング培地 （テリーフォックスラボ髄性コロニーおよび赤血球性コロニーの数を計数し、こ の数を各ウェルにまいた細胞数で割り、コロニー形成能（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒ ｍｉｎｇ　ｃａｐａｃｆｔｙ；　ＣＦ　Ｃ）の発生率を決定した。ＣＦＣ発生率 に細胞総数をかけて、培養液あたりのＣＦＣ数を決定した。各ＣＦＣ数を０日目 のＣＦＣ数と比較し、試験した各前駆細胞増加用培地についての増加比を決定し た。

骨髄性および赤血球性構成物の細胞増加を培養後４日目と８日目で決定した。

増加数が１ということは、コロニー数の増加がながったことを意味し、一方、増 加数が２ということは、コロニー数が０日目の数から２倍になったことを意味す る。

第１の実験は、マソコイズ培地＋２０％ＦＣ３（ウシ胎児血清）から成り、ＰＩ 　ＸＹ３２１、ＳＦ若しくはＰＩＸＹ３２１とＳＦの組み合わせを供与された造 培地のみ　領　５８　領　７４　０．６３　０．８９ＰＩＸＹ３２１　１．４１ 　２．１９　４．２９　１３．６３ＳＦ　１．５９　０．７６　２．４９　４． ８９ＰＩＸＹ３２１ ＋ＳＦ３，７７　８．３３　１２．６８　２２．６５第１の実験からのデータは 、ＰＩＸＹ３２１とＳＦが骨髄性および赤血球性前駆細胞の増加を改善したこと を示す。ＰＩＸＹ３２１とＳＦの組み合わせは、骨髄および赤血球細胞について 相加的以上の増加を示した。

第２の実験は、造血前駆細胞をＰＴＸＹ３２１、ＳＦおよびＩＬ−１αの存在下 で培養した際の、骨髄性および赤血球性前駆細胞の増加を比較した。本実験では 、培地に加える単核細胞の濃度を第１の実験の１０’細胞／ｍｌから本実験の４ Ｘ１０５細胞／ｍｌに減らした。

培地　０．　８７５　領　３２　３．５０【Ｌ−１α　０．７４　０．２１　１ ．８０ＳＦ　１．３７５　０．４２　４．２６ＰｒＸＹ３２１　２．７０　１． ９０　１９．０１１Ｌ−１α＋Ｓ　１．５０　０．８０　２．１１１Ｌ−１α ＋ＰｒＸＹ３２１　８．１７　３．１２　５．８４ＳＦ＋ＰＩＸＹ３２１　７． ３１　４．４３　３２．６４ＳＦ＋ＰＩＸＹ３２１ ＋ｒＬ−ｉα　５．４０　４．９５　５．２５第２の実験からのデータは、増殖 因子としてＰＩＸＹ３２１のみで増加した時は骨髄性および赤血球性系列の前駆 細胞の増加が見られたが、増殖因子としてＳＦのみ若しくはＩＬ−１αを用いた 場合は増加が見られなかったことを示す。ＩＬ−１α＋ＰＩＸＹ３２１、ＳＦ＋ ＰＩＸＹ３２１およびＳＦ＋ＰＩＸＹ３２１＋１１−１αの増殖因子の組み合わ せは、４日目の骨髄および赤血球系列の両方の前駆細胞数において著しい増加を 提供した、しかし、８日目の結果では、ＳＦ＋ＰＩＸＹ３２１およびＰｒＸＹ３ ２１のみに関してだけ、改善が見られた。

第３の実験は、４日目および８日目の骨髄性前駆細胞の増加を、ＰＩＸＹ３２１ 、ＳＦＳ　［Ｌ−３およびその組み合わせを含む培養液について比較した。

培地　０．　５０　０．　７４ ＰＩＸＹ３２１　２．１８　４．８３ ＰＩＸＹ３２１＋ＳＦ　４．０１　７．０５［Ｌ−３＋ＳＦ　２．６５　４．２ ２ これらのデータは、ＰＩＸＹ３２１とＳＦという増殖因子の組み合わせが、■Ｌ −３とＳＦという増殖因子の組み合わせよりも大きな骨髄性前駆細胞の増加を提 供することを示す。

第４の実験は、４日目および８日目の骨髄性前駆細胞の増加を、Ｐ　Ｉ　ＸＹ３ ２１、ＳＦ、Ｇ−Ｃ８Ｆおよびその組み合わせを含む培養液について比較した。

培地に加えられた単核細胞の濃度は１０６細胞／ｍｌであった。

培地　０．７６　０．８０ ＰＩＸＹ３２１　２．６９　３．９４ ＰＩＸＹ３２１＋ＳＦ　ＮＡ　３．５６ｐｌＸＹ３２１＋Ｇ−Ｃ３Ｆ　５．０２ 　１２．５０ＳＦ＋Ｇ−Ｃ５Ｆ　３．　３６　１．　７９ＰＩＸＹ３２１＋ＳＦ ＋Ｇ−Ｃ３Ｆ　６，３４　３．５７ＮＡはアッセイに問題があったことを示す。

これらのデータは、Ｇ−Ｃ３Ｆとの組み合わせがＰＩＸＹ３２１とＳＦという組 み合わせほど有効ではなかったことを示す。

４つの実験をまとめると、ｅｘ　ｖｉｖｏで培養した前駆細胞の増加を向上させ るために、培地への増殖因子もしくは増殖因子の組み合わせを添加することの有 効性が確証された。

実施例２ 本実施例は、骨髄破壊性の化学療法および本発明による末梢血液前駆細胞の増加 を提供する臨床プロトコールを例示する。この臨床プロトコールは、ＳＦとＰｒ ＸＹ３２１という増殖因子の組み合わせでｅｘ　ｖｉｖｏ増加した末梢血液由来 の（そしてＧＭ−Ｃ３Ｆ補充された）造血前駆細胞を用いた骨髄の造血機能再構 築についての有効性を評価するために考案されている。

以前のいずれの化学療法からも十分に回復した後（白血球数は３０００／ｍｍ３ 以上、血小板数は１００，０００／ｍｍ３以上）　、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　（サルグラ モスチン）を日に２回、５ｍｃｇ／ｋｇ／日の投与量で皮下投与する。ＧＭ−Ｃ ３Ｆ補充増殖因子の６．８および９日目に末梢血液を回収する。一群からのコレ クションについて９リツトル、３時間処理を用いた白血球分離（ｌｅｕｋｏｐｈ ｏｒｅｓｉｓ）を行い、末梢血液から好適な単核細胞コレクションを得て、造血 前駆細胞の集団を作製する。通常、２Ｘ１０’／ｋｇ以上の細胞数が各末梢血液 コレクションから得られる。前駆細胞増加用培地で用いる自己血清も各患者から 得る。

末梢血液から得て白血球分離を行った造血前駆細胞を、コロニー形成活性（ＣＦ Ｕ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＢＦＵ−ｅおよびブラスト細胞）に関してアッセ イし、ＣＤ３４、ＣＤ３３およびＣＤ７に関する表現型を調べる。１０％自己血 清、１１００ｎ／ｍ１ｓＦおよび１１００ｎ／ｒｎｌＰＩＸＹ３２１を入れたマ ッコイズ培地で、ｅｘ　ｖｉｖｏ培養を約５Ｘ１０’単核細胞／ｍｌの細胞濃度 から開始する。培地を４日目と８日目に交換しながら細胞を１２日間培養する。

細胞数、分化状管、前駆細胞としての可能性および表現型について週に３回、細 胞子を除き、１０５から２Ｘ１０’細胞／ｍｌの範囲の濃度で自己血清中で液体 窒素により低温保存する。

各患者は、１日に１時間ずつ３日間続けてシクロホスファミド（１８７５ｍｇ／ ｍ２）を点滴する；３日間連続的にシス−ジアミノジクロロプラチナ（５５ｍｇ ／ｍ２／日；計７２時間にわたり１６５ｍｇ／ｍ２の投与量）を点滴する：そし て細胞減少治療の最終日に６００ｍｇ／ｍ”のＢＣＮＵを５ｍｇ／ｍ”／分の割 合で点滴することから成る、高い投与量の骨髄破壊性の化学治療プロトコールを 受ける。

高い投与量の骨髄破壊性の化学療法の最終日の２日後、各患者に彼、若しくは彼 女の増加した前駆細胞を投与する。細胞を急速に融解し、１０　ｃ　ｃ／分、１ ０６細胞／ｍ＋の割合で静脈に点滴する。細胞は３日続けて等量ずつ投与する。

最後に細胞注入してから約３時間後から始めて、ＧＭ−Ｃ８Ｆを（静脈注射もし くは皮下に）１２ｍｃｇ／ｋｇ／日の量で計７日間投与する。ＧＭ／Ｃ８Ｆはさ らに１４日間、６ｍｃｇ／ｋｇ／日の量だけ（静脈注射もしくは皮下に）投与さ れる。

この処置は、骨髄破壊性の高い投与量の化学療法による抗腫瘍効果の恩恵を、造 血前駆細胞を増加する本発明の方法の能力と組み合わせて、患者の骨髄、造血機 能および免疫学的回復を改善する。

実施例３ 本実施例は、骨髄減少を起こすが骨髄奪格は起こさない、一群の細胞を減少させ るガン化学治療剤を用いた治療によって骨髄毒性が生じた際の、骨髄毒性からの 造血機能の回復のための自己細胞移植法に関する患者治療のスケジュールを例示 する。肺小細胞ガン（ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ； 　Ｓ　ＣＬ　Ｃ）　、結腸ガン、若しくはメラノーマなどの固形腫瘍を持つ患者 を、１００−４０００μｇ／ｍ２／日の量のＳＦ、および５−２５０　ｕ　ｇ／ ｍ２／日の量のＰＩＸＹ３２１で１から７日間、前治療する。前治療の後、末梢 血液を採取し、ケラノンジャー（［ｅｓｓｉｎｇｅｒ）ら、Ｂｌｏｏｄ　７４： １２６０．１９８９に記載されているような白血球分離技術によって造血前駆細 胞を分離する。

前駆細胞を、マッコイズ培地、１０％自己血清、１μｇ／ｍｌのＳＦおよび１０ ０　ｎ　ｇ／ｍ　ＩのＰＩＸＹ３２１中で７−１４日間培養、増加する。培地は ４日毎に交換する。末梢血液由来の前駆細胞を培養している間、患者は、造血機 能回復がない場合に寛容できたはずの量よりさらに５０％まで上乗せした投与量 で、細胞減少療法を受ける。

細胞増加が終了した後、培養した前駆細胞を洗浄して培養培地と増殖因子を除き 、緩衝食塩水に懸濁する。自己血清を供与して、増加した前駆細胞を同じ患者に 再点滴して（自己細胞移植）、高い投与量の細胞減少化学療法からの造血機能回 復に影響を与える。

実施例４ 本実施例は、細胞減少療法によって生じた骨髄毒性からの造血機能回復のための 自己細胞移植に関する患者治療のスケジュールを例示する。５０−３０００μｇ ／ｍ２／日の量のＧＭ−Ｃ３Ｆで１−７日間、前治療する。前治療の後、末梢血 液と骨髄を採取し、造血前駆細胞を分離する。分離した前駆細胞をＳＦとＰＩＸ Ｙ３２１とともに実施例３に記載されたようにして培養する。患者には細胞減少 治療を施し、培養した造血前駆細胞を自己細胞移植で再投与する。

実施例５ 本実施例は、細胞を減少させるガン治療剤による骨髄毒性からの造血機能回復の ための自己細胞移植に関する患者治療の別のスケジュールを例示する。患者治療 のスケジュールは、末梢血液前駆細胞の代わりに骨髄を取る以外は、実施例３の スケジュールに従う。

実施例６ 本実施例は、細胞を減少させるガン治療剤による骨髄毒性からの造血機能回復の ための自己細胞移植に関する患者治療の別のスケジュールを例示する。患者治療 のスケジュールは、骨髄および末梢血液前駆細胞の両方の代わりに骨髄のみを取 る以外は、実施例４のスケジュールに従う。

実施例７ 本実施例は、細胞を減少させるガン治療剤による骨髄毒性からの造血機能回復の ための自己細胞移植に関する患者治療の別のスケジュールを例示する。患者治療 のスケジュールは、末梢血液前駆細胞のみの代わりに骨髄および末梢血液前駆細 胞の両方を取る以外は、実施例３のスケジュールに従う。

実施例８ 本実施例は、造血前駆細胞の移植および増殖を改善するための移植助長用増殖因 子をｉｎ　ｖｉｖｏ投与する前に行う、ｅｘ　ｖｉｖｏ刺激された造血前駆細胞 の自己細胞移植に関する患者治療のスケジュールを例示する。固形腫瘍を持つ患 者をＧＭ−Ｃ３Ｆ　（１０μｇ／ｋｇ／日）もしくはＰＩＸＹ３２１　（１０μ ｇ／ｋ　ｇ／日）で７日間、前治療する。末梢血液（２バインド）もしくは骨髄 を取る。標準的な技術を用いた密度勾配遠心により造血前駆細胞を分離する。分 離した単核細胞を、１０％自己血清、ピルビン酸塩、ペニノリソーストレブトマ インンーグルタミンおよび増殖因子（１００ｎｇ／ｍ１ｓＦおよび１１００ｎ／ ｍ１ＰＩＸＹ−３２１）の入った細胞必須培地で培養し、増加された造血前駆細 胞の培養液を作製する。細胞を、湿った大気（５％Ｃ０２）中で、０．ｌＸＩＯ ３から５Ｘ１０’細胞／ｍｌの間の細胞密度で培養する。培養液には、定期的に 、必要に応じて培地および増殖因子を与える。培養は１から２週間維持される。

培養液中の細胞を回収し、洗浄し、自己血清の入った生理緩衝液に再懸濁する。

およそ１０７から１０９細胞／ｋｇを、細胞減少治療後の１から３日間、患者に 再投与する。

患者は、増加した前駆細胞（細胞調製品）の再投与２日後から始めて７から２１ 日間、移植助長用増殖因子（５０μｇ／ｋｇ／日ＳＦおよび２５μｇ／ｋｇ／日 ＰＩＸＹ３２１）でさらｉｎ　ｖｉｖｏ治療する。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、 ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ．細胞減少治療に先立って患者から造血前駆細胞を取り；ｂ．造血前駆細 胞の増加させた集団から成る細胞調製品を提供するために、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＦ 、ＩＬ−３、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質およびこれらの組み 合わせから成るグループから選択される増殖因子を用いて造血前駆細胞をｅｘ　 ｖｉｖｏで増加させ（但し、ＩＬ−１は必ず他のｅｘ　ｖｉｖｏ増殖因子の少な くとも１つと組み合わせて用いる）；そしてｃ．細胞減少治療に続いて上記細胞 調製品を患者に投与する：ことから成る、細胞減少治療を受ける患者に自己造血 細胞の移植を行う方法。
2. ２．増殖因子がＳＦとＬｅｕ２３Ａｓｐ２７Ｇｌｕ３４ｈＧＭ−ＣＳＦ／Ｇｌｙ ４ＳｅｒＧＩｙ５Ｓｅｒ／Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５Ａｓｐ７０ｈＩＬ−３融合蛋白質 との組み合わせから成る請求項１に記載の方法。
3. ３．ｅｘ　ｖｉｖｏ増殖因子がＩＬ−１αとＬｅｕ２３Ａｓｐ２７Ｇｌｕ３４ｈ ＧＭ−ＣＳＦ／Ｇｌｙ４ＳｅｒＧｌｙ５Ｓｅｒ／Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５Ａｓｐ７０ ｈＩＬ−３触合蛋白質、あるいはＳＦとＩＬ−１αとＬｅｕ２３Ａｓｐ２７Ｇｌ ｕ３４ｈＧＭ−ＣＳＦ／Ｇｌｙ４ＳｅｒＧｌｙｓＳｅｒ／Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５Ａ ｓｐ７０ｈＩＬ−３触合蛋白質との組み合わせから成る、請求項１に記載の方法 。
4. ４．造血前駆細胞を取る前に１−７日間、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＳＦ、ＧＭ −ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質およびこれらの組み合わせから成るグループから 選択される補充増殖因子でｉｎ　ｖｉｖｏに患者を前治療するステップをさらに 含む請求項１に記載の方法。
5. ５．ｅｘ　ｖｉｖｏ増殖因子およびｉｎ　ｖｉｖｏ補充増殖因子がＧＭ−ＣＳＦ ／ＩＬ−３融合蛋白質から成る、請求項４に記載の方法。
6. ６．細胞調製品を患者に投与した後に続いて３から２１日間、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ Ｌ−３、ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質およびこれらの組み合わせか ら成るグループから選択される移植助長用増殖因子でｉｎ　ｖｉｖｏに患者を治 療するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
7. ７．細胞調製品を患者に投与した後に続いて３から２１日間、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ Ｌ−３、ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質およびこれらの組み合わせか ら成るグループから選択される移植助長用増殖因子でｉｎ　ｖｉｖｏに患者を治 療するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
8. ８．移植助長用増殖因子がＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質から成 る請求項７に記載の方法。
9. ９．細胞培養培地、ｅｘ　ｖｉｖｏ増殖因子および自己血清から成り、ｅｘｖｉ ｖｏ増殖因子がＧＭ−ＣＳＦ、ＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ −３融合蛋白質およびこれらの組み合わせから成るグループから選択される（但 し、ＩＬ−１は必ず他の増殖因子の少なくとも１つと組み合わせて用いる）、造 血前駆細胞を増加させるための培地組成物。
10. １０．ｅｘ　ｖｉｖｏ増殖因子がＳＦとＬｅｕ２３Ａｓｐ２７ＧＩｕ３４ｈＧＭ −ＣＳＦ／Ｇｌｙ４ＳｅｒＧｌｙ５Ｓｅｒ／Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５Ａｓｐ７０ｈＩ Ｌ−３融合蛋白質との組み合わせ、またはＳＦとＩＬ−１αとＬｅｕ２３Ａｓｐ ２７Ｇｌｕ３４ｈＧＭ−ＣＳＦ／ＧＩｙ４ＳｅｒＧｌｙｓＳｅｒ／Ｐｒｏ８Ａｓ ｐ１５Ａｓｐ７０ｈＩＬ−３融合蛋白質の組み合わせから成る、請求項９に記載 の造血前駆細胞を増加させるための培地組成物。