JP2007521236A - 癌の治療によって損傷した細胞を補充する方法 - Google Patents

Abstract

癌の治療によって損傷した細胞を補充する方法が開示される。当該方法は、霊長哺乳類から血球細胞を取り出すステップと、取り出した血球細胞の立体構造を維持し、細胞間のサポート及び細胞間構造を維持したままで、血球細胞を７日以内に少なくとも７００％の膨張倍率を成す率で制御して膨張するステップと、血球細胞から毒性物質を取り除くステップと、霊長哺乳類が造血細胞または他の細胞の喪失により減少した可動性を被るのを防止するのに十分な時間内で霊長哺乳類に細胞を戻すステップとを有する。

Description

本発明は、癌の治療によって損傷した細胞を補充する方法に関する。

癌の治療において化学療法を使用する最もひどい副作用の一つは、赤血球の損失により患者のエネルギーが不足することである。癌細胞を破壊するプロセスにおいて、化学療法は、頻繁に、骨髄細胞などの他の迅速な分割する細胞に損傷をもたらす。骨髄は、赤血球、白血球及び血小板の生成を担っている。骨髄の抑制された能力は、骨髄抑制と呼ばれる。化学療法及び放射線は、赤血球数を低レベルに抑制して、結果として、疲労感をもたらし、活力を失い、貧血症を引き起こす。骨髄抑制は、最も効果が高い化学治療薬の投与量制限毒性である。近年、この制限は、ＳＣ移植（ＳＣＴ）の利用によって克服された。実際に、高い投与量の化学療法の後、実行されるＳＣＴは投与濃度の更なる段階的拡大を許容し、したがって、多くの進行した悪性疾患患者の生存を増大する。しかしながら、ＳＣＴによって治療される大部分の患者は、増加した罹患率及び死亡率に結果としてなる長期にわたる好中球減少および血小板減少を経験する。

一部の患者によって、癌の一番の副作用とされる疲労は、７２％〜９５％の癌患者の疾患の一部である。慢性病患者または急性患者の幾人かはそれを“壁にぶち当たる”と評し、癌患者によって経験される疲労は健常な人々の疲労と異なる。それは衰えさせて、低下させることであり、それは通常の活動に影響をもたらし、なおかつ、それは人の生命の享受に対する障害である。国立癌研究所は、疲労の社会的意味を潜在的に“重大である”と述べている。

治療がより積極的になって、骨髄抑制を悪化させて、なおかつ、健康の専門家が骨髄抑制を治療の投与量制限毒性で、定量化可能な扱いやすい副作用として承認したので、長期の疲労困憊は、より顕著になった。それは調査の深刻な主題として現れており、それは生化学的、病態生理学的、心理学的、及び行動的な変数を含む。残念なことに、医学が癌の治療において安定して発達する一方、癌に関連した疲労は、しばしば見逃され、過小認識されて、治療されていない。消耗したと感じる不快感とは別に、疲労は、癌に対処して利用できる処置の完全な有益性を得ることに対する多くの障害となる。疲労は、患者の生活の質に関して相当の影響を及ぼし、投与され得る化学療法の回数を制限し、概して処置の効果を制限する。

過去において、癌の処置と関連する疲れの好ましい処置は、エポエチンアルファ（epoetin alfa）（Ｐｒｏｃｒｉｔ）のような薬物が投与されるか、または症状が重篤の場合は赤血球が輸血されていた。

例えば、エポエチンアルファなどの現在利用可能な薬物のいずれも、化学療法による疲労の完全な解消を提供しない。薬物がある問題を減らして、ある程度に緩和する一方で、薬物はまた副作用があり、それが患者の新たな一連の問題をもたらす。同様に、概して患者が疲労での最悪の状態で苦しんだ後に、赤血球の輸血が投与される。

したがって、癌治療を受けている患者にとって良好な生活の質を提供するために、化学療法または放射線に関連する疲れを最小限にする必要がある。

本発明は、霊長哺乳類から血球細胞を取り出すステップと、取り出した血球細胞の立体構造を維持し、血球細胞の細胞間サポート及び細胞間構造を維持したままで、血球細胞を７日以内に少なくとも７倍の膨張倍率を成す率で制御して膨張するステップと、血球細胞から毒性物質を取り除くステップと、霊長哺乳類が造血細胞または他の細胞の喪失により減少した移動性を被るのを防止するのに十分な時間内で霊長哺乳類に細胞を戻すステップとを有する、癌の治療によって損傷した細胞を補充する方法である。癌の治療による損傷は、骨髄移植、化学療法、または放射線による。好ましくは、細胞を戻すことはむしろ短期間内においてなされ、好ましくは、癌治療後一週間以内であり、癌治療後、遅くとも一ヶ月以内でなければならない。

本発明において、コロニー形成単位（ＣＦＵ）−顆粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）及びＣＦＵ−顆粒級−マクロファージ−赤血球−巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の数は、７日でそれぞれ約７倍と約９倍に増大し、バースト形成単位−赤血球（burst-forming units-erythroid）（ＢＦＵ−Ｅ）の数は５日で培養液の約２．７倍に増大する。ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ１５＋及びＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋を発現する細胞数の著しい増大と、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−及びＣＤ１９表面抗原を発現する細胞数の著しい減少が生じる。

組換え造血成長因子は、臨床医に化学療法によって誘発された骨髄抑制で患者を治療するための有用なツールを提供した。それらの因子は、好中球減少症の期間を短くし、重篤な感染症の発病率を低下させる、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの脊髄成長因子を含む。

本発明の目的は、癌の治療によって損傷した細胞を補充する方法を提供することである。

本発明の別の目的は、癌を化学療法または放射線で治療された患者の疲労を軽減するための方法を提供することである。

本発明の上記及び他の目的並びに利点は、下記の好ましい実施態様の記載から明らかとなる。

本発明は、以下に記載の好ましい実施態様によって、より完全に記載される。

本発明の好ましい実施態様において、造血細胞は、化学療法に先立って癌患者から取り出される。血球細胞は、現在、多分化能な成体幹細胞と呼ばれている。血球細胞は、本明細書に参照として組み込まれている、米国特許第５，７０２，９４１号明細書に記載されるようなバイオリアクターに配置される。バイオリアクター管は、血球細胞の立体構造、血球細胞の細胞間サポート及び構造を維持するように、血球細胞の懸濁を提供するための速度で回転される。細胞がリアクターにある間、細胞に栄養分が供給され、毒性物質は除去される。細胞は、元の細胞よりも実質的に大きい体積まで膨張される。次いで、患者に化学療法が処置される。

本発明の別の実施態様において、末梢血球細胞（ＰＢ）は、通常の幹細胞（ＳＣ）ドナーから得られる。要約すると、単核細胞（ＭＮＣｓ）は、ＳＣドナーから収集されたファーストアフェレーシス産物（first apheresis product）から得られる。アフェレーシスに先立ち、各ドナーは３日間にわたって１２時間ごとにＧ−ＣＳＦ６ｇ／ｋｇで処置されて、４日目に一度だけ処理される。単核細胞は、各ドナーの総血液量をＣｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ細胞セパレータなどのセパレータによる３回の連続した流れの白血球搬出法によって収集される。

実施方法
Ａ）細胞の収集及び維持
収集された単核細胞（０．７５ｘ１０^６cells/ml）は、２０％の胎児の子牛血清（ＦＣＳ）（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＣｌｅａｎ、ＶＡ）、５％ヒトアルブミン（ＨＡ）、または２０％ヒト血漿のいずれか、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧ−ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ， ＣＡ）および１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）（Ａｍｇｅｎ）が補充された、Iscoveの修正されたDulbeccoの培養液（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）に懸濁される。培養混合液は、３００ｍｌまたは５００ｍｌのＬｉｆｅ Ｃｅｌｌ 非発熱性のプラスチック袋（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）に注入され、５％ＣＯ_２の雰囲気下において３７ＥＣで湿式インキュベーターに配置された。培養袋は毎日検査される。２、５、６及び７日目に、各培養液は混合されて、サンプルは吸い出されて、トリパン−ブルー（trypan-blue）除外試験を用いてカウントされた。バック内の細胞の濃度が０．７５ｘ１０^６cells/mlを超える場合、細胞濃度を０．７５ｘ１０^６cells/mlに調整するために、２０％ＦＣＳ、５％ＨＡまたは２０％ヒト血漿のいずれか、１００ｎｇ／ｍｌの組換えＧ−ＣＳＦ、および１００ｎｇ／ｍｌＳＣＦが補充されたＩＭＤＭは、バック内に注入される。

Ｂ）造血コロニー形成細胞の分析
造血コロニー形成細胞は、既に記載したアッセイの変形を用いてアッセイされる。要約すると、１０^５の単核細胞は、ＩＭＤＭ、３０％ＦＣＳ、１．０％Ｕ／ｍｌのエリトロポエチン（Ａｍｇｅｎ）、５０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）及び５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（Ａｍｇｅｎ）を有する０．８％メチルセルロースに培養される。次いで、各培養混合液の１ミリリットルのアリコートは、３５ｍｍのペトリ皿（Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）に配置され、５％ＣＯ_２の湿った雰囲気下において３７ＥＣで複製してインキュベーションされた。すべての培養は、バースト形成単位の赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）群体（５００よりも多いヘモグロビン化細胞（hemoglobiinized cells）または３以上の赤血球のサブコロニーの凝集として定義）の数、顆粒細胞若しくは単球−マクロファージ細胞又は両者のコロニー形成単位の顆粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）コロニーの数、及びすべての要素を含んでいるＣＦＵ−顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の数において、７日後に評価された。個々のコロニーは、マイクロピペットで培養液から採取され、細胞の構成のために分析された。

Ｃ）リンパ球の分析
リンパ球は、下記の抗体の組合せ：ＣＤ５６＋ＣＤ１６−ＰＥ／ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰＥ／ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰＥ／ＣＤ８−ＦＩＴＣ、ＣＤ１９−ＰＥを使用して２色染色によって分析された。コントロールは、イソタイプのＩｇＧ１−ＰＥ／ＩｇＧ１−ＦＩＴＣと、ゲートのためのＣＤ１４−ＰＥ／ＣＤ４５−ＦＩＴＣを含む。始原細胞は、下記の抗体の組み合わせ：ＣＤ４５／ＣＤ９０／ＣＤ３４、ＣＤ４５／ＣＤ３４／ＣＤ３８、ＣＤ４５／ＣＤ３４／ＣＤ３３、及びＣＤ４５／ＣＤ３４／ＣＤ１５を用いて、蛍光色素ＰｅｒＣＰ／ＰＥ／ＦＩＴＣでの３色染色によって解析される。ＣＤ４５／ＩｇＧ１／ＩｇＧ１はコントロールとして使用される。要約すると、各ドナーからの１０^６の細胞は、暗所で１５分間２〜８ＥＣにおいて１０：１の抗体でインキュベーションされ、次いで、リン酸塩緩衝液で２回洗浄された。次いで、細胞は再懸濁され、１％ホルムアルデヒドで固定され、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（べクトンディッキンソン）が装備されたＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（べクトンディッキンソン）で解析された。リンパ球の解析のため、１００００細胞が各試験管から得られ、前方の直角光散乱パターンに基づいてゲート制御された。カットオフポイントは、イソタイプのコントロールによって明らかに呈される、バックグラウンドより高いレベルで視覚的に設定される。始原細胞の分析のため、各試験管から７５０００細胞が得られ、次いで、順次ゲート制御される。

Ｄ）造血コロニー形成細胞の増加
この組織培養システムでのドナーの末梢血球細胞のインキュベーションは、造血コロニー形成細胞の数を著しく高める。ＣＦＵ−ＧＭ（７倍まで）及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ（９倍まで）のコロニー形成細胞の数の一定の増加は、明らかなプラトーはなく７日間まで観察された。

Ｅ）ＣＤ３４＋細胞の増加
この組織培養システムで通常のドナーからの単核細胞のインキュベーションは、ＣＤ３４＋細胞の数を著しく高める。ＣＤ３４＋細胞の平均数は、６日の培養で１０倍までに高まり、同じ日にプラトーになった。脊髄血統標識ＣＤ１５及びＣＤ３３を共に発現するＣＤ３４＋細胞の相対的な数は、５日と６日で相当に高くなる。

化学療法の一週間で、膨張された細胞は身体に戻され、それによって、身体が化学療法によって引き起こされる疲労を克服するために、補充された細胞の充分なレベルを維持することができる。

本発明の好ましい実施態様を上述したが、他の変更が本発明の範囲内でなされ得ることが当業者によって認識されるであろう。

Claims (13)

1. 癌の治療によって損傷した細胞を補充する方法であって、該方法は、霊長哺乳類から血球細胞を取り出すステップと、該取り出した血球細胞の立体構造を維持し、血球細胞の細胞間サポート及び細胞間構造を維持したままで、該血球細胞を７日以内に少なくとも７倍の膨張倍率を成す率で制御して膨張するステップと、該血球細胞から毒性物質を取り除くステップと、該霊長哺乳類が造血細胞または他の細胞の喪失により減少した移動性を被るのを防止するのに十分な時間内で該霊長哺乳類に該細胞を戻すステップとを有する方法。
2. 前記癌のための処置は、骨髄移植であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記癌のための処置は、化学療法であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記癌のための処置は、放射線であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記膨張した血球細胞を戻すステップは、前記癌の処置の一ヶ月以内になされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記膨張した血球細胞を戻すステップは、前記癌の処置の一週間以内になされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 癌の治療によって損傷した細胞を補充する方法であって、該方法は、霊長哺乳類から末梢血球細胞を取り出すステップと、該取り出した細胞の立体構造を維持し、血球細胞の細胞間サポート及び細胞間構造を維持したままで、該細胞を膨張するステップと、該末梢血球細胞から毒性物質を取り除くステップと、該霊長哺乳類が造血細胞または他の細胞の喪失により減少した移動性を被るのを防止するのに十分な時間内で該霊長哺乳類に該細胞を戻すステップとを有する方法。
8. 前記霊長哺乳類はヒトであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 前記癌のための処置は、骨髄移植であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
10. 前記癌のための処置は、化学療法であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
11. 前記癌のための処置は、放射線であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
12. 前記膨張した血球細胞を戻すステップは、前記癌の処置の一ヶ月以内になされることを特徴とする請求項７に記載の方法。
13. 前記膨張した血球細胞を戻すステップは、前記癌の処置の一週間以内になされることを特徴とする請求項７に記載の方法。