JPS6030293B2 - 人顆粒球の分化増殖を促進する加熱処理ｈｇｉｇｐ及びｈｇｉｇｐの加熱処理方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、「健康な人の尿から分離された人骨髄中の骨
髄細胞に作用してこの細胞の額粒球への分化増殖を促進
する糖蛋白質」（以下ＨＧＩＧＰと記載する）を含有す
る水溶液を、アルプミンの存在下及びＰＨ５〜９にて５
０〜７０ｏｏの温度で８〜３畑時間加熱処理することに
よって得られる物質（以下処理物質と記載する）及びＨ
ＧＩＧＰを含有する水溶液に混入することが危・漠され
るウイルスを不活化するために該水溶液を加熱処理する
方法に関する。

ＨＧＩＧＰは、人只に 里に り、人の骨髄細胞に作用して、顎粒球のみを分化増殖せ
しめる機能（以下生物活性と記載する）を有する。

この物質は先に本発明の共同研究者が人尿から純粋に分
離精製し、その物質の特定を行ない、再現性ある製法に
よる製造を可能とし、人の白血球減少症治療剤としての
用途を見出し特許出願した（特願階５３−３１９９９）
ものである。しかし人尿中には肝炎・風土病等のウイル
スが存在していることが知られており、人尿から製造し
た医薬品をウイルスの除去又は不活性化処理を施さない
まま医薬として人に投与した場合、ウイルス感染症に確
患するおそれがある。このような危険を回避するため、
通常は免疫学的測定法で予めウイルスを測定し、高濃度
にウイルスを含有する原料を除外することによりある程
度のウイルス感染症の防止効果をあげている。

しかしこの方法は数万人分の尿を一度に取扱う工業的製
法においては採用できない。血数を分画して得られる人
血清蛋白製剤についてもウイルス感染症の問題は包含さ
れている。

しかし特にァルブミン製剤について６０こ○、１餌時間
の加熱処理を施すことにより、アルブミンを変質させる
ことなくウイルス感染症を阻止し得ることが見出され、
その後ァルブミン製剤にはこの加熱処理が施され、安全
に臨床使用されている。このように６０ｑｏ、１餌時間
加熱処理を施した製剤が投与後ウイルス感染症の防止に
有効であることが判明して以来、この方法は他の人血清
蛋白製剤にも応用されている。

６０００、１ｍ時間の加熱処理の方法を応用できる物質
は、この処理に対して物質自体が安定でなければならな
い。

そこでこの加熱処理を可能とするために各種の安定化剤
が見出され、安定化剤なしでは加熱処理に耐え得ないが
、安定化剤の存在下では加熱処理を可能となし得る物質
がある。一般に人血清蛋白の安定化剤としてはアミノ酸
や糖類などが生理的等張或はそれ以下の濃度で用いられ
ている。ＨＧＩＧＰを含有する製剤の場合にもこの６０
００、１畑時間の加熱処理を行なうことはウイルスを不
活化するために望ましいことであるが、この処理を行な
うことにより、ＨＧにＰの生物活性をも低下させる。

そこで本発明者等は、ＨＧＩＧＰの加熱安定性を高める
ための、安定化剤および加熱条件の研究を重ねた結果、
ＨＧＩＧＰの水溶液を加熱処理するにあたり、該水溶液
にアルブミンを添加し、更にｐＨを５〜９に調整するこ
とにより、ＨＧＩＧＰが加熱に際し著しく安定化される
ことを見出し、本発明を完成した。本発明は、ＨＯＩＧ
Ｐを含有する水溶液を、人血清又は人胎盤由来アルブミ
ンの存在下及びＰＨ５〜９において、ウイルスを不活化
するための加熱処理を施こした物質及びＨＧＩＧＰの加
熱処理方法に関する。

本発明に使用するＨＧＩＧＰの典型的な製造法は、次の
とおりである。

健康な人から集めた新鮮な尿に希薄な酸又はアルカリの
水溶液を加え、ｐＨを６〜９好ましくは７〜８に調整し
、次いで遠心分離して尿中に含まれている不溶物を除去
する。ここに得られる尿の上情をケイ素を含有する吸着
剤、例えばシリカゲル、シリカゲルーケィ酸マグネシウ
ム、珪磯土、シリカガラス、ベントナイトなどに接触さ
せ、吸着成分を溶出させる。溶出は好ましくはｐＨ９以
上のアルカリ水溶液で行なう。溶出に用いるアルカリ水
溶液は、特に限定されるものではないが、好ましくは水
酸化アンモニウム、水酸化ナトリウムなどの０．３〜１
．９Ｍ濃度の水溶液を使用する。この様にして得られた
熔出液のｐＨを７−８に調整し中性塩例えば硫酸アンモ
ニウムを７０％飽和に加えて有効物質を塩折しＨＧＩＧ
Ｐを含む粗分画を得る。次にこの粗分画を少量のアルカ
リ水溶液に溶解し、分子分別フィルターで分子量１００
００以下の低分子成分を除去し、陽イオン交換体（例え
ば、カルボキシメチル交換基、結合デキストラン、カル
ボキシメチルセルロース、ホスフオセルロース）と接触
させ、溶液中に含まれている不純物を吸着せしめ除去す
る。

接触はほぼ中性に於て行なわれ、ＨＧＩＧＰ粗分画及び
イオン交換体は、ｐＨ６一８に、好ましくは０．０１〜
０．１９ Ｍの無機塩緩衝液によって調整される。この
際ＨＧＩＧＰの大部分は通過する。これを濃縮してから
ｐＨ６〜８の希薄な緩衝液と平衡させ、平衡化した陰イ
オン交換体（例えばＤＥＡＥ セルロース）と接触させ
、ＨＧＩＧＰを吸着させ、０．１〜０．３Ｍの無機塩例
えば塩化ナトリウム溶液を用いて塩濃度を変化させ、い
わゆる直線濃度匂配溶出法により港出させる。この際Ｈ
ＧＩＧＰは０．１Ｍ以上の塩濃度で溶出するが、完全な
分離は困難である。この０．１〜０．３Ｍの塩濃度によ
る溶出分画を集め、要すれば脱塩及び濃縮する。尚、こ
の塩濃度を変化させて溶出させる工程の前に、ＨＧＩＧ
Ｐを陰イオン交換体に吸着せしめ、０．１〜０．３Ｍの
塩濃度の水溶液で溶出させ、精製してもよい。

更に前記分画を分子筋クロマトグラフィーの目的で、１
０〜２０の上／夕の水吸収度を有する高架橋度重合ゲル
、例えばセフアデツクスＧ−１５０、バイオゲルＰ−１
００を充填したカラムに通液して分画中の有効物質を０
．０５〜０．１モルの塩類緩衝液にて展開せしめ、相対
溶出液量が１．１１〜１．６０、望ましくは１．１１〜
１．４５である分画を分別し、脱塩し濃縮又は凍結乾燥
を行なう。

このようにして得られたＨＧＩＧＰを含有する粗製物は
医薬として使用することができる。

相対熔出液量とはＶｅ／Ｖｏの比で表わされる数値であ
る（Ｖはカラム内の物質を溶出するに必要な溶媒の液量
を示し、Ｖｏはカラム内のゲル粒子外部の溶媒の液量を
示す。

）上記粗製物を更に精製するには、粗製物を１．０〜２
．０Ｍ塩を含有する希薄な緩衝液例えばリン酸塩緩衝液
（冊６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．０〜７．０）
に溶解させ、あらかじめ該緩衝液で平衡化させた糖親和
性吸着体例えばコンカナバリンＡ−セフアロース砥（フ
ァイン ケミカル ラボラトリ−社製）にＨＧＩＧＰを
吸着せしめ、ついで２０のＭから１００ｍＭの糖類、例
えばＱ−メチル−Ｄーグルコシドなどを含む１．０〜２
．０Ｍ塩添加緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０、好ましくは
ｐＨ６．０〜７．０）で溶出させ、ＨＧＩＧＰ分画を集
め、必要により脱塩し濃縮又は凍結乾燥を行なう。

更にここに得られた分画を電気泳動的に純化する目的で
、支持体として例えばアクリルアミドゲル、寒天ゲルｐ
Ｈ７．０〜９．０を用いる調製用ゾーン電気泳動にかけ
、冷却下で希薄塩溶液により支持体からＨＧＩＧＰを回
収し、脱塩し濃縮又は凍結乾燥を行なう。

このようにして得られたＨＧＩＧＰは、白色乃至はかす
かに褐色を呈し、無味、無臭であり、わずかに吸湿性を
示す粉末であって、次に記載する理化学的特徴を有する
。

尚、次の理化学的特徴を決定するための試料には実施例
１の精製ＨＧＩＧＰの製法により製造した精製ＨＧＩＧ
Ｐを用いた。

‘１） 分子量 本発明のＨＧＩＣＰをドデシル硫酸ナトリウム・ポリア
クリルァミドゲル電気泳動法により、分子量を測定した
ところ、約８５０００であった。

又、セフアデツクスＧ−１５０によるゲル炉週の結果で
は、ＨＧＩＧＰの分子量は７５０００から９０，０００
であった。従ってＨＧＩＧＰの分子量を７５０００〜９
００００とすることが最も信頼度の高い範囲と思われる
。■ 溶解性 ＨＧＩＧＰの各種溶剤に対する溶解性は、第１表の通り
である。

・ この他、希薄な塩溶液、例えばリン酸塩溶液、トリスア
ミノメタン溶液に容易に溶解し、希薄塩類溶液の柵１〜
１２の範囲で溶解する。

‘３｝ ＰＨＨＧＩＧＰＩ％水溶液のｐＨ‘ま５．０〜
６．０であり、酸性を示す。

‘４｝ 比旋光度 ＨＧＩＧＰの０．２５％水溶液を用いて、２０℃で旋光
度を測定し、比旋光度〔Ｑ〕容を求めた結果、０〜士４
０の範囲であった。

‘５｝ 赤外線吸収スペクトル ＨＧＩＯＰのＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトル
は、第１図に示す如くである。

ＨＧＩＧＰは第２表に示すように特徴的な吸収値を有す
る。

１２表 【６）等露点 ポリアクリルァミドゲル等電点電気泳動法（ｐｏｌｙａ
ｃｒｙｌ ａｍｉｄｅ 鱒ｌ ｉｓｏｅｌｅｃ
ｔｔｉｃｆｏｒｃｍｓｓｉｎｇ）によりＨＧＩＧＰの等
露点を測定した結果、等霞点は飴４．７±０．２であっ
た。

‘７｝ 呈色反応ＨＧＩＧＰを水に溶解したものについ
て呈色反応を試験した結果を第３表に示す。

３ 職 温度安定性 ＨＧＩＧＰを１％（重量）の濃度で水に溶解し、６０Ｃ
Ｏ±３０分間加熱したところ、そのＣＳＦ清曲ま完全に
矢なわれた。

（９’ 蛋白質部分の構成アミノ酸 ＨＧＩＧＰを常法により加水分解し、その蛋白質部分の
アミノ酸構成をアミノ酸自動分析装置を用いて分析した
。

その結果を第４表に示す。第４第４表より、ＨＧＩＧＰ
の蛋白質部分は１万蚤のアミノ酸から構成され、酸性ア
ミノ酸と中性アミノ酸が多量に存在し、塩基性アミノ酸
は極めて少量である。

また、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、ダルタミ
ン酸、グリシン、アラニン、バリンならびにロイシンの
直鎖状アミノ酸が全アミノ酸の７０％以上を占めること
も特徴である。皿 電気炎動 いｅｍ血の方法（Ｎａｔｍｅ、２２７巻、６８０頁、１
９７０王）に従い、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアク
リルアミドゲルを用いた露気泳動により、相対移動度０
．２５の位置に単一バンドを示す。

ＨＧＩＧＰトリプシンィンヒビタ‐（分子量２１５００
）、オボァルブミン（分子量４３０００）、人血清アル
ブミン単量体（分子量６５０００）及び人血清ァルブミ
ン２量体（分子量１３００００）を同時に泳動させ、こ
れらの分子量既知の物質の相対移動度とＨＧＩＧＰのそ
れとからＨＧＩＧＰの分子量を求めた結果約８５０００
であった（第２図）。第２図においてａ，ｂ，ｃ，ｄは
それぞれトリプシンィンヒピタ一、オボアルプミン、人
血清アルブミン単量体及び人血清アルブミン２量体を示
し、矢印は、ＨＧＩＧＰを示す。（１１）紫外線吸収 ＨＧＩＧＰの０．１％水溶液を１弧のセルで測定した紫
外線吸収スペクトルは第３図に示すとおりであり、２８
仇のに極大吸収を示し、２５仇仇以下の波長で末端吸収
を示した。

又、ＨＧＩＧＰの２８仇ｍにおける吸光値（Ｅ士鎌）は
３．８であった。（１２）糖質部分の構成糖 中性糖をフェノール硫酸法、シアル酸を Ｗａｎｅｎのチオバルビッール酸法（Ｊｏｍ岬ｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３４巻
、１９７１頁、１９５９年）、ア ミ ノ 糖をＥ１ｓ
ｏｎ− Ｍｏｒｇａｎ法（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａＩ Ｊ
ｏｍＭ１、２７巻、１８２４頁、１９３３年）により定
着した。

そして中性糖の量は、グルコース換算量として表わした
。その結果、中性糖１０．０〜１３．０％、シアル酸３
．０〜７．０％、アミノ糖１．０％以下であり、合計の
糖質量は、１３．０〜２０．０％であった。（１３）蛋
白質と糠質の構成比率 蛋白質をセミミクロケールダール法により定量した結果
７５〜８５％であり、前記（１２）記載のように糠質の
量は１３．０〜２０．０％である。

（１山 元素分析元素分析の結果は次のとおりである。

炭 素 ４２３〜４７３％水
素 ５７〜７．８％窒 素
側〜１４３％酸 素
３４４〜３９４％イオウ
０．２％以下以上詳記した理化学的
特性を有するＨＧＩＧＰは、人類粒球の分化増殖を促進
する作用を有する。

本発明において使用するＨＧＩＧＰ含有水溶液中のＨＧ
ＩＧＰ精製の程度は特に限定されるものではない。

又加熱処理する水溶液中に含まれるＨＧＩＧＰの濃度は
０．１％（Ｗ／Ｖ 以下同じ）以上、より好ましくは０
．５〜１５％である。

そして水溶液に酸又はアルカリ水溶液、より好ましくは
緩衝液を添加し、ｐＨを５〜９、望ましくは６〜８に調
整する。本発明において使用する人血清又は人胎盤由来
のァルブミンは公知の方法に従って医療用に精製された
ものであり、その純度は霧気泳動法で分析して８０％以
上がアルブミンであるものが好ましい。

これらのァルブミンの添加量は蛋白質として、最終濃度
２％以上、望ましくは１０〜２０％である。この添加量
の上限は特に限定されないが最終製品へのアルブミンの
混入比率の関係から選択される。加熱温度は５０〜７０
２０、より好ましくは５５〜６５『０、加熱時間は８〜
３世時間、より好ましくは８〜１２時間である。このよ
うにして加熱処理されたのち、精製されたＨＧＩＧＰを
使用した場合には、除菌処理し、容器に分注し、凍結乾
燥し、製剤とする。

粗製のＨＧＩＧＰを使用した場合には、さらに精製する
こともできる。ＨＧＩＧＰ製剤中に含まれるアルプミン
はＨＧＩＧＰの保存安定性をも高める。本発明の処理物
質を含有する製剤を使用するにあたっては、滅菌生理食
塩水、滅菌水、無菌の注射用等張液等を加えて溶解し、
静脈注射、筋注射、皮下注射により白血球減少症患者に
投与される。

有効投与量は１日体量ｌｋ９当りＨＧＩＧＰとして０．
７５の９以上、望ましくは０．７５〜２．２４雌である
。本発明は加熱安定剤として人由来アルブミンを用いる
ものであるから、抗原性物質が製剤中に混入する危険性
がなく、きわめて有効にＨＧＩＧＰに対する加熱安定化
を可能にする。さらにアルブミンは糠蛋白質製剤の保存
中の安定性をも保持するものであるから、アルブミンの
添加量を選択することにより処理後にこれを除去する必
要がない。それ故に本発明の加熱処理法はきわめて効率
的にＨＧＩＧＰの製造工程に組込むことができ、ウイル
ス不活化処理工程を含む工業的製法として大きな効果を
有する。又、本発明の処理物質は、活性なウイルスが爽
雑する危燥がないので、人尿から得られた医薬品として
ウイルス感染症の心配のない安全な白血球減少症治療剤
として使用される。〔実験１〕本発明の加熱効果を検討
するため、ＨＧＩＧＰ製剤に含まれる可能性が危倶され
る各種ウイルスの感染症について、ァルブミンの添加に
よる加熱効果を実験した。

実施例１と同様の精製ＨＧにＰの製法を１の【当り１０
０の９の割合で水に熔解した溶液を調製し、これに痘燈
ウイルス、おたふくかぜウイルス、はしかウイルス、水
泡性口内炎ウイルス、チクングニアウィルス、日本脳炎
ウイルス、風疹ウイルス「ポリオウイルス、コクサツキ
ーウイルス、エコーウイルスを各々１／１０量のウイル
ス浮遊液（１×１び〜１×１ぴ／０．２の‘のウイルス
感染価を有する：測定法は後記）として加え、さらに人
血清アルブミン（シグマ社製）を０、２い１０リ２００
のタ′偽添加し、０．１Ｍトリスー塩酸緩衝液を加え、
ｐＨを７．０に調整した。

次いでこの水溶液を６０００で１０時間加熱し、のち直
ちに氷水で冷却し、以下実施例１と同様の方法で処理し
、凍結乾燥粉末を得た。そしてこれらの粉末の生物活性
及びウイルスの感染性を次の方法で測定した。生物活性
の測定は、ｉｎｖ中ｏにおけるマウス骨髄細胞の顎粒球
のコロニー形成をパラメーターとして行なった。

すなわち、直径３５側のプラスチック培養皿に２０％牛
胎児血清、ＨＧＩＧＰ濃度が同一になるよう調整した０
．１の‘の試料、０．３％寒天及び７．５×１ぴ個のマ
ウス骨髄細胞を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ渚地を加え、全
量を１の‘に調整し、７日間５％Ｃ０２を含む湿潤した
空気中で培養した。培養後、倒立顕微鏡下で検鏡し、５
Ｍ固以上の細胞集塊をコロニー数としてて計測した。尚
、加熱処理前の額粒球コロニー数に対する加熱処理後の
それの百分率を算出し、生物活性回収率として表わした
。ウイルスの感染価は、次の細胞を用いて測定した。

痘損ウイルスはＨｅＬａ細胞で継代し、同細胞でフオー
カス形成単位（Ｆｏｃｕｓ位ｒｍｉｎｇｕｎｉｔ：Ｖｉ
ｍｌｏｇｙ、３母蓋、１７４〜１７９頁、１９６８王）
を測定した。おたふく風ウイルス、はしかウイルス、日
本脳炎ウイルスの継代にはＶＥＲＯ細胞を、そしてポリ
オウイルス、コクサツキーウイルス、エコーウイルスの
継代にはＨｅＬａ細胞を用い、これらの感染性は、それ
ぞれの細胞を用いウイルスによる細胞変性を目安に５０
％組織培養感染価（５０％ｔ；ｓｓｕｅｃｕｌｔｍｅｆ
ｎｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅ：国立予防衛生研究所学友会
編、「ウイルス実験学」、丸善、１９６７年）を求めた
。この場合、観察はいずれも１０日間行なった。水泡性
口内炎ウイルスはＦＬ細胞、チクングニアゥィルスはＶ
ＥＲＯ細胞を用いて継代し、感染価はそれぞれの細胞を
用いてブラック形成単位（ｐｌａｑ肥ｆｏｒｍｍｇ、ｕ
ｎｉｔ：前記「ウイルス実験学」）を測定した。

風疹ウイルスはＢＨＫ−２１細胞で継代し、ＶＥＲＯ細
胞を用いてブラック形成単位を測定した。その結果を第
５表に示す。

第５表 第５表から明らかなように、６０３０１独特間加熱後に
は、アルプミンの添加、非添加に係わらず、各試料とも
ウイルス感染性が完全に失われていた。

この結果は用いたウイルス以外のウイルスについても本
発明の加熱処理が施されるならば感染性は失活させうる
ことを示唆するものである。また、ァルブミンを添加し
た試料では、ＨＧＩＧＰの生物活性が失われず、フルブ
ミン添加の効果は、有意であった。尚、他の加熱条件で
実験１と同様の試験を行なったが、実験１と同一の結果
が得られた。次にＨＧＩＧＰ水溶液にアルブミンを添加
した溶液のｐＨを変更した場合につき、加熱処理による
生物活性の変化を試験した。

〔実験２〕 実施例１と同様の精製ＨＧＩＧＰの製法により得た精製
ＨＧＩＧＰを１の上当り２０雌の割合で水に溶解した水
溶液を調製し、この水溶液に人血清アルブミン（シグマ
社製）を１００柵／奴の割合で添加した。

そしてこの溶液のｐＨを次のようにして２〜１０に調整
した。ｐＨ２〜６については０．１Ｍクエン酸−リン酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ７〜１０については０．１Ｍト
リスー塩酸緩衝液を該溶液に加え各々調整した。各試料
を６０ｑ０１脚時間加熱し、加熱後の生物活性の残存を
前記実験１と同様の方法で測定して試験した。ただし生
物活性の回収率を、未加熱のＨＧＩＧＰ水溶液の額粒球
コロニー数に対する加熱後の各試料のそれの百分率で表
わした。その結果は第６表に示す通りであり、溶液のｐ
Ｈが５〜９においてＨＧＩＧＰは、その生物活性を有意
に残存し、ＨＧＩＧＰの水溶液のｐＨを５〜９に調整す
ることが必須であることを示した。第６表 実施例 １ 健康な人から集めた新鮮な尿４００とに１０％水酸化ナ
トリウムを加えてｐＨを８に調整し０℃に冷却しながら
１５００仇．ｐ．ｍで連続遠心分離機で遠心し不溶物を
除去し、上清を得た。

次にこの上情を１０％塩酸でｐＨを７とし、シリカゲル
を充填したカラム（１０×８０肌）に通液し、シリカゲ
ルに吸着された成分を５％アンモニア水４０そでカラム
から溶出した。

このようにして得られた溶出液を１規定の硫酸でｐＨを
７．５に調整しこれに粉末硫酸アンモニウムを加えて７
０％飽和となし、０℃で一夜放置し生成した沈殿を炉別
した。

この沈殿物を５％アンモニア水２れこ溶解し、透析チュ
ーブ（Ｖｉｓｋｉｎｇ社製）に入れ、０．０８Ｍリン酸
塩緩衝液（ｐＨ６．５）に対して充分透析し、透析内液
に該緩衝液を加えて全量を１０〆に調整し、あらかじめ
０．０８Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化させ
たＣＭセファデックスＣ−５０イオン交換カラム（４０
×４０仇）に通液し、爽雑物を該イオン交芋剣樹脂に吸
着せしめ、通過夜を得た。

この通過液１０〆をダイアフローホローフアィバー濃縮
装置（アミコン社製、ＤＣ−３の型）で濃縮し、前記と
同様に濃縮液を０．１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に対し一晩５℃で透析し、この透析内液に該緩衝液
を加えて１のこ調整した。

この溶液をあらかじめ該緩衝液で平衡、活性化したＤＥ
ＡＥセルロースカラム（４．０×４０肌）に通液し、０
．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを充
分洗浄した後、０．３Ｍの食塩を含む０．１Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で綾出を行なった。そして試
験１と同様の方法で測定して額粒球の分化増殖促進効果
を有する分画を進め、０．１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に対して透析し、透析内液を得た。この透析
内液を再び該緩衝液で平衡、活性化させたＤＥＡＥセル
ロースカラム（４．０×４０弧）に通液し、０．１Ｍか
ら０．３Ｍの食塩の直線濃度勾配溶出法により溶出させ
、額粒球の分化増殖促進効果を有する分画を集め、この
分画に粉末硫酸アンモニウムを加えて７０％飽和となし
、沈殿物を集め、この沈殿を少量の０．１Ｍトリスー塩
酸緩衝液（拍７．０）に溶解し、該緩衝液に対して透析
し、透析内液を得た。

次にこの透析内液２０の【を、あらかじめ０．１Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセフアデッ
クスＧ−１５０カラム（４．０×６０肌）で展開させ、
相対溶出液量１．１１−１．４５の分画を集め、この分
画を蒸留水に対して充分透析し、透析内液を凍結乾燥し
、約５００の９の粉末を得た。

次に、上記粉末２００の９を１．０Ｍ食塩を含む０．０
２Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、あらかじ
め該緩衝液で平衡化したコンカナバリンＡ−セフアロー
ス砥（ファインケミカル・ラボラトリー社製）１００Ｍ
を含むカラムに通液し、１．０Ｍ食塩を含む０．０２Ｍ
リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを充分洗浄し、
のち５０ｍＭ ＱーメチルーＤーグルコシド及び１．ｍ
Ｍ食塩を含む０．０２Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）
で溶出させ、後述する方法で測定して額粒球の分化増殖
効果を有する分画を集め、これを蒸留水に対して透析し
、透析内液を凍結乾燥した。

更に、ここに得られた凍結乾燥粉末約５０雌を、１０％
グリセリンを含む０．１２８Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）、１の‘に熔解し、８％アクリルアミドゲル
（ｐＨ８．９ ２仇肋×２５側）を用いた調製用電気泳
動装置（富士理研、フジカバラーロ型）により、冷却水
通水下、１０のＡの電流を通電し、泳動させ、相対移動
度０．４６の分画を０．０２９Ｍトリスーグリシン緩衝
液（ｐＨ８．３）で回収し、蒸留水に対して透析し、透
析内液を凍結乾燥し、精製ＨＧＩＧＰ約１０の９を得た
くこの方法を、精製ＨＧＩＧＰの製法とする）。

この方法を反覆して実施し、約１００の９のＨＣＩＧＰ
を得た。

このようにして得た精製ＨＧＩＧＰＩＯＯ双９に１０％
の人血清アルブミン（ミドリ十字社製）を含有する水溶
液１００泌を加え、ＨＧＩＧＰを完全に溶解し、１０％
水酸化ナトリウム水溶液を加え、ＰＨを６．８に調整し
た。次いでこの溶液を６０ｑｏで１餌時間加熱し、のち
氷水で急冷し、孔径０．４５〆のメンブランフイルター
を装着した炉過除菌装置（ミリポア社製）を用いて炉遇
して除菌し、あらかじめ１８０００で２時間乾熱滅菌し
たガラス製バィアル塵へ１の【づつ無菌的に分注し、無
菌的に凍結乾燥し、バィアル墨を密封し、１ｍ９の加熱
処理されたＨＧＩＧＰを含有する製剤約９７本を得た。

この製剤について前記実験１と同様の方法により、生物
活性及びウイルスの活性を試験した。

その結果、生物活性は加熱処理しないものと同等であり
、何らのウイルスの活性も検出されなかった。実施例
２ 健康な人から集めた新鮮な尿１０００夕から実施例１と
同様の方法でＣＭ−セフアデックスＣ−５０イオン交換
カラムの通過液の濃縮液１そを得た。

この水溶液に１０その０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）を加え、充分蝿拝し、再びダイアフローホロ
ーフアィバー高速濃縮装置で約１／１０に濃縮した。次
いでこの濃縮液に０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
．０）５夕及びあらかじめ０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥセルロース液（乾
燥重量としてＤＥＡＥを３００多）５夕を加え、３０分
間燈拝し、静直した後、吸引炉過して該セルロースを炉
則した。炉昇りした該セルロースに１０その０．１Ｍト
リスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて洗浄し、再度
吸引炉過して該セルロースを炉別し、０．０８Ｍ食塩を
含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０そ
で洗浄し、吸引炉過して該セルロ−スを炉別した。炉別
した該セルロースに０．３Ｍ食塩を含む０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０夕を加え、鷹拝してＨ
ＧＩＧＰを含有する分画を該ＤＥＡＥセルロースより溶
出させ、得られた溶出液を、ダイアフローホローフアィ
バー高速濃縮装置（ＤＣ−３頂型）を用いて蒸留水によ
る希釈、濃縮を繰り返し、脱塩し、のち凍結乾燥し、粉
末約１５夕を得た。得られた凍結乾燥粉末を１５０叫の
蒸留水に溶解し、あらかじめ０．１Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で平衡化したセフアデックスＧ−１５
０カラム（６．０×８０伽）に通液してゲル炉適し、相
対溶出液量１．１１−１．６０のＨＧＩＧＰを含有する
分画を集めた。次いで該分画を蒸留水に対して充分透析
し、透析内液をダイアフローホローフアィバー濃縮装置
（ＤＣ ２型）で濃縮し、ＨＧＩＧＰ粗製物約３夕を含
む濃縮液１００の‘を得た。この濃縮液に人胎盤アルブ
ミン粉末（特公昭５１〜４０１３２の実施例の方法で製
造。

粉末中９８％のアルブミンを含有）１０夕を加えて溶解
し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を加えｐＨを７．０
に調整し、実施例１と同様の方法で炉過除菌して無菌的
にバイァル曇に２．５汎‘づつ分注し、無菌的に凍結乾
燥し、バイアル塵を密封し、約３．８の９の加熱処理さ
れたＨＧＩＧＰを含有する製剤４０本を得た。この製剤
について前記実験１と同様の方法により「生物活性及び
ウイルスの活性を試験した。その結果、生物活性は加熱
処理しないものと同等であり、何らかのウイルスの活性
も検出されなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＧＩＧＰの赤外線吸収スペクトルを、第２図
は雷気泳動による相対移動度と分子量との関係を、第３
図はＨＧＩＧＰの紫外線吸収スペクトルをそれぞれ表わ
す。 第１図 第２図 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の理化学的性質を有し、人尿から分離された人骨
   髄細胞に作用して顆粒球の分化増殖を促進するＨＧＩＧ
   Ｐを含有する水溶液を、アルブミンの存在下及びｐＨ５
   〜９にて５０〜７０℃の温度で８〜３０時間加熱処理す
   ることによつて得られる物質。 （ａ）分子量：ゲル濾過法による測定で７５０００〜９
   ００００、（ｂ）溶解性：水に溶解し、クロロホルムに
   やや溶解し、エチルアルコール、アセトンに不溶、（ｃ
   ）比旋光度：〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝０〜±４０（０．２
   ５％水溶液）、（ｄ）ｐＨ：１％（重量）水溶液で５．
   ０〜６．０、（ｅ）等電点：ｐＨ４．７±０．２、（ｆ
   ）温度安定性：１％（重量）水溶液を６０℃±０．５℃
   で３０分間加熱することにより人顆粒球の分化増殖作用
   を失う、（ｇ）電気泳動：ドデシル硫酸ナトリウム・ポ
   リアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により相対移動
   度０．２５を示す、（ｈ）赤外線吸収：次の特徴的吸収
   値（ｃｍ＾−＾１）を有する、３６００〜３２００（強
   ）、１７００〜１６００（強）、１５５０（中）、１４
   ３０〜１３８０（中）、１１５０〜１０００（ブロード
   ）、（ｉ）呈色反応：α−ナフトール硫酸反応、インド
   ール硫酸反応、アンスロン硫酸反応、フエノール硫酸反
   応について糖類の呈色反応を示し、ローリイフオン反応
   法ならびに塩酸加水分解後のニンヒドリン反応について
   ペプチド結合ならびにアミノ酸の呈色反応を示す、（ｊ
   ）蛋白質部分の構成アミノ酸：プロリン、アスパラギン
   酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、ア
   ラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン
   、チロシン、フエニルアラニン、リジン、ヒスチジン、
   トリプトフアン、アルギニン、（ｋ）色及び形状：ほぼ
   白色、不定形である、（ｌ）糖質部分の構成糖：中性糖
   （グルコース換算）１０．０〜１３．０％（重量）、シ
   アル酸３．０〜７．０％（重量）、アミノ糖１％（重量
   ）以下、（ｍ）蛋白質と糖質との比率：蛋白質７５〜８
   ５％（重量）、糖質１３．０〜２０．０％（重量）、（
   ｎ）元素分析Ｃ：４２．３〜４７．３％、Ｈ：５．７〜
   ７．８％、Ｎ：９．６〜１４．３％、Ｏ：３４．４〜３
   ９．４％、Ｓ：０．２％以下。 ２ 人の顆粒球の分化増殖を促進する人尿由来のＨＧＩ
   ＧＰを含有する水溶液に、人血清又は人胎盤由来のアル
   ブミンを加え、ｐＨを５〜９に調整し、ウイルスを不活
   化するために５０〜７０℃で８〜３０時間加熱処理する
   ことを特徴とするＨＧＩＧＰの加熱処理方法。