CN113214351B - 胡芦巴蛋白及其分离提取方法和在制备骨髓hsc清除辅助剂中的应用 - Google Patents

胡芦巴蛋白及其分离提取方法和在制备骨髓hsc清除辅助剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了胡芦巴蛋白及其分离提取方法和在制备骨髓HSC清除辅助剂中的应用。所述胡芦巴蛋白的分离提取方法包括以下步骤：向胡芦巴提取液中缓慢加入硫酸铵至40％的饱和度，离心，收集上清液；继续加入硫酸铵至70％的饱和度，离心，收集沉淀；将沉淀透析和冷冻干燥，得到胡芦巴蛋白。本发明的胡芦巴蛋白能显著降低LSK细胞群中的G0细胞的比例，具有增强地贫铁过载小鼠骨髓移植预处理的骨髓HSC清除功能，可用作地贫骨髓移植预处理的骨髓HSC清除辅助剂。

Description

胡芦巴蛋白及其分离提取方法和在制备骨髓HSC清除辅助剂 中的应用
技术领域
本发明属于天然功能产物领域，具体涉及胡芦巴蛋白及其分离提取方法和在制备骨髓HSC(造血干细胞)清除辅助剂中的应用。
背景技术
地中海贫血是常见的遗传性血液病之一，其分子基础为珠蛋白基因缺陷导致珠蛋白链合成障碍，使形成血红蛋白四聚体的α-链/非α-链比例失衡，进而引起红细胞破坏而溶血。常规采用红细胞输注及去铁治疗。对于重型β地贫患者，骨髓移植被认为是目前唯一可以治愈的方法。
预处理是骨髓移植的重要环节之一，其主要目的是：①根除异常骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)，最大限度减少复发；②破坏患者免疫系统，为异基因HSC的植入提供条件，防止移植物被排斥；③为异基因HSC的植入提供空间。
白消安(Busulfan，Bu)具有明显的骨髓毒性，能清除骨髓中的HSC(包括多能祖细胞)，但对成熟淋巴细胞没有作用，通常与对成熟淋巴细胞具有毒性作用的药物(如环磷酰胺,Cyclophosphamide,Cy)联合，用于骨髓移植的预处理。
目前，大多数移植中心采用以Bu/Cy为基础的移植预处理方案。预处理方案中所用Bu/Cy的剂量若过大，会引起不良反应，导致病人死亡；剂量若不足，骨髓中的HSC清除不充分，则引起移植排斥或复发。因此探索新的能增强骨髓移植预处理清除骨髓HSC的辅助剂，成为提高地贫预处理效果、降低骨髓移植死亡率的重要手段之一。
胡芦巴为豆科植物胡芦巴Trigonella foenum-graecum L.的干燥成熟种子。目前对其研究主要集中在营养价值上，对其药用价值的相关研究报道较少，而关于其在清除地贫铁过载小鼠骨髓中应用的研究未见报道。
中国发明专利CN104224894B公开了胡芦巴植物蛋白大分子的制备，其将胡芦巴脱脂子叶粉分散和研磨，将所得滤液经过膜分离，制得胡芦巴植物蛋白大分子。然而该专利未明确胡芦巴植物蛋白大分子的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胡芦巴蛋白及其分离提取方法和在制备骨髓HSC清除辅助剂中的应用。硫酸铵饱和度40-70％(优选50-60％)下沉淀出的胡芦巴蛋白具有清除骨髓HSC的功能。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
胡芦巴蛋白的分离提取方法，包括以下步骤：
(1)将胡芦巴粉碎，先用石油醚浸泡脱脂，然后加入KH2PO4-NaOH缓冲液搅拌浸提4-12h，离心，取上清液；重复上述浸提操作若干次，合并所得的上清液，即为提取液；
(2)向提取液中缓慢加入硫酸铵至40％的饱和度，离心，收集上清液；继续加入硫酸铵至70％的饱和度，离心，收集沉淀；
(3)将沉淀转移至透析袋中，在去离子水中透析(平均每隔12h换一次水)，至透析液无色为止，最后将透析袋中的成分冷冻干燥，得到胡芦巴蛋白；
优选地，所述步骤(2)为：向提取液中缓慢加入硫酸铵至50％的饱和度，离心，收集上清液；继续加入硫酸铵至60％的饱和度，离心，收集沉淀；所得到的胡芦巴蛋白清除骨髓HSC的效果更好；
所述的胡芦巴为豆科植物胡芦巴Trigonella foenum-graecum L.的干燥成熟种子(购自广州清平中药材市场，经广东药科大学中药学院专家鉴定)；
所述的石油醚浸泡脱脂，是用石油醚密闭浸泡胡芦巴粉末2-4小时，过滤，粉末风干，滤液用旋转蒸发仪回收；
所述的KH2PO4-NaOH缓冲液，其中KH2PO4的浓度优选40mmol/L，pH值优选6.5-8.0；
上述方法所述的离心，优选1500-3500r/min，离心10-15min；
上述方法优选在4-10℃的环境下进行。
由上述方法制得的胡芦巴蛋白能显著降低LSK(Lin-Sca1+c-kit+，富含HSC)细胞群中的静止期(quiescence，G0，大多数HSC所处的状态)细胞的比例，具有增强地贫铁过载小鼠骨髓移植预处理的骨髓HSC清除功能，可用作地贫骨髓移植预处理的骨髓HSC清除辅助剂。
所述的胡芦巴蛋白作为地贫铁过载小鼠骨髓移植预处理的骨髓清除辅助用途，其给药途径为胃肠道途径，其剂量为0.5-6g/kg.d，优选1.0-3.0g/kg.d，持续给药28天。人用剂量可以经折算后确定。
所述的骨髓HSC清除辅助剂可以是药品或功能食品；
所述的功能食品包括饼干、液体饮料、固体饮料等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、不同于一般成分复杂的中药饮片，本发明的胡芦巴蛋白成分简单，质量易控。
2、本发明的胡芦巴蛋白有望作为地贫骨髓移植预处理的骨髓清除辅助剂，添加到饼干、液体饮料、固体饮料中，使用方便，可满足喜好不同食品类型的地贫骨髓移植患者。
3、胡芦巴来源广泛，药材供给充足，其蛋白质含量丰富，提取分离方法成熟，易于产业化推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
胡芦巴蛋白的分离提取方法，包括以下步骤：
(1)将胡芦巴粉碎，先用石油醚浸泡脱脂，然后加入KH2PO4-NaOH缓冲液(pH值为7；下同)搅拌浸提4-12h，离心，取上清液；重复上述浸提操作若干次，合并所得的上清液，即为提取液；
(2)向提取液中缓慢加入硫酸铵至40％的饱和度，离心(2000r/min，离心15min；下同)，收集上清液；继续加入硫酸铵至50％的饱和度，离心，收集沉淀；
(3)将沉淀转移至透析袋中，在去离子水中透析(平均每隔12h换一次水)，至透析液无色为止，最后将透析袋中的成分冷冻干燥，得到胡芦巴蛋白；
给予本实施例制得的硫酸铵饱和度40％-50％沉淀的胡芦巴蛋白，剂量为1.0g/kg.d，持续28天，观察对地贫铁过载模型小鼠骨髓移植预处理的骨髓清除作用的影响。
取健康C57BL/6小鼠，雄性，8周龄，体重29-23克。于23±2℃、相对湿度55±5％环境下饲养，设定光照/黑暗为12h/12h昼夜循环。每日给予常规饲料，自由进食、进水，1周换2-3次垫料。
实验分为对照组，Bu/Cy组，Bu/Cy+蛋白组。各组小鼠每天早上均腹腔注射右旋糖酐铁(Fe含量100mg/ml)，1g铁元素/kg体重，1次/周，共3周，建立地中海贫血Pesaro危险分级所对应的II级铁过载小鼠模型(详见专利ZL 2015 10094638.0)。
腹腔注射右旋糖酐铁结束后，Bu/Cy组和Bu/Cy+蛋白组每天早上腹腔注射Cy，剂量为60mg/kg，每天一次，连续2天；在Cy给完药后的1天起，每天早上腹腔注射给予Bu，剂量6mg/kg，每天一次，连续3天；对照组对应给予PBS。Bu/Cy+蛋白组在腹腔注射右旋糖酐铁开始时，每天下午给予本实施例的胡芦巴蛋白，剂量为1.0g/kg.d，持续28天；其它两组对应给予PBS。在Bu给药完成后的第6天处死小鼠，取骨髓。
骨髓清除率的检测：骨髓细胞首先使用APC-conjugated anti-c-Kit,PE-Cy7-conjugated anti-ScaI,PerCP-conjugated lineage Ab进行染色,然后用Cytoperm/Cytofix(Brdu kit)固定，最后用10mg/ml Hoechst 33342和1mg/ml pyronin Y(Sigma-Aldrich)染色。采用FACSAriaⅡ(BD Biosciences)流式细胞仪进行分析。
实验数据采用IBM SPSS Statistics 23统计软件进行分析，结果用_x_±SD表示，组间样本比较采用单因素方差分析。
从表1可见，与Bu/Cy组比较，给予本实施例的胡芦巴蛋白，剂量为1.0g/kg.d，持续28天，增加了对LSK细胞群中G0的清除作用，表现为LSK细胞群中的G0细胞比例显著下降。说明其具有增加地贫铁过载模型小鼠骨髓移植预处理的骨髓清除作用，可用作地贫骨髓移植预处理的骨髓清除辅助剂。
实施例2
胡芦巴蛋白的分离提取方法同实施例1，所不同的是步骤(2)：
(2)向提取液中缓慢加入硫酸铵至50％的饱和度，离心，收集上清液；继续加入硫酸铵至60％的饱和度，离心，收集沉淀；
给予本实施例制得的硫酸铵饱和度50％-60％沉淀的胡芦巴蛋白，剂量为3.0g/kg.d，持续28天，观察对地贫铁过载模型小鼠骨髓移植预处理的骨髓清除作用的影响。
实验方法同实施例1。
从表1可见，与Bu/Cy组比较，给予本实施例的胡芦巴蛋白，剂量为3.0g/kg.d，持续28天，增加了对LSK细胞群中G0的清除作用，表现为LSK细胞群中的G0细胞比例显著下降。说明其具有增加地贫铁过载模型小鼠骨髓移植预处理的骨髓清除作用，可用作地贫骨髓移植预处理的骨髓清除辅助剂。
实施例3
胡芦巴蛋白的分离提取方法同实施例1，所不同的是步骤(2)：
(2)向提取液中缓慢加入硫酸铵至60％的饱和度，离心，收集上清液；继续加入硫酸铵至70％的饱和度，离心，收集沉淀；
给予本实施例制得的硫酸铵饱和度60％-70％沉淀的胡芦巴蛋白，剂量为2.0g/kg.d，持续28天，观察对地贫铁过载模型小鼠骨髓移植预处理的骨髓清除作用的影响。
实验方法同实施例1。
从表1可见，与Bu/Cy组比较，给予本实施例的胡芦巴蛋白，剂量为2.0g/kg.d，持续28天，增加了对LSK细胞群中G0的清除作用，表现为LSK细胞群中的G0细胞比例显著下降。说明其具有增加地贫铁过载模型小鼠骨髓移植预处理的骨髓清除作用，可用作地贫骨髓移植预处理的骨髓清除辅助剂。
对比例1
胡芦巴蛋白的分离提取方法同实施例1，所不同的是步骤(2)：
(2)向提取液中缓慢加入硫酸铵至40％的饱和度，离心，收集沉淀；
给予本对比例制得的硫酸铵饱和度0％-40％沉淀的胡芦巴蛋白，剂量为3g/kg.d，持续28天，观察对地贫铁过载模型小鼠骨髓移植预处理的骨髓清除作用的影响。
实验方法同实施例1。
从表1可见，与Bu/Cy组比较，给予硫酸铵饱和度度0％-40％沉淀的胡芦巴蛋白，剂量为3g/kg.d，持续28天，对LSK细胞群中G0的清除没有影响，表现为LSK细胞群中的G0细胞比例没有显著变化。说明其没有增加地贫铁过载模型小鼠骨髓移植预处理的骨髓清除作用，不能用作地贫骨髓移植预处理的骨髓清除辅助剂。
对比例2
胡芦巴蛋白的分离提取方法同实施例1，所不同的是步骤(2)：
(2)向提取液中缓慢加入硫酸铵至70％的饱和度，离心，收集上清液；继续加入硫酸铵至100％的饱和度，离心，收集沉淀；
给予本对比例制得的硫酸铵饱和度70％-100％沉淀的胡芦巴蛋白，剂量为3.0g/kg.d，持续28天，观察对地贫铁过载模型小鼠骨髓移植预处理的骨髓清除作用的影响。
从表1可见，与Bu/Cy组比较，给予硫酸铵饱和度70％-100％沉淀的胡芦巴蛋白，剂量为3.0g/kg.d，持续28天，对LSK细胞群中G0的清除没有影响，表现为LSK细胞群中的G0细胞比例没有显著变化。说明其没有增加地贫铁过载模型小鼠骨髓移植预处理的骨髓清除作用，不能用作地贫骨髓移植预处理的骨髓清除辅助剂。
表1.胡芦巴蛋白对地贫铁过载模型小鼠骨髓移植预处理骨髓清除作用的影响(
Figure BDA0003012895690000071
n＝10)
Figure BDA0003012895690000072
与对照组比较，▲▲P<0.01；与Bu/Cy组比较，*P<0.05.
正常情况下，体内HSC池中大多数HSC处于静止期(quiescence，G0)。LSK(Lin-Sca1+c-kit+)细胞是骨髓中富含HSC的细胞群，因此以小鼠骨髓LSK细胞群中G0细胞的比例为检测对象，G0细胞的比例越低，说明相应蛋白清除HSC的效果越好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.胡芦巴蛋白在制备骨髓HSC清除辅助剂中的应用，其特征在于：
所述胡芦巴蛋白的分离提取方法包括以下步骤：
（1）将胡芦巴粉碎，先用石油醚浸泡脱脂，然后加入KH2PO4-NaOH缓冲液搅拌浸提4-12h，离心，取上清液；重复上述浸提操作若干次，合并所得的上清液，为提取液；
（2）向提取液中缓慢加入硫酸铵至40%的饱和度，离心，收集上清液；继续加入硫酸铵至70%的饱和度，离心，收集沉淀；
（3）将沉淀转移至透析袋中，在去离子水中透析，至透析液无色为止，最后将透析袋中的成分冷冻干燥，得到胡芦巴蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤（2）为：向提取液中缓慢加入硫酸铵至50%的饱和度，离心，收集上清液；继续加入硫酸铵至60%的饱和度，离心，收集沉淀。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的石油醚浸泡脱脂，是用石油醚密闭浸泡胡芦巴粉末2-4小时，过滤，粉末风干，滤液回收。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的KH2PO4-NaOH缓冲液，其中KH2PO4的浓度为40mmol/L，pH值为6.5-8.0。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的离心，是1500-3500r/min，离心10-15min。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的透析，平均每隔12h换一次水。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述方法在4-10℃下进行。
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Aqueous extract of Trigonella foenum-graecum L. ameliorates additive urotoxicity of buthionine sulfoximine and cyclophosphamide in mice.;Bhatia K, et al.;《Food Chem Toxicol.》;20061031;第44卷(第10期);摘要，第1744页右栏第1段，第1748页右栏第2段 *
Effect of fenugreek seeds extract on cyclophosphamide-induced histomorphometrical, ultrastructural and biochemical changes in testes of albino mice.;Sakr SA, et al.;《Toxicol Ind Health.》;20120430;第28卷(第3期);全文 *
Immunomodulatory effects of fenugreek (Trigonella foenum graecum L.) extract in mice.;Bin-Hafeez B, et al.;《Int Immunopharmacol.》;20030228;第3卷(第2期);全文 *
The Effects of Fenugreek on Radiation Induced Toxicity for Human Blood T-Cells in Radiotherapy.;Tavakoli MB, et al.;《J Med Signals Sens.》;20150930;第5卷(第3期);全文 *
Toxicity of Trigonella foenum graecum (Fenugreek) in bone marrow cell proliferation in rat.;Araee M, et al.;《Pak J Pharm Sci.》;20090430;第22卷(第2期);全文 *
Toxicological properties of fenugreek (Trigonella foenum graecum).;Ouzir M, et al.;《Food Chem Toxicol.》;20161031;第96卷;全文 *
中西医结合治疗62例免疫抑制治疗无效的重型再生障碍性贫血临床观察;苏尔云，等;《中国中西医结合杂志》;20121231;第32卷(第12期);全文 *

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