CN111249291A - 白头翁皂苷b4在制备治疗/预防细菌性肺炎药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了白头翁皂苷B4在制备治疗和/或预防克雷伯菌引发的哺乳动物包括人的细菌性肺炎的药物中的用途。白头翁皂苷B4对肺炎克雷伯菌诱导的细菌性肺炎具有保护作用,保护机制可能与降低炎症因子IL‑6、IL‑1β、TNF‑α的含量及肺组织中MPO、IL‑6、TNF‑α含量,减少血浆中性粒细胞数和白细胞数有关,并且注射用B4效果较阳性药效果好。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域。更具体地说,本发明涉及一种白头翁皂苷B4在制备治疗/预防细菌性肺炎药物的用途。
背景技术
肺炎通常是收到病毒或细菌感染而引发的,偶尔会由其它微生物感染引起。肺炎克雷伯菌是导致社区获得性肺炎的主要条件性致病菌,也是院内感染的主要患者。肺炎克雷伯菌能够诱发肺炎、尿路感染、败血症及脓毒症等多种疾病,而其中肺炎克雷伯菌诱发肺炎是最为常见的疾病。由于肺炎克雷伯菌具有高度的变异性和耐药性,使治疗肺炎克雷伯菌感染的药物日益减少,严重影响人类的生活质量和生命健康,肺炎克雷伯菌肺炎的患者极易发展为肺脓肿、肺空洞及脓胸,死亡率高达50%,当疾病恶化为败血症时死亡率接近100%。急性肺损伤是肺炎反应连带的结果,由各种直接或间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤,造成弥漫性肺间质及肺泡水肿,导致的急性低氧性呼吸功能不全。其主要治疗方法为呼吸支持治疗,如氧疗、无创呼吸机、有创通气为主,从而改善低氧血症。细菌感染性肺炎治疗与急性肺损伤的呼吸支持治疗不同,目前用于治疗细菌感染性肺炎主要以抗菌药物如青霉素、红霉素、庆大霉素、氧氟沙星等,此外免疫治疗如免疫球蛋白,转移因子、胸腺肽等免疫调节剂辅助治疗为主,但长期使用抗生素容易产生耐药性和副反应,而免疫治疗尚处于试验阶段。因此,探索治疗细菌感染性肺炎的新方法,具有十分重要的意义。
肺炎克雷伯菌感染引发肺炎的原因,主要由于肺炎克雷伯菌进入机体后触发一系列的炎症反应,激活转录因子,增强趋化因子和炎症因子等的水平,过多的炎症因子分泌将会对肺实质造成肺损伤而引发肺炎。前期研究表明,肺炎克雷伯菌感染能够触发多种炎症通路,促进炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌,激活NLRP3炎症小体等。因此,抑制炎症因子的水平和炎症细胞,是治疗肺炎克雷伯菌感染的细菌性肺炎的有效方法。
白头翁皂苷B4是从毛茛科多年生草本植物白头翁中提取具有药理活性的五环三萜类皂苷,其具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等药理作用,但白头翁皂苷B4对防治细菌性肺炎的作用尚未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种白头翁皂苷B4在制备治疗/预防细菌性肺炎药物的用途,白头翁皂苷B4对肺炎克雷伯菌诱导的细菌性肺炎具有保护作用,保护机制可能与降低炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量及肺组织中MPO、IL-6、TNF-α含量,减少血浆中性粒细胞数和白细胞数有关,并且注射用B4效果较阳性药效果好。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,提供了一种白头翁皂苷B4在制备治疗和/或预防细菌引发的哺乳动物包括人的细菌性肺炎的药物中的用途。
优选的是,所述药物含有治疗有效量的白头翁皂苷B4和药学上可接受的载体。
优选的是,所述药物被制成药学上允许的剂型。
优选的是,所述药物被制成注射剂。
优选的是,所述药物下调细菌性肺炎受试者炎症因子、炎症调节因子的水平。
优选的是,所述炎症因子包括IL-6、IL-1β、TNF-α,所述炎症调节因子包括MPO。
优选的是,白头翁皂苷B4的给药剂量为不低于0.5mg/kg·d。
本发明至少包括以下有益效果:
本发明利用肺炎克雷伯菌(KP)诱导细菌性肺炎,探讨注射用白头翁皂苷B4(B4)对细菌性肺炎的保护作用及可能机制,为防治细菌感染性肺炎提供理论依据。通过KP诱导小鼠细菌性肺炎模型,以评价指标:血常规、肺泡灌洗液IL-6、IL-1β、TNF-α、血清IL-6、TNF-α等炎症因子的含量、肺组织中IL-6、TNF-α和MPO的含量等,评价注射用B4是否具有治疗细菌性肺炎的作用。KP(1.04×109/mL)气管滴注给药能够显著诱导小鼠细菌性肺炎模型,小鼠呼吸急促、血清中IL-6、TNF-α含量升高,肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量升高,肺组织中MPO、IL-6、TNF-α含量升高,血浆中性粒细胞数和白细胞数增加。注射用B4能够显著降低血清中IL-6、TNF-α含量,肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量及肺组织中MPO、IL-6、TNF-α含量,减少血浆中性粒细胞数和白细胞数。实验结果表明,注射用B4对肺炎克雷伯菌诱导的细菌性肺炎具有保护作用,保护机制可能与降低炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量及肺组织中MPO、IL-6、TNF-α含量,减少血浆中性粒细胞数和白细胞数有关,并且注射用B4效果较阳性药效果好。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合细节对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是,下述实施方案中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
1、材料
1.1实验动物
健康BALB/c小鼠,120只,SPF级,体重20±2g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物合格证号:SCXK京2016-0006。
1.2药物与试剂
注射用白头翁皂苷B4,以下简称B4(江西本草天工科技有限责任公司,批号:2018042205);肺炎克雷伯菌,以下简称KP(北纳创联生物技术有限公司,编号:102997);头孢曲松钠,以下简称CRO(瑞阳制药有限公司,批号:18101111);注射用生理盐水(四川科伦药业股份有限公司,批号:L219012211);IL-6、IL-1β、TNF-αELISA测定试剂盒(欣博盛生物科技有限公司,批号:M190530-102a)。
1.3仪器
Mindray血常规检测仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司,型号:BC-5000vet);1/1000精密天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司,型号:ME204E);低温高速离心机(Eppendorf公司,型号:5425R);酶联免疫检测仪(美国BioTek公司,型号:SYNERGYH1);病理图像分析仪(日本OLYMPUS,型号:BX-60);组织研磨机(杰灵仪器制造天津有限公司,型号:TP-24);肺部液体定量雾化器(YAN30012,上海玉颜科学仪器有限公司)。
2、方法
2.1动物造模及给药
健康BALB/c小鼠,120只,适应性喂养3天,实验室室温为(25±5)℃,相对湿度(40~70)%。常规饲料喂养,自由饮水。于造模前称小鼠体重并随机分为空白对照组、模型对照组(KP,1.04×109/mL)、白头翁皂苷B4低剂量组(KP+白头翁皂苷B4 2.5mg/kg)、白头翁皂苷B4中剂量组(KP+白头翁皂苷B4 5mg/kg)、白头翁皂苷B4高剂量组(KP+白头翁皂苷B4 10mg/kg)、阳性对照组(KP+CRO 200mg/kg)(每组20只),为了方便记录数据,以上六组后续分别在表格中计为空白对照组、KP模型组、B4(2.5mg/kg)组、B4(5mg/kg)组、B4(10mg/kg)组、CRO(40mg/kg)组,按照KP浓度为1.04×109/mL,气管滴注(i.t)给药1次复制小鼠细菌性肺炎模型。造模前各组小鼠腹腔注射0.4%巴比妥钠,0.12mL/10g麻醉后,取小鼠仰卧位,于手术台上,用小鼠开口器打开小鼠口腔,用肺部液体定量雾化器,从会厌软骨开口处将KP溶液(50μL)(空白对照组注入等量无菌生理盐水)注入肺脏,模型即建立完成,待其苏醒后给予水和饲料。白头翁皂苷B4低、中、高剂量组于造模后0h、3h、24h、48h、72h尾静脉(i.v)注射注射用B4(2.5、5、10mg/kg),CRO组0h腹腔(i.p)给药(200mg/kg),KP模型组i.v注射等量生理盐水。
2.2检测指标
2.2.1肺泡灌洗液(BALF)提取测定
每组10只小鼠于造模后72h处死,打开小鼠胸腔,结扎右肺后进行气管插管,用1mL注射器吸取PBS溶液0.3mL注入气管内,反复连续抽洗3次,如法操作重复3次,合并灌洗液,在4℃下以1600rpm/min离心10min,收集上清液,严格按照ELISA试剂盒说明书操作检测IL-6、IL-1β、TNF-α含量。
2.2.2肺组织指标测定
每组10只小鼠于造模后72h处死,摘除肺脏,各组进行以下指标观察和测定。
(1)取右肺下叶,用多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,连续切片,进行HE染色,显微镜下观察肺组织病理学改变;
(2)余肺用冰冷生理盐水漂洗后,滤纸吸干表面水分,精密称取重量,用组织研磨机匀浆后,于-80℃冰箱保存,进行检测MPO活性、IL-6、TNF-α含量;WB检测炎症相关蛋白表达如NF-κB、iNOS、COX-2、IL-1β等。
2.2.3血清指标测定
(1)小鼠处死前,摘眼球取血于EP管中,吸取25μL血溶于5μL EDTA-K2抗凝剂中,立即用血常规仪器检测小鼠血液中白细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板等常规指标。
(2)测定血常规后,剩余血室温血液自然凝固30min后,于4℃、3000r/min离心20min,分离血清,分装冻存于-80℃,严格按照操ELISA操作说明检测血清IL-4、TNF-α炎症因子的含量。
2.2.4统计学分析
多个样本间均数比较。方差齐性数据采用单因素方差分析LSD检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。
采用SPSS13.0统计软件包,各项指标结果用均数±标准差(X±S)表示,两组间均数比较采用t检验,多组间计量资料比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)和两两比较(LSD法)。P<0.05为差异具有统计学意义。
3、实验结果
3.1白头翁皂苷B4对血液中性粒细胞数和白细胞数的影响
与空白对照组比较,模型对照组小鼠血液中性粒细胞数(NEUT)和白细胞数(WBC)显著升高(P<0.001);与模型对照组比较,阳性对照组能够降低血液中NEUT数,但对WBC无显著作用。白头翁皂苷B4低、中、高剂量组小鼠血液NEUT数和WBC数均显著降。
结果显示,肺炎克雷伯菌可导致BALB/c小鼠血液NEUT和WBC水平升高,而白头翁皂苷B4有降低肺炎克雷伯菌所致中性粒细胞和白细胞水平升高的作用,阳性对照组对肺炎克雷伯菌所致中性粒细胞和白细胞水平无影响。白头翁皂苷B4对血液中性粒细胞和白细胞的抑制作用比阳性药CRO效果更显著,详见表1、表2。
注:与KP模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001
注:与KP模型组比较,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001
3.2白头翁皂苷B4对肺泡灌洗液(BALF)中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影响
与空白对照组比较,模型对照组小鼠肺泡灌洗液IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高(P<0.001);与模型对照组比较,阳性对照组小鼠肺泡灌洗液IL-6、IL-1β和TNF-α水平均显著降低(P<0.001),白头翁皂苷B4低、中、高剂量组小鼠肺泡灌洗液IL-6、IL-1β水平均显著降低,白头翁皂苷B4低、中剂量组小鼠肺泡灌洗液TNF-α水平均降低(P<0.05),白头翁皂苷B4高剂量组对TNF-α无显著作用。
结果显示,肺炎克雷伯菌可导致BALB/c小鼠肺泡灌洗液IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高,而CRO和白头翁皂苷B4有降低肺炎克雷伯菌所致肺泡灌洗液IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高的作用,且白头翁皂苷B4对肺泡灌洗液中IL-6抑制作用较CRO强,但对IL-1β和TNF-α的作用弱于阳性对照组,详见表3-5。
注:与KP模型组比较,▲▲▲P<0.001
注:与KP模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001
注:与KP模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001
3.3白头翁皂苷B4对血清中IL-6、TNF-α含量的影响
小鼠摘眼球取血,离心后取上清,ELISA试剂盒检测IL-6、TNF-α含量。与空白对照组比较,模型对照组小鼠血清IL-6和TNF-α水平均显著升高(P<0.05,P<0.001);与模型对照组比较,阳性对照组显著降低小鼠血清IL-6和TNF-α水平(P<0.001)。白头翁皂苷B4低、中、高剂量组显著降低小鼠血清IL-6水平(P<0.05或P<0.001);除白头翁皂苷B4高剂量组TNF-α水平差异不具显著性外(P>0.05),白头翁皂苷B4低、中剂量组小鼠血清TNF-α水平均降低(P<0.05)。
结果显示,肺炎克雷伯菌可导致BALB/c小鼠血清炎症因子IL-6、TNF-α水平升高,而头孢曲松钠和白头翁皂苷B4有降低肺炎克雷伯菌所致炎症因子升高的作用,但其抑制作用弱于阳性对照组,详见表6、表7。
注:与KP模型组比较,▲P<0.05,▲▲▲P<0.001
注:与KP模型组比较,▲P<0.05,▲▲▲P<0.001
3.4白头翁皂苷B4对肺组织匀浆中IL-6、TNF-α和MPO水平的影响
小鼠于造模后72h处死,摘除肺脏,用冰冷生理盐水漂洗后,滤纸吸干表面水分,精密称取重量,用组织研磨机匀浆后离心取上清,ELISA试剂盒检测IL-6、TNF-α含量,MPO试剂盒检测MPO活性。与空白对照组比较,模型对照组小鼠肺组织匀浆IL-6和TNF-α水平均显著升高(P<0.001),MPO水平升高(P<0.05);与模型对照组比较,阳性对照组显著降低小鼠肺组织匀浆IL-6和TNF-α水平(P<0.001),但对MPO无明显作用。白头翁皂苷B4低、中、高剂量组显著降低小鼠肺组织匀浆中IL-6和TNF-α水平(P<0.001),对MPO水平有显著的降低作用(P<0.05,P<0.001)。
结果显示,肺炎克雷伯菌可导致BALB/c小鼠费组织匀浆中IL-6、TNF-α和MPO水平升高,而头孢曲松钠和白头翁皂苷B4有降低肺炎克雷伯菌所致IL-6、TNF-α升高的作用,同时白头翁皂苷B4对肺组织匀浆中MPO水平升高有抑制作用,而CRO对MPO水平无影响,详见表8-10。
注:与KP模型组比较,▲▲▲P<0.001
注:与KP模型组比较,▲▲▲P<0.001
注:与KP模型组比较,▲P<0.05,▲▲▲P<0.001
3.5结论
实验结果表明,白头翁皂苷B4对肺炎克雷伯菌诱导的细菌性肺炎具有治疗作用,能够降低肺炎克雷伯菌诱导的中性粒细胞数和白细胞数,效果较阳性药CRO更显著;降低小鼠血清、肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α的水平,IL-6、TNF-α为肺炎相关炎症因子,不同于急性肺损伤炎症因子IL-1β和TGFβ等,因此,降低IL-6、TNF-α水平可以对肺炎具有治疗作用。降低肺组织匀浆中IL-6、TNF-α和MPO水平,CRO对肺组织匀浆中MPO无作用,以上结果提示白头翁皂苷B4在2.5,5,10mg/kg对细菌性肺炎具有治疗作用,其剂量远低于“白头翁皂苷B4作为免疫调节剂在治疗急性炎症药物中的应用”专利中的剂量,并且优于阳性对照药。因此,本发明首次发现,较低剂量白头翁皂苷B4对细菌性肺炎具有治疗作用。
本发明提取物用作药物时,可以直接使用,或者以药物制剂的形式使用。
所述药物制剂含有治疗有效量的本发明白头翁皂苷B4,其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可通过口服或者注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时,可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂(纳米制剂)、口服液、喷雾剂、栓剂等;用于注射时,可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
本发明提取物用作药物时,以药物制剂的形式使用,优选为注射剂,其中B4纯度>99%。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的细节。
Claims (7)
1.白头翁皂苷B4在制备治疗和/或预防细菌引发的哺乳动物包括人的细菌性肺炎的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述药物含有治疗有效量的白头翁皂苷B4和药学上可接受的载体。
3.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述药物被制成药学上允许的剂型。
4.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述药物被制成注射剂。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述药物下调细菌性肺炎受试者炎症因子、炎症调节因子的水平。
6.如权利要求5所述的用途,其特征在于,所述炎症因子包括IL-6、IL-1β、TNF-α,所述炎症调节因子包括MPO。
7.如权利要求1所述的用途,其特征在于,白头翁皂苷B4的给药剂量为不低于0.5mg/kg·d。
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