CN111388492B - Jasurolignoside在制备治疗和/或预防肺损伤的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Jasurolignoside在制备治疗和/或预防哺乳动物包括人的肺损伤的药物中的用途，Jasurolignoside的结构式为式(I)：

本发明对肺损伤具有一定的保护作用，抑制肺部促炎性细胞因子释放以及抑制TLR4信号通路。

Description

Jasurolignoside在制备治疗和/或预防肺损伤的药物中的 用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域。更具体地说，本发明涉及一种Jasurolignoside在制备治疗和/或预防肺损伤的药物中的用途。

背景技术

近年，肺炎发病率及致死率有增长的趋势。目前肺炎的治疗常用药有激素和以下几类抗生素：第一类为青霉素类及第一代头孢菌素等；第二类是氟喹诺酮类药物(莫西沙星、吉米沙星和左氧氟沙星)；第三类为大环内酯类药物(红霉素和阿奇霉素等)。近年来，尽管应用强力的抗生素和有效的疫苗，然而肺炎的病死率没有降低，反而有所上升。究其原因，主要是由于抗生素大量使用导致多药耐药的病原体增加，从而导致肺炎疾病治疗效果不甚理想。激素改善严重肺炎症状具有良好的效果，但是，激素的大量使用副作用也非常明显，不但使患者自身免疫下降，导致肺炎症状加重，而且也会引发骨质疏松等副作用。因此加强治疗肺炎的相关研究，探索治疗肺炎的新方法，具有十分重要的意义。

肺损伤属于胸外科疾病，包括胸部严重外伤、吸入对肺有害的物质(有毒气体、胃内容物、海水等)、严重的肺部感染等各种致伤因素所造成的肺组织损伤，导致肺脏结构完整性的破坏或功能障碍。急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是指心源性以外的各种肺外、肺内因生物、物理、化学等因素导致的急性、进行性呼吸衰竭，临床表现为呼吸困难、窘迫以及顽固性低氧血症，是机体在肺部启动急性过度炎症反应的表现。近年来，在ALI发病机理越来越复杂及其导致死亡率越来越高的情况下，全面了解ALI的发病机理，对ALI的治疗具有重要的意义。目前，对ALI发病机制的最新认知，是将其概括为早期出现的肺泡炎症反应，即伴随的肺实质损伤和受损肺泡过度修复而导致的炎症反应，是发生肺炎的病理基础。Jasurolignoside(JO)是广西毛冬青环烯醚萜并木脂素类主要化学成分，具有抗炎，抗肿瘤，抗氧化等药理作用。目前尚没有研究表明Jasurolignoside对治疗肺损伤有效。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种Jasurolignoside在制备治疗和/或预防肺损伤的药物中的用途，其对肺损伤具有一定的保护作用，抑制肺部促炎性细胞因子释放以及抑制TLR4信号通路。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种Jasurolignoside在制备治疗和/或预防哺乳动物包括人的肺损伤的药物中的用途，Jasurolignoside的结构式为式(I)：

优选的是，所述肺损伤为上呼吸道感染、慢性支气管炎、肺水肿、肺炎、肺脓肿以及由心脑缺血和器官移植引起的肺组织损伤、炎症和感染。

优选的是，所述肺损伤由流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染导致。

优选的是，所述肺损伤包括急性肺损伤和慢性肺损伤。

优选的是，所述药物含有治疗有效量的Jasurolignoside和药学上可接受的载体。

优选的是，所述药物被制成药学上允许的剂型。

优选的是，所述药物下调急性肺损伤受试者中炎症因子的水平。

优选的是，所述药物提高急性肺损伤受试者生存率，改善急性肺损伤受试者的呼吸功能。

优选的是，所述药物抑制TLR4信号通路的表达。

优选的是，Jasurolignoside的给药剂量为不低于1mg/kg·d。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明的死亡保护实验的结果表明JO可以提高LPS诱导的急性肺损伤小鼠存活率。本发明的建立的ALI小鼠模型中，小鼠肺组织肺泡腔出现明显实变，有明显的的炎性细胞浸润，肺泡隔增厚，部分肺泡结构紊乱，边界不清晰，而JO组对上述病理损伤明显减轻，实变明显缓解，炎性细胞明显减少，肺泡隔增厚缓解，肺泡结构边界较清晰；另外，肺呼吸功能的检测的结果表明，JO可以改善肺损伤小鼠的呼吸功能。

本发明的研究结果表明JO可以降低ALI中的肺泡灌洗液，血清，组织中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。生理状态下，人体内有TNF-α、IL-6和IL-1β水平较低，而病理状态下，人体内TNF-α、IL-6和IL-1β分泌大量增加促进炎症细胞的激活，并在体内形成“瀑布效应”，导致炎症介质数量不断增加，进而引起组织细胞损伤。此外，在ALI小鼠体内的白细胞，中性粒细胞，淋巴细胞的数量明显增加，对肺组织有破化作用，本发明的研究结果表明JO可以降低ALI小鼠血浆中的白细胞，中性粒细胞和淋巴数量。

TLR4是识别内毒素脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)主要受体，在急性肺损伤中起了重要作用。LPS激活TLR4后，其下游的NF-κB信号被激活，TNF-α、IL-6和IL-1β导致炎症因子的释放，继而引起对肺组织的损伤。本发明的研究结果表明，JO可以减少TLR4的表达，并且减少下游的NF-κB/p65的表达，表明JO可以抑制TLR4信号通路的表达。

综上所述，Jasurolignoside对LPS所致的小鼠ALI具有一定的防治作用，其作用机制不仅与调节TNF-α、IL-6及IL-1β表达，降低白细胞，中性粒细胞和淋巴细胞相关，也与JO抑制TLR4信号通路有关。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的JO对LPS诱导急性肺损伤小鼠生存率的影响；

图2为本发明的JO对LPS诱导急性肺损伤小鼠肺功能相关指标的影响；

图3为本发明的JO对LPS诱导急性肺损伤小鼠血常规相关指标的影响；

图4为本发明的JO对肺组织损伤的作用；

图5为本发明的JO对LPS诱导急性肺损伤小鼠炎症因子的作用；

图6为本发明的JO对肺组织相关蛋白的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

1、材料

1.1实验动物

SPF级健康BALB/C小鼠，体重20-22g，7-8周，雄性，购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，所有实验动物均饲养于可控环境中，室温18-24℃、湿度40％-50％，实验期间动物自由进食、饮水，昼夜节律正常。

1.2主要药品和试剂

Jasurolignoside，以下简称JO(广西中医药大学药学院杨世林科研平台提供)；地塞米松磷酸钠注射液，以下简称DEX(河南润弘制药股份有限公司，国药准字H41020330)；脂多糖，以下简称LPS(上海碧云天生物技术有限公司)；多聚甲醛(国药分析纯)；0.9％氯化钠注射液(回音必集团江西东亚制药有限公司)；肿瘤坏死因子(TNF-α)试剂盒、白介素(IL-6、IL-1β)试剂盒(美国invitrogen公司)；肺部给药定量雾化器(上海玉研科学仪器有限公司)；AniRes2005动物肺功能分析系统(北京贝兰博科技有限公司；电子天平(梅特勒托利多仪器上海有限公司)；数字式移液器枪(德国Eppendorf公司)；高速离心机(德国Eppendorf公司)；倒置显微镜(德国Leica公司)4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱(澳柯玛产品)；酶标仪(美国Bio-Tek公司)；兽用全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)

2、方法

2.1动物造模及给药

SPF级BALB/C小鼠，雄性，体质量20-22g，适应性饲养3天，实验室室温为(25±5)℃，相对湿度(40-70)％。常规饲料喂养，自由饮水。造模前12h禁食，随机分组后，按照LPS剂量为4mg/kg或者致死剂量15mg/kg，气管滴注(i.t)建立急性肺损伤小鼠模型。各小鼠腹腔注射0.4％戊巴比妥钠0.12mL/10g麻醉后，取小鼠仰卧位于手术台上，用小鼠开口器打开小鼠口腔，用微量雾化器从会厌软骨开口处将LPS(空白对照组注入等量无菌生理盐水)注入肺脏，模型即建立完成，待其苏醒后给予水和饲料。JO组按上述剂量造模，且于造模前2h、造模后6h，12h尾静脉注射给予JO，空白对照组给予等量无菌生理盐水，阳性药组按上述剂量造模，且于造模后6h腹腔注射给予地塞米松注射液1次后，余下给药时间点腹腔注射给予等量生理盐水。

按照上述造模，给药方式，分别进行以下3批实验：

(1)用致死剂量的LPS(15mg/kg)造模，分为5组，空白对照组、LPS模型组(15mg/kg)，JO(5、10mg/kg)组、阳性药组(地塞米松，DEX，5mg/kg)，观察120h内小鼠生存情况；

(2)用4mg/kg的LPS造模，分为5组，空白对照组，LPS模型组(4mg/kg)，JO(5、10mg/kg)组、阳性药组(地塞米松，DEX，5mg/kg)，造模24h后，用呼吸机检测小鼠肺呼吸功能；

(3)用4mg/kg的LPS造模，分为6组，空白对照组，LPS模型组(4mg/kg)，JO(2.5、5、10mg/kg)组、阳性药组(地塞米松，DEX，5mg/kg)，造模24h后，造模眼球取血，血常规检测白细胞、中性粒细胞的变化趋势，ELISA检测血清、肺泡灌洗液、肺组织中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平，HE染色法观察肺脏病理组织学改变，免疫组化和Western blotting法检测肺组织TLR4/NF-κB p65表达。

2.2检测指标

2.2.1小鼠生存率

用15mg/kg的LPS造模后，每隔12h观察并记录小鼠存活情况。

2.2.2小鼠肺呼吸功能检测

用4mg/kg的LPS造模24h后，各组小鼠腹腔注射0.4％戊巴比妥钠，0.12mL/10g麻醉后，麻醉后进行气管插管，连接小动物肺功能分析仪，检测小鼠肺阻力(RL)、呼吸阻力(Re)、动态肺顺应性(Cydn)。

2.2.3血液分析

用4mg/kg的LPS造模24h后，小鼠眼球取血，取40μL血液，用迈瑞血液分析仪检测血液中淋巴细胞(Lymphocyte)、中性粒细胞(Neutrophil)和白细胞(WBC)数量。

2.2.4血清TNF-α、IL-6及IL-1β的检测

用4mg/kg的LPS造模24h后，取小鼠眼球全血，4℃，3000rpm/min离心15min，取上清液，严格按照操ELISA操作说明检测血清IL-6、IL-1β、TNF-α炎症因子的含量。

2.2.5肺泡灌洗液(BALF)炎症因子的检测

用4mg/kg的LPS造模24h，采血结束后，处死，迅速打开胸腔并暴露颈部气管，用1mL注射器由气管注入生理盐水(冰)0.3mL，反复回抽推注3～5次，得肺泡灌洗液置于冰上，同法重复3次，合并3次肺泡灌洗液。以4℃，1600rpm/min，离心15min，收集上清液，严格按照操ELISA操作说明检测肺泡灌洗液炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.2.6肺组织指标测定

用4mg/kg的LPS造模24h，采血结束后，处死，

(1)取右肺下叶，4％多聚甲醛溶液固定、梯度酒精脱水、脱钙后石蜡包埋处理切片，HE染色，显微镜观察取小鼠右肺组织形态变化。

(2)取左肺下叶，4％多聚甲醛溶液固定，进行免疫组化实验；

(3)余肺用冰冷生理盐水漂洗后，滤纸吸干表面水分，精密称取重量，用组织研磨机匀浆后，于-80℃冰箱保存，检测IL-6、IL-1β、TNF-α含量；Western blot检测TLR4及NF-κBp65蛋白表达等。

2.2.7统计学分析

采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，通过单因素方差分析进行组间比较。P<0.05为显著性事件。

3实验结果

3.1 JO对LPS诱导急性肺损伤小鼠的死亡保护的作用

如图1所示，LPS造模处理后84h时，LPS模型组死亡率为100％，JO(5mg/kg)组为10％，JO(10mg/kg)组为10％，阳性药组死亡率为20％。结果表明JO保护LPS诱导急性肺损伤小鼠的死亡，且保护作用优于阳性药组，因此，JO及含JO的药物提高急性肺损伤受试者生存率。

3.2 JO对LPS诱导急性肺损伤小鼠呼吸功能的影响

如图2所示(A小鼠肺阻力(RL)；B小鼠呼吸阻力(Re)；C小鼠动态肺顺应性(Cydn)(#P＜0.05，*P＜0.05))，与空白对照组比较，LPS模型组肺阻力(RL)、呼吸阻力(Re)显著增加，动态肺顺应性(Cydn)显著下降(#P＜0.05)，与LPS模型组相比较，JO(5、10mg/kg)和阳性药组RL、Re明显下降，Cdyn明显增加(*P＜0.05)。

3.3 JO对LPS诱导急性肺损伤小鼠血常规的影响

如图3所示(A小鼠血液中白细胞(WBC)数量；B小鼠血液中中性粒细胞(Neutrophil)数量；C淋巴细胞(Lymphocyte)(#P＜0.05，***P＜0.001))，与空白对照组比较，LPS模型组白细胞(WBC)、中性粒细胞(Neutrophil)和淋巴细胞(Lymphocyte)数量增加(#P＜0.05)，而JO(2.5、5、10mg/kg)组和阳性药组小鼠血液中白细胞(WBC)、中性粒细胞(Neutrophil)和淋巴细胞(Lymphocyte)数量明显低于LPS模型组(*P＜0.05)。

3.4 JO对LPS诱导急性肺损伤小鼠肺组织病理学影响

如图4所示，通过光学显微镜观察，LPS模型组小鼠肺组织肺泡腔出现明显实变，有明显的炎性细胞浸润，肺泡隔增厚，部分肺泡结构紊乱，边界不清晰，而JO(2.5、5、10mg/kg)组及阳性药组与LPS模型组比较，上述表现明显减轻。

3.5 JO对LPS诱导急性肺损伤小鼠炎症因子的作用

如图5所示(A小鼠肺泡灌洗液中TNF-α含量；B小鼠肺泡灌洗液中IL-6含量；C小鼠肺泡灌洗液中IL-1β含量；D小鼠血清中TNF-α含量；E小鼠血清中IL-6含量；F小鼠血清中IL-1β含量；G小鼠肺组织中TNF-α含量；H小鼠肺组织中IL-6含量；I小鼠肺组织中IL-1β含量(#P＜0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001))，LPS处理24h后，LPS模型组肺泡灌洗液(BLAF)，血清，肺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达明显高于空白对照组(#P＜0.05)，说明LPS(4mg/kg，24h)诱导的ALI模型成功，而JO(2.5、5、10mg/kg)组、阳性药组小鼠肺泡灌洗液(BLAF)，血清，肺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达明显低于LPS模型组。(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)

3.6 JO对LPS诱导急性肺损伤小鼠肺组织相关蛋白的影响

如图6A所示(A肺组织的TLR4/p-p65的蛋白表达)，肺组织Western blot结果显示，与空白对照组比较，LPS小鼠肺组织TLP4、p-p65蛋白表达增加；与LPS模型组比较，地塞米松组和JO(2.5、5、10mg/kg)组TLP4、p-p65蛋白表达减少。

如图6B，6C所示(B肺组织TLR4的免疫荧光；C肺组织p65的免疫荧光)，肺组织免疫组化结果显示，与空白对照组相比，LPS模型组小鼠肺组织TLR4，p65蛋白表达明显(蓝色)；与LPS模型组相比，地塞米松组和JO(2.5、5、10mg/kg)组TLR4，p65表达相对较少。

综上所述，本发明建立脂多糖(LPS)气管滴注导致的急性肺损伤(ALI)模型，探讨Jasurolignoside(JO)对肺损伤的保护作用及可能机制，为ALI的治疗提供依据。本发明观察JO对LPS诱导的急性肺损伤小鼠的死亡保护作用，利用AniRes2005动物肺功能分析系统通过检测相关指标测定JO对ALI小鼠呼吸功能的影响，探究JO对ALI的保护作用。随机分组后，气管滴注LPS建立小鼠ALI模型，JO组于造模前2h，造模后6h、12h给药，阳性药组于造模后6h给药。(1)造模后，连续观察120h，观测可得模型组小鼠于造模后84h内全部死亡，而JO组(5，10mg/kg)小鼠在120h后生存率达到80％。(2)AniRes2005动物肺功能分析系统结果表明，与空白对照组相比，LPS模型组小鼠肺吸气阻力(RL)、呼气阻力(Re)显著增加，动态肺顺应性(Cdyn)显著减少。与LPS模型组相比较，JO(5，10mg/kg)组小鼠RL、Re明显下降，Cdyn明显上升。(3)各组小鼠造模后24h麻醉取指标，血常规仪器计数各组小鼠血液中白细胞(WBC)，中性粒细胞(Neu)，淋巴细胞(Lym)，HE染色观察肺组织病理组织学改变，免疫组化检测肺组织中TLR4和P65表达水平变化，Western blotting法检测肺组织TLR4和P-P65蛋白表达，ELISA检测血清，组织和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6及IL-1β的表达水平。结果表明，与空白对照组相比，LPS模型组血液中WBC、Neu、Lym，血清中TNF-α、IL-6、IL-1β均显著升高(P＜0.05,＜0.01,＜0.001)，肺组织出现明显病理改变，主要表现为肺泡腔炎性细胞明显增多，肺泡隔增厚，部分肺泡结构紊乱，肺组织TLR4，P65，P-P65表达增加。与LPS模型组相比较，JO组血液WBC、Neu、Lym，血清TNF-α、IL-6、IL-1β均明显下降，肺组织的病理损害程度较LPS模型组明显减轻，且肺组织的TLR4，P65，P-P65表达也明显减少。综上所述，JO对LPS诱导的小鼠急性肺损伤具有一定的保护作用，其机制可能与抑制肺部促炎性细胞因子释放以及抑制TLR4信号通路有关。

本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。

所述药物制剂含有治疗有效量的本发明JO，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可通过口服或者注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂(纳米制剂)、口服液、喷雾剂、栓剂等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.Jasurolignoside在制备治疗和/或预防哺乳动物包括人的急性肺损伤的药物中的用途，Jasurolignoside的结构式为式(I)：

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述急性肺损伤为由上呼吸道感染、慢性支气管炎、肺水肿、肺炎、肺脓肿以及由心脑缺血和器官移植引起的肺组织损伤、炎症和感染。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述急性肺损伤由流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染导致。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物含有治疗有效量的Jasurolignoside和药学上可接受的载体。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物被制成药学上允许的剂型。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物下调急性肺损伤受试者中炎症因子的水平。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物提高急性肺损伤受试者生存率，改善急性肺损伤受试者的呼吸功能。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物抑制TLR4信号通路的表达。

9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，Jasurolignoside的给药剂量为不低于1mg/kg·d。

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