JP6774952B2 - 多能性幹細胞のマクロファージへの分化 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１月１６日出願のシンガポール特許出願第１０２０１５００３６６Ｖ号の優先権の利益を請求する；このシンガポール特許出願は、その内容全体が全ての目的で参照により本明細書に組み込まれている。
本発明は、幹細胞のマクロファージへの分化に関する。具体的には、本発明は、幹細胞から原始マクロファージを分化させるための、無血清、無フィーダー及び無胚様体下における方法に関する。
マクロファージは、単核貪食細胞であり、組織のホメオスタシス及び免疫において極めて重要な役割を担うが、また、広く病態にも寄与し、したがって、主要な治療標的になる。しかし、現時点では、ヒト多能性幹細胞の原始マクロファージへ（primitive macrophages）の分化、それらのホメオスタシス、及び組織特異的な状況におけるそれらの定義された活性に対する深い洞察が欠如している。
単核貪食細胞系（ＭＰＳ、mononuclear phagocyte system）の概念によれば、組織に常在するマクロファージのホメオスタシスは、血液単核球の持続性の動員に依存する。しかし、病的な状況及び炎症においては、単核球からマクロファージが明らかに生じるが、最近の証拠から、（１）定常状態下及び特定のタイプの炎症においては、特定の組織マクロファージへの単核球の実質的な寄与はなく、（２）一部の成体組織のマクロファージ、例として、脳のミクログリアは、原始マクロファージと呼ばれる胚性原始前駆体に由来し、原始マクロファージは、出生前に組織中に散らばり、成体においてはそれら自体を自己再生により維持することが示されるに至った。
この証拠に基づいて、単核球及びマクロファージを標的とする新たな臨床戦略を設計するために、マクロファージの胚性の原始的起源をインビトロで再現する必要がある。この点に関して、ヒト細胞の血球分化をもたらす圧倒的多数の現存するアプローチでは、間質層との共培養の利用、又は胚様体（ＥＢ、embryoid body）の利用のいずれかが行われている。これらのプロトコールの多くは、定義されていないウシ血清サプリメントの使用に依存する。これらの条件により、ヒト細胞の血球分化のためのプロトコールに、それ独自の変動レベルが導入され、こうした変動は、再現性及び収率に影響を及ぼす恐れがある。したがって、上記に記載した１又は２以上の欠点を克服又は少なくとも改善して、マクロファージの胚性の起源をインビトロで再現する、血球分化のための方法を提供する必要がある。
一態様では、幹細胞から原始様マクロファージ（primitive-like macrophages）を培養するための方法であって、
（ａ）前記幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤を含む無血清培地と接触させてインキュベートし、前記幹細胞の中胚葉系列の細胞への分化を誘導するステップと、
（ｂ）中胚葉系列の前記細胞を、ＤＫＫ１を含む培地と接触させてインキュベートし、中胚葉系列の細胞を造血細胞系列の細胞に分化させるステップと、
（ｃ）造血細胞系列の前記細胞を成熟させるステップと、
（ｄ）造血細胞系列の前記成熟細胞を、Ｍ−ＣＳＦを含む培地と接触させてインキュベートし、前記造血細胞の原始様マクロファージへの分化をドライブするステップと
を含む方法を提供する。
一態様では、ＧＳＫ３阻害剤及びＤＫＫ１を使用説明書と共に含む、本明細書の定義に従う方法において使用する場合のキットを提供する。
一態様では、本明細書の記載に従う方法により得られる原始様マクロファージを提供する。
一態様では、疾患モデルを、インビトロで成長させる（developing）ための、本明細書の記載に従う原始様マクロファージの使用であって、疾患が、神経変性疾患、代謝疾患、呼吸器疾患、心血管疾患、結合組織疾患、がん又は炎症性疾患である使用を提供する。
一態様では、疾患モデルを、インビトロで成長させるための、本明細書の記載に従うミクログリア細胞の使用であって、疾患が、神経変性疾患である使用を提供する。
一態様では、疾患を治療するための化合物をスクリーニングするための、本明細書の記載に従う原始様マクロファージの使用であって、疾患が、神経変性疾患又は代謝疾患である使用を提供する。
一態様では、疾患を治療するための化合物をスクリーニングするための、本明細書の記載に従うミクログリア細胞の使用であって、疾患が、神経変性疾患である使用を提供する。
一態様では、創傷治癒及び組織再生ための医薬品の製造における、本明細書の記載に従う原始様マクロファージの使用を提供する。
一態様では、カーゴ分子を組織内に送達するための、本明細書の記載に従う原始様マクロファージの使用であって、カーゴ分子が、免疫調節物質であるサイトカイン若しくはケモカイン、又はプロドラッグを活性化させる酵素である使用を提供する。
一態様では、マウス幹細胞から原始様マクロファージを培養するための方法であって、
（ａ）前記幹細胞を、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を含む無血清培地と接触させてインキュベートし、前記幹細胞の中胚葉系列の細胞への分化を誘導するステップと、
（ｂ）中胚葉系列の前記細胞を、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ及びＶＥＧＦを含む培地と接触させてインキュベートし、中胚葉系列の細胞を造血細胞系列の細胞に分化させるステップと、
（ｃ）造血細胞系列の前記細胞を成熟させるステップと、
（ｄ）造血細胞系列の前記成熟細胞を、Ｍ−ＣＳＦを含む培地と接触させてインキュベートし、前記造血細胞の原始様マクロファージへの分化をドライブするステップと
を含む方法を提供する。
本発明は、詳細な説明を参照し、非限定的な例及び添付の図面と併せて検討する場合に、より良好に理解されるであろう。
本発明の方法の流れ図である。 本発明の方法において使用する増殖因子の添加についての時系列を示す図である。 ａ）Ｈ１ ＥＳ細胞、ｂ）患者由来ＷＴ ｉＰＳＣ、及びｃ）患者由来変異体ｉＰＳＣから分化させたマクロファージのフローサイトメトリーよる分析を示す図である。細胞を、それらのＦＳＣ／ＳＳＣプロファイル、次いで、生存細胞（ＤＡＰＩ−）、次いで、造血細胞（ＣＤ４５＋）、次いで、シングレット（ＳＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ｗとによるゲーティング）に関して逐次的にゲーティングする。マクロファージの一般的なマーカー、すなわち、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１６３の発現プロファイルを示す。Ｈ１ ＥＳ細胞、患者由来ＷＴ ｉＰＳＣ及び患者由来変異体ｉＰＳＣから分化したマクロファージは、ＣＤ１４＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋であり、それらのうちのほとんどが、ＣＤ１６３＋及びＣＤ１１ｂ＋である。（ＳＳＣ（side scatter）＝側方散乱光：側方散乱光により、レーザーの経路に対して９０度の散乱光を測定し、細胞の粒度を測定する；ＦＳＣ（Forward Scatter）＝前方散乱光：前方散乱光により、レーザーの経路方向の散乱光を測定し、細胞のサイズを測定する；ＤＡＰＩ（4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride）（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩）：ＣＤ４５：汎造血細胞マーカー；ＨＬＡ−ＤＲ：マクロファージ及び樹状細胞のマーカー、ヒト白血球抗原複合体がコードするＭＨＣクラスII細胞表面受容体；ＣＤ１４：分化抗原群１４、マクロファージのマーカー；ＣＤ１１ｂ：インテグリンアルファＭ（ＩＴＧＡＭ、Integrin alpha M）、マクロファージのマーカー；ＣＤ１６３：分化抗原群１６３、ヘモグロビン−ハプトグロビンの複合体に対して高い親和性を示すスカベンジャー受容体、マクロファージのマーカー）。 第１２日に選別し、蛍光標識したラテックスビーズ又はアミロイドＡβペプチドに曝露させた場合のｉＰＳＣ由来原始マクロファージに対する貪食作用アッセイの結果を示す図である。ＩＢＡ−１（ionized calcium-binding adapter molecule 1）＝イオン化カルシウム結合アダプター分子１（ミクログリア及びマクロファージのマーカー）；ＣＸ３ＣＲ１＝フラクタルカイン受容体；ＤＩＣ（Differential interference contrast）＝微分干渉。 ７日間の培養の後の、ｉＰＳＣ由来原始マクロファージのニューロン上における共培養から得られた結果の顕微鏡画像を示す図である。Ｔｕｊ１＝ニューロン特異的クラスIIIベータ−チューブリンのマーカー；Ｉｂａ１（ionized calcium-binding adapter molecule 1）＝イオン化カルシウム結合アダプター分子１（ミクログリア及びマクロファージのマーカー）；Hoechst＝ＤＮＡ、この場合は、細胞の核を標識する蛍光色素。画像の右上の数（＊６０及び＊１００）は、顕微鏡の倍率を示す。 共培養の異なる日（第７、１６及び２１日）における、ｉＰＳＣ由来原始マクロファージのｉＰＳＣ由来ニューロン（供給源は、同じｉＰＳＣである）上における共培養から得られた結果の顕微鏡画像を示す図である。 それらの機能を試験するために、ＣＳＦ２ａＲ−ＫＯマウス（ＣＤ４５．２）モデルにおいて、マウスｉＰＳＣ由来原始マクロファージを鼻腔内から移植する戦略を例証する図である。 ａ）野生型（ＷＴ、wild type）マウスの肺（８月齢）；ｂ）ＣＳＦ２ａＲ−ＫＯマウスの肺（９月齢）（肺胞マクロファージが認められない（分化を欠く））；及びｃ）陽性対照（凍結ｉＰＳＣマクロファージ）を加えたＣＳＦ２ａＲ−ＫＯマウスの肺（１．５月齢）のフローサイトメトリーよる分析を示す図である。 ｉＰＳＣ Ｍφ（１０００Ｋ）を移植してから４２日が経過したＣＳＦ２ａＲ−ＫＯマウスの肺（９月齢）のフローサイトメトリーよる分析を示す図である。Ｍφは、マクロファージを指す。 マウスｉＰＳＣ由来原始マクロファージが、肺内に８週超にわたり生着すること、及び肺胞マクロファージのマーカー（シグレックＦ）を獲得することが可能であることを示す図である。 マウスｉＰＳＣ由来原始マクロファージ（ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰ＋）が、肺内に８週超にわたり生着すること、及びサーフェクタント関連タンパク質Ｂ（ＳＰＢ、Surfactant Associated Protein B）を貪食することができることを示す図である。 ＣＳＦ２ａＲ−ＫＯマウス（ＫＯ）及びｉＰＳＣ由来原始マクロファージを移植したＣＳＦ２ａＲ−ＫＯマウス（ＫＯ−移植）から収集した気管支肺胞洗浄液の濁度を示す図である。洗浄液の光学密度を、６００ｎｍにおいて測定した。 野生型マウス（ＷＴ）、ＣＳＦ２ａＲ−ＫＯマウス（ＫＯ）及びｉＰＳＣ由来原始マクロファージを移植したＣＳＦ２ａＲ−ＫＯマウス（ＫＯ−移植）から収集した気管支肺胞洗浄液の濁度を示す図である。洗浄液の光学密度を、６００ｎｍにおいて測定した。
第１の態様では、本発明は、幹細胞から原始様マクロファージを培養するための方法を指す。この方法は、（ａ）前記幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤を含む無血清培地と接触させてインキュベートし、前記幹細胞の中胚葉系列の細胞への分化を誘導するステップと、（ｂ）中胚葉系列の前記細胞を、ＤＫＫ１を含む培地と接触させてインキュベートし、中胚葉系列の細胞を造血細胞系列の細胞に分化させるステップと、（ｃ）造血細胞系列の前記細胞を成熟させるステップと、（ｄ）造血細胞系列の前記成熟細胞を、Ｍ−ＣＳＦを含む培地と接触させてインキュベートし、前記造血細胞の原始様マクロファージへの分化をドライブするステップとを含む。
幹細胞を、胚性幹細胞（ＥＳＣ、embryonic stem cell）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ、induced pluripotent stem cell）から選択することができる。一実施形態では、幹細胞が、ヒトＨ１胚性幹細胞（ＥＳＣ）であり得る。別の実施形態では、幹細胞が、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。
ＧＳＫ３阻害剤を、６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ、6-bromoindirubin-3'-oxime）、ＣＨＩＲ−９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＴＷＳ１１９、ＩＭ−１２、１−アザケンパウロン、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＳＢ４１５２８６、ＡＺＤ１０８０、ＡＺＤ２８５８、インディルビン、Ａ１０７０７２２、ＴＣＳ２００２、チデグルシブ、又はそれらの任意の誘導体から選択することができる。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の少なくとも２４時間前に、幹細胞を、マトリゲルコート６ウエルプレート上に、１ｃｍ２当たり１未満の小型コロニーの密度で蒔く（plate）ことができる。
ステップ（ａ）の前に、幹細胞を、８０％のDMEM/F12、２０％のノックアウト血清代替品、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ベータ−メルカプトエタノール及びＦＧＦ−２を含む培地を用いてインキュベートすることができる。いくつかの実施形態では、幹細胞を、前記培地中で約１日間インキュベートすることができる。
別の実施形態では、ステップ（ａ）において、幹細胞を、１〜２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５〜１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、０〜５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２及び０〜１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含む分化培地と接触させることができる。分化培地が、Invitrogen社製のStemPro（登録商標）34であり得る。細胞を、約５％の酸素濃度下で、培地を用いて約２日間インキュベートすることができる。
別の実施形態では、細胞を、ステップ（ａ）において、１〜２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び５〜１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦとさらに接触させる。
別の実施形態では、細胞を、約５％の酸素濃度下で、前記培地を用いて約２日間インキュベートする。
細胞を、ステップ（ｂ）において、５〜１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ；０〜５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２；０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ；０〜５００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１；０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６；及び０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を含む分化培地と接触させることができる。細胞を、約５％の酸素濃度下で、前記培地を用いて約３日間インキュベートすることができる。
いくつかの実施形態では、細胞を、ステップ（ｃ）において、０〜５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２；０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ；０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３及び０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を含む分化培地と接触させることによって成熟させることができる。細胞を、正常酸素圧の条件下で、培地を用いて約７日間インキュベートすることができる。用語「正常酸素圧の条件」は、本明細書で使用する場合、培地中の酸素濃度のレベルが約２０％であり得る条件を指す。
細胞を、ステップ（ｄ）において、０〜１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含む分化培地と接触させてインキュベートすることができる。細胞を、正常酸素圧の条件下で、培地を用いて少なくとも６日間インキュベートすることができる。
一実施形態では、本明細書の記載に従う方法は、６ウエル培養プレート中で２１〜２５日間培養すると、１×１０６／ウエルより高い、原始様マクロファージの収率をもたらすことができる。当技術分野で理解されているように、マクロファージの収率は、本明細書に記載する方法において適用する細胞の起源に依存し得る。
別の実施形態では、この方法は、前記原始様マクロファージを、ＦＡＣＳソーティング又は磁気分離を使用して単離するステップをさらに含むことができる。
本明細書ではまた、ＧＳＫ３阻害剤及びＤＫＫ１を使用説明書と共に含む、本明細書の記載に従う方法に従って使用する場合のキットも提供する。
本明細書はまた、本明細書の記載に従う方法により得られる原始様マクロファージも提供する。原始様マクロファージを、後に、ミクログリア細胞、肺胞マクロファージ、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞又はその他の組織マクロファージに分化させることができる。用語「その他の組織のマクロファージ」は、これらに限定されないが、腎臓組織、膵臓組織、脂肪組織、肝臓組織又は結合組織を含む、任意の組織型中に見出すことができるマクロファージを指す。
本明細書はまた、疾患モデルを、インビトロで成長させるための、本明細書の記載に従う原始様マクロファージの使用であって、疾患が、神経変性疾患、代謝疾患、呼吸器疾患、心血管疾患、結合組織疾患、がん又は炎症性疾患である使用も提供する。一実施形態では、疾患が、神経変性疾患である。
いくつかの実施形態では、疾患を治療するための化合物をスクリーニングするための、本明細書の記載に従う原始様マクロファージの使用であって、疾患が、神経変性疾患又は代謝疾患である使用を提供する。
いくつかの実施形態では、疾患が、神経変性疾患である。いくつかの実施形態では、神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病又はレット症候群であり得る。いくつかの実施形態では、代謝疾患が、肥満又は糖尿病であり得る。いくつかの実施形態では、呼吸器疾患が、肺胞蛋白症であり得る。いくつかの実施形態では、心血管疾患が、アテローム動脈硬化症であり得る。いくつかの実施形態では、結合組織疾患が、線維症であり得る。いくつかの実施形態では、炎症性疾患が、関節炎、関節リウマチ、実験的な自己免疫性脳脊髄炎、多発性硬化症又は炎症性腸疾患、及び皮膚の炎症性疾患、例として、アトピー性皮膚炎、乾癬であり得る。
また、創傷治癒及び組織再生のための、本明細書の記載に従う原始様マクロファージの使用も提供する。
また、カーゴ分子を組織内に送達するための、本明細書の記載に従う原始様マクロファージの使用であって、カーゴ分子が、免疫調節物質であるサイトカイン若しくはケモカイン、又はプロドラッグを活性化させる酵素である使用も提供する。
また、マウス幹細胞から原始様マクロファージを培養するための方法であって、（ａ）前記幹細胞を、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を含む無血清培地と接触させてインキュベートし、前記幹細胞の中胚葉系列の細胞への分化を誘導するステップと、（ｂ）中胚葉系列の前記細胞を、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ及びＶＥＧＦを含む培地と接触させてインキュベートし、中胚葉系列の細胞を造血細胞系列の細胞に分化させるステップと、（ｃ）造血細胞系列の前記細胞を成熟させるステップと、（ｄ）造血細胞系列の前記成熟細胞を、Ｍ−ＣＳＦを含む培地と接触させてインキュベートし、前記造血細胞の原始様マクロファージへの分化をドライブするステップとを含む方法も提供する。
マウス幹細胞を、マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）及びマウス誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から選択することができる。
本明細書で例示的に記載している本発明は、本明細書に具体的な開示がない任意の要素（複数可）又は限定（複数可）なしで適切に実行することができる。したがって、例えば、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」等は、広範かつ非限定的に読み取るものとする。さらに、本明細書で利用する用語及び表現は、限定するのではなく、説明する用語として使用しており、そのような用語及び表現を使用することによって、いかなる場合であっても、示したり、記載したりした特徴の均等物又はそれらの一部を除外する意図はないが、多様な改変形態が特許請求する本発明の範囲に属し得ることも認識されたい。したがって、本発明を、好ましい実施形態により具体的に開示してきたが、本明細書に開示する実施形態における、本発明の任意の特徴、改変形態及び変更形態を当業者であれば利用することができること、並びにそのような改変形態及び変更形態は、本発明の範囲に属するとみなされるものとすることを理解すべきである。
本明細書では、本発明を広くかつ一般的に記載してきた。一般的な開示の範囲に属する、種及び亜属のより狭いグループのそれぞれもまた、本発明の一部を形成する。これには、本発明についての一般的な記載に、取り除かれる材料が本明細書に具体的に列挙されているか否かにかかわらず、属から何らかの主題を除去する条件又は否定的限定を伴う場合が含まれる。
その他の実施形態は、以下の特許請求の範囲及び非限定的な例に属する。さらに、本発明の特徴又は態様を、マーカッシュ群の形で記載する場合、それにより、本発明はまた、マーカッシュ群のうちのいずれかの個々のメンバー又はメンバーのサブグループによっても説明されることを当業者であれば認識するであろう。
［実施例］
最良のモードを含む、本発明の非限定的な例、及び比較例を、具体的な実施例を参照することにより、より詳細にさらに記載する；いかなる場合であっても、これらの実施例が本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
マウス多能性幹細胞の原始マクロファージへの分化
ｍＥＳＣ／ｍｉＰＳＣがＭＥＦ上で増殖したら、ゼラチンコート６ウエルプレート上で１〜２回継代することによって、ＭＥＦを枯渇させてから、分化を開始する。
第０日に、コロニーを解離させ、５ｎｇ／ｍｌのｈＦＧＦ２及び５ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ４を補充した無血清分化培地（レシピ、下記）中に、１７５，０００〜２００，０００細胞／ｍｌで再懸濁する。これらを非接着性のプレート内に分注して、胚様体（ＥＢ）を形成させる。
４８時間後、ＥＢをプールし、TrypLE（推奨の）又はトリプシンを用いて解離させる。
次いで、５ｎｇ／ｍｌのｈＦＧＦ２、２ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ４、２ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡ、５ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦを補充した無血清分化培地中で、ＥＢを１７５，０００細胞／ｍｌで再凝集させる。
その４８時間後、ＥＢを解離させ、Ｆｌｋ−１＋細胞について選別する。
次いで、５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、３００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１、１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを補充した無血清分化培地中で、選別した細胞を５００，０００細胞／ｍｌで再凝集させる。次いで、細胞の懸濁液を非接着性の培養ウエル内に分注して、ＥＢを形成させる。
その４８時間後（分化全体の第６日）、ＥＢを解離させ、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを補充したStemPro SFM完全培地（レシピ、下記）中に再懸濁する。次いで、細胞を、ゼラチンコート組織培養プレート上に蒔く。
原始様マクロファージは、分化の第８日から出現し、分化の第１３〜１４日付近でピークに達するはずである。典型的には、細胞を第１０〜１１日付近で選別又は採取する。細胞を継代する必要はないが、第８日までに多くの細胞が懸濁液中に生じることに注目されたい。懸濁液及び接着画分の両方を収集して、選別を行う。
無血清分化培地：
７５％のIMDM／２５％のF12
０．５×のＮ２サプリメント
０．５×のＢ２７サプリメント（レチノイン酸を含有しない）
１×のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ
０．０５％のＢＳＡ
２ｍＭのＬ−グルタミン
０．５ｍＭのアスコルビン酸
４．５×１０−４Ｍの１−チオグリセロール
StemPro SFM完全培地：
StemPro-34 SFM（Invitrogen社）
１×のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ
２ｍＭのＬ−グルタミン
２００μｇ／ｍｌのトランスフェリン
０．５ｍＭのアスコルビン酸
４．５×１０−４Ｍの１−チオグリセロール
ヒト多能性幹細胞の原始マクロファージへの分化
分化の戦略を、４つの段階、すなわち、原条／中胚葉の誘導、造血系への指定（hematopoietic specification）、造血細胞の成熟、そして最後に、最終の骨髄の増殖に分けることができる。各段階の実験の詳細を、図１及び図２に示し、下記に記載する。
段階０：ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を、マトリゲルコート皿上で、ＣＦ１ ＭＥＦ馴化培地中に維持する。培地のレシピは、８０％のDMEM/F12、２０％のノックアウト血清代替品、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ベータ−メルカプトエタノール及び６ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２からなり、培地を、１日１回交換する。コラーゲナーゼIV処理及び細胞スクレーパーを用いる穏やかな剥離を使用して、細胞を５〜６日に１回継代する。分化の開始の２４時間前に、細胞を、マトリゲルコート６ウエルプレート上に、非常に低い密度（１ｃｍ２当たり１未満の小型コロニー）で蒔き、一晩かけて付着させる。
段階１（原条／中胚葉の誘導）：この初期の段階では、細胞を、ＢＭＰ４及びＧＳＫ３阻害剤を用いて処理して、後側の原条への指定（specification）を促進する；原条から、胚形成の間に中胚葉が発生する。ＶＥＧＦもまた添加して、造血中胚葉の発生を促進する。また、細胞を、低酸素条件（５％のＯ２）下に維持する。
段階２（造血系への指定）：およそ４〜５日後には、ＫＤＲ及びＣＤ３１の高い発現を示す、細胞のサブセットを観察することができる。この集団は、血管芽細胞、すなわち、造血細胞及び内皮細胞への二分化能前駆体を含有する。この時点の誘導用カクテルは、血管芽細胞を増殖させ、さらにそれらを造血系列へと指定する（specify）ように調整される。ここで、ＳＣＦ及びＦＧＦ−２を添加して、細胞の生存及び増殖を促進する。ＩＬ−３、ＩＬ−６及びＶＥＧＦを添加して、血球分化を促進し、ＤＫＫ１を添加して、赤血球への分化を抑制する（恐らく、マクロファージへの分化をドライブする）。細胞を、第８日まで低酸素条件下に維持し、その後、正常酸素圧下で培養する。
段階３（造血細胞の成熟）：この段階では、造血細胞に対するドライブをより完全なものにし、マクロファージ系列へ向かわせる。ＤＫＫ及びＶＥＧＦは、この時点までに最早必要でなくなっており、したがって、カクテルから除去する。
段階４（最終の骨髄の増殖）：ＣＳＦ１受容体を介するシグナル伝達により原始マクロファージの増殖を促進することが見出されたＭ−ＣＳＦを除く、全てのサイトカインを除去する。
古典的な表面マーカーを発現するマクロファージを、早くも分化の第１８日に、集団中に観察することができ、分化の第２１〜２５日における細胞の流動選別により、良好な収率及び生存率が得られることを本発明者らは見出すに至った。具体的には、図３に、マクロファージの一般的なマーカー（ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１６３）の発現プロファイルを、Ｈ１ ＥＳ細胞、患者由来ＷＴ ｉＰＳＣ及び患者由来変異体ｉＰＳＣから分化したマクロファージに関して示す。
分化培地１（ＤＭ１、Differentiation medium 1）：
サプリメント及び１×のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを加えたStemPro 34（Invitrogen社）
２ｍＭのグルタミン
１×のアポ−トランスフェリン
４×１０−４Ｍのモノチオグリセロール（ＭＴＧ、monothioglycerol）
５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（ＡＡ、ascorbic acid）
分化培地２（ＤＭ２、Differentiation medium 2）：
１×のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを加えた７５％のIMDM／２５％のHam's F-12
０．５×のＢ２７サプリメント（レチノイン酸を含有しない）
０．５×のＮ２サプリメント
２ｍＭのグルタミン
４×１０−４Ｍのモノチオグリセロール
５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸
手順
第０日：増殖培地を、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）を含有するＤＭ１と交換する。５％のＯ２下で培養する；
第２日：培地を、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＤＭ１と交換する。５％のＯ２下で培養する；
第４日：培地を、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）を含有するＤＭ１と交換する。５％のＯ２下で培養する；
第６日：培地を、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＤＫＫ１（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＤＭ１と交換する。５％のＯ２下で培養する；
第８日、第１０日：培地を、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＤＫＫ１（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＤＭ１と交換する。細胞を、正常酸素圧の条件（２０％のＯ２）に戻す；
第１２日、第１４日：培地を、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＤＭ１と交換する；
第１６日、第１８日、第２０日：培地を、ＭＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＤＭ２と交換する。
技術的な留意点
６ウエルプレート中の３ｍｌ培地／ウエルの体積を推奨する。
第６日以降、懸濁液中に細胞が観察される。造血細胞の損失を回避するために、上清を遠心分離し、得られた細胞ペレットを、少量の新鮮な培地中に再懸濁してから、それらの元々のウエルに再び添加する。
ＤＭ１は、５〜７日に１回用時調製し、生理活性の損失を最小限に留めるために、４℃で保存すべきである。
ＤＭ２は、（ＡＡ及びＭＴＧを含有させずに）あらかじめ調製し、使用するまで、一定分量に分けて凍結しておくことができる。ＡＡ及びＭＴＧを、解凍した一定分量に添加し、４℃で最長１週間保存することができる。
この方法には、胚性卵黄嚢中の原始造血発生を模倣することを含む、いくつかの特有かつ好都合な特徴がある。血清の補充を後に必要とし、間質細胞、例として、ＯＰ９との共培養を必要とする競合技術と比較して、この方法は、血清もフィーダーも完全に含有しない。さらに、解離のステップを必要とせず、胚様体形成の段階もない。それどころか、プロセス全体にわたり、２Ｄの接着培養物上において、分化を行う。また、この方法の妥当性を、Ｈ１細胞及びその他のｉＰＳＣ細胞株上でも確認しており、この方法は、拡張性があり、原始マクロファージが高い収率（６ウエルプレートにおいて、１×１０６超／ウエル）で得られている。ＧＳＫ阻害剤の添加は、原条への初期指定を推し進め、一方、ＤＫＫの添加は、赤血球への分化を抑制する。
ヒトｉＰＳＣ由来原始マクロファージの分化
貪食作用アッセイを、第１２日に選別したｉＰＳＣ由来原始マクロファージ（ＣＤ１６３＋ＣＤ１１ｂ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＩＢＡ−１＋ＣＸ３ＣＲ１＋ＣＤ１４＋）を用いて実施した；このマクロファージは、患者由来ＷＴ ｉＰＳＣから分化させてあり、その発現プロファイルは、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１６３＋である。具体的には、第１２日に選別したｉＰＳＣ由来原始マクロファージを、マクロファージ及びミクログリアとしての、それらの貪食能力を評価するために、蛍光標識したラテックスビーズ又はアミロイドＡβペプチドに曝露させた。
図４に示すように、前記ｉＰＳＣ由来原始マクロファージの、マクロファージ及びミクログリアとしての貪食能力が裏付けられている。このことは重要である；というのは、アミロイドベータ（amyloid beta、Ａβ又はＡｂｅｔａ）ペプチドは、アルツハイマー患者の脳中に見出されるアミロイドプラークの主要な構成成分として、アルツハイマー病に決定的に関与するからである。
手順
マクロファージの貪食能力を分析するための方法は、ハンチントン病ヒトｉＰＳＣ（ＨＤ３３ｉ）の対照株に由来する原始マクロファージを使用し、これらのマクロファージは、１０％のＦＣＳを含有するIMDMを用いて再構成し、２４ウエル皿上に（５．０×１０４細胞／ウエルで）播種し、空気中に５％のＣＯ２を有する完全に加湿した雰囲気下、３７℃で一晩かけて定着させた。
次いで、細胞をラテックスビーズと共に（１：１００，０００）２４時間インキュベートし、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、４％のＰＦＡを用いて固定し、レーザー共焦点顕微鏡法により分析した。
細胞形態（微分干渉）及び核（ＤＡＰＩ、１：１０，０００）を参照することによって、貪食されたラテックスビーズを分析した。
ヒトｉＰＳＣ由来のニューロン及びマクロファージの共培養
本明細書に記載する方法により得たｉＰＳＣ由来原始マクロファージを、ニューロンと共に共培養した。
図５及び図６に示すように、共培養により、ｉＰＳＣ由来原始マクロファージが、インビボの成体ミクログリアを連想させる網目状の形態を有するＩＢＡ１＋ミクログリアに分化した。
これらの結果から、ｉＰＳＣ由来原始マクロファージがミクログリア細胞へ分化する能力を有することが示されている。
手順
本明細書に記載する分化の方法を採用して、ヒトｉＰＳＣ（ＨＤ３３ｉ）からニューロンを誘導した。８０パーセント（８０％）の培養密度のｉＰＳＣを、DMEM/F12を用いて２回洗浄し、accutaseを用いて単一細胞に解離させた。細胞を、ニューロン前駆細胞（ＮＰＣ、neuron precursor cell）＋培地を用いて再懸濁し、マトリゲルコート６ウエル皿上に蒔いた。ＮＰＣ＋培地を、ＮＰＣの誘導のために、７日間毎日交換した。次いで、ＮＰＣを、マトリゲルコート６ウエル皿上で、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を加えたＮＰＣ−培地中に１：３の希釈度で分割し、続いて、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＮＰＣ−培地を用いて数回継代して、馴化させた。ニューロンへの最終の分化のために、コンフルエントなＮＰＣを、accutaseを用いて単一細胞に解離させ、ニューロン用分化培地を用いて再懸濁させ、２４ウエル皿中のポリ−Ｌ−オルニチン及びラミニンを用いてコートしたカバーガラス上に（５．０×１０４細胞／ウエルで）播種した。
ＣＳＦ２ａＲ−ＫＯマウス肺への移植
肺胞蛋白症のＣＳＦ２ａＲ−ＫＯマウス（ＣＤ４５．２）マウスモデルを、ｉＰＳＣ由来原始マクロファージの効果を試験するのに使用した。
図７に示すように、マウスモデルにおいて、マウスｉＰＳＣ由来原始マクロファージの移植により、肺胞蛋白症疾患が回復及び軽減した。
未治療の野生型マウス肺から得られた細胞の懸濁液（８ａ、陽性対照）、未治療のマウスモデルＣＳＦ２ａＲ−ＫＯ肺から得られた細胞の懸濁液（８ｂ、陰性対照）、及び技術的対照としての、マウスモデルＣＳＦ２ａＲ−ＫＯ肺から得られた細胞の懸濁液であって、その中にｉＰＳＣマクロファージを添加した細胞の懸濁液（８ｃ）を、フローサイトメトリーにより分析し、肺胞マクロファージの有無を、公知のマクロファージのマーカーの可視化により検出した。
この点に関して、図８ａ、図８ｂ及び図８ｃ中の円で囲んだ領域は、肺胞マクロファージの有無を示す；肺胞マクロファージは、図８ａ中には存在し、図８ｂ及び図８ｃ中には存在しない。図８ａ、図８ｂ及び図８ｃは、エクスビボ誘導マクロファージの鼻腔内移植前に、ＣＳＦ２ａＲ−ＫＯマウスにおいては、肺胞マクロファージが欠損していることを示す。
さらに、さらなる実験において、ＣＳＦ２ａｒ−ＫＯマウスに、１０００ＫのｉＰＳＣ ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰマクロファージを鼻腔内移植し、肺の細胞の懸濁液を、フローサイトメトリーにより分析した。図９及び図１０に示すように、マウスｉＰＳＣ由来原始マクロファージ（ｉＰＳＣ由来のマクロファージは、Ｆ４／８０及びＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰであり、シグレック−Ｆの発現を獲得する）は、肺内に４２日超にわたり生着し、肺胞マクロファージのマーカー（シグレックＦ）を獲得し、かつ特異的マーカー、例として、ＣＤ１１ｂの発現を同時に維持している。具体的には、図９中の点線で示す円は、ＷＴマウス中に存在する内因性の肺胞マクロファージの予測される集団を示す。
また、マウスｉＰＳＣ由来原始マクロファージが、肺内に８週超にわたり生着し、肺胞マクロファージのマーカー（シグレックＦ）を獲得し、肺全体に分布することも示されている（図１０）。
また、マウスｉＰＳＣ由来原始マクロファージ（ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰ＋）が、肺内に８週超にわたり生着し、内因性の機能性肺胞マクロファージの非存在に起因して蓄積したサーフェクタント関連タンパク質Ｂ（ＳＰＢ）を貪食することも示された（図１０及び図１１を参照されたい）。結果として、移植された肺中のＳＰＢの蓄積が減り、ＥＬＩＳＡにより測定した気管支肺胞洗浄液の濁度が低下する（図１２及び図１３）。理解されるように、ＣＳＦ２ａＲ−ＫＯマウス（ＣＤ４５．２）マウスモデル上で示された効果及び結果は、ｉＰＳＣ由来原始マクロファージを用いた治療の結果として、疾患が消失する徴候である。

Claims (22)

  1. ヒト多能性幹細胞から原始様マクロファージを培養するための方法であって、
    （ａ）前記ヒト多能性幹細胞を、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ４及びＧＳＫ３阻害剤を含む無血清培地と接触させてインキュベートし、前記ヒト多能性幹細胞の中胚葉系列の細胞への分化を誘導するステップと、
    （ｂ）中胚葉系列の前記細胞を、ＳＣＦ、ＦＧＦ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ及びＤＫＫ１を含む培地と接触させてインキュベートし、中胚葉系列の前記細胞を造血細胞系列の細胞に分化させるステップと、
    （ｃ）造血細胞系列の前記細胞を、ＳＣＦ、ＦＧＦ−２、ＩＬ−３及びＩＬ−６を含む培地と接触させることによって、成熟させるステップと、
    （ｄ）造血細胞系列の前記成熟細胞を、Ｍ−ＣＳＦを含む培地と接触させてインキュベートし、前記造血細胞の原始様マクロファージへの分化をドライブするステップと
    を含み、
    前記原始様マクロファージが、ＣＤ１６３、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＢＡ−１、ＣＸ３ＣＲ１及びＣＤ１４を発現する、前記方法。
  2. ヒト多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. ヒト多能性幹細胞が、ヒトＨ１胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、請求項２に記載の方法。
  4. ヒト多能性幹細胞が、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２に記載の方法。
  5. ＧＳＫ３阻害剤が、６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ−９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＴＷＳ１１９、ＩＭ−１２、１−アザケンパウロン、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＳＢ４１５２８６、ＡＺＤ１０８０、ＡＺＤ２８５８、インディルビン、Ａ１０７０７２２、ＴＣＳ２００２、チデグルシブ、又はそれらの任意の誘導体である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 請求項１に記載のステップ（ａ）の少なくとも２４時間前に、ヒト多能性幹細胞を、マトリゲルコート６ウエルプレート上に、１ｃｍ２当たり１未満の小型コロニーの密度で播種する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 請求項１に記載のステップ（ａ）の前に、ヒト多能性幹細胞を、８０％のDMEM/F12、２０％のノックアウト血清代替品、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ベータ−メルカプトエタノール及びＦＧＦ−２を含む培地を用いてインキュベートする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. ヒト多能性幹細胞を、培地中で約１日間インキュベートする、請求項７に記載の方法。
  9. 請求項１に記載のステップ（ａ）において、ヒト多能性幹細胞を、１〜２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５〜１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、０〜５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２及び０〜１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含む分化培地と接触させる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 分化培地が、Invitrogen社製のStemPro（登録商標）34である、請求項９に記載の方法。
  11. ヒト多能性幹細胞を、約５％の酸素濃度下で、培地を用いて約２日間インキュベートする、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. ステップ（ａ）において、ヒト多能性幹細胞を、１〜２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び５〜１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦとさらに接触させる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. ヒト多能性幹細胞を、約５％の酸素濃度下で、培地を用いて約２日間インキュベートする、請求項１２に記載の方法。
  14. 請求項１に記載のステップ（ｂ）において、中胚葉系列の細胞を、５〜１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ；０〜５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２；０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ；０〜５００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１；０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６；及び０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を含む分化培地と接触させる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 中胚葉系列の細胞を、約５％の酸素濃度下で、培地を用いて約３日間インキュベートする、請求項１４に記載の方法。
  16. 請求項１に記載のステップ（ｃ）において、造血細胞系列の細胞を、０〜５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２；０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ；０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３及び０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を含む分化培地と接触させることによって成熟させる、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 造血細胞系列の細胞を、正常酸素圧の条件下で、培地を用いて約７日間インキュベートする、請求項１６に記載の方法。
  18. 請求項１に記載のステップ（ｄ）において、造血細胞系列の成熟細胞を、０〜１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含む分化培地と接触させてインキュベートする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 造血細胞系列の成熟細胞を、正常酸素圧の条件下で、培地を用いて少なくとも６日間インキュベートする、請求項１８に記載の方法。
  20. ６ウエル培養プレート中で２１〜２５日間培養すると、１×１０６／ウエルより高い、原始様マクロファージの収率をもたらす、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. 原始様マクロファージを、ＦＡＣＳソーティング又は磁気分離を使用して単離するステップをさらに含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. ＧＳＫ３阻害剤及びＤＫＫ１を、使用説明書と共に含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法において使用する場合のキット。
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