KR20240051185A - 노화-관련 및 신경변성 질환의 예방 및 치료에서 ipsc-유래 면역 세포 - Google Patents

노화-관련 및 신경변성 질환의 예방 및 치료에서 ipsc-유래 면역 세포 Download PDF

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KR20240051185A
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csf
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바네사 알렌산드라 모저
클라이브 닐스 스벤슨
헬렌 굿리지
알렉산더 라펠르
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세다르스-신나이 메디칼 센터
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Abstract

유도 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵구 및 선택적으로 유도 만능성 줄기세포로부터 생성된 추가의 마크로파지를 포함하는, iMPs로 표시되는 유도 만능성 줄기세포로부터 유래된 단핵 포식세포는 인지 기능 개선, 신경 건강 개선, 및/또는 포유동물에서 신경변성 장애를 완화 또는 치료하는데 사용하기 위해 제공된다. 다양한 구체예에서, 상기 iMPs는 이식 후 또는 인 비트로에서 자극된 후에 마크로파지를 생산하고, 및/또는 마크로파지 마커를 발현한다. 본 발명자들은 iMPs 투여 시에 노화, 알츠하이머병 및 근위축성 측삭 경화증의 설치류 모델에서 인지 및 신경 건강을 개선하는 것을 보여주었다. 신경변성 장애의 치료 또는 예방이 필요한 환자에서 자가 줄기세포 또는 자가 세포로부터 수득된 유도 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵 포식세포를 사용한 치료 방법이 또한 제공된다.

Description

노화-관련 및 신경변성 질환의 예방 및 치료에서 IPSC-유래 면역 세포
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)에 따라 2021년 8월 19일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/234,984호에 대한 우선권 주장을 포함하며, 이의 전체내용은 본원에 참조로 통합된다.
발명의 분야
본 발명은 신경변성 질환 (neurodegenerative diseases) 및 노화 (aging)에 대한 만능성 줄기세포-유래 요법 (pluripotent stem cell-derived therapies), 및 만능성 줄기세포-유래 단핵구 및/또는 마크로파지를 생산하기 위한 개선된 프로토콜에 관한 것이다.
본원의 모든 간행물은 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로 통합되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 통합된다. 하기 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 정보가 선행 기술이거나 또는 현재 청구된 발명과 관련이 있거나, 또는 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 임의의 간행물이 선행 기술이라는 점을 인정하는 것은 아니다.
신경변성 질환은 뇌의 신경 세포 또는 말초 신경계에 영향을 미치며, 경시적으로 기능을 손실하게 될 것이다. 일례로서, 알츠하이머병 (Alzheimer disease: AD)은 인지 및 기능에 영향을 미치는 진행성 신경변성 질환이며, 환자는 삶의 여러 측면, 예컨대 인지 기능, 행동, 기분 및 심리적 상태에 영향을 미치는 증상들을 경험한다. 그러나, 알려진 질병-조절 요법 (disease-modifying therapy)이 존재하지 않기 때문에, 약물 개발이 충족되지 않은 의료 분야가 되었다. 또 다른 예로서, 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis: ALS)은 또한 루게릭병 (Lou Gehrig disease)으로 알려져 있고, 이는 흔하고 파괴적이며 변함없이 치명적인 성인 신경변성 질환이다. 상위 및 하위 운동 뉴런 (upper and lower motor neurons)의 손실에 추가하여, ALS는 현재 면역 조절곤란이 있는 장애로서 간주되며, 이는 질병 부담 및 질병 진행 속도를 증가시키는 염증 세포의 변경/활성화를 특징으로 한다. 불행하게도, 현재 ALS 환자에서 이러한 냉혹한 염증 반응을 저지하거나 또는 실질적으로 지연시킬 수 있는 치료법은 없다.
젊은 (young) 혈장 및 골수를 사용한 이전 연구에서는 노인 또는 신경변성 환자에서 인지 능력 및 신경 건강이 어느 정도 개선되는 것으로 나타났다. 그러나, 젊은 혈장 및 골수 투여와 관련된 위험으로 인해 치료제로는 적합하지 않다. 예를 들어, 혈장 주입은 알레르기 및 수혈-관련 순환 과부하와 같은 위험을 수반하여, 폐부종 (종창) 및 호흡 곤란을 초래할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 목적은 신경변성 장애의 치료 또는 완화를 위한 새로운 요법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
하기 구체예 및 이의 양상은 조성물 및 방법과 함께 서술 및 예시되며, 이는 예시 및 설명을 위한 것으로 범위를 제한하지 않는 것으로 이해된다.
다양한 구체예에서, 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵 포식세포 (mononuclear phagocytes)의 치료적으로 유효한 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하거나 또는 예방을 제공하는 방법이 제공되며, 상기 대상체는 신경변성 장애가 있고, 인지 장애를 경험하거나, 또는 인지 기능 개선을 필요로 한다. 단핵 포식세포는 단핵구, 마크로파지, 또는 단핵구 및 마크로파지의 혼합물을 포함할 수 있다. 인간 대상체에 대한 단핵 포식세포의 치료적으로 유효한 양은 하나 이상의 도스 (doses)로 제공되는, 1×106, 1×107 또는 1×108 정도일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 만능성 줄기세포, 특히 유도 만능성 줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC)로부터 생성된 단핵 포식세포는 자연 발생 대응물보다 더 우수하게 대량 공급으로 제공하며, 후자는 인 비트로 증식이 불가능하지는 않더라도 어렵기 때문이다.
다양한 구체예에서, 본원에 개시된 치료에 사용하기 위한 단핵 포식세포는, 골수 분화를 유도하는 조건하에 세포 배양 배지에서 만능성 줄기세포를 배양하여, 단핵 포식세포의 생성을 유도하는 단계를 포함하는 방법으로 만능성 줄기세포, 바람직하게는 iPSC로부터 생성된다. 다양한 구체예에서, 단핵 포식세포를 생성하기 위해 골수 분화를 유도하는 방법은 상기 세포를 미세아교 세포 (microglial cell) 또는 수지상 세포 (dendritic cell)로 유도하는 것을 포함하지 않는다. 일부 추가 구체예에서, 단핵 포식세포를 생성하기 위해 골수 분화를 유도하는 방법은 상기 세포를 마크로파지로 인 비트로 유도하는 것을 포함하지 않으며; 반면에 다른 추가 구체예에서, 단핵 포식세포를 생성하기 위해 골수 분화를 유도하는 방법은 상기 세포를 마크로파지로 인 비트로 유도하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 단핵 포식세포를 생성하기 위해 골수 분화를 유도하는 방법은 하기 단계들 중 처음 1, 2, 3 또는 4개 단계 모두를 포함한다: 배지에서 골 형성 단백질 (bone morphogenetic protein) (BMP-4)을 포함하는 제1 조성물과 iPSC를 접촉시키는 단계; 상기 제1 조성물의 존재하에 iPSC를 배양한 후에, bFGF, VEGF 및 SCF 중 하나 이상을 포함하는 제2 조성물과 세포 배양 배지를 접촉시키는 단계; 상기 제2 조성물의 존재하에 iPSC를 배양한 후에, SCF, IL-3, 트롬보포이에틴 (TPO), 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF) 및 Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드 (FLT3 리간드) 중 하나 이상을 포함하는 제3 조성물과 세포 배양 배지를 접촉시키는 단계; 및 상기 제3 조성물의 존재하에 iPSC를 배양한 후에, 하나 이상의 M-CSF, GM-CSF 및 FLT3 리간드를 포함하는 제4 조성물과 세포 배양 배지를 접촉시키는 단계.
바람직한 구체예에서, BMP-4를 포함하는 제1 조성물은 bFGF 및 TGFβ를 함유하고, 선택적으로 아미노부티르산 (GABA), 피페콜산 및 염화리튬을 추가로 함유하는 배지에 존재한다. 바람직하게는 상기 제1 조성물은 mTeSR1 배지에 존재한다. 추가 구체예에서, 상기 제2 조성물, 제3 조성물 및/또는 제4 조성물은 조혈 세포 배지, 예컨대 StemPro-34 배지에 존재한다. 바람직하게는, 상기 배지는 무혈청 배지, 예를 들어 무혈청 mTeSR1 배지 또는 StemPro-34 무혈청 배지이다.
추가 구체예는 본원에 개시된 치료에 사용하기 위한 단핵 포식세포가 혈액 세포, 예컨대 말초 혈액 단핵 세포로부터, 또는 섬유아세포 또는 다른 체세포 공급원으로부터 재프로그램된 iPSC로부터 생성되는 것을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 치료에 사용하기 위한 단핵 포식세포는 자가 (autologous)이고, 즉 자가 체세포로부터 재프로그램된 iPSC로부터 생성된다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 대상체의 치료에 사용하기 위한 단핵 포식세포는 대상체로부터 입수한 자가 체세포로부터 재프로그램된 iPSC로부터 생성된다.
다양한 구체예에서, 생성된 단핵 포식세포는 노령의 포유동물 대상체, 또는 신경변성 장애 예컨대 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 파킨슨병, 다발성 경화증 (MS), 정신분열증 및 자폐 스펙트럼 장애가 있는 대상체, 또는 신경변성 장애와 관련된 염증의 감소가 필요한 대상체에서 사용하기 위한 것이다. 다양한 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같이 생성된 단핵 포식세포는 하나 이상의 행동 평가, 시냅스 수송체인, VGLUT1의 수준, 미세아교세포 가지 길이 또는 또 다른 분자 분석에서 대상체의 개선된 인지 기능을 제공한다. 일부 양상에서, 상기 개선은 단핵 포식세포의 투여를 받기 전의 대상체의 기저선 상태와 비교한다. 일부 양상에서, 상기 개선은 젊거나, 또는 신경변성 장애가 없는 건강한 대상체에 필적하거나 또는 이와 유사한 수준을 유도한다.
만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵 포식세포가 또한 제공되며, 이는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는 조성물에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 혈액 세포 또는 섬유아세포로부터 재프로그램된 iPSC로부터 생성된 단핵 포식세포가 제공된다.
추가 구체예는 고처리량 스크리닝 방법 (high-throughput screening methods)을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본원에서 생성된 단핵 포식세포를 사용하는 약물 스크리닝 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 단핵구 및/또는 마크로파지의 결함 (defect) 또는 결핍 (deficiency)과 관련된 질환 또는 장애, 또는 신경변성 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 확인하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 후보 화합물과 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 단핵 포식세포를 접촉시키는 단계, 및 상기 후보 화합물이 단핵구 또는 마크로파지의 결함 또는 결핍, 또는 신경변성 질환 또는 장애를 각각 개선하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 본 발명의 구체예의 다양한 특징을 예시적으로 설명하는 첨부된 도면과 함께, 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.
예시되는 구체예가 참조 도면에 설명되어 있다. 본원에 개시된 구체예 및 도면은 제한하는 것이 아니라 설명하는 것으로 간주되어야 한다.
도 1은 마우스 모델의 개략도로, 여기서 본 발명자들은 iPSC-유래 단핵 포식세포를 3일마다 투여하고, 다양한 인지 태스크 (cognitive tasks)에 대한 행동 테스트를 수행한다. "83iGFP"는 iMP를 생성하는데 사용되는 iPSC 라인을 나타낸다. "SAB"는 자발적 교대 행동 테스트 (spontaneous alternation behavior test)를 나타낸다. "FC"는 공포 조건화 (fear conditioning)를 나타낸다. "NOP"은 신규한 물체 배치 테스트 (novel object placement test)를 나타낸다. "NOR"은 신규한 물체 인식 테스트 (novel object recognition test)를 나타낸다. "EPM"은 상승된 플러스 미로 (elevated plus maze)를 나타낸다. 젊은 마우스의 연령은 3-4개월이고, 노령 마우스의 연령은 11-13개월이다.
도 2는 공간 작업 기억 (spatial working memory)을 테스트하는 자발적 교대 행동 (SAB) 태스크를 나타내는 개략도이고, 여기서 공간 작업 기억이 양호한 마우스는 암 (arm) A에서 B에서 C로 회전할 것이고, 기억이 좋지 않은 마우스는 방금 나온 암들 사이를 더 자주 교대로 회전할 것이다 (예를 들어, 암 A에서 B를 가다가 다시 A로 돌아옴).
도 3a는 iMP가 없는 비히클로 처리한 노령 동물 ("Aged Veh"로 표시; 녹색 점)이 자발적 교대 행동 태스크에서 좋지 않게 수행하고, iMP로 처리한 노령 마우스 ("Aged iMPs"로 표시; 적색 점)는 젊은 동물 ("Young"으로 표시; 청색 점)과 비교하여, 더 나쁘게 수행하지 않았음을 보여준다. 도 3b는 노령 그룹들 모두 젊은 동물보다 암 진입 회수가 유의미하게 더 적은 것을 보여주며, 이는 도 3a에서 iMP의 효과가 이동 (locomotion)의 변화에 의한 것이 아닌, 인지적 효과임을 나타낸다.
도 4a는 "NOR (novel object recognition)" 연구를 나타내며, 여기서 마우스를 이전에 한 번도 본 적이 없는 2개의 신규한 물체에 노출시키고, 30분의 기억 지연 (retention delay) 후에, 이들을 하나의 새로운 물체에 노출시키며 - 이들은 이전 물체를 본 기억이 있는 경우 신규한 물체에 더 많은 시간을 할애할 것이다. 신규한 물체 인식 분석에는 연령 또는 치료 효과가 없었고 - 그 결과는 젊은 마우스 그룹, 비히클로 처리한 노령 마우스 그룹, 및 iMP로 처리한 노령 마우스 그룹 간에 통계적으로 상이하지 않았다.
도 4b는 "NOP (novel object location/placement)" 연구를 나타내며, 여기서 2개의 물체들 중 하나를 이동시키고, 동물이 이전 물체가 배치된 위치를 기억하면 신규한 위치에 있는 물체에 더 많은 시간을 할애할 것이다. 그 결과는 노령 마우스가 위치를 이동시킨 물체를 인식하는데 유의미하게 장애가 있었고, iMP 처리 ("Aged iMPs" 그룹)는 이러한 태스크에서 노령 마우스의 능력을 유의미하게 개선하였음을 보여준다.
도 5a는 Neun+ 세포의 수가 Cornu Ammonis 영역 1 및 3 (CA1, CA3)에서 연령 또는 치료에 따라 변하지 않은 것을 나타낸다. Neun은 신경핵 (neuronal nuclei)의 마커이므로, 신경세포의 수를 나타낸다.
도 5b는 젊은 동물에 비해, VGLUT1이 노령 동물에서는 감소하지만 iMP로 처리한 동물에서는 감소하지 않았음을 나타낸다. VGLUT1은 시냅스에 위치한 글루타메이트 수송체로, 정상적인 시냅스 기능에 필수적이며, 알츠하이머병에서 감소하는 것으로 나타났다.
도 6a는 CA3에서, 미세아교세포 가지 길이가 노령 동물에서는 감소하지만, iMP로 처리한 노령 동물에서는 감소하지 않은 것을 나타낸다. iMP로 처리한 노령 동물은 "Aged iMPs" 그룹으로 표시된다. 도 6b는 CA1에서, 가지 길이가 노령 동물에서 다시 감소하지만, iMP로 처리한 노령 동물에서는 유의미하게 증가하는 것을 나타낸다. 미세아교세포는 뇌의 주요 면역 세포이며, 그 기능이 손상 또는 발작이 있는지 환경을 조사하는 것이기 때문에, 일반적으로 길고 분기되는 과정을 갖는다. 그러나, 활성화되는 경우, 이러한 과정이 축소되고, 세포당 가지 길이가 줄어들 것이다. 이는 노화 및 알츠하이머병 모두에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 또한, 두 경우 모두에서 전체 미세아교세포 수가 증가한다.
도 7은 LAMP1이 노령 그룹들 모두에서 CA1이 증가하는 것을 나타낸다. LAMP1은 리소좀 마커 (lysosomal marker)이고, 이는 노화 및 알츠하이머병에 따라 증가하는 것으로 밝혀졌다.
도 8은 성상세포 (astrocytes)의 수가 노령 동물에서는 증가하지만, iMP로 처리한 노령 동물에서는 증가하지 않았음을 나타낸다. GFAP는 성상세포의 마커이고, 이는 일반적으로 노화 및 질환에 따라 수 및 세포체 크기가 증가한다.
도 9a는 알츠하이머병의 마우스 모델에서 iMP 투여에 대한 연구의 타임라인을 나타내고, 5xFAD 마우스가 처음 병리가 발생하는 시점인, 3개월령의 5xFAD 마우스로 출발한다. (아밀로이드 및 미세아교세포가 활성화된 AD 마우스 모델은 약 2개월령부터 출발한다.) 사이클로스포린 A를 제1 세포 투여 3일 전에 복강내 주사를 통해 투여한 다음에 음용수 (drinking water)를 통해 투여한다. 도면에 나타낸 바와 같이 83iGFP 단핵 세포를 500,000개 세포/주사로 8회 주사한다. 본 발명자들은 이미 광범위한 병리가 있는 7개월령 동물에서 이 과정을 반복할 것이다.
도 9b는 3개월째에 iMPs로 처리한 5xFAD 마우스 ("iMPs")가 비히클로 처리한 5xFAD 마우스와 비교하여, 공간 작업 기억 및 단기 공간 기억의 태스크에 변화가 없음을 나타낸다. 도 9c는 iMP-처리한 동물이 "신규한 물체 인식" 연구에서 개선을 보여주는 것을 나타낸다.
도 10a는 iPSCs (번호 1로 표시되고, 1A, 1B 및 1C로 삼중으로 표시됨), 웰 플레이트에서 성장된 iMPs (실시예 2에 기재된 바와 같고; 번호 3으로 표시되고, 3A, 3B, 3C로 삼중으로 표시됨), 웰 플레이트로부터의 배양물에서 수집된 동결보존된 iMPs (번호 2로 표시되고, 2A, 2B, 2C로 삼중으로 표시됨), 및 생물반응기에서 초기에 생성된 iMPs (일 15; 번호 4로 표시되고, 4A, 4B, 4C로 삼중으로 표시됨), 및 생물반응기에서 후기에 생성된 iMPs (일 55; 번호 5로 표시되고, 5A, 5B, 5C로 삼중으로 표시됨)를 비교한 벌크 RNA-시퀀싱 데이터의 계층적 클러스터링 (hierarchical clustering)이다. 모든 분화된 iMPs (그룹 2-5)는 서로 매우 유사하다.
도 10b는 도 10a에 나타낸 분석 전반에 걸쳐 2000개의 가장 가변적인 유전자를 나타내는 주성분 분석 플롯 (principal component analysis plot)이다. 도 10a의 클러스터링과 마찬가지로, 근접성 (proximity)은 유사성을 나타내므로, 그룹 2-5에서의 iMPs는 서로 유사한 것으로 나타났다.
도 11은 도 10a에 나타낸 세포의 그룹 2-5에서 일부 주요 단핵구/마크로파지 마커 (CD14, CD16, CD64, CD11b, CD11c, 및 CD71)의 발현 (TPM (transcripts per kilobase million))의 RNA-seq 결과를 보여준다.
발명의 설명
본원에서 인용된 모든 참고문헌은 이들의 전체내용이 완전히 기재된 것처럼 참조로 통합된다. 다르게 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 또는 동등한 많은 방법 및 물질을 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 기재된 방법 및 물질에 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 다음 용어를 하기에 정의한다.
"대상체 (subject)"는 인간 또는 동물을 의미한다. 일반적으로, 상기 동물은 척추동물 예컨대 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물 (game animal)이다. 영장류는 침팬지, 시아노몰구스 원숭이 (cynomologous monkeys), 거미 원숭이 (spider monkeys), 및 마카크 (macaques) 예컨대 레수스 (Rhesus)를 포함한다. 설치류는 마우스 (mice), 래트 (rats), 우드척 (woodchucks), 흰담비 (ferrets), 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 사냥감 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 바이슨, 버팔로, 고양이과 종 (예: 집고양이), 및 개과 종 (예: 개, 여우, 늑대)을 포함한다. 용어 "환자 (patient)", "개인 (individual)" 및 "대상체 (subject)"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일 구체예에서, 상기 대상체는 포유동물이다. 상기 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만 이들 예에 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 대상체는 인간이다. 추가 일 구체예에서, 상기 대상체는 신경변성 증상 또는 질환의 징후를 나타내는, 예를 들어 기억 (단기 기억, 작업 기억 등) 상실의 징후, 시간 또는 장소에 대한 혼란의 징후, 떨림 (tremor)의 징후를 보이는 인간이다.
"신경학적 장애 (neurological disorders)"는 뇌뿐만 아니라 몸 전체에서 발견되는 신경 및 척수에 영향을 미치는 장애를 지칭하며, 여기에는 간질, 학습 장애, 신경근 장애, 자폐증, 주의력 결핍 장애, 뇌종양, 및 뇌성 마비를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
"신경변성 질환 또는 장애 (neurodegenerative diseases or disorders)"는 일반적으로 뇌 또는 말초 신경계의 신경 세포가 시간이 지남에 따라 기능을 상실하고 궁극적으로 죽는 병리를 의미한다. 신경변성 질환에 이환될 위험은 나이가 들수록 급격히 증가한다. 알츠하이머병 및 파킨슨병은 흔한 신경변성 질환이다. 신경변성 질환의 예로는 알츠하이머병 및 기타 치매, 파킨슨병 및 이의 관련 장애, 헌팅턴병, 프리온병, 운동 뉴런 질환, 척수소뇌 운동실조증 (spinocerebellar ataxia), 척수근 위축증 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한다.
"공간 작업 기억 (spatial working memory)"은 공간 정보를 단기간 동안 작업 기억에 활성 상태로 유지하는 능력을 수반한다.
"단기 기억 (short-term memory)"은 또한 일차 기억 또는 활성 기억으로 알려져 있으며, 소량의 정보를 저장하여 이를 단기간 동안 쉽게 사용할 수 있도록 유지하는 능력이다. 일반적으로, 단기 기억은 매우 짧다. 단기 기억은 연습하거나 또는 적극적으로 유지하지 않으면, 단 몇 초 동안만 지속할 수 있다.
용어 "치료하는 (treating)", "치료 (treatment)" 또는 "치료하다 (to treat)"는 진단된 병리학적 질환 또는 장애를 치유하고, 지연시키고, 이의 증상을 완화시키고, 및/또는 이의 진행을 중단시키는 치료적 조치를 지칭한다. 따라서, 치료가 필요한 대상체는 이미 장애가 있는 대상체를 포함한다. 특정 구체예에서, 대상체가 예를 들어, 질환 또는 장애와 관련된 임의의 증상의 전체적, 부분적, 영구적 또는 일시적인 완화 또는 제거를 나타내는 경우, 대상체는 질환 또는 장애에 대해 성공적으로 "치료"된다.
참조된 숫자 표시 (퍼센트)와 관련하여 사용된 용어 "약 (about)" 또는 "대략 (approximately)"은 달리 본원에 특별히 제공되지 않는 한, 참조된 숫자 표시 (퍼센트)에 해당 참조된 숫자 표시 (퍼센트)의 최대 5%를 플러스 또는 마이너스한 것을 의미한다. 예를 들어, 표현 "약 50%"는 45% 내지 55%의 범위를 포함한다. 다양한 구체예에서, 참조된 숫자 표시와 관련하여 사용된 용어 "약"은 구체적으로 청구항에서 제공되는 경우, 참조된 숫자 표시에 해당 참조된 숫자 표시의 최대 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.25%를 플러스 또는 마이너스한 것을 의미할 수 있다. 다른 구체예에서, 적어도 일수 (예: 일, 주 또는 개월) 단위의 기간의 참조된 숫자 표시와 관련하여 사용된 "약" 또는 "대략"은 참조된 숫자 표시에 적어도 1일, 또는 표시된 기간의 10%가 1일보다 큰 경우 적어도 1일 및 표시된 기간의 최대 10%를 플러스 또는 마이너스한 것을 의미한다. 예를 들어, 표현 "대략" 4일은 3일 내지 5일의 범위를 포함하고; 표현 "대략" 60일 또는 "대략" 2개월은 54일 내지 66일의 범위를 포함한다.
용어 "만능성 줄기세포 (pluripotent stem cells)" 또는 "PSCs"는 내배엽, 외배엽 및 중배엽 세포 중 어느 하나로 발생할 수 있는 능력뿐만 아니라 성장 능력을 갖는 자가-복제 세포를 의미한다. 만능성 줄기세포의 예로는 배아 줄기 (ES) 세포, 핵 이식을 통해 수득된 복제 배아로부터 유래된 배아 줄기세포 (ntES 세포), 생식계열 줄기세포 ("GS 세포"), 배아 생식 세포 ("EG 세포") 및 유도 만능성 줄기세포 ("iPS 세포" 또는 "iPSC")를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, PSCs는 인간 PSCs이다. PSCs의 바람직한 예는 ES 세포 및 iPS 세포를 포함한다.
ES 세포는 포유동물 예컨대 인간 또는 마우스의 초기 배아 (예를 들어 포배 (blastocyst))의 내부 세포 매스 (inner cell mass)로부터 확립된 줄기세포이고, ES 세포는 만능성 및 자가-재생에 의한 성장 능력을 갖는다. ES 세포는 대상 동물의 수정란의 포배로부터 내부 세포 매스를 제거한 후에, 피더 (feeders)로서 섬유아세포에서 내부 세포 매스를 배양함으로써 확립될 수 있다. 상기 세포는 물질 예컨대 백혈병 억제 인자 (LIF) 및/또는 염기성 섬유아세포 성장 인자 (basic fibroblast growth factor: bFGF)가 보충된 배지를 사용하여 계대배양함으로써 유지될 수 있다. 인간 및 원숭이 ES 세포의 확립 및 유지 방법은 예를 들어 US 5,843,780 B; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848; Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1 145-1147; H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279; H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585; 및 Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485에 기재되어 있다.
유도 만능성 줄기 (iPS) 세포는 특정 재프로그래밍 인자를 체세포에 도입하여 제조될 수 있고, 상기 재프로그래밍 인자는 DNA 또는 단백질의 형태이다. iPS 세포는 분화 만능성, 자가-재생에 의한 성장 능력과 같은, ES 세포와 거의 동등한 특성을 가진 체세포-유래 인공 줄기세포이다. 상기 재프로그래밍 인자는 ES 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자 또는 이의 유전자 산물, 또는 비-코딩 RNA; 또는 ES 세포의 미분화 상태의 유지에 중요한 역할을 하는 유전자 또는 이의 유전자 산물, 비-코딩 RNA 또는 저분자량 화합물로 구성될 수 있다. 재프로그래밍 인자의 유전자의 예는 Oct3/4, Sox2, Soxl, Sox3, Soxl5, Soxl7, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbxl5, ERas, ECAT15-2, Tell, 베타-카테닌 (beta-catenin), Lin28b, Salll, Sall4, Esrrb, Nr5a2 및 Tbx3을 포함하고, 이러한 재프로그래밍 인자들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
용어 "혈청 (serum)"은 인간 혈청, 원숭이 혈청, 우태아 혈청, 소 혈청, 돼지 혈청, 말 혈청, 당나귀 혈청, 닭 혈청, 메추라기 혈청, 양 혈청, 염소 혈청, 개 혈청, 고양이 혈청, 토끼 혈청, 래트 혈청, 기니피그 혈청, 마우스 혈청 등을 지칭한다. 혈청을 함유하지 않는 배지의 예로는 MEM (minimum essential medium), DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), IMDM (Iscove's modification of Dulbecco's medium), StemPro-34SFM (Invitrogen), Stemline II (Sigma-Aldrich) 및 ITS가 보충된 유사물; 혈청 대체물이 사전 첨가된 영장류 ES 세포를 배양하기 위한 배지 (영장류 ES/iPS 세포를 위한 배지, ReproCELL); 및 무혈청 배지 (mTeSR, Stemcell Technology)를 포함한다. 혈청을 포함하지 않는, 또는 무혈청인 배지는 더 바람직하게는 mTeSR1 배지 또는 StemPro-34 무혈청 배지이다.
"조혈 인자 (hematopoietic factor)"는 혈액 세포의 분화 및 성장을 촉진하는 인자를 의미한다. 이의 예로는 SCF (stem cell factor), G-CSF (granulocyte- colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte-monocyte colony-stimulating factor), M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), EPO (erythropoietin), TPO (thrombopoietin), 인터루킨, 및 Flt3 리간드를 포함한다. 인터루킨은 백혈구로부터 분비되는 단백질로, 다양한 타입 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 및 IL-9로 나눌 수 있다.
문구 "실질적으로 순수한 (substantially pure)"은 세포의 적어도 95%가 언급된 표현형 또는 발현 마커 프로파일을 갖는 세포 집단을 지칭한다. "실질적으로 순수한" 세포 집단을 언급하는 모든 구체예에서, 세포 집단이 더 낮거나 또는 더 높은 수준의 순도를 갖는 대안적인 구체예가 또한 고려된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 주어진 세포 집단이 "실질적으로 순수한" 대신에, 세포 집단은 세포의 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 세포의 100%가 언급된 표현형 또는 유전자 발현 프로파일을 갖는 것일 수 있다.
다양한 구체예는 대상체에서 인지 기능을 개선하기 위한, 신경변성 장애가 있는 대상체를 치료하기 위한, 또는 대상체에서 신경변성 장애의 발병을 완화, 치료 또는 지연시키기 위한, 또는 신경변성 장애가 있는 대상체의 염증을 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵 포식세포 집단을 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 상기 단핵 포식세포의 집단은 유도 만능성 줄기세포 (iPSCs)로부터 분화된다. 다른 양상에서, 상기 단핵 포식세포의 집단은 자가 iPSCs로부터 분화된다. 또 다른 양상에서, 상기 단핵 포식세포의 집단은 배아 줄기세포로부터 분화된다. 다양한 구체예에서, 상기 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵 포식세포는 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵구를 포함한다. 다양한 구체예에서, 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵 포식세포는 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵구이다. 일부 구체예에서, 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵 포식세포는 마크로파지를 추가로 포함하고; 상기 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵구를 이식한 후에, 또는 상기 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵구를 인 비트로 또는 엑스 비보 자극하여 마크로파지를 생성한다. 추가 구체예에서, 단핵 포식세포의 집단은 본원에 개시된 하나 이상의 분화 방법에 의해 iPSCs로부터 생성된 골수 계통 세포이다. 추가 구체예에서, 본 발명의 단핵 포식세포는 단핵구를 포함하고, 마크로파지를 추가로 포함할 수 있지만 호중구는 제외한다.
일부 구체예에서, 대상체에서 인지 기능을 개선하기 위한, 신경변성 장애가 있는 대상체를 치료하기 위한, 또는 대상체에서 신경변성 장애의 발병을 완화, 치료 또는 지연시키기 위한, 또는 신경변성 장애가 있는 대상체의 염증을 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 본원에 개시된 하나 이상의 분화 방법에 의해 iPSCs로부터 생성된 단핵구를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체에서 인지 기능을 개선하기 위한, 신경변성 장애가 있는 대상체를 치료하기 위한, 또는 대상체에서 신경변성 장애의 발병을 완화, 치료 또는 지연시키기 위한, 또는 신경변성 장애가 있는 대상체의 염증을 감소시키기 위한 방법은 상기 대상체에게 본원에 개시된 분화 방법에 의해 iPSCs로부터 생성된 단핵구로 구성된 세포를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 분화 방법은 생성된 단핵구를 마크로파지로 인 비트로 분화하는 단계를 포함하지 않으며, 예를 들어 상기 분화 방법은 M-CSF 및 IFN-감마 또는 IL-4 중 하나 또는 둘 다의 존재하에 생성된 단핵구를 배양하는 단계를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 대상체에서 인지 기능을 개선하기 위한, 또는 신경변성 장애가 있는 대상체를 치료하기 위한, 또는 대상체에서 신경변성 장애의 발병을 완화, 치료 또는 지연시키기 위한, 또는 신경변성 장애가 있는 대상체의 염증을 감소시키기 위한 방법은 상기 대상체에게 iPSCs로부터 생성된 단핵 포식세포를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하고, 이는 (1) 분화 방법이 마크로파지 분화를 인 비트로 추가로 유도하는 경우, iPSCs로부터 생성된 단핵구 및 iPSCs로부터 생성된 마크로파지의 혼합물, 또는 (2) 분화 방법이 마크로파지 분화를 인 비트로 추가로 유도하고 추가적인 분류/정제가 iPSCs로부터 생성된 마크로파지만을 수득하기 위해 수행하는 경우, iPSCs로부터 생성된 실질적으로 순수한 마크로파지, 또는 (3) 분화 방법이 iPSCs로부터 생성된 단핵구의 분화를 유도하지 않는 경우, iPSCs로부터 생성된 실질적으로 순수한 단핵구일 수 있다.
다양한 구체예에서, 임상적으로 의미있는 양의 단핵 포식세포 (또는 골수 단핵구 세포)는 본원에 개시된 방법으로, 특히 생물반응기에서 배양을 통해, 만능성 줄기세포 (예를 들어, 유도 만능성 줄기세포)로부터 생성된다. 만능성 줄기세포, 특히 iPSCs로부터 생성된 단핵 포식세포의 임상적으로 의미있는 양을 환자로부터 단핵 포식세포 (또는 단핵구)를 단리하고, 이를 사용하는 것과 대조적으로, 상당한 양으로 환자 투여에 사용하기 위해 저장 (예: 동결)되거나, 또는 배양 중에 유지될 수 있다. 만능성 줄기세포, 구체적으로 유도 만능성 줄기세포로부터 출발하여, 본원에 기재된 생성된 단핵 포식세포는 치료가 필요한 환자 또는 대상체로부터 수득한 자가 단핵구 또는 마크로파지와 비교하여, 유전자 돌연변이가 발생할 가능성이 적을 수 있고, 질병 돌연변이가 더 적을 수 있다.
일부 구체예에서, 대상체, 특히 노령 대상체 (예: 40 내지 50세, 50 내지 60세, 60 내지 70세, 70 내지 80세, 80 내지 90세, 90 내지 100세, 또는 100세 초과의 인간)에서 인지 기능을 개선하는 방법은 상기 대상체에게 상기 대상체의 자가 iPSCs로부터 생성된 단핵 포식세포를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 신경변성 장애가 있는 대상체를 치료하는 방법은 상기 대상체에게 상기 대상체의 자가 iPSCs로부터 분화된 단핵 포식세포를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체에서 신경변성 장애의 발병을 완화, 치료 또는 지연시키는 방법은 상기 대상체에게 상기 대상체의 자가 iPSCs로부터 분화된 단핵 포식세포를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다. 추가 구체예에서, 치료 또는 예방 방법은 단핵 포식세포의 결함 또는 결핍과 관련된 질환 또는 장애가 있거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 또는 이의 발병할 위험이 있는 대상체에게 자가 iPSCs로부터 생성된 단핵 포식세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 치료 또는 예방 방법은 마크로파지의 결함 또는 결핍과 관련된 질환 또는 장애가 있거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 또는 이의 발병할 위험이 있는 대상체에게 자가 iPSCs로부터 생성된 단핵 포식세포를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 투여되는 단핵 포식세포는 대상체에게 투여한 후에 마크로파지를 생성한다. 추가 구체예에서, 염증을 감소시키는 방법은 염증과 관련된 질환 또는 장애가 있거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 또는 이의 발병할 위험이 있는 대상체에게 자가 iPSCs로부터 생성된 단핵 포식세포를 투여하는 단계를 포함하고; 선택적으로 여기서 투여되는 단핵 포식세포는 대상체에게 투여한 후에 마크로파지를 생성한다. 염증과 관련된 질환 또는 장애는 신경변성 질환 또는 장애일 수 있다.
다른 구체예에서, 대상체, 특히 노령 대상체 (예: 40 내지 50세, 50 내지 60세, 60 내지 70세, 70 내지 80세, 80 내지 90세, 90 내지 100세, 또는 100세 초과의 인간)에서 인지 기능을 개선하는 방법은 상기 대상체에게 상기 대상체의 자가 iPSCs로부터 생성된 골수 단핵구 세포 (myeloid monocytic cells) 또는 단핵구 (monocytes)를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 골수 단핵구 세포 또는 단핵구는 상기 대상체에게 투여하기 전에 미세아교세포, 수지상 세포, 또는 마크로파지로 분화하도록 자극되지 않는다. 일부 구체예에서, 신경변성 장애가 있는 대상체를 치료하는 방법은 상기 대상체에게 상기 대상체의 자가 iPSCs로부터 생성된 골수 단핵구 세포 또는 단핵구를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 골수 단핵구 세포 또는 단핵구는 상기 대상체에게 투여하기 전에 미세아교세포, 수지상 세포, 또는 마크로파지로 분화하도록 자극되지 않는다. 일부 구체예에서, 대상체에서 신경변성 장애의 발병을 완화, 치료 또는 지연시키는 방법은 상기 대상체에게 상기 대상체의 자가 iPSCs로부터 생성된 골수 단핵구 세포 또는 단핵구를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 골수 단핵구 세포 또는 단핵구는 상기 대상체에게 투여하기 전에 미세아교세포, 수지상 세포, 또는 마크로파지로 분화하도록 자극되지 않는다. 추가 구체예에서, 치료 또는 예방 방법은 단핵구 또는 단핵 포식세포의 결함 또는 결핍과 관련된 질환 또는 장애가 있거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 또는 이의 발병할 위험이 있는 대상체에게 상기 대상체의 자가 iPSCs로부터 생성된 골수 단핵구 세포 또는 단핵구를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 골수 단핵구 세포 또는 단핵구는 상기 대상체에게 투여하기 전에 미세아교세포, 수지상 세포, 또는 마크로파지로 분화하도록 자극되지 않는다. 일부 구체예에서, 치료 또는 예방 방법은 마크로파지의 결함 또는 결핍과 관련된 질환 또는 장애가 있거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 또는 이의 발병할 위험이 있는 대상체에게 상기 대상체의 자가 iPSCs로부터 생성된 골수 단핵구 세포 또는 단핵구를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 투여되는 골수 단핵구 세포 또는 단핵구는 상기 대상체에게 투여한 후에 마크로파지를 생성한다. 추가 구체예에서, 염증을 감소시키는 방법은 염증과 관련된 질환 또는 장애가 있거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 또는 이의 발병할 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 골수 단핵구 세포 또는 단핵구는 상기 대상체에게 투여하기 전에 미세아교세포, 수지상 세포, 또는 마크로파지로 분화하도록 자극되지 않는다. 염증과 관련된 질환 또는 장애는 신경변성 질환 또는 장애일 수 있다. 대안적인 구체예에서, 치료 또는 예방 방법, 또는 염증을 감소시키는 방법은 상기 대상체의 자가 iPSCs 유래의 골수 단핵구 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 투여되는 골수 단핵구 세포는 상기 대상체에게 투여하기 전에 마크로파지로 추가로 분화된다.
다양한 구현에서, 만능성 줄기세포, 바람직하게는 iPSCs로부터 분화된 단핵 포식세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법은 혈장 또는 골수를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하지 않거나; 또는 이러한 방법들에서의 대상체는 혈장 또는 골수 이식을 받지 않는다. 대안적인 구현에서, 상기 방법은 대상체에 대한 혈장 또는 골수 이식 요법에 추가하여, 만능성 줄기세포, 바람직하게는 iPSCs로부터 분화된 단핵 포식세포를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현에서, 만능성 줄기세포로부터 분화된 단핵 포식세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법은 혈장 주입 또는 골수 이식 요법에 대한 반응이 효과적이지 않거나 또는 이환 합병증 (morbidity complications)을 수반하는 대상체를 위한 것이다.
상기 방법의 다양한 구체예에서, 상기 단핵 포식세포는 골수 계통 세포 (바람직하게는 단핵구)를 생성하기 위해 골수 분화를 유도하는 조건하에 세포 배양 배지에서 만능성 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법으로 만능성 줄기세포로부터 생성되고, 상기 방법은 상기 생성된 세포를 미세아교세포 분화 배지 또는 수지상 세포 분화 배지에서 접촉시키거나 또는 배양하는 단계를 포함하지 않는다. 예를 들어, 만능성 줄기세포로부터 단핵 포식세포 (또는 골수 계통 세포)를 생성하는 방법은 생성된 세포를 (a) IL-34, (b) IL-34 및 GM-CSF, (c) IL-4, 또는 (d) IL-4 및 GM-CSF의 존재하에서 배양하거나 또는 접촉시키는 단계를 포함하지 않는다. 그러므로, 본원에 개시된 하나 이상의 방법에서 사용하기 위한 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵 포식세포 (바람직하게는 단핵구)는 미세아교세포 또는 수지상 세포가 아니다. 이에 의해, 대상체에서 인지 기능을 개선하기 위한, 신경변성 장애가 있는 대상체를 치료하기 위한, 또는 대상체에서 신경변성 장애의 발병을 완화, 치료 또는 지연시키기 위한, 또는 마크로파지 또는 단핵구의 결함 또는 결핍과 관련된 질환 또는 장애가 있거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 또는 이의 발병할 위험이 있는 대상체의 치료 또는 예방을 위한 본원에 개시된 방법은 만능성 줄기세포로부터 생성된 미세아교세포 또는 수지상 세포를 투여하는 단계를 포함하지 않는다. 추가 구체예에서, 상기 방법은 상기 생성된 세포를 마크로파지 분화 배지에서 또는 마크로파지 분화 자극제의 존재하에 접촉시키거나 또는 배양하는 단계를 추가로 배제한다. 예를 들어, 이러한 추가 예에서, 만능성 줄기세포로부터 단핵 포식세포 (또는 골수 계통 세포)를 생성하는 방법은 생성된 세포를 (a) IL-34, (b) IL-34 및 GM-CSF, (c) IL-4, (d) IL-4 및 GM-CSF, 또는 (e) M-CSF, 및 IFN-감마 및 IL-4 중 하나 또는 둘 다의 존재하에 배양하거나 또는 접촉시키는 단계를 포함하지 않는다. 즉, 상기 단핵 포식세포를 생성하는 방법은 생성된 세포를 (a) IL-34, (b) IL-34 및 GM-CSF의 조합, (c) IL-4, (d) IL-4 및 GM-CSF의 조합, (e) M-CSF 및 IFN-감마의 조합, 및 (f) M-CSF 및 IL-4의 조합 중 어느 하나와 배양하는 단계를 포함하지 않는다. 다수의 시약들을 "조합"하여 배지에 동시에 또는 후속하여 부가할 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 상기 생성된 세포를 마크로파지 분화 배지 또는 마크로파지 분화 자극제의 존재하에 접촉시키거나 또는 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 만능성 줄기세포로부터 단핵 포식세포 (또는 골수 계통 세포)를 생성하는 방법은 생성된 세포를 (a) IL-34, (b) IL-34 및 GM-CSF, (c) IL-4, 또는 (d) IL-4 및 GM-CSF의 존재하에 배양하거나 또는 접촉시키는 단계를 포함하지 않지만, 그러나 생성된 세포를 M-CSF, 및 IFN-감마 및 IL-4 중 하나 또는 둘 다와 배양하거나 또는 접촉시키는 단계를 포함한다.
구체적으로, 일부 예에서, 만능성 줄기세포로부터 단핵 포식세포를 생성하는 방법은 골수 분화를 유도하는 조건하에 세포 배양 배지에서 만능성 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 배양은 상기 만능성 줄기세포를 BMP-4를 포함하는 제1 조성물과, bFGF, bFGF 및 TGFβ, 또는 bFGF, TGFβ, 아미노부티르산, 피페콜산 및 염화리튬을 함유하는 무혈청 배지에서 접촉시키는 단계를 포함한다. 다양한 양상에서, 상기 배양은 상기 만능성 줄기세포를 BMP-4를 포함하는 제1 조성물과, bFGF, TGFβ, 아미노부티르산, 피페콜산 및 염화리튬 중 모두, 또는 1개, 2개, 3개 또는 4개를 함유하는 mTeSR1 배지에서 접촉시키는 단계를 포함한다.
골수 분화를 유도하는 조건하에 세포 배양 배지에서 만능성 줄기세포를 배양하는 단계는 제1 조성물을 포함하는 단계에서 수득된 세포를, bFGF, VEGF, SCF, 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상 또는 모든 인자를 포함하는 제2 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다양한 양상에서, 상기 세포를 제2 조성물과 접촉시키는 단계는 상기 세포 배양 배지를 제2 조성물을 갖는 것으로 변경하거나, 또는 상기 세포 배양 배지를 제2 조성물과 접촉시키는 단계를 의미한다. 다양한 양상에서, 상기 제2 조성물은 bFGF, VEGF, 또는 SCF, 또는 bFGF, VEGF 및 SCF의 조합으로 구성된 조혈 인자를; 바람직하게는 무혈청 배지에 포함한다.
골수 분화를 유도하는 조건하에 세포 배양 배지에서 만능성 줄기세포를 배양하는 단계는 제2 조성물을 포함하는 단계에서 수득된 세포를, SCF, IL-3, 트롬보포이에틴, M-CSF, FLT3 리간드, 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상 또는 모든 인자를 포함하는 제3 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다양한 양상에서, 상기 세포를 제3 조성물과 접촉시키는 단계는 상기 세포 배양 배지를 제3 조성물을 갖는 것으로 변경하거나, 또는 상기 세포 배양 배지를 제3 조성물과 접촉시키는 단계를 의미한다. 다양한 양상에서, 상기 제3 조성물은 SCF, IL-3, 트롬보포이에틴, M-CSF, 또는 FLT3 리간드, 또는 SCF, IL-3, 트롬보포이에틴, M-CSF, FLT3 리간드의 조합으로 구성된 조혈 인자를; 바람직하게는 무혈청 배지에 포함한다.
골수 분화를 유도하는 조건하에 세포 배양 배지에서 만능성 줄기세포를 배양하는 단계는 제3 조성물을 포함하는 단계에서 수득된 세포를, M-CSF, GM-CSF, FLT3 리간드, 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상 또는 모든 인자를 포함하는 제4 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다양한 양상에서, 상기 세포를 제4 조성물과 접촉시키는 단계는 상기 세포 배양 배지를 제4 조성물을 갖는 것으로 변경하거나, 또는 상기 세포 배양 배지를 제4 조성물과 접촉시키는 단계를 의미한다. 다양한 양상에서, 상기 제4 조성물은 M-CSF, GM-CSF, 또는 FLT3 리간드, 또는 M-CSF, GM-CSF, 및 FLT3 리간드의 조합으로 구성된 조혈 인자를 포함한다.
일 구체예에서, 만능성 줄기세포로부터 단핵 포식세포를 생성하는 방법은 (a) 만능성 줄기세포를 BMP-4를 포함하지만 혈청을 포함하지 않는 제1 조성물과 부착 배양 (adherent culture)으로 배양하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에 의해 수득된 세포를 bFGF, VEGF 및 SCF를 포함하지만 혈청을 포함하지 않는 제2 조성물과 부착 배양으로 배양하는 단계; (c) 상기 단계 (b)에 의해 수득된 세포를 SCF, IL-3, 트롬보포이에틴, M-CSF 및 FLT3 리간드를 포함하지만 혈청을 포함하지 않는 제3 조성물과 부착 배양으로 배양하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에 의해 수득된 세포를 M-CSF, GM-CSF 및 FLT3 리간드를 포함하는 제4 조성물과 부착 배양으로 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 마크로파지 및/또는 단핵구를 생산/수집한다. 대안적으로, 만능성 줄기세포로부터 단핵 포식세포를 생성하는 방법은 현탁 배양 (suspension culture)으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 단계 (d)는 M-CSF, GM-CSF 및 FLT3 리간드를 포함하는 제4 조성물과 현탁 배양으로, 예컨대 생물반응기에서 수행할 수 있다. 표 1은 생물반응기에서 현탁 배양으로 배양된 세포가 살아있음을 보여준다. 현탁 배양으로 배양하는 단계는 세포 배양 배지를 교환할 때 배양물의 상등액에 존재하는 세포를 수집하는 단계, 및 상기 수집된 세포를 다시 세포 배양물에 부가하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 만능성 줄기세포로부터 단핵 포식세포를 생성하는 방법은 하기 4개의 단계들 중 하나 이상을 수행하는 단계를 포함한다: 첫째, 세포 배양물을 배양 배지에서 BMP4를 포함하는 제1 조성물과 접촉시키는 단계로서, 상기 세포 배양물은 초기에 상기 제1 조성물과 접촉하는 경우 상기 세포 배양물은 만능성 줄기세포를 포함하는 것인 단계; 둘째, 상기 세포 배양물을 조혈 세포 배지에서 bFGF, SCF 및 VEGF-A 중 하나 이상 (예: bFGF, SCF 및 VEGF-A 각각)을 포함하는 제2 조성물과 접촉시키는 단계; 셋째, 상기 세포 배양물을 조혈 세포 배지에서 SCF, IL-3, TPO, M-CSF 및 FLT3 리간드 중 하나 이상 (예: SCF, IL-3, TPO, M-CSF 및 FLT3 리간드 각각)을 포함하는 제3 조성물과 접촉시키는 단계; 넷째, 상기 세포 배양물을 조혈 세포 배지에서 M-CSF, FLT3 리간드 및 GM-CSF 중 하나 이상 (예: M-CSF, FLT3 리간드 및 GM-CSF 각각)을 포함하는 제4 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 단핵 포식세포를 생성하는 단계. 일부 구체예에서, 상기 4개의 단계들 모두를 순서대로 수행한다. 다양한 구체예에서, 상기 생성된 단핵 포식세포는 미세아교세포 또는 수지상 세포로 추가로 분화되거나 또는 자극되지 않는다. 추가 구체예에서, 생성된 단핵 포식세포는 마크로파지로 추가로 분화되거나 또는 자극되지 않고; 대안적으로, 생성된 단핵 포식세포는 분화되어 적어도 일부 마크로파지를 수득할 수 있다. 이러한 일부 구체예에서, 이들 4개의 단계들 중 어느 하나에 사용되는 배지는 무혈청 배지이다. 이러한 일부 구체예에서, 이들 4개의 단계들 중 어느 하나에 사용되는 배지는 화학적으로 정의된 배지이다. 이러한 일부 구체예에서, 상기 4개의 단계들 전부 또는 어느 하나의 단계는 세포외 기질-코팅된 디쉬 또는 웰 플레이트에서 수행한다. 일부 양상에서, 상기 세포외 기질은 Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 세포로부터 추출된 재구성된 기저막 제제이다.
일 구체예에서, 만능성 줄기세포로부터 단핵 포식세포를 생성하는 방법은 골 형성 단백질 4 (BMP-4)가 보충된 제1 배지에서 만능성 줄기세포를 인큐베이션하여 제1 배지-처리된 세포를 형성하는 단계; 상기 제1 배지-처리된 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 줄기세포 인자 (SCF)가 보충된 제2-배지에서 인큐베이션하여 제2 배지-처리된 세포를 형성하는 단계; 상기 제2 배지-처리된 세포를 SCF, 인터루킨 3 (IL-3), 트롬보포이에틴 (TPO), 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF) 및 FLT3 리간드가 보충된 제3 배지에서 인큐베이션하여 제3 배지-처리된 세포를 형성하는 단계; 및 상기 제3 배지-처리된 세포를 M-CSF, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 및 FLT3 리간드가 보충된 제4 배지에서 인큐베이션하여 상기 만능성 줄기세포로부터 분화된 단핵 포식세포인 제4 배지-처리된 세포를 형성하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 만능성 줄기세포로부터 단핵구를 생성하는 방법은 BMP-4가 보충된 제1 배지에서 iPSCs를 인큐베이션하여 제1 배지-처리된 세포를 형성하는 단계; 상기 제1 배지-처리된 세포를 bFGF, VEGF 및 SCF가 보충된 제2-배지에서 인큐베이션하여 제2 배지-처리된 세포를 형성하는 단계; 상기 제2 배지-처리된 세포를 SCF, IL-3, TPO, M-CSF 및 FLT3 리간드가 보충된 제3 배지에서 인큐베이션하여 제3 배지-처리된 세포를 형성하는 단계; 및 상기 제3 배지-처리된 세포를 M-CSF, GM-CSF 및 FLT3 리간드가 보충된 제4 배지에서 인큐베이션하여 상기 만능성 줄기세포로부터 분화된 단핵구인 제4 배지-처리된 세포를 형성하는 단계를 포함한다. iPSCs로부터 생성된 수득된 단핵구는 이식, 수혈 또는 기타 이를 필요로 하는 환자에게의 투여에 사용하기에 적합하다.
일부 양상에서 제1 배지는 무-피더 배양 배지 (feeder-free culture medium)인 mTeSR이고 BMP-4가 보충되는 것을 제공한다. BMP-4는 최종 농도 10 내지 200 ng/mL, 또는 40 내지 160 ng/mL, 또는 60 내지 120 ng/mL, 또는 약 80 ng/mL로 제1 배지에 부가될 수 있다. 일부 양상에서, 상기 BMP-4의 농도는 5 ng/mL 내지 150 ng/mL이다. 일부 양상에서, 상기 BMP-4의 농도는 10 ng/mL 내지 100 ng/mL이다. 일부 양상에서, 상기 BMP-4의 농도는 20 ng/mL 내지 80 ng/mL이다. 추가 양상에서, 상기 제1 배지는 mTeSR 맞춤형 배지가 아닌 표준 mTeSR 배지이고; 그러므로 상기 제1 배지는 bFGF, TGFβ, GABA, 피페콜산 및 염화리튬을 함유하는 mTeSR이다. 상기 보충제를 함유하는 이러한 제1 배지는 하나 이상의 새로운 부피로, 약 3일 동안 또는 1일 내지 4일 동안 줄기세포를 배양하는데 사용할 수 있다. 일부 양상에서, 줄기세포의 유지에 적합한 조직 배양 배지가 제1 배지로서 사용된다. 다른 양상에서, 줄기세포의 분화에 적합한 조직 배양 배지가 제1 배지로서 사용된다.
"TeSR"은 hPSCs의 유도 및 장기간 피더-비의존적 배양을 지원하는 것으로 나타난 무혈청, 무-이종 배지 (serum-free, xeno-free medium)이며, Tenneille Ludwig 및 동료들에 의해 개발되었다 (Ludwig TE et al., Nat Biotechnol. 24: 185-7, 2006). "TeSR"의 제제에는 TGF, GABA, 피페콜산 및 염화리튬과 함께, 높은 수준의 bFGF를 포함하였다. Ludwig 등의 이러한 원래 간행물에서는 4가지 인간 성분들 (콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌 및 비트로넥틴)로 구성된 세포 지지 매트릭스의 사용을 설명하였다. Ludwig 및 동료들은 상기 배지에 대한 변형을 추가로 개발하였고 ("mTeSR1"), 이는 일부 동물-유래 단백질을 포함하면서도 완전히 정의되고 무혈청이라는 이점을 유지하고, 피더 세포를 필요로 하지 않고 hPSCs의 자가-재생을 지원한다 (Ludwig TE, et al., Nat Methods 3: 637-46, 2006). Ludwig TE, et al., Nat Methods 3: 637-46, 2006에 따른 mTeSR1 배지는 DMEM/F12, 스톡 B (용해된 소 혈청 알부민, 티아민, 환원된 글루타티온, L-아스코르브산 2-포스페이트 마그네슘 염, 셀레늄, 미량원소 B, 미량원소 C, 인슐린, 홀로-트란스페린 포함), 제브라피시 (zebrafish) bFGF, TGFβ1, 피페콜산, GABA, 염화리튬, 지질, L-글루타민-β 머캅토에탄올, MEM NEAA, 및 NaHCO3를 함유하고, 이는 혼합 시에 NaOH를 사용하여 pH가 7.4가 되도록 조정하고, 결정 NaCl을 사용하여 삼투질농도 (osmolarity)가 340 내지 350 mOsMol이 되도록 조정하고, 바람직하게는 사용 전에 필터-멸균한다.
일부 양상에서 제2 배지는 무혈청 배지, 예를 들어 StemPro-34이고, (1) 최종 농도 5 내지 100 ng/mL, 또는 10 내지 50 ng/mL, 또는 20 ng/mL 내지 35 ng/mL, 또는 약 25 ng/mL의 bFGF; (2) 최종 농도 약 10 내지 200 ng/mL, 약 40 내지 120 ng/mL, 약 60 내지 100 ng/mL, 또는 약 80 ng/mL의 VEGF; 및 (3) 최종 농도 약 10 내지 500 ng/mL, 또는 30 내지 300 ng/mL, 또는 50 내지 150 ng/mL, 또는 80 내지 120 ng/mL, 또는 약 100 ng/mL의 SCF가 보충되는 것을 제공한다. 상기 보충제를 함유하는 제2 배지는 약 2일 동안, 일 4 내지 일 6 동안 세포를 배양하기 위해 하나 이상의 새로운 부피로 사용될 수 있다.
일부 양상에서 제3 배지는 무혈청 배지, 예를 들어 StemPro-34이고, (1) 최종 농도 5 내지 100 ng/mL, 또는 25 내지 75 ng/mL, 또는 40 내지 60 ng/mL, 또는 약 50 ng/mL의 SCF; (2) 최종 농도 5 내지 100 ng/mL, 또는 25 내지 75 ng/mL, 또는 40 내지 60 ng/mL, 또는 약 50 ng/mL의 IL-3; (3) 최종 농도 0.5 내지 20 ng/mL, 또는 1 내지 10 ng/mL, 또는 3 내지 7 ng/mL, 또는 약 5 ng/mL의 TPO; (4) 최종 농도 5 내지 100 ng/mL, 또는 25 내지 75 ng/mL, 또는 40 내지 60 ng/mL, 또는 약 50 ng/mL의 M-CSF; 및 (5) 최종 농도 5 내지 100 ng/mL, 또는 25 내지 75 ng/mL, 또는 40 내지 60 ng/mL, 또는 약 50 ng/mL의 FLT3 (또는 FLT3 리간드)가 보충되는 것을 제공한다. 상기 보충제를 함유하는 제3 배지는 약 6일 또는 7일 동안, 예를 들어 일 6 내지 일 12 또는 일 13 동안 세포를 배양하기 위해 하나 이상의 새로운 부피로 사용될 수 있다.
일부 양상에서 제4 배지는 무혈청 배지, 예를 들어 StemPro-34이고, (1) 최종 농도 5 내지 100 ng/mL, 또는 25 내지 75 ng/mL, 또는 40 내지 60 ng/mL, 또는 약 50 ng/mL의 M-CSF; (2) 최종 농도 약 5 내지 50 ng/mL, 또는 10 내지 40 ng/mL, 또는 20 내지 30 ng/mL, 또는 약 25 ng/mL의 GM-CSF; 및 (3) 최종 농도 5 내지 100 ng/mL, 또는 25 내지 75 ng/mL, 또는 40 내지 60 ng/mL, 또는 약 50 ng/mL의 FLT3 (또는 FLT3 리간드)가 보충되는 것을 제공한다.
추가 양상에서는 스테이지 2-4에서 임의의 적합한 조혈 세포 배지가 제2, 제3 및 제4 배지로서 사용될 수 있다는 것을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 조혈 세포 배지는 "StemPro-34"이다. StemPro-34 배지의 조성은 당해 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들어 EP 0891419 (또는 US20040072349, US20100297090) (명칭 "Hematopoietic Cell Culture Nutrient Supplement") 및 WO1997033978 (또는 US20040072349, US20100297090)에 기재되어 있고, 이들의 내용은 본원에 참조로 통합된다. 그러나, 당업자는 조혈 세포를 배양하는데 사용하기 위한 이의 적합성의 측면에서 StemPro-34 배지와 동등한 여러 가지 다른 타입의 배지가 있음을 인식할 것이며, 이들 중 어느 하나가 사용될 수 있다.
다양한 경우에, 각 단계에서 사용되는 조혈 인자를 포함한 사이토카인 또는 유사물의 농도는 관심 세포가 상기 농도로 수득될 수 있는 한 제한되지 않는다. 일부 양상에서, 각 단계에서 세포 배양 배지 중 bFGF의 농도는 10 ng/mL 내지 100 ng/mL이다. 일부 양상에서, 각 단계에서 세포 배양 배지 중 bFGF의 농도는 20 ng/mL 내지 50 ng/mL이다. 일부 양상에서, 각 단계에서 세포 배양 배지 중 bFGF의 농도는 약 25 ng/mL이다. 일부 양상에서, 각 단계에서 세포 배양 배지 중 VEGF의 농도는 20 ng/mL 내지 100 ng/mL이다. 일부 양상에서, 각 단계에서 세포 배양 배지 중 VEGF의 농도는 30 ng/mL 내지 70 ng/mL이다. 일부 양상에서, 각 단계에서 세포 배양 배지 중 VEGF의 농도는 약 50 ng/mL이다. 일부 양상에서, 각 단계에서 세포 배양 배지 중 SCF의 농도는 20 ng/mL 내지 100 ng/mL이다. 일부 양상에서, 각 단계에서 세포 배양 배지 중 SCF의 농도는 30 ng/mL 내지 70 ng/mL이다. 일부 양상에서, 각 단계에서 세포 배양 배지 중 SCF의 농도는 약 50 ng/mL이다. IL-3의 경우, 농도는 일부 경우에 5 ng/mL 내지 100 ng/mL이다. IL-3의 농도는 일부 양상에서 30 ng/ml 내지 70 ng/ml일 수 있다. 다른 양상에서, IL-3의 농도는 약 50 ng/ml일 수 있다. TPO의 경우, 농도는 1 ng/mL 내지 25 ng/mL이다. 일부 양상에서, TPO의 농도는 바람직하게는 1 ng/mL 내지 10 ng/mL이다. 일부 양상에서, TPO의 농도는 약 5 ng/mL이다. Flt3-리간드 (FLT3L)의 경우, 농도는 다양한 양상에서 10 ng/ml 내지 100 ng/ml이다. 일부 양상에서, FLT3L의 농도는 30 ng/ml 내지 70 ng/ml이다. 일부 양상에서, FLT3L의 농도는 약 50 ng/ml이다. GM-CSF의 경우, 농도는 다양한 양상에서 5 ng/ml 내지 100 ng/ml이다. 일부 양상에서, GM-CSF의 농도는 바람직하게는 10 ng/ml 내지 50 ng/ml이다. 일부 양상에서, GM-CSF의 농도는 약 25 ng/ml이다. M-CSF의 경우, 농도는 다양한 양상에서 5 ng/ml 내지 100 ng/ml이다. 일부 양상에서, M-CSF의 농도는 바람직하게는 30 ng/ml 내지 70 ng/ml, 또는 더 바람직하게는 50 ng/ml이다.
다양한 양상에서, 만능성 줄기세포 (바람직하게는 iPSCs)로부터 단핵 포식세포를 생성하는 방법은 하기 조합으로 각 인자들을 사용하는 것을 포함한다:
제1 세포 배양 배지에서, BMP-4는 60 ng/mL 내지 100 ng/mL이고;
제2 세포 배양 배지에서, bFGF는 15 ng/mL 내지 30 ng/mL이고, VEGF는 60 ng/mL 내지 100 ng/mL이고, SCF는 80 ng/mL 내지 120 ng/mL이고;
제3 세포 배양 배지에서, SCF는 40 ng/mL 내지 60 ng/mL이고, IL-3은 40 ng/mL 내지 60 ng/mL이고, TPO는 4 ng/mL 내지 6 ng/mL이고, M-CSF는 40 ng/mL 내지 60 ng/mL이고, FLT3L은 40 ng/mL 내지 60 ng/mL이고;
제4 세포 배양 배지에서, M-CSF는 40 ng/mL 내지 60 ng/mL이고, GM-CSF는 15 ng/mL 내지 30 ng/mL이고, FLT3L은 40 ng/mL 내지 60 ng/mL이다.
다양한 구체예는 또한, 각 단계의 기간의 측면에서, 상기 단계 (a) (또는 "스테이지 1")가 2일 이상, 바람직하게는 2일 이상 6일 이하, 더 바람직하게는 4일 동안 수행되는 것을 제공한다. 상기 단계 (b) (또는 "스테이지 2")는 1일 이상, 바람직하게는 1일 이상 5일 이하, 더 바람직하게는 2일 동안 수행된다. 상기 단계 (c) (또는 "스테이지 3")는 5일 이상, 바람직하게는 6일 이상 14일 이하, 더 바람직하게는 9일 동안 수행된다. 상기 단계 (d) (또는 "스테이지 4")는 3일 이상, 바람직하게는 3일 이상 90일 이하 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 단계 (d) (또는 "스테이지 4")는 적어도 55일 또는 60일, 최대 약 90일 동안 수행된다.
일부 구체예에서, 생성된 단핵 포식세포는 적어도 1×106개 세포의 임상적으로 관련된 수로 성장하도록 생물반응기에서 추가로 배양된다. 일부 구체예에서, 만능성 줄기세포로부터 단핵 포식세포를 생성하는 방법은 단계 (a) ("스테이지 1"), 단계 (b) ("스테이지 2"), 단계 (c) ("스테이지 3"), 또는 단계 (d) ("스테이지 4") 중 어느 하나로부터 출발하여, 생물반응기에서 수행된다. 실시예 3에서 입증된 바와 같이, 만능성 줄기세포로부터 생성되고, 생물반응기에서 증식되는 (1-10일, 11-20일, 21-30일, 31-40일, 41-50일, 50-60일, 또는 초과의 다양한 일수 동안) 단핵 포식세포는 웰-플레이트에서 생성된 것과 유사한 유전자 발현 프로파일 및 단핵구/마크로파지 마커 발현 수준을 나타낸다.
당해 기술 분야에 알려진 생물반응기는 일반적으로 iMPs를 성장시켜서 투여를 위해 임상적으로 관련된 수를 수득하는데 적합하다. 예시되는 생물반응기는 교반기 탱크 생물반응기 (stirrer tank bioreactors)라고도 불리는 교반 플라스크를 포함하고, 여기서 임펠러 혼합은 세포를 현탁 상태로 유지하고, 유체 이동은 영양분 및 폐기물의 대량 수송을 돕는다. 교반 플라스크에 추가하여, 본 발명자들은 또한 iMPs의 생산을 스케일업하기 위해 락커 백 시스템 (rocker bag system) 및/또는 G-REX® 시스템을 사용하는 것을 고려한다. 예를 들어, 락커 백 시스템은 락커 (베이스 (base)를 포함하고, 트레이 형태의 플랫폼을 제공하고, 선택적으로 히터 및/또는 열전대를 추가로 포함함) 및 하나 이상의 세포 배양 락커 백 (세포 배양물을 봉입하기 위한 것으로, 플랫폼에 배치하기에 적합함)을 포함한다. 상기 락커는 부드럽고 효율적인 혼합 및 기체 전달을 제공하는 유연한-락킹, 웨이브 모션 (smooth-rocking, wave motion)을 생성한다. 세포 배양 락커 백은 일반적으로 유체 및/또는 공기를 백의 안팎으로 가져오고 내보내는 포트를 포함한다. G-REX®는 기체 투과성 급속 팽창을 의미한다. G-REX 생물반응기는 세포가 영양분과 산소에 무제한으로 방해받지 않고 접근할 수 있도록 하여 다량의 세포를 생산함으로써, 통합 시스템에 필요한 배지 교환 및 복잡한 하드웨어를 제거한다.
다양한 구체예에서, 본원에 개시된 방법에서 만능성 줄기세포 (예: iPSCs)로부터 생성된 골수 단핵구 세포 또는 단핵 포식세포는 단핵구/마크로파지 마커 예컨대 CD14, CD16, CD64, CD11b, CD11c, CD71에 대해 양성이며, 이에 의해 iMPs로 지칭되고 (iPSCs로부터 생성된 단핵 포식세포), 또는 iPSCs로부터 생성된 단핵구 및/또는 iPSCs로부터 생성된 마크로파지 (우선권 출원 US 63/234,984에서 iMACs로 지칭됨)를 포함하는 다양한 경우에, 조혈 줄기세포 마커 CD34가 더 이상 또는 거의 발현되지 않는다. 다양한 구체예에서, 줄기세포 (예: iPSCs)로부터 생성된 단핵 포식세포는 미세아교세포가 아니며, 이는 그 분화 방법이 미세아교세포 배지에서 생성된 임의의 세포를 배양하는 단계를 포함하지 않기 때문이다. 분화된 단핵 포식세포는 수확할 때까지 4가지 배지 (보충제 포함)의 새로운 부피로 배양할 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 분화 방법은 각 스테이지에서 배지의 새로운 부피를 보충하여 세포를 증폭시키는 단계, 및 선택적으로 세포를 계대시키는 단계를 추가로 포함하거나 또는 수반한다. 일부 구현에서, 수확된 세포는 선택적으로 일부 희석 또는 농축하여, 대상체에게 직접 투여된다. 다양한 구체예에서, 제4 배지-처리된 세포로부터 수확된 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 단핵구이다. 바람직하게는 제4 배지 이후에 수확된 세포의 적어도 50%는 단핵구이다. 더 바람직하게는 제4 배지 이후에 수확된 세포의 적어도 70% 또는 약 70%는 단핵구이다. 단핵구/마크로파지 마커를 발현하는 세포의 퍼센트를 결정하기 위해 항원을 표적으로 하는 항체 예컨대 CD34, CD11b, CD11c, CD14, 및 CD16을 사용하여 세포를 분석할 수 있다.
다른 구현에서, 줄기세포로부터 유래된 수확된 단핵 포식세포는 보관 및 운송 단계 중에 제품 안정성을 유지하기 위해 동결보존된다. 일부 양상에서, 상기 방법으로부터 생성된 수확된 단핵 포식세포는 예를 들어 CD14의 마커에 의해 정제된다. CD14-양성 세포의 정제는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있으며, 해당 방법은 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 세포는 CD14 MicroBeads 또는 유세포 분석기를 사용하여 정제될 수 있다. 일부 양상에서, 단핵 포식세포는 하나 이상의 마커에 의한 추가 분류 없이, 특히 마커 C3CR1에 의해 분류되지 않고 수확된다.
다양한 구체예에서, 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵 포식세포의 유의미한 양이 생물반응기에서 배양될 수 있으며, 예를 들어 적어도 1×106, 1×107, 또는 1×108 (2 이상의 도스를 함유하는 요법에서 도스당, 또는 요법당) 정도의 임상적으로 의미있는 양을 달성할 수 있고, 바람직하게는 생물반응기에서 배양된 단핵 포식세포는 적어도 5일, 10일, 2주, 3주, 4주 또는 초과의 기간에 걸쳐 유전자 프로파일 (마크로파지 마커 또는 단핵구/마크로파지 마커의 발현양 포함)을 유지한다. 일부 구체예에서, 생물반응기 배양 또는 냉동 보관에서 일정 기간 (예: 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 또는 초과) 후에, 생물반응기에서의 배양을 통해 특히 임상적으로 의미있는 양으로, 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵 포식세포는 ("스테이지 4" 분화 후 7일 이내에 수집될 수 있는) 만능성 줄기세포로부터 새로 생성된 단핵 포식세포와 비교하여, 유전자 프로파일 (단핵구/마크로파지 마커의 발현양 포함)을 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 또는 50%의 수준으로 유지한다.
특히, 다양한 구체예에서, 생성된 iMPs는 자연 발생 단핵구 또는 자연 발생 마크로파지 또는 자연 발생 단핵 포식세포와 비교하여 차등적 유전자 발현을 갖는다. 생성된 iMPs는 유사한 마커에 대해 양성일 수 있으며, 특히 인 비보 기능 테스트에서 자연 발생 대응물과 유사하게 거동하고, 이에 의해 실시예에서 입증된 바와 같이 치료적 효능을 가질 수 있다. iPSCs 또는 자연 발생 마크로파지/단핵구는 모두 증식성이 없지만, 실시예 2 및 3에 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명은 iPSCs로부터 분화된 낭포 (cysts)를 제공하여, iMPs는 낭포로부터 분리되어 (bud off) 생산 과정에서 치료적 양 (또는 임상적으로 의미있는 양)으로 확장될 수 있다.
상기 방법의 다양한 구체예에서, 단핵 포식세포의 집단을 포함하는 조성물은 대상체에게 2회 이상의 노출로 투여된다. 일 구체예에서, 상기 단핵 포식세포의 집단을 포함하는 조성물은 대상체에게 적어도 3회의 도스로 투여된다. 일 구체예에서, iPSCs로부터 생성된 단핵 포식세포의 집단을 포함하는 조성물은 대상체에게 4-10회의 용량으로 투여된다. 일 구체예에서, iPSCs로부터 생성된 단핵 포식세포의 집단을 포함하는 조성물은 대상체에게 6-12회 용량으로 투여된다. 일부 구현에서, 상기 조성물은 대상체에게 매주, 격주, 격월 또는 월 단위로, 또는 필요에 따라 투여된다. 일부 구현에서, 대상체에 대한 각 노출의 조성물은 적어도 106개 세포, 107개 세포, 108개 세포, 109개 세포, 1010개 세포, 또는 1011개의 세포를 포함할 수 있다. 다양한 구현에서, 세포의 치료적으로 유효한 양은 환자의 필요, 연령, 생리학적 상태 및 건강 상태, 및 도달하려는 조직 크기 및 치료 목표, 이식 부위, 병리학 정도 (뉴런 수준의 악화), 선택된 이동 방식 및 치료 전략에 따라 달라진다. 일부 구현에서, 저용량의 세포가 반복적으로 이식된다. 이들 세포는 신경 급성 또는 만성 손상의 치료, 및/또는 신경변성 질환 및 신경 질환의 발병 지연, 이의 완화 또는 치료에 사용될 수 있다.
치료 방법의 다양한 구체예는 노령 포유동물, 예를 들어 적어도 50세, 적어도 60세, 적어도 70세, 적어도 80세, 또는 적어도 90세의 인간을 위한 것이다.
다른 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머병이 발병하거나 또는 이로 진단된 대상체를 위한 것이다. 추가 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 아밀로이드 및 미세아교세포 활성화가 검출되는 경우와 같이, 알츠하이머병의 병리를 처음으로 나타내는 대상체를 위한 것이다. 또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 적어도 6개월, 1년, 2년 또는 초과 동안 알츠하이머병을 유의미하게 앓고 있거나 또는 알츠하이머병으로 진단된 대상체를 위한 것이고, 상기 방법은 병리를 완화하거나 또는 역전시킨다. 특정 구체예에서, 상기 방법의 신경변성 질환 또는 신경 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 다발성 경화증, Rett 증후군, 구형체를 동반한 미만성 백질뇌병증 (diffuse leukoenchephalopathy with spheroids), 축삭 구형체를 동반한 유전성 미만성 백질뇌병증 (hereditary diffuse leukoenchephalopathy with axonal spheroids), FTLD (frontotemporal lobar degeneration), 가족성 FTLD, 정신분열증, 자폐 스펙트럼 장애, 헌팅턴 무도병, 루이체 치매 (dementia with Lewy body), 소뇌 운동실조, 스타인-레벤탈 증후군 (stein-leventhal syndrome), 척수 손상, 간질, 국소 허혈군으로 졸중되는 그룹 (group that apoplexy becomes with local ischemia group)으로부터 선택된다.
추가 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 알츠하이머병 (예: 알츠하이머병의 징후 또는 증상을 나타내거나, 또는 이로 진단됨)을 앓고 있지만, 근위축성 측삭 경화증 (ALS)을 앓고 있지 않은 대상체를 위한 것이다.
추가 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 마크로파지 결핍, 또는 마크로파지의 결함 또는 결핍과 관련된 질환 또는 장애가 있는 대상체를 위한 것이므로, iPSCs로부터 생성된 단핵 포식세포를 투여하면 투여 후 대상체에서 마크로파지를 생성할 수 있다.
다양한 구체예는 본원에 개시된 방법이 만능성 줄기세포로부터 생성된 단핵 포식세포를 투여하기 위한 신경변성 질환을 앓고 있거나, 이의 징후를 보이거나, 또는 이의 발병할 위험이 있는 대상체를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 것을 제공한다. 다양한 구체예는 본원에 개시된 방법이 신경변성 질환을 앓고 있거나, 이의 징후를 보이거나, 또는 이로 발병할 위험이 있는 대상체로부터 자가 체세포 (예: 섬유아세포, 혈액 세포)를 수득한 다음에, 자가 체세포로부터 iPS 세포를 당해 기술 분야에 알려진 재프로그래밍 과정에 의해 생성하여, 대상체에게 투여하기 위한 iPS 세포로부터 생성된 단핵 포식세포를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 제공한다. 추가 구체예는 본원에 개시된 방법이 생물반응기에서 적어도 1×106개 또는 1×107개의 세포를 수득하기 위해 생성된 단핵 포식세포를 성장시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 제공한다.
추가 구체예는 만능성 줄기세포로부터 단핵 포식세포 (또는 골수 단핵구 세포 또는 골수 계통 세포)를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
상기 줄기세포를 골 형성 단백질 4 (BMP-4)가 보충된 제1 배지에서 인큐베이션하여 제1 배지-처리된 세포를 형성하는 단계;
상기 제1 배지-처리된 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 줄기세포 인자 (SCF)가 보충된 제2 배지에서 인큐베이션하여 제2 배지-처리된 세포를 형성하는 단계;
상기 제2 배지-처리된 세포를 SCF, 인터루킨 3 (IL-3), 트롬보포이에틴, 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF) 및 FLT3 리간드가 보충된 제3 배지에서 인큐베이션하여 제3 배지-처리된 세포를 형성하는 단계; 및
상기 제3 배지-처리된 세포를 M-CSF, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 및 FLT3 리간드가 보충된 제4 배지에서 인큐베이션하여 줄기세포로부터 분화된 마크로파지 또는 단핵구인 제4 배지-처리된 세포를 형성하는 단계,
상기 방법은 IL-34, 또는 IL-34 및 GM-CSF의 조합, 또는 IL-4, 또는 IL-4 및 GM-CSF의 조합, 또는 M-CSF 및 IFN-감마의 조합, 또는 M-CSF 및 IL-4의 조합의 존재하에 배양하는 단계를 포함하지 않는다.
상기 분화 방법의 일부 양상에서, 상기 방법은 제4 배지-처리된 세포를 미세아교세포 분화 배지 또는 수지상 세포 분화 배지에서 인큐베이션하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 양상에서, 상기 제4 배지-처리된 세포의 적어도 50%는 단핵구이거나; 또는 단계 (d) (또는 "스테이지 4")로부터 수득된 세포는 마커 CD14, CD16, CD64, CD11b, CD11c, 및 CD71의 발현을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 단핵 포식세포 (단핵구 및 마크로파지 포함)이다. 상기 분화 방법의 일부 양상에서, 생성된 단핵 포식세포는 미세아교세포가 아니고, 수지상 세포가 아니며, 생성된 단핵 포식세포는 CD11b, CD11c, CD14, 및 CD16의 하나 이상의 마커에 대해 양성이다.
일부 양상에서, 상기 단핵 포식세포는 대상체, 예를 들어 건강한 인간 대상체, 젊은 인간 (예: 5-11세, 12-16세, 17-18세, 19-21세, 22-34세, 또는 35-49세의 연령 그룹 내의 연령의 인간), 또는 젊고 건강한 인간 대상체로부터 혈액 세포, 바람직하게는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 재프로그래밍하여 제조된 iPSC로부터 분화된다. 추가 구체예에서, 상기 단핵 포식세포는 대상체로부터 수득된 섬유아세포를 재프로그래밍하여 제조된 iPSC로부터 분화된다.
일부 구체예에서, 혈액 세포를 iPSCs로 재프로그래밍하는 방법은 WO2017219000, US 특허 제10,221,395호, 및 US 특허 제10,745,671호에 개시되고, 이는 본원에 참조로 통합된다. 예를 들어, 혈액 세포 유래 iPSC를 생성하는 방법은 Oct-4, Sox-2, Klf-4, 1-Myc, Lin-28, SV40 대형 T 항원 ("SV40LT"), 및 shRNA-p53 (short hairpin RNAs targeting p53)을 포함하는 재프로그래밍 인자 및 EBNA1의 일정량을 일정량의 혈액 세포에 전달하는 단계; 및 상기 혈액 세포를 재프로그래밍 배지에서 적어도 4일 동안 배양하는 단계를 포함하고, 상기 EBNA1 및 재프로그래밍 인자를 전달하고 재프로그래밍 배지에서 배양하여 혈액 세포 유래 유도 만능성 줄기세포를 생성하고, 상기 재프로그래밍 인자는 Oct4, Sox2, SV40LT 및 Klf4를 코딩하는 제1 벡터, Oct4 및 shRNA-p53을 코딩하는 제2 벡터, Sox2 및 Klf4를 코딩하는 제3 벡터, 및 1-Myc 및 Lin-28을 코딩하는 제4 벡터를 포함하는 4개의 oriP/EBNA1 유래 벡터에 코딩되고; 제5 oriP/EBNA1 유래 벡터는 EBNA1을 코딩한다.
일부 양상에서, 상기 단핵 포식세포는 종 (species) 유래의 줄기세포 또는 유도 만능성 줄기세포로부터 분화되고, 동일한 종의 대상체를 치료하는데 사용된다. 일부 양상에서, 상기 단핵 포식세포는 젊은 연령의 종으로부터의 줄기세포 또는 유도 만능성 줄기세포로부터 분화되고, 예를 들어 상기 줄기세포는 해당 종의 평균 수명의 전반부보다 더 젊은 연령의 종의 대상체로부터 수득된 체세포로부터 수득되거나 또는 재프로그램된다. 일부 양상에서, 단핵 포식세포는 4개월령 미만, 예를 들어 3-4개월령, 2-3개월령, 1-2개월령의 마우스로부터 수득된 마우스 줄기세포로부터 분화된다. 일부 양상에서, 상기 단핵 포식세포는 10대 초반, 20대, 또는 30대, 또는 40대 초반의 인간의 체세포로부터 재프로그램된 iPSCs로부터 생성되고, 인간이 노화 또는 신경변성 질환 또는 장애를 나타내는 경우 사용된다. 또 다른 양상에서, 상기 단핵 포식세포는 인지 장애 또는 신경변성 질환/장애가 있는 인간 대상체, 또는 노령의 인간 대상체 (예: 적어도 40세, 적어도 50세, 적어도 60세, 적어도 70세, 또는 적어도 80세)로부터 분화된다. 또 다른 양상에서, 상기 단핵 포식세포는 노령의 마우스, 예를 들어 약 11-13개월령 마우스로부터 분화된다.
다양한 구체예에서, 본 발명은 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 줄기세포로부터 유래되는, 예를 들어 유도 만능성 줄기세포로부터 분화된 단핵 포식세포의 집단을 포함한다. 일부 구체예에서, 환자 자신 (자가)의 세포를 사용하여 단핵 포식세포를 유도한다. 다른 구체예에서, 공여된 (동종) 세포를 사용하여 단핵 포식세포를 유도한다. 줄기세포로부터 분화된 단핵 포식세포는 투여 전까지 액체 현탁액 또는 제제로 유지할 수 있다.
상기 개시된 방법은 인지 기능 및/또는 신경 건강을 개선할 수 있다. 예를 들어, 치료한 대상체는 치료 전 대상체의 상태와 비교하여, 개선된 공간 작업 기억 및/또는 개선된 단기 기억을 가질 수 있다. 치료한 대상체는 또한 대조군과 비교하여, 증가된 수준의 시냅스 수송체, 증가된 미세아교세포 수준 및/또는 증가된 성상세포 수준을 가질 수 있다. 일부 양상에서, 상기 대조군은 본원에 개시된 세포 요법으로 치료하지 않은 신경변성 장애가 있는 대상체일 수 있다. 다른 양상에서, 대조군은 치료 전의 대상체의 기저선 수준일 수 있다. 대안적으로, 상기 치료한 대상체는 젊고 및/또는 건강한 대상체와 유사한 인지 기능 또는 신경 건강을 나타낼 수 있다.
본원에 개시된 분화 방법에 의해 줄기세포로부터 분화된 단핵 포식세포가 또한 제공된다. 다양한 양상에서, 본원에 개시된 방법에 의해 iPSCs로부터 생성된 단핵구가 제공된다. 다양한 구현에서, 유도 만능성 줄기세포로부터 분화된 단핵 포식세포는 하나 이상의 부형제와 함께, 조성물 또는 약학적 조성물로 제공된다.
바람직하게는, 상기 단핵 포식세포는 생성된 단핵 포식세포가 종종 확장 후에 투여될 대상체의 자가 줄기세포로부터 분화된다. 예를 들어, 포유동물 유래의 혈액 세포, 또는 섬유아세포 또는 다른 체세포는 유도 만능성 줄기세포로 재프로그램된 다음에, 본원에 개시된 분화 방법에 의해 단핵 포식세포로 분화되고; 수득된 단핵 포식세포는 인지 기능 개선이 필요하거나 또는 신경변성 장애를 앓고 있는 상기 포유동물에게 주입/이식되거나 또는 달리 주사된다. 다른 예에서, 건강하거나 또는 젊은 포유동물의 체세포는 유도 만능성 줄기세포로 재프로그램되고; 수득된 단핵 포식세포는 인지 기능 개선이 필요하거나 또는 신경변성 장애를 앓고 있는 포유동물에게 주입, 이식 또는 주사된다. 일 구체예에서, 다능성 줄기세포 (multipotential stem cell)는 마우스, 돼지, 원숭이, 양 또는 인간의 배아 줄기세포이다. 다른 구체예에서, 실험자 (experimenter)는 환자, 더욱 바람직하게는 인간 환자이고, 다능성 줄기세포는 인간 환자 자신의 조직 세포로부터 재프로그램된다. 체세포를 유도 만능성 줄기세포 (또는 다능성 줄기세포)로 재프로그래밍하기 위한 추가 절차가 알려져 있으며, 예를 들어 Zhao et al., iScience 23, 101192, 2020 및 U.S. 특허 제9,534,205호, 제9,394,524호, 제9,540,615호, 및 제9,771,563호에 기재되어 있고, 이는 본원에서 참조로 통합된다.
일부 구체예는 대상체에서 염증을 감소시키거나 또는 염증 관련 질환이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 iPSCs로부터 생성된 단핵 포식세포를 포함하는 약학적 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 단핵 포식세포는 iPSCs로부터 하기 단계를 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성된 방법에 의해 생성된다:
상기 iPSCs를 골 형성 단백질 4 (BMP-4)가 보충된 제1 배지에서 인큐베이션하여 제1 배지-처리된 세포를 형성하는 단계;
상기 제1 배지-처리된 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 줄기세포 인자 (SCF)가 보충된 제2 배지에서 인큐베이션하여 제2 배지-처리된 세포를 형성하는 단계;
상기 제2 배지-처리된 세포를 SCF, 인터루킨 3 (IL-3), 트롬보포이에틴, 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF) 및 FLT3 리간드가 보충된 제3 배지에서 인큐베이션하여 제3 배지-처리된 세포를 형성하는 단계; 및
상기 제3 배지-처리된 세포를 M-CSF, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 및 FLT3 리간드가 보충된 제4 배지에서 인큐베이션하여 상기 iPSC로부터 분화된 단핵 포식세포인 제4 배지-처리된 세포를 형성하는 단계.
일부 구체예는 대상체에서 인지 기능을 개선하거나, 또는 신경변성 장애가 있는 대상체를 치료하거나, 또는 대상체에서 신경변성 장애의 발병을 완화, 치료 또는 지연시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 iPSCs로부터 생성된 단핵 포식세포를 포함하는 약학적 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 단핵 포식세포는 iPSCs로부터 하기 단계를 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성된 방법에 의해 분화된다:
상기 iPSCs를 골 형성 단백질 4 (BMP-4)가 보충된 제1 배지에서 인큐베이션하여 제1 배지-처리된 세포를 형성하는 단계;
상기 제1 배지-처리된 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 줄기세포 인자 (SCF)가 보충된 제2 배지에서 인큐베이션하여 제2 배지-처리된 세포를 형성하는 단계;
상기 제2 배지-처리된 세포를 SCF, 인터루킨 3 (IL-3), 트롬보포이에틴, 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF) 및 FLT3 리간드가 보충된 제3 배지에서 인큐베이션하여 제3 배지-처리된 세포를 형성하는 단계; 및
상기 제3 배지-처리된 세포를 M-CSF, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 및 FLT3 리간드가 보충된 제4 배지에서 인큐베이션하여 상기 iPSC로부터 분화된 단핵 포식세포인 제4 배지-처리된 세포를 형성하는 단계.
일부 구체예에서, 상기 대상체는 노령의 인간이다. 일부 구체예에서, 상기 대상체는 알츠하이머병 및/또는 근위축성 측색 경화증을 앓고 있다. 일부 구체예에서, 상기 iMPs를 포함하는 약학적 조성물은 정맥내로 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 iMPs를 포함하는 약학적 조성물은 복강내 주사를 통해 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 행동 분석 (학습 및 기억 연구), 신경 건강 검사 및 염증 수준 측정 중 하나 이상을 추가로 수행하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 줄기세포로부터 분화된 단핵 포식세포를 포함하는 약학적 조성물의 투여 후에 상기 대상체는 치료 전 대상체의 기저선에 비해, 하나 이상의 행동 연구에 의해 분석 시에 개선된 신경 건강, 인지 기능, 및/또는 감소된 염증 수준을 나타낸다.
다양한 양상에서, 본원에 개시된 하나 이상의 방법은 신경변성 장애가 있지만 마크로파지 또는 단핵구를 사용한 치료를 받지 않은 대조군 대상체와 비교하여, 개선된 인지 기능 (예: 하나 이상의 행동 테스트에서 특성화됨) 또는 개선된 수준의 시냅스 수송 (예: VGLUT1)을 유도한다.
다른 양상에서, 본원에 개시된 하나 이상의 방법은 만능성 줄기세포로부터 생성된 마크로파지 및/또는 단핵구를 사용한 치료를 받기 전의 대상체의 기저선 수준인 대조군 수준과 비교하여, 개선된 인지 기능 (예: 하나 이상의 행동 테스트에서 특성화됨) 또는 개선된 수준의 시냅스 수송 (예: VGLUT1)을 유도한다.
상기 약학적 조성물은 세포를 안정화시키거나 또는 생리학적 삼투질농도를 제공하기 위해 첨가되는 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체, 예컨대 완충제, 염, 폴리머, 단백질 및 보존제를 함유할 수 있다. "약학적으로 허용 가능한 부형제 (pharmaceutically acceptable excipient)"는 일반적으로 안전하고, 무독성이며, 바람직한 약학적 조성물을 제조하는데 유용한 부형제를 의미하며, 수의학적 용도뿐만 아니라 인간의 약학적 용도에도 허용 가능한 부형제를 포함한다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체일 수 있다. 제제화 및 환자 사용 전에 세포의 최종 수확물에는 세포 배양 보충제의 잔여량을 포함할 수 있다. 그러므로, 본원에 개시된 조성물은 제제에 사용되는 성분 및 최종 제품에 남아 있을 수 있는 보조 물질 (예: 세포 배양 보충제)을 지칭하는 부형제를 포함할 수 있다.　 부형제의 예로는 인간 혈청 알부민, 디메틸 설폭시드 (DMSO), 염화칼슘, 염화칼륨, 염화나트륨, 소듐 락테이트, 물, 덱스트란 및 이들의 조합을 포함되지만 이에 한정되지 않는다. "약학적으로 허용 가능한 담체"는 관심 화합물을 신체의 한 조직, 장기 또는 일부에서 신체의 다른 조직, 장기 또는 일부로 운반하거나 또는 수송하는데 관여하는 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 예를 들어, 상기 담체는 액체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 담체는 접촉할 수 있는 임의의 조직 또는 장기와 접촉하여 사용하기에 적합하며, 이는 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 치료적 유익보다 지나치게 가중되는 임의의 다른 합병증의 위험이 없어야 한다.
다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 임의의 투여 경로를 통해 전달되도록 제제화될 수 있다. "비경구 (parenteral)"는 안와내, 주입, 동맥내, 피막내, 심장내, 피부내, 근육내, 복강내, 폐내, 척수내, 흉골내, 척수강내, 자궁내, 정맥내, 지주막하 (subarachnoid), 피막하 (subcapsular), 피하, 경점막 또는 경기도 (transtracheal)를 포함하는, 일반적으로 주사와 관련된 투여 경로를 의미한다. 비경구 경로를 통해, 상기 조성물은 주입 또는 주사용 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 전형적으로, 상기 조성물은 주사로 투여된다. 이들 투여 방법은 당업자에게 알려져 있다.
추가 구체예에서, 개시된 치료 및/또는 예방 방법은 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머병이 있는 대상체에게 하나 이상의 약물 또는 표준 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약물 또는 표준 요법과 동시에 투여된다. 일부 구현에서, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약물 또는 표준 (현재 승인된) 요법과 별도로 투여된다. 적합한 약물 또는 현재 승인된 요법에는 갈란타민, 리바스티그민, 도네페질, 메만틴, 아두카누맙 (아밀로이드-β의 응집된 형태를 표적으로 하는 인간 항체)을 포함한다.
추가적인 구체예는 본원에 기재된 바와 같이 생성되거나, 또는 본원에 기재된 방법을 사용하여 생산된 단핵 포식세포를 사용하는 약물 스크리닝 방법을 제공하며, 이는 고처리량 스크리닝 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명은 단핵구 및/또는 마크로파지의 결함 또는 결핍과 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 단핵 포식세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계, 및 상기 후보 화합물이 단핵구 또는 마크로파지의 결함 또는 결핍을 개선하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 화합물을 확인하는 방법은 고처리량 방법이다. 일부 구체예에서, 확인된 화합물은 인간 또는 포유동물의 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 유용하다. 일부 구체예에서, 상기 단핵 포식세포는 자가이거나, 또는 자가 체세포로부터 재프로그램된 iPSCs를 포함하는 자가 세포로부터 생성된다. 일부 구체예에서, 상기 단핵 포식세포는 동종이거나, 또는 동종 세포로부터 재프로그램된 iPSCs를 포함하는 동종 세포로부터 생성된다. 일부 구체예에서, 마크로파지 및/또는 단핵구의 결함 또는 결핍과 관련된 질환 또는 장애는 알츠하이머병이다. 일부 구체예에서, 마크로파지 및/또는 단핵구의 결함 또는 결핍과 관련된 질환 또는 장애는 파킨슨병이다.
실시예
하기 실시예는 청구된 발명을 더 잘 예시하기 위해 제공되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 특정 물질이 언급되는 정도는 단지 예시를 위한 것이고, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다. 당업자는 진보적 능력을 행사하지 않고, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 동등한 수단 또는 반응물을 개발할 수 있다.
실시예 1.
노령 대상체의 인지 기능을 회복하기 위해 젊은 대상체 유래의 혈액, 혈장 또는 골수를 사용하는 것은 잠재적인 치료 가치를 제한하는 심각한 실제적 단점을 갖는다. 유도 만능성 줄기세포 (iPSCs)는 자가 요법을 생성하는 능력을 제공한다.
본원에서, 본 발명자들은 젊은 혈장 및 골수를 사용한 연구에서 관찰된 유익한 효과를 담당하는 세포 타입을 확인하고자 하였고, 본 발명자들은 iPSCs 유래의 단핵 포식세포 (iMPs)를 생성하였고, 이는 조혈 줄기세포 마커 CD34를 낮은 수준으로 발현하고, 단핵구/마크로파지 마커 CD11b, CD14 및 CD16은 높은 수준으로 발현하며; 본 발명자들은 이들을 노령의 유전적으로 면역저하된 NOD-scid-gamma (NSG) 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. (젊은 마우스는 3-4개월령이고; 노령의 마우스는 11-13개월령이다.) 마우스를 22일 동안 3일마다 치료하였고 (도 1), 다수의 행동 분석에 대해 테스트하였다. 본 발명자들은 자발적 교대 테스트에서 공간 작업 기억 (도 3a, 3b)뿐만 아니라, 신규한 물체 배치 분석에서 해마-의존적 단기 기억 (도 4b)에서 유의미한 개선을 발견하였다. 더욱이, iMPs를 사용한 치료는 시냅스 수송체인 VGLUT1을 포함하는 여러 주요 신경 건강 지표에 유의미한 영향을 미쳤으며 (도 5b), 이는 노령 마우스에서 감소하였지만 치료를 통해 회복하였고; 미세아교세포 및 성상세포의 수 및 형태에 유의미한 영향을 미쳤다 (도 6a, 6b 및 8). 노령 동물에서 나타나는 성상세포 및 미세아교세포 수의 증가 및 미세아교세포 가지 길이의 감소는 모두 iMPs를 사용한 치료로 역전된다. 이러한 발견은 면역 세포, 구체적으로 단핵구 및 마크로파지가 젊은 혈장 수혈 또는 골수 이식 후에 이전에 관찰된 재생 효과를 담당할 수 있음을 나타낸다. 중요하게는, 본 발명자들은 iMPs가 노화에서 유의미한 재생 잠재력을 갖는 것을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 알츠하이머병의 마우스 모델인 5xFAD 마우스에서 iMPs의 잠재력을 테스트하기 시작하였고 (도 9a), 이들 마우스가 처음 병리가 발생하기 시작한 생후 3개월에도 신규한 물체 인식 연구에서 개선된 결과를 발견하였다 (도 9c). 본 발명자들은 또한 유의미한 병리를 보이는 8개월령의 5xFAD 마우스를 연구할 것이며, 본 발명자들은 iMP 치료가 이들 더 나이가 많은 5xFAD 마우스에서 행동 및 신경 건강/염증 결과에 더 유의미하게 영향을 미칠 것으로 기대한다.
이들 연구는 노화 및 신경변성 시에 인지 및 신경 건강을 개선하는데 있어서 iMPs의 잠재적인 유익을 보여준다. iPSC-유래 단핵 포식세포는 젊은 혈장 및 골수 이식의 효과를 모방할 수 있으며, 노화 및 알츠하이머병의 치료제로서 인지 기능을 회복하기 위해 대상체에서 사용할 수 있다.
실시예 2.
iMP는 하기 분화 프로토콜을 사용하여 iPSC로부터 분화시켰다.
저밀도에서 EZ Passage Tool을 사용하여 iPSC를 계대하고; 각 웰에 120개의 콜로니를 목표로 한다.
EZ Passage Tool을 사용하여 iPSC 웰의 중앙만 크롭 (crop)한다.
배지를 흡인한다.
3 ml의 새로운 배지를 사용하여, 상기 플레이트에서 콜로니를 블로잉 (blowing)한다. 긁는 것은 피한다!
콜로니 현탁액을 채취하고, 새로운 15 ml 원뿔형 튜브 (conical tube)로 전달한다. 상기 콜로니 현탁액을 약 120 콜로니/ml (eyeball)로 희석한다. 참고: 상기 콜로니 현탁액을 많이 희석해야 할 것이다 (현탁액에 최대 10 ml의 배지를 부가할 수도 있음).
참고: 필요한 경우 세포주별로 콜로니 현탁액의 농도를 조정한다 (즉, 부착이 떨어지는 세포주의 경우 농도를 증가시키고, 부착이 강한 세포주의 경우 농도를 감소시킨다).
플레이트로부터 Matrigel을 흡인하고, 웰당 1 ml의 배지로 교체한다.
각 웰에 콜로니 현탁액 1 ml을 부가하고, 인큐베이터로 전달하고, 수평 및 수직 (z 및 x 축)으로 각 방향으로 4회 진탕한다.
콜로니가 밤새 부착되도록 정치한다.
콜로니 일일 유지 관리
하기 조건들 중 어느 하나를 충족하는 임의의 분화 세포 및 콜로니를 제거한다:
Figure pct00001
대부분의 콜로니보다 훨씬 더 작거나 또는 더 큰 콜로니
Figure pct00002
그 옆에 임의의 분화 세포가 있는 경우
Figure pct00003
다른 콜로니와 너무 가까운 경우 (즉, 경시적으로 서로 성장할 수 있음).
Figure pct00004
웰에 15개 이상의 콜로니가 있는 경우 (이상적인 웰에는 10-12개의 콜로니를 가질 것임).
Figure pct00005
이상한 형태의 콜로니 (예: 초승달 형태/전혀 원형에 가깝지 않음)
직경이 균일한 콜로니의 균일한 분포를 갖는 것이 중요하다.
각 분화 스테이지를 대표하는 명시야 배양 이미지 (5X)에서, 분화가 적절하게 수행되면 유사한 콜로니 형태를 볼 수 있다. 또한, 분화가 진행됨에 따라, 콜로니는 매우 "메시 (messy)"하다는 점에 유의하며, 이는 원래 그래야 하는 방식이다.
분화 시작
모든 콜로니의 직경이 최소 0.7 mm이고 대다수의 직경이 1.0 mm (evos 4X에서 7 센티미터 (centimeters) 직경)일 때 스테이지 1 배지 (mTeSR* + 80 ng/mL BMP4)를 시작한다. 이는 D0 (일 0)이다. * Stem Cell Reports, vol.8, 1516-1524, 2017에 기재된 바와 같이 mTeSR 맞춤 배지를 사용한 Douvaras 등과 달리, 본 발명자들은 표준 mTeSR (예: STEMCELL Technology, catalog number 85850, 적어도 bFGF 및 TGFβ를 포함함)을 사용한다. Douvaras 등은 Stem Cell Reports, vol.8, 1516-1524, 2017 (Supplemental)에서, 그의 mTeSR 맞춤 배지가 염화리튬, GABA, 피페콜산, 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 및 전환 성장 인자 β (TGFβ1) (Stem Cell Technologies)가 없는 mTeSR1 배지라고 기재하였다.
스테이지 1:
스테이지 1 개시는 D0이다.
4일째까지 매일 스테이지 1 배지를 1 ml/웰로 공급한다. 즉, 매일 상등액을 흡인하고, 4일째까지 매일 1 mL의 신선한 배지를 부가한다.
스테이지 1의 종료 시, 스테이지 2 직전에 스테이지 2 배지로 전체 배지를 교체한다.
스테이지 2:
4일째에, 세포를 스테이지 2 배지 (StemPro-34 SFM + 25 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 80 ng/mL 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 100 ng/mL 줄기세포 인자 (SCF)), 2 mls/웰로 전환한다.
스테이지 2의 종료 시, 스테이지 3 직전에 전체 배지를 교체한다.
스테이지 3:
6일째에, 세포를 스테이지 3 (StemPro-34 SFM + 50 ng/mL SCF, 50 ng/mL IL-3, 5 ng/mL 트롬보포이에틴 (TPO), 50 ng/mL 마크로파지 CSF (M-CSF), 50 ng/mL FLT3-리간드 (FLT3L)) 2 mls/웰로 전환한다.
10일째에 전체 배지를 교체한다.
D10에 배지를 교체하고, 세포에 스테이지 3 배지를 2 ml/웰로 다시 공급하였다 (상등액을 흡인하고, 신선하게 공급함).
스테이지 3의 종료 시, 스테이지 4 직전에 전체 배지를 교체한다.
참고: 낭포 (cyst)가 형성되기 시작한다 (좋은 신호).
스테이지 4 (수집 단계):
D12 또는 D13 또는 D14에서, 세포를 스테이지 4 배지 (StemPro-34 SFM + 50 ng/mL M-CSF, 25 ng/mL GM-CSF, 50 ng/mL FLT3L) 2 mls/웰로 전환한다 (상등액을 완전히 흡인한 다음에, 스테이지 4 배지를 부가함).
이후 낭포가 웰 플레이트에 느슨하게 부착되므로, 더 이상 흡인하지 않았고, 본 발명자들은 현탁액에 부유하는 세포를 수집하고, 격주 (즉, 매주 월요일 또는 화요일 및 금요일) 2 ml/웰로 스테이지 4로 세포를 공급하였다. 흡인 없음.
참고: 세포는 매주 2회 공급하고, 한 번은 수집 후에 공급한다. 낭포는 상기 플레이트에 느슨하게 부착되었고, 단핵구 또는 단핵 포식세포는 낭포로부터 분리되어, 현탁액에 부유하였다. 따라서 매주에 1회, 부유 세포를 함유하는 배지를 세롤로지컬 피펫 (serological pipette)을 통해 수집하고, 회전시켜서 세포 펠렛을 남기고, 그 다음에 본 발명자들은 투여에 사용할 수 있다. 공급은 3 내지 4일 간격을 두어야 하고; 부유 세포를 수집하고, 회전시킨 다음에, 기존 배지를 흡인하고, 세포 펠렛을 신선한 배지에 재현탁하여 상기 플레이트에 다시 공급하였다. 상기 프로토콜의 이러한 시점에서, Douvaras 등 (Stem Cell Reports, vol. 8, pp:1516-1524, June 6, 2017)은 매주 분류를 수행하여 CD14+/CX3CR1+ 세포만 수집한 다음에, 2주 동안 GM-CSF 및 IL34에 이들을 노출시켜서 이들 세포를 미세아교세포로 추가 분화시켰다. 반대로, 본 발명자들은 이들 세포를 분류하지 않고, 대신에 노화 및 신경변성의 동물 모델을 치료하는데 사용하기 위해 보다 미성숙한 세포 타입을 수집하였다. 본 발명자들은 상기 세포를 미세아교세포 배지 (2 mM GlutaMAX-I, 10 ng/mL GM-CSF, 및 100 ng/mL IL-34를 함유하는 RPMI-1640)에서 배양하지 않았다.
실시예 3. 생물반응기에서 iMPs를 임상적으로 관련된 수로 생산하기 위한 스케일-업 공정 및 특성화
스테이지 4에 도달하면 (실시예 2에서 약 D14), 상기 세포는 상기 플레이트에 느슨하게 부착된 낭포를 형성하였다. 상기 iMPs는 이들 낭포로부터 분리되어 현탁액 중에 부유하였다. 예를 들어, 세포 스크레이퍼 (cell scraper)를 사용하여 iMP 낭포를 수집하고, 저속 자기 교반 플레이트 (예: DURA-MAGTM) 상의 교반 플라스크 생물반응기 (예: CORNING®)로 전달하였다. 수집한 낭포를 24시간 동안 현탁 배양에 적응시킨 후에 교반 플레이트를 켜고, 30회 회전/분으로 설정하였다. 생물반응기에서, 낭포가 부유하고, iMPs는 이들로부터 계속해서 분리되고, 생성된 iMPs는 추가 분석 또는 절차를 위해 수집하였다.
또한, 본 발명자들은 출발 밀도를 미세-조정하고: 단층 시딩 밀도 (monolayer seeding density)를 약 100,000개 세포/cm2으로 미세-조정하였다. 본 발명자들은 폴리디메틸실록산 (PDMS) 스탬프를 사용하여 세포가 부착하는 단백질 (예: 세포외 기질 단백질 또는 마트리겔 (matrigel))의 작은 "아일랜드 (islands)"에 플레이팅 (plating)하여, 즉 배양 장치의 표면 전체가 아닌 개별/단리된 아일랜드에 "시딩 (seeding)'함으로써, 분화 과정 중에 낭포가 이격되도록 하였다.
또한, 본 발명자들은 RNA-시퀀싱 기술을 사용하여, 생물반응기에서 15일 동안 배양한 iMPs, 생물반응기에서 55일 동안 배양한 iMPs, 실시예 2에 개시된 바와 같이 웰 플레이트에서 배양한 iMPs, 실시예 2에 개시된 바와 같이 웰 플레이트에서 배양한 세포를 냉동 바이알로부터 회수한 iMPs뿐만 아니라, 대조군인 iPSCs의 유전자 발현을 비교하였다. 도 10a 및 10b는 이들 4가지 조건의 iMPs가 계층적 클러스터링 분석 및 주성분 분석의 측면에서 서로 유사하다는 것을 보여준다. 도 11은 4개 그룹들 각각에서 각 유전자의 상대적인 발현 비율을 보여준다.
본 발명자들은 생물반응기 배양으로부터 서로 다른 일자에 수집한 총 세포 수 (살아 있는 세포 및 사멸 세포 포함)를 계수하여, 적어도 48일 동안 세포 생존율이 65% 이상으로 일관되게 높게 나타났다 (표 1).
생물반응기로부터 각 해당 수집 일자에 대해 살아있는 세포 대 사멸 세포의 수, 및 계산된 생존율 퍼센트 (생존율 = 살아있는 세포의 수 ÷ (살아있는 세포의 수 + 사멸 세포의 수)).
일자 살아있는 세포 사멸 세포 생존율 (%)
제1 일 5,300,000 1,150,000 82.2
제1 일 + 7일 16,100,000 6,800,000 70.3
제1 일 + 12일 10,300,000 1,850,000 84.8
제1 일 + 18일 9,900,000 3,300,000 75
제1 일 + 28일 25,800,000 8,600,000 75
제1 일 + 38일 18,100,000 8,000,000 69.3
제1 일 + 48일 13,850,000 6,250,000 68.9
지금까지 본 발명자들은 125 mL 플라스크 또는 500 mL 플라스크를 사용하였지만, 필요에 따라 공정을 그 이상의 부피로 확장할 수 있다.
RNA-Seq 분석에 추가하여, 본 발명자들은 또한 유세포 분석, 웨스턴 블롯팅, 및 포식작용 분석 (phagocytosis assay) (비드 흡수)을 수행하였다.
본 발명의 다양한 구체예는 상기 상세한 설명에서 설명되었다. 이러한 설명은 상기 구체예를 직접적으로 설명하지만, 당업자는 본원에 개시되고, 설명된 특정 구체예에 대한 수정 및/또는 변형을 구상할 수 있음을 이해한다. 본 설명의 범위에 속하는 이러한 수정 또는 변형이 또한 본원에 포함되는 것으로 의도된다. 구체적으로 언급하지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에서의 단어 및 문구는 해당 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 통상적이고 익숙한 의미를 부여하는 것이 본 발명자들의 의도이다.
본 출원 당시에 출원인에게 알려진 본 발명의 다양한 구체예에 대한 전술한 설명이 제시되었고, 이는 예시 및 설명의 목적으로 의도된다. 본 설명은 본 발명을 완전하게 설명하거나 또는 개시된 정확한 형태로 제한하려는 것이 아니며, 상기 교시에 비추어 많은 수정 및 변형이 가능하다. 기재된 구체예들은 본 발명의 원리 및 이의 실제 적용을 설명하고, 당업자가 본 발명을 다양한 구체예에서 고려되는 특정 용도에 적합한 다양한 수정을 통해 활용할 수 있도록 하기 위한 것이다. 그러므로, 본 발명은 본 발명을 수행하기 위해 개시된 특정 구체예로 제한되지 않는 것으로 의도된다.
본 발명의 특정 구체예가 도시되고 설명되었지만, 당업자에게는 본원의 교시에 기반하여, 본 발명 및 이의 더 넓은 양상으로부터 벗어나지 않고 변경 및 수정이 이루어질 수 있음이 자명할 것이며, 그러므로 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 정신 및 범위 내에 있는 모든 이러한 변경 및 수정을 그 범위 내에 포함하도록 한다. 당업자는 일반적으로 본원에서 사용된 용어가 일반적으로 "개방형" 용어인 것으로 이해할 것이다 (예: 용어 "포함하는 (including)"은 "포함하지만 이에 한정되지 않음"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는 (having)"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하며, 용어 "포함한다 (includes)"는 "포함하지만 이에 한정되지 않음"으로 해석되어야 한다).
본 발명을 설명하고 청구하기 위해, 개방형 용어 "포함하는 (comprising)"이 용어 예컨대 포괄하는, 함유하는 또는 갖는의 동의어로서 본원에서 사용되었지만, 본 발명 또는 이의 구체예는 대체 용어 예컨대 "구성하는" 또는 "필수적으로 구성하는"을 사용하여 대안적으로 설명될 수 있다.

Claims (30)

  1. 대상체에서 인지 기능 (cognitive function)을 개선하거나, 또는 신경변성 장애 (neurodegenerative disorder)가 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 유도 만능성 줄기세포 (induced pluripotent stem cells: iPSCs)로부터 생성된 단핵 포식세포 (mononuclear phagocytes)를 포함하는 조성물을 치료적으로 유효한 양으로 투여함으로써, 상기 대상체에서 인지 기능을 개선하거나 또는 신경변성 장애가 있는 대상체를 치료하는 단계를 포함하고,
    상기 단핵 포식세포는, 골수 분화 (myeloid differentiation)를 유도하는 조건하에 세포 배양 배지에서 상기 iPSCs를 배양하여, 단핵 포식세포의 생성을 유도하는 단계를 포함하는 방법으로 상기 iPSCs로부터 생성되고,
    상기 배양은 상기 생성된 단핵 포식세포를 인터루킨 34 (IL-34)를 포함하거나, 또는 IL-34 및 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF)를 포함하는 미세아교세포 분화 배지 (microglial differentiation medium)에서 접촉시키는 단계를 포함하지 않고, 상기 배양은 상기 생성된 단핵 포식세포를 인터루킨 4 (IL-4)를 포함하거나, 또는 IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 수지상 세포 분화 배지 (dendritic cell differentiation medium)에서 접촉시키는 단계를 포함하지 않는 것인
    대상체에서 인지 기능을 개선하거나, 또는 신경변성 장애가 있는 대상체를 치료하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 단핵 포식세포는 단핵구를 포함하고;
    선택적으로 상기 투여 후에, 상기 단핵 포식세포는 상기 대상체에서 마크로파지를 생산하거나, 또는 선택적으로 상기 단핵 포식세포는 마크로파지 분화를 유도하는 조건하에 세포 배양 배지에서 추가로 배양되는 것인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 배양은 상기 iPSCs를 골 형성 단백질 (bone morphogenetic protein: BMP-4)을 포함하는 제1 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 배양은
    상기 제1 조성물의 존재하에 상기 iPSCs의 배양 후에 상기 세포 배양 배지를 제2 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 제2 조성물은 bFGF, 혈관 내피 성장 인자 (vascular endothelial growth factor: VEGF), 줄기세포 인자 (stem cell factor: SCF), 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 배양은
    상기 세포 배양 배지를 제3 조성물과 접촉하는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 제3 조성물은 SCF, 인터루킨 3 (IL-3), 트롬보포이에틴 (TPO), 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF), Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드 (FLT3 리간드), 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 배양은
    상기 세포 배양 배지를 제4 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 제4 조성물은 M-CSF, GM-CSF 및 FLT3 리간드, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 세포 배양 배지를 상기 제1 조성물과 대략 4일 동안 접촉시키는 단계,
    상기 세포 배양 배지를 상기 제2 조성물과 대략 2일 동안 접촉시키는 단계,
    상기 세포 배양 배지를 상기 제3 조성물과 대략 6 내지 8일 동안 접촉시키는 단계, 및/또는
    상기 세포 배양 배지를 상기 제4 조성물과 대략 3 내지 90일 동안 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 3 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, BMP-4를 포함하는 제1 조성물은 bFGF, TGFβ, GABA, 피페콜산 및 염화리튬 중 하나 이상을 함유하는 mTeSR1 배지에 존재하고; 상기 제1 조성물은 무혈청이고, 상기 제2 조성물, 제3 조성물, 및/또는 제4 조성물은 독립적으로 무혈청 조혈 세포 배지에 존재하고, 이는 선택적으로 StemPro-34 무혈청 배지인 것인 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵 포식세포는 CD11b, CD14, CD16, CD64, CD11c, CD71, 또는 이들의 조합을 포함하는 마커를 발현하는 것인 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 생물반응기에서 상기 단핵 포식세포를 적어도 1×106, 5×106, 또는 1×107개를 수득하도록 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSCs는 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells: PBMCs), 또는 섬유아세포 (fibroblasts)로부터 유래되고; 선택적으로 상기 PBMCs 및 섬유아세포는 상기 대상체로부터 수득되는 것인 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 50세 이상의 인간인 것인 방법.
  13. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 파킨슨병, 다발성 경화증 (MS), Rett 증후군, 구형체를 동반한 미만성 백질뇌병증 (diffuse leukoenchephalopathy with spheroids), 축삭 구형체를 동반한 유전성 미만성 백질뇌병증 (hereditary diffuse leukoenchephalopathy with axonal spheroids), FTLD (frontotemporal lobar degeneration), 가족성 FTLD, 정신분열증, 및 자폐 스펙트럼 장애로 구성된 그룹으로부터 선택되는 신경변성 장애가 있는 대상체인 것인 방법.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 후 상기 대상체에서 공간 작업 기억 (spatial working memory)의 개선, 단기 기억 (short-term memory)의 개선, 시냅스 수송체 수준 (synaptic transporter level)의 증가, 미세아교세포 가지 길이 (microglia branch length)의 증가 중 하나 이상을, 대조군 대상체와 비교하거나 또는 투여 전 대상체의 각 수준과 비교하여, 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  15. 단핵 포식세포를 생성하는 방법으로서,
    골수 분화를 유도하는 조건하에 세포 배양 배지에서 유도 만능성 줄기세포를 배양하여, 단핵 포식세포의 생성을 유도하는 단계로서, 상기 배양은 상기 유도 만능성 줄기세포를 골 형성 단백질 (BMP-4)을 포함하는 제1 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 단계,
    상기 제1 조성물의 존재하에 유도 만능성 줄기세포의 배양 후에 상기 세포 배양 배지를 제2 조성물과 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 조성물은 bFGF, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 줄기세포 인자 (SCF), 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 단계,
    상기 제2 조성물의 존재하에 배양 후에 상기 세포 배양 배지를 제3 조성물과 접촉시키는 단계로서, 상기 제3 조성물은 SCF, 인터루킨 3 (IL-3), 트롬보포이에틴 (TPO), 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF), 및 Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드 (FLT3 리간드), 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 단계, 및
    상기 제3 조성물의 존재하에 배양 후에 상기 세포 배양 배지를 제4 조성물과 접촉시켜서, 단핵 포식세포를 생성하는 단계로서, 상기 제4 조성물은 M-CSF, GM-CSF 및 FLT3 리간드, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 단계를 포함하고,
    상기 배양은 상기 생성된 단핵 포식세포를 인터루킨 34 (IL-34)를 포함하거나, 또는 IL-34 및 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)를 포함하는 미세아교세포 분화 배지에서 접촉시키는 단계를 포함하지 않고, 상기 배양은 상기 생성된 단핵 포식세포를 인터루킨 4 (IL-4)를 포함하거나, 또는 IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 수지상 세포 분화 배지에서 접촉시키는 단계를 포함하지 않는 것인
    단핵 포식세포를 생성하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 조성물은 무혈청 배지에 존재하고; 선택적으로 상기 제1 조성물은 mTeSR1 배지에 존재하고, 상기 제2, 제3 및 제4 조성물은 StemPro-34 배지에 존재하는 것인 방법.
  17. 청구항 15에 있어서,
    상기 세포 배양 배지를 상기 제1 조성물과 대략 4일 동안 접촉시키는 단계,
    상기 세포 배양 배지를 상기 제2 조성물과 대략 2일 동안 접촉시키는 단계,
    상기 세포 배양 배지를 상기 제3 조성물과 대략 6 내지 8일 동안 접촉시키는 단계, 및/또는
    상기 세포 배양 배지를 상기 제4 조성물과 대략 3 내지 90일 동안 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 15 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 생물반응기에서 상기 단핵 포식세포의 적어도 1×106, 5×106, 또는 1×107개의 집단을 수득하도록 배양하는 것을 포함하고; 선택적으로 상기 생물반응기는 교반기 탱크 생물반응기 (stirrer tank bioreactor)인 것인 방법.
  19. (1) 만능성 줄기세포를 골 형성 단백질 4 (BMP-4)를 포함하는 제1 세포 배양 배지에서 부착 배양 (adherent culture)으로 배양하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)에 의해 수득된 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자 (basic fibroblast growth factor: bFGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 줄기세포 인자 (SCF)를 포함하는 제2 세포 배양 배지에서 부착 배양으로 배양하는 단계;
    (3) 상기 단계 (2)에 의해 수득된 세포를 SCF, 인터루킨 3 (IL-3), 트롬보포이에틴, 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF) 및 FLT3 리간드를 포함하는 제3 세포 배양 배지에서 부착 배양으로 배양하는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3)에 의해 수득된 세포를 M-CSF, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 및 FLT3 리간드를 포함하는 제4 세포 배양 배지에서 현탁 배양 (suspension culture)으로 배양하는 단계로서, 여기서 마크로파지 및/또는 단핵구가 생성되는 것인 단계
    를 포함하는 방법을 사용하여 생성된 단핵 포식세포 (mononuclear phagocytes)로서,
    상기 방법은 상기 생성된 단핵 포식세포를 인터루킨 34 (IL-34)를 포함하거나, 또는 IL-34 및 GM-CSF를 포함하는 미세아교세포 분화 배지에서 접촉시키는 단계를 포함하지 않고, 상기 배양은 상기 생성된 단핵 포식세포를 인터루킨 4 (IL-4)를 포함하거나, 또는 IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 수지상 세포 분화 배지에서 접촉시키는 단계를 포함하지 않는 것인
    단핵 포식세포.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 만능성 줄기세포는 인간 유도 만능성 줄기세포인 것인 단핵 포식세포.
  21. 청구항 18에 있어서, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 세포 배양 배지 각각은 혈청을 포함하지 않고; 선택적으로 상기 제1 조성물은 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 전환 성장 인자 β (TGFβ), 아미노부티르산 (GABA), 피페콜산 및 염화리튬 중 하나 이상 또는 이들 모두를 함유하는 mTeSR1 배지에 존재하고, 선택적으로 상기 제2, 제3, 및 제4 조성물은 StemPro-34 배지에 존재하는 것인 단핵 포식세포.
  22. 청구항 19 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵 포식세포는 CD11b, CD14, CD16, CD64, CD11c, CD71, 또는 이들의 조합에 대해 양성인 것인 단핵 포식세포.
  23. 청구항 19 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (4), (3), (2) 및 (1) 중 하나 이상의 단계에서의 배양은 생물반응기에서의 배양을 포함하는 것인 단핵 포식세포.
  24. 청구항 19 내지 23 중 어느 한 항에 따른 단핵 포식세포를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 마크로파지의 결함 (defect) 또는 결핍 (deficiency)과 관련된 질환 또는 장애가 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 단핵 포식세포는 상기 대상체에게 투여 후에 마크로파지를 생산하는 것인
    마크로파지의 결함 또는 결핍과 관련된 질환 또는 장애가 있는 대상체를 치료하는 방법.
  25. 단핵 포식세포를 생성하여, 신경변성 장애가 있는 대상체 또는 인지 기능 개선이 필요한 대상체를 치료하는 방법으로서,
    유도 만능성 줄기세포를 골수 분화를 유도하는 조건하에 세포 배양 배지에서 배양하여 단핵 포식세포의 생성을 유도하는 단계로서, 상기 배양은 유도 만능성 줄기세포를 골 형성 단백질 (BMP-4)을 포함하는 제1 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 단계,
    상기 제1 조성물의 존재하에 유도 만능성 줄기세포의 배양 후에 상기 세포 배양 배지를 제2 조성물과 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 조성물은 bFGF, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 줄기세포 인자 (SCF), 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 단계,
    상기 제2 조성물의 존재하에 배양 후에 상기 세포 배양 배지를 제3 조성물과 접촉시키는 단계로서, 상기 제3 조성물은 SCF, 인터루킨 3 (IL-3), 트롬보포이에틴 (TPO), 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF), 및 Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드 (FLT3 리간드), 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 단계, 및
    상기 제3 조성물의 존재하에 배양 후에 상기 세포 배양 배지를 제4 조성물과 접촉시켜서, 단핵 포식세포를 생성하는 단계로서, 상기 제4 조성물은 M-CSF, GM-CSF 및 FLT3 리간드, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 배양은 상기 생성된 단핵 포식세포를 인터루킨 34 (IL-34)를 포함하거나, 또는 IL-34 및 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)를 포함하는 미세아교세포 분화 배지에서 접촉시키는 단계를 포함하지 않고, 상기 배양은 상기 생성된 단핵 포식세포를 인터루킨 4 (IL-4)를 포함하거나, 또는 IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 수지상 세포 분화 배지에서 접촉시키는 단계를 포함하지 않으며,
    상기 대상체에게 상기 생성된 단핵 포식세포를 포함하는 조성물을 치료적으로 유효한 양으로 투여하여, 신경변성 장애가 있는 대상체를 치료하거나 또는 대상체에서 인지 기능을 개선하는 단계를 포함하는
    단핵 포식세포를 생성하여, 신경변성 장애가 있는 대상체 또는 인지 기능 개선이 필요한 대상체를 치료하는 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 배양은 상기 생성된 단핵 포식세포를 M-CSF, 및 인터페론 감마 (IFN-γ) 및 IL-4 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 마크로파지 분화 배지 (macrophage differentiation medium)에서 접촉시키는 단계를 포함하지 않는 것인 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 상기 배양은 상기 생성된 단핵 포식세포를 마크로파지 분화 배지에서 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 마크로파지 분화 배지는 M-CSF 및 IL-4를 포함하는 것인 방법.
  29. 청구항 27에 있어서, 상기 마크로파지 분화 배지는 M-CSF 및 인터페론 감마 (IFN-γ)를 포함하는 것인 방법.
  30. 청구항 25 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 상기 생성된 단핵 포식세포의 집단을 상기 대상체에게 투여하기 위해, 생물반응기에서 상기 단핵 포식세포의 적어도 1×106, 5×106, 또는 1×107개의 집단을 생성하도록 배양하는 것을 포함하는 방법.
KR1020247009221A 2021-08-19 2022-08-19 노화-관련 및 신경변성 질환의 예방 및 치료에서 ipsc-유래 면역 세포 KR20240051185A (ko)

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