JP5849257B2 - 培地添加剤及びその利用 - Google Patents
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Description
(1)魚類に由来しているため、ヒトなどの哺乳類と共通するろ過性病原体がない。このため安全性が高い。
(2)魚類1個体から相当程度の量を採取でき、また、採取した魚類個体において内液が再生されるため、効率的に取得できる。
(3)内液は、リンパ液様であって血球を含まないため、血球分離が不要である。
(4)魚類個体を生存させたまま内液を採取可能であるため、動物保護の観点からも問題がない。
本培地用添加剤は、水疱魚類の水疱内液又は水泡内液由来成分を有効成分として含有することができる。本明細書において、「体表に水疱を有する魚類」(水疱魚類)は、体表に体液が含まれる水疱を有する魚類を意味している。こうした魚類としては、例えば、「水泡眼」というキンギョの品種又はその近縁種が挙げられる。水泡眼は、両目の周囲に水疱が生じてその内部に体液が蓄積する遺伝的性質を有している。水泡眼の水疱内液の組成は明らかではないが、体長10cm以上の水泡眼からは、大量(1尾1回あたり10ml以上40ml以下程度)の水疱内液を注射器で容易に採取できる。水泡眼の水疱は、水疱内液の採取後、一時的に収縮するが、数ヶ月内には再び採取前と同様に体液が蓄積して復帰することがわかっている。なお、水疱魚類は、水泡眼又はその近縁種を利用して交配して得られた新品種若しくは水泡眼又はその近縁種に対して遺伝子工学的な操作により改変した改変体、突然変異によって体表に水疱が生ずるようになったキンギョであってもよい。また、キンギョ以外の魚類であっても突然変異や遺伝子組み換えなどにより体表に水疱を形成する性質を付与したものおよびその魚を祖先の一つとする交雑魚でもよい。
本培地用添加剤の他の一つの形態として、水疱内液に対して熱処理を施した熱処理液又は熱処理液に由来する成分を含有する形態が挙げられる。一般的には補体などの細胞毒性を有する酵素群を不活性化する目的から熱処理することが好ましい。また、動物細胞の培養や増殖の観点からは、熱処理することで良好な細胞形態を維持できることがわかっており、熱処理によって、動物細胞に対して有効性の高い薬剤として利用可能となる。熱処理の条件は、上記した補体不活性化の観点からは、例えば、50℃以上70℃以下で、15分以上2時間以下程度とすることができる。典型的には、56℃程度で30分程度とすることができる。熱処理に供される水疱内液は、特に限定されないで各種の形態や経過を採ることができる。例えば、採取されたままの水疱内液(固液分離後の液を含む。)の他、その希釈液や濃縮液であってもよく、また、水疱内液の凍結体や凍結乾燥体を復元した液であってもよい。
さらに、本培地用添加剤の他の一つの形態として、水疱内液に対して活性炭処理して得られる活性炭処理液又は活性炭処理液に由来する成分を含有する形態を採ることができる。水疱内液を活性炭で処理することより、活性炭処理前に比較して動物細胞の増殖活性が向上される。活性炭処理に供される水疱内液は、特に限定されないで各種の形態や経過を採ることができる。例えば、採取されたままの水疱内液(固液分離後の液を含む。)の他、その希釈液や濃縮液であってもよく、また、水疱内液の凍結体や凍結乾燥体を復元した液であってもよい。
本明細書に開示される動物細胞用の培地の製造方法は、水疱魚類の水疱内液を活性炭で処理する処理工程と、前記処理工程で得られた処理液又は前記処理液に由来する成分を含む前記培地添加剤を製造する工程と、を備えることができる。本製造方法によれば、活性炭で処理していない水疱内液に比較して高い活性の培地添加剤を得ることができる。
本明細書に開示される動物細胞用の培地(以下、単に本培地ともいう。)は、本培地用添加剤を含有している。本培地は、本培地用添加剤を含有するため、牛胎児血清等を使用することなく、そのまま動物細胞の活性を維持し、増殖を促進する培地として用いることができる。
本明細書に開示される動物細胞の生産方法は、本培地用添加剤を用いて動物細胞を培養し増殖させる工程を備えることができる。この生産方法によれば、動物細胞を、牛胎児血清等を用いることなく増殖させ、所望量の動物細胞を得ることができる。本明細書に開示される生産方法においては、既に述べた全ての形態の本培地用添加剤及び培地を適用することができる。本培地用添加剤を用いて動物細胞を培養する形態としては、動物細胞の培養に用いる公知の培地に適宜本培地用添加剤を添加して用いてもよいし、予め本培地用添加剤を含む本培地を準備し、本培地を用いて動物細胞を培養してもよい。また、既に説明したように動物細胞の種類は問わない。培養条件は、動物細胞の種類に応じて適宜設定される。
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、本培地用添加剤を用いて動物細胞を培養して有用物質を生産する工程を備えることができる。この生産方法によれば、動物細胞を、牛胎児血清等を用いることなく培養して、動物細胞内あるいは細胞外に有用物質を得ることができる。本生産方法により、牛胎児血清由来プリオン蛋白質の混入を防止し、安全にかつ効率的に有用物質を生産する方法を提供できる。本明細書に開示される生産方法においては、既に述べた全ての形態の本培地用添加剤及び培地を適用することができる。また、動物細胞の種類は問わないが、有用なタンパク質やペプチド、抗体などを生産する動物細胞とすることもできる。
本明細書に開示される動物細胞の処理方法は、本培地用添加剤と動物細胞とを接触させる工程を備えることができる。本培地用添加剤は、動物細胞の増殖活性等の活性を維持、向上させることができる。こうした接触工程は、特定の目的の処理工程に先立って行ってもよい。また、この接触工程は、特定の目的の処理工程と兼用していてもよい。こうした工程としては、例えば、各種の遺伝子工学的技術上の操作が挙げられる。すなわち、外来遺伝子の導入操作、発生工学における各種操作等が挙げられる。より具体的には、顕微操作、染色体操作を含んでいてもよい。接触工程は、処理工程は、凍結工程及び/又は保存工程としても実施できる。
本明細書の開示によれば、以上の実施形態のほか、本培地用添加剤を用いて動物胚の前駆細胞を保存又は処理して胚を作製することもできる。また、本明細書の開示によれば、さらに上記胚作製工程を備えて、さらに動物個体を作製することもできる。本明細書の開示によれば、上記した動物胚又は動物個体の作製により得られる胚又は動物個体も提供される。さらに、本明細書の開示によれば、培地添加剤用材料としての、水泡眼及びその近縁種を含む水疱魚類が提供される。さらに、本明細書の開示によれば、培地添加剤用原料としての、水疱魚類の水疱内液も提供される。
本実施例に供した水泡眼の水疱内液は、飼育場内の水槽で飼育されていた体長約6cmの水泡眼数尾より注射器(10mlシリンジと23G注射針)を用いて水疱より直接採取した。
培地は、陰性対照区はMCDB105培地にFGFを70ng/ml加えたものとし、陽性対照区はMCDB105培地にFGFを70ng/mlおよびFBSを10%添加したものとした。活性炭処理済み水疱内液区および未処理水疱内液区は、MCDB105培地にFGF70ng/mlおよびそれぞれの水疱内液を10%添加したものを培地とした。
動物細胞は、臍帯由来ヒト血管内皮細胞を用い、20cm2シャーレからトリプシン処理により剥離した細胞を100mlの培養液(MCDB105培地にFBSを10%添加しFGFを70ng/ml加えたもの)に懸濁し、懸濁液を1mlずつ24穴シャーレ(PBSに1%ゼラチンを溶かしたもので室温1時間静置してコーティングしたもの)の各1穴に滴下、CO2インキュベーター内で37℃で24時間培養して、シャーレに細胞を接着させた。この培養細胞を、以下の実験に用いた。
シャーレに接着させた培養細胞の培地を全量抜き取り、代わりに既述のそれぞれの実験区のために準備した培地を1ml加えて37℃で培養した。10日間培養後、それぞれのシャーレから培地を抜き取り、代わりにトリプシンを各シャーレに加えて細胞を剥離し、剥離した細胞を1mlの培養液(MCDB105培地に牛血清を10%添加したもの)に懸濁した。各細胞懸濁液10μl採取して、その中の細胞数を顕微鏡下で計測し、1ml中の細胞数を算出した。結果を図1に示す。
以下の事項は、出願時の特許請求の範囲に記載の要素である。
(1)体表に水疱を有する魚類の前記水疱内液又は前記水疱内液に由来する成分を含有する、動物細胞用の培地添加剤。
(2)前記魚類は、水泡眼又はその類縁種である、(1)に記載の培地添加剤。
(3)前記水疱内液の活性炭処理液又は前記活性炭処理液に由来する成分を含有する、(1)又は(2)に記載の培地添加剤。
(4)動物細胞用の培地であって、
(1)〜(3)のいずれかに記載の培地添加剤を含有する、培地。
(5)動物細胞の生産方法であって、
(1)〜(3)のいずれかに記載の培地添加剤を用いて、動物細胞を培養して増殖させる工程、
を備える、生産方法。
(6)有用物質の生産方法であって、
(1)〜(3)のいずれかに記載の培地添加剤を用いて動物細胞を培養して前記動物細胞により前記有用物質を生産させる工程、
を備える、生産方法。
(7)動物細胞の処理方法であって、
(1)〜(3)のいずれかに記載の培地添加剤を前記動物細胞と接触させる工程、
を備える、処理方法。
(8)動物細胞用の培地添加剤の製造方法であって、
体表に水疱を有する魚類の前記水疱内液又は前記水疱内液に由来する成分を含有する液体を活性炭で処理する処理工程と、
前記処理工程で得られた処理液又は前記処理液に由来する成分を含む前記培地添加剤を製造する工程と、
を備える、製造方法。
(9)体表に水疱を有する魚類の前記水疱内液又は前記水疱内液に由来する成分を含有する液体を活性炭で処理して得られる、動物細胞用の培地添加剤。
Claims (17)
- 体表に水疱を有する魚類(ただし、病的に体表に水疱を生じている魚類を除く。)の水疱内液又は前記水疱内液に由来する成分を含有する、動物細胞(魚類細胞を除く。)用の培地添加剤。
- ウシ胎児血清を代替するために用いる、ヒトを含む哺乳動物細胞用である、請求項1に記載の培地添加剤。
- 前記水疱内液を含有する、請求項1又は2に記載の培地添加剤。
- 前記体表に水疱を有する魚類は、水泡眼又はその近縁種である、請求項1〜3のいずれかに記載の培地添加剤。
- 前記水疱内液の活性炭処理液又は前記活性炭処理液に由来する成分を含有する、請求項1〜4のいずれかに記載の培地添加剤。
- 前記体表に水疱を有する魚類は水泡眼である、請求項1〜5のいずれかに記載の培地添加剤。
- ヒトを含む哺乳動物細胞用である、1〜6のいずれかに記載の培地添加剤。
- ヒト細胞用である、請求項7に記載の培地添加剤。
- 動物細胞(魚類細胞は除く。)用の培地添加剤の製造方法であって、
体表に水疱を有する魚類(ただし、病的に体表に水疱を生じている魚類を除く。)の前記水疱内液又は前記水疱内液に由来する成分を含有する液体を活性炭で処理する処理工程と、
前記処理工程で得られた処理液又は前記処理液に由来する成分を含む前記培地添加剤を製造する工程と、
を備える、製造方法。 - 動物細胞(魚類細胞を除く。)用の培地であって、
請求項1〜8のいずれかに記載の培地添加剤を含有する、培地。 - ウシ胎児血清を含有しない、ヒトを含む哺乳動物細胞用である請求項10に記載の培地。
- 動物細胞(魚類細胞は除く。)の生産方法であって、
請求項1〜8のいずれかに記載の培地添加剤を用いて、前記動物細胞を培養して増殖させる工程、
を備える、生産方法。 - 前記増殖させる工程は、前記動物細胞をウシ胎児血清非存在下で培養してヒトを含む哺乳動物細胞を増殖させる工程である、請求項12に記載の生産方法。
- 有用物質の生産方法であって、
請求項1〜8のいずれかに記載の培地添加剤を用いて動物細胞(魚類細胞は除く。)を培養して前記動物細胞により前記有用物質を生産させる工程、
を備える、生産方法。 - 前記有用物質を生産させる工程は、前記動物細胞がヒトを含む哺乳動物細胞であって、前記ヒトを含む哺乳動物細胞をウシ胎児血清非存在下で培養して、前記ヒトを含む哺乳動物細胞により前記有用物質を生産させる工程である、請求項14に記載の生産方法。
- 動物細胞(魚類細胞は除く。)の処理方法であって、
請求項1〜8のいずれかに記載の培地添加剤を前記動物細胞と接触させる工程、
を備える、処理方法。 - 前記動物細胞と接触させる工程は、ウシ胎児血清非存在下で前記培地添加剤とヒトを含む哺乳動物細胞とを接触させる工程である、請求項16に記載の処理方法。
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