CN118139970A - 年龄相关疾病和神经退行性疾病的预防和治疗中的源自iPSC的免疫细胞 - Google Patents

年龄相关疾病和神经退行性疾病的预防和治疗中的源自iPSC的免疫细胞 Download PDF

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Abstract

源自诱导多能干细胞的单核吞噬细胞被表示为iMP，其包括由诱导多能干细胞生成的单核细胞并任选地进一步包括由诱导多能干细胞生成的巨噬细胞，被提供用于在哺乳动物中改善认知功能、改善神经健康和/或缓解或治疗神经退行性障碍。在各种实施方式中，iMP在移植后或在体外被刺激后产生巨噬细胞和/或表达巨噬细胞标志物。我们证明，在衰老、阿尔茨海默病和肌萎缩性侧索硬化症的啮齿动物模型中，iMP在施用后改善认知和神经健康。还提供了在需要治疗或预防神经退行性障碍的患者中使用单核吞噬细胞的治疗方法，所述单核吞噬细胞从自体干细胞或从由自体细胞获得的诱导多能干细胞生成。

Description

年龄相关疾病和神经退行性疾病的预防和治疗中的源自iPSC 的免疫细胞
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请包括对2021年8月19日提交的美国临时专利申请号63/234,984的优先权要求，通过引用在此将其整体并入。
技术领域
本发明涉及对于神经退行性疾病和衰老的多能干细胞源性疗法，以及用于产生源自多能干细胞的单核细胞和/或巨噬细胞的改进的方案。
背景技术
本文中的所有出版物均以引用的方式并入，其程度等同于每个单独的出版物或专利申请均被明确并单独地指示为通过引用并入。以下描述包括可能对理解本发明而言有用的信息。这并非承认本文中提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或承认具体或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
神经退行性疾病影响脑或周围神经系统中的神经细胞，所述神经细胞会随时间的推移丧失功能。例如，阿尔茨海默病(AD)是影响认知和功能的进行性神经退行性疾病，其中，患者会经历影响生活多方面(例如认知功能、行为、情绪和心理状况)的症状。然而，还没有已知的疾病修正疗法，使得药物发现成为尚未得到满足的医学领域。再例如，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，也称为卢伽雷病，是常见的、破坏性的、并且总是致命的成人神经退行性疾病。除了丧失上运动神经元和下运动神经元外，ALS现在还被认为是伴随免疫失调的障碍，其特征是增加疾病负担和疾病进展速率的炎性细胞的改变/激活。不幸的是，目前没有治疗可以阻止或在实质上延缓患有ALS的患者的这些不可阻挡的炎性应答。
使用年轻血浆和骨髓的先前的研究表明了衰老的成年人或具有神经退行性变的人的认知表现和神经健康有一些改善。然而，与施用年轻血浆和骨髓相关的风险使它们成为不合适的治疗法。例如，血浆输注可带来风险，例如过敏和输血相关的循环超负荷，导致肺水肿(肿胀)和呼吸困难。
因此，本发明的目的是提供用于治疗或缓解神经退行性障碍的新疗法。
发明内容
结合组合物和方法描述并说明了以下实施方式及其方面，所述组合物和方法是示例性和说明性的，而不是对范围的限制。
在各种实施方式中，提供了治疗受试者或为受试者提供预防的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的由多能干细胞生成的单核吞噬细胞，其中，所述受试者具有神经退行性障碍、经历认知损害、或需要改善认知功能。单核吞噬细胞可包括单核细胞、巨噬细胞、或单核细胞与巨噬细胞的混合物。对于人类受试者，单核吞噬细胞的治疗有效量可以处于1×106、1×107或1×108的数量级，以一剂或多剂给予。因此，本发明的由多能干细胞生成、特别是由诱导多能干细胞(iPSC)生成的单核吞噬细胞允许大量供应，比天然存在的对应物更优越，因为后者难以(如果不是不可能的话)在体外增殖。
在各种实施方式中，本文中公开的用于治疗的单核吞噬细胞在如下过程中由多能干细胞(优选由iPSC)生成，所述过程包括在诱导髓系分化的条件下在细胞培养基中培养多能干细胞，引起单核吞噬细胞生成。在各种实施方式中，诱导髓系分化以生成单核吞噬细胞的过程不包括驱动细胞成为小胶质细胞或树突状细胞。在一些另外的实施方式中，诱导髓系分化以生成单核吞噬细胞的过程不包括在体外驱动细胞成为巨噬细胞；而在其它另外的实施方式中，诱导髓系分化以生成单核吞噬细胞的过程包括在体外驱动细胞成为巨噬细胞。
在一些实施方式中，诱导髓系分化以生成单核吞噬细胞的过程包括以下中的第一个步骤、前两个步骤、前三个步骤或全部四个步骤：在培养基中使iPSC与包含骨形态发生蛋白(BMP-4)的第一组合物接触；在第一组合物的存在下培养iPSC后，使细胞培养基与第二组合物接触，所述第二组合物包含bFGF、VEGF和SCF中的一种或多种；在第二组合物的存在下培养iPSC后，使细胞培养基与第三组合物接触，所述第三组合物包含SCF、IL-3、血小板生成素(TPO)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和Fms样酪氨酸激酶3配体(FLT3配体)中的一种或多种；以及在第三组合物的存在下培养iPSC后，使细胞培养基与第四组合物接触，所述第四组合物包含M-CSF、GM-CSF和FLT3配体中的一种或多种。
在优选的实施方式中，包含BMP-4的第一组合物处于含有bFGF和TGFβ，并任选地进一步含有氨基丁酸(GABA)、哌啶酸和氯化锂的培养基中。优选地，第一组合物处于mTeSR1培养基中。在另外的实施方式中，第二组合物、第三组合物和/或第四组合物处于造血细胞培养基中，例如StemPro-34培养基。优选地，培养基是无血清培养基，例如无血清mTeSR1培养基或StemPro-34无血清培养基。
另外的实施方式提供了，本文公开的用于治疗的单核吞噬细胞是由从血细胞(如外周血单个核细胞)或者从成纤维细胞或其它体细胞来源重编程的iPSC生成的。在一些实施方式中，本文公开的用于治疗的单核吞噬细胞是自体的，即由从自体体细胞重编程的iPSC生成。在一些实施方式中，本文公开的用于治疗受试者的单核吞噬细胞由从受试者获得的自体体细胞重编程的iPSC生成。
在各种实施方式中，所生成的单核吞噬细胞用于衰老的哺乳动物受试者，或用于患有神经退行性障碍(如阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森病、多发性硬化症(MS)、精神分裂症和自闭症谱系障碍)的受试者，或用于需要减少与神经退行性障碍相关的炎症的受试者。在各种实施方式中，如本文所公开地生成的单核吞噬细胞在一种或多种行为评估、突触转运体VGLUT1水平、小胶质细胞分支长度或另一种分子分析中提供了受试者中改善的认知功能。在一些方面，所述改善是与受试者在接受单核吞噬细胞施用前的基线状况相比。在一些方面，所述改善产生与年轻或无神经退行性障碍的健康受试者可比或相似的水平。
还提供了由多能干细胞生成的单核吞噬细胞，其可以处于进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物中。优选地，提供了由从血细胞或成纤维细胞重编程的iPSC生成的单核吞噬细胞。
另外的实施方式提供了使用本文生成的单核吞噬细胞进行药物筛选的方法，包括但不限于高通量筛选方法。在一些实施方式中，提供了用于鉴别化合物的方法，所述化合物在治疗或预防与单核细胞和/或巨噬细胞缺陷或缺乏有关的疾病或障碍、或神经退行性疾病或障碍中有用，其中，所述方法包括将通过本文公开的方法生成的单核吞噬细胞与候选化合物接触，并确定候选化合物是否各自改善了单核细胞或巨噬细胞的缺陷或缺乏、或神经退行性疾病或障碍。
通过以下结合附图的详细描述，本发明的其它特征和优点将变得显而易见，所述详细描述以示例的方式说明了本发明实施方式的各种特征。
附图说明
在参考附图中说明了示例性实施方式。本文所公开的实施方式和附图旨在被视为说明性而非限制性的。
图1是小鼠模型的示意图，其中我们每三天施用一次源自iPSC的单核吞噬细胞，并对一些认知任务进行行为测试。“83iGFP”代表用于生成iMP的iPSC系。“SAB”代表自发交替行为测试。“FC”代表恐惧条件化。“NOP”代表新物体放置测试。“NOR”代表新物体识别测试。“EPM”代表高架十字迷宫。年轻小鼠为3-4月龄，老龄小鼠为11-13月龄。
图2是描绘自发交替行为(SAB)任务的示意图，所述任务测试空间工作记忆，其中具有良好空间工作记忆的小鼠会从A臂转到B臂再转到C臂，而具有较差记忆的小鼠会更频繁地在它们刚从中出来的臂之间交替(例如，在A臂和B臂之间移动，并再回到A臂)。
图3A显示，与年轻动物(表示为“年轻”；蓝色的点)相比，用不含iMP的溶媒处理的老龄动物(表示为“老龄Veh”；绿色的点)在自发交替行为任务中表现更差，而用iMP处理的老龄小鼠(表示为“老龄iMPs”；红色的点)没有表现更差。图3B显示，两个老龄组均进行了比年轻动物显著更少的臂进入，表明图3A中iMP的影响是认知上的，并且不是由于运动力的变化。
图4A描绘了“新物体识别”(NOR)研究，其中，将小鼠暴露于两个它们以前从未遇到过的新物体，并且在30min的保持延迟后，将它们暴露于一个新物体——如果它们记得之前见过先前的物体，它们将会与新物体花费更多时间。在新物体识别测定中没有年龄或处理的影响——年轻小鼠组、用溶媒处理的老龄小鼠组和用iMP处理的老龄小鼠组之间的结果没有统计学上的差异。
图4B描绘了“新物体定位/放置”(NOP)研究，其中两个物体中的一个被移动，并且如果动物记得先前物体放置的位置，它就会在位于新位置的物体上花费更多时间。结果表明，老龄小鼠在识别移动过位置的物体方面显著受损，并且iMP处理(“老龄iMPs”组)显著改善了老龄小鼠在这项任务中的表现。
图5A描绘了海马角(Cornu Ammonis)1区和3区(CA1、CA3)中Neun+细胞的数量不随年龄或处理而改变。Neun是神经元细胞核的标志物，因此指示神经元的数量。
图5B描绘了，相对于年轻动物，老龄动物中VGLUT1减少，但在用iMP处理的老龄动物中没有减少。VGLUT1是位于突触处的谷氨酸转运体，对正常突触功能至关重要，并已被证明在阿尔茨海默病中减少。
图6A描绘了在CA3中，衰老动物中小胶质细胞分支长度减少，但用iMP处理的衰老动物中小胶质细胞分支长度没有减少。用iMP处理的衰老动物表示为“老龄iMP”组。图6B描绘了在CA1中，衰老动物中分支长度再次减少，但用iMP处理的衰老动物中分支长度显著增加。小胶质细胞是脑的主要免疫细胞，并且鉴于它们的功能是对环境检测损害或损伤，它们通常具有长的支化的突起(processes)。然而，当被激活时，它们会缩回这些突起，并且每个细胞会具有更小的分支长度。已知衰老和阿尔茨海默病两者都会发生这种情况。此外，在两种情况下，总体的小胶质细胞数量均增加。
图7描绘了在两个老龄组中，CA1中LAMP1均增加。LAMP1是溶酶体标志物，其已被证明随着衰老和阿尔茨海默病而增加。
图8描绘了在衰老动物中星形胶质细胞的数量增加，但在用iMP处理的衰老动物中没有增加。GFAP是星形胶质细胞的标志物，星形胶质细胞的数量和细胞体大小通常随着衰老和疾病增加。
图9A描绘了在阿尔茨海默病小鼠模型中施用iMP的研究时间线，从5xFAD小鼠在3月龄时开始，这是它们首次发展出病状的时间。(伴有淀粉样蛋白和小胶质细胞激活的AD小鼠模型在约2个月时开始。)在首次细胞前3天通过腹膜内注射施用环孢素A，然后通过饮用水施用。如图所示，以500,000个细胞/次注射来注射83iGFP单核吞噬细胞，注射8次。我们将在已经具有广泛病状的7月龄的动物中重复这些。
图9B描绘了与用溶媒处理的5xFAD小鼠相比，用iMP在3个月时进行处理的5xFAD小鼠(“iMPs”)在空间工作记忆和短期空间记忆的任务上没有表现出变化。图9C描绘了经iMP处理的动物在“新物体识别”研究中表现出改善。
图10A是批量RNA序列数据的层次聚类图，比较了iPSC(表示为编号1，三重复表示为1A、1B和1C)、生长在孔板中的iMP(如实施例2中所述；表示为编号3，三重复表示为3A、3B、3C)、从孔板培养液中收集的冻存的iMP(表示为编号2，三重复表示为2A、2B和2C)，以及在早期(第15天；表示为编号4，三重复表示为4A、4B、4C)和晚期(第55天；表示为编号5，三重复表示为5A、5B、5C)在生物反应器中产生的iMP。所有分化的iMP(第2-5组)彼此之间非常相似。
图10B是描绘了图10A所描绘的测定中2000个变化最大的基因的主成分分析图。与图10A中的聚类一样，接近性指示相似性，因此显示了第2-5组中的iMP彼此相似。
图11显示了图10A中描绘的细胞的第2-5组中一些关键单核细胞/巨噬细胞标志物(CD14、CD16、CD64、CD11b、CD11c和CD71)的表达(以每千碱基百万的转录本(transcriptsper kilobase million，TPM)计)的RNA-seq结果。
具体实施方式
本文引用的所有参考文献均以引用的方式以其整体并入，如同已完全阐述一样。除非另有定义，否则本文中使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
本领域技术人员将认识到与本文所述方法和材料相似或等同的许多方法和材料，所述方法和材料可用于本发明的实践。事实上，本发明绝不仅限于所描述的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语被定义如下。
“受试者”意指人或动物。通常，动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿类动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物物种(如家猫)和犬科动物物种(如狗、狐狸、狼)。术语“患者”、“个体”和“受试者”在本文中可互换使用。在实施方式中，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。在实施方式中，受试者是人。在进一步的实施方式中，受试者是表现出神经退行性症状或疾病的迹象(例如，表现出记忆(短期记忆、工作记忆等)丧失的迹象、时间或地点混淆的迹象、震颤的迹象)的人。
“神经系统障碍”是指影响脑以及遍布全身的神经和脊髓的障碍，其包括但不限于癫痫、学习无能(learning disability)、神经肌肉障碍、自闭症、注意力缺陷障碍、脑肿瘤和脑性瘫痪。
“神经退行性疾病或障碍”一般描述脑或周围神经系统中的神经细胞随时间丧失功能并最终死亡的病状。受神经退行性疾病影响的风险随着年龄而急剧增加。阿尔茨海默病和帕金森病是常见的神经退行性疾病。神经退行性疾病的实例包括阿尔茨海默病和其它痴呆、帕金森病及其相关障碍、亨廷顿病、朊蛋白病(Prion disease)、运动神经元病、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩症和肌萎缩性侧索硬化症。
“空间工作记忆”涉及在短时间内在工作记忆中保持空间信息活跃的能力。
“短期记忆”也称为初级记忆或活跃记忆(active memory)，是在头脑中存储少量信息并在短期时间内保持其便捷可得的能力。通常短期记忆非常短暂。当短期记忆没有被重复或主动保持时，它们可以仅持续数秒。
术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(to treat)”是指治愈、减缓、减轻已确诊病理疾病或障碍的症状和/或阻止已确诊病理疾病或障碍的进展的治疗性措施。因此，那些需要治疗的人包括那些已经患有所述障碍的人。在某些实施方式中，如果受试者表现出例如与疾病或障碍相关的任何症状的完全、部分、永久或短暂的缓解或消除，则该受试者被成功“治疗”了所述疾病或障碍。
除非本文另有特别规定，否则术语“约(about)”或“大约(approximately)”在与参考数值指示(以百分比计)结合使用时，意指参考数值指示(以百分比计)加上或减去该参考数值指示(以百分比计)的多至5％。例如，语言“约50％”涵盖45％到55％的范围。在各种实施方式中，如果权利要求中特别规定的话，当与参考数值指示结合使用时，术语“约”可以意指参考数值指示加上或减去该参考数值指示的多至4％、3％、2％、1％、0.5％或0.25％。在其它实施方式中，当与至少以天(例如，天、周或月)为单位的时间段的参考数值指示结合使用时，“约”或“大约”意指参考数值指示加上或减去至少一天，或者当所指示的时间段的10％大于1天时，则为加上或减去至少一天并多至所指示的时间段的10％。例如，语言“大约”4天涵盖3天至5天的范围；语言“大约”60天或“大约”2个月涵盖54天至66天的范围。
术语“多能干细胞”或“PSC”是指具有发育成内胚层、外胚层和中胚层细胞中任一者的能力以及生长能力的自我复制细胞。多能干细胞的实例包括但不限于胚胎干(ES)细胞、来源于通过核移植获得的克隆胚胎的胚胎干细胞(ntES细胞)、生殖系干细胞(“GS细胞”)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)和诱导多能干细胞(“iPS细胞”或“iPSC”)。在一些实施方式中，PSC细胞是人PSC。PSC的优选实例包括ES细胞和iPS细胞。
ES细胞是从哺乳动物(如人或小鼠)的早期胚胎(例如囊胚)的内细胞团中建立的干细胞，ES细胞具有通过自我更新的生长能力和多能性。可以通过从受试动物的受精卵的囊胚中移除内细胞团，然后在作为饲养体的成纤维细胞上培养内细胞团来建立ES细胞。可通过使用补充了物质(如白血病抑制因子(LIF)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))的培养基进行传代培养来维持细胞。人和猴ES细胞的建立和维持方法在例如以下中进行描述：US 5,843,780B；Thomson JA等(1995)，Proc Natl.Acad.Sci.U S A.92:7844-7848；Thomson JA等(1998)，Science.282:1145-1147；H.Suemori等(2006)，Biochem.Biophys.Res.Commun.，345:926-932；M.Ueno等(2006)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:9554-9559；H.Suemori等(2001)，Dev.Dyn.，222:273-279；H.Kawasaki等(2002)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99:1580-1585；和Klimanskaya I等(2006)，Nature.444:481-485。
可通过向体细胞引入特定的重编程因子来制备诱导多能干细胞(iPS)，所述重编程因子处于DNA或蛋白质的形式。iPS细胞是源自体细胞的人工干细胞，具有几乎等同于ES细胞的特性，如通过自我更新的生长能力和分化多能性。重编程因子可包括以下：在ES细胞中特异表达的基因或其基因产物或非编码RNA；或在维持ES细胞的未分化状态中发挥重要作用的基因或其基因产物、非编码RNA或低分子量化合物。重编程因子基因的实例包括Oct3/4、Sox2、Soxl、Sox3、Soxl5、Soxl7、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbxl5、ERas、ECAT15-2、Tell、β-连环蛋白、Lin28b、Salll、Sall4、Esrrb、Nr5a2和Tbx3，并且这些重编程因子可单独使用或组合使用。
术语“血清”是指人血清、猴血清、胎牛血清、牛血清、猪血清、马血清、驴血清、鸡血清、鹌鹑血清、绵羊血清、山羊血清、狗血清、猫血清、兔血清、大鼠血清、豚鼠血清、小鼠血清等。不含血清的培养基的实例包括最低必需培养基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)、StemPro-34SFM(Invitrogen)、Stemline II(Sigma-Aldrich)以及补充有ITS的类似培养基；用于培养灵长类ES细胞的培养基(用于灵长类ES/iPS细胞的培养基，ReproCELL)，其中已预先添加了血清替代物；以及无血清培养基(mTeSR，Stemcell Technology)。不含血清或“无血清”的培养基更优选mTeSR1培养基或StemPro-34无血清培养基。
“造血因子”是指促进血细胞分化和生长的因子。其实例包括干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素和Flt3配体。白细胞介素是从白细胞分泌的蛋白质，可分为多种类型，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8和IL-9。
短语“实质上纯净”是指其中至少95％的细胞具有所述的表型或表达标志物谱的细胞群。在提及“实质上纯净”细胞群的所有实施方式中，其中细胞群具有更低或更高纯度水平的替代实施方式也在考虑之列。例如，在一些实施方式中，代替“实质上纯净”的给定细胞群，细胞群可以是其中至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞或100％的细胞具有所述的表型或基因表达谱的细胞群。
各种实施方式提供了改善受试者认知功能的方法，或治疗患有神经退行性障碍的受试者的方法，或减轻、治疗或延迟神经退行性障碍发作的方法，或减轻患有神经退行性障碍的受试者中的炎症的方法，其中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由多能干细胞生成的单核吞噬细胞群。在一些方面，单核吞噬细胞群从诱导多能干细胞(iPSC)分化。在其它方面，单核吞噬细胞群从自体iPSC分化。在又另一个方面，单核吞噬细胞群从胚胎干细胞分化。在各种实施方式中，由多能干细胞生成的单核吞噬细胞包括由多能干细胞生成的单核细胞。在各种实施方式中，由多能干细胞生成的单核吞噬细胞是由多能干细胞生成的单核细胞。在一些实施方式中，由多能干细胞生成的单核吞噬细胞进一步包括巨噬细胞；并且巨噬细胞是在移植由多能干细胞生成的单核细胞后产生或通过体外或离体刺激由多能干细胞生成的单核细胞而产生。在进一步的实施方式中，单核吞噬细胞群是通过本文公开的一种或多种分化方法从iPSC生成的髓系细胞。在另外的实施方式中，本发明的单核吞噬细胞包括单核细胞，可进一步包括巨噬细胞，但不包括中性粒细胞。
在一些实施方式中，提供了改善受试者的认知功能的方法，或治疗患有神经退行性障碍的受试者的方法，或减轻、治疗或延迟神经退行性障碍的发作的方法，或减轻患有神经退行性障碍的受试者中的炎症的方法，其中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含通过本文公开的一种或多种分化方法由iPSC生成的单核细胞。在一些实施方式中，改善受试者的认知功能的方法，或治疗患有神经退行性障碍的受试者的方法，或减轻、治疗或延迟神经退行性障碍的发作的方法，或减少患有神经退行性疾病的受试者的炎症的方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由通过本文公开的分化方法由iPSC生成的单核细胞组成的细胞，其中，所述分化方法不包括在体外将生成的单核细胞分化为巨噬细胞，例如，所述分化方法不包括在IFN-γ或IL-4中的一种或两种以及M-CSF的存在下对生成的单核细胞进行培养。在其它实施方式中，改善受试者的认知功能的方法，或治疗患有神经退行性障碍的受试者的方法，或减轻、治疗或延迟神经退行性障碍的发作的方法，或减少患有神经退行性障碍的受试者中的炎症的方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由iPSC生成的单核吞噬细胞，所述单核吞噬细胞(1)如果分化方法进一步驱动巨噬细胞体外分化，其可以是由iPSC生成的单核细胞和由iPSC生成的巨噬细胞的混合物，或者(2)如果分化方法进一步驱动巨噬细胞体外分化，并进行另外的分选/纯化以仅获得由iPSC生成的巨噬细胞，其可以是实质上纯净的由iPSC生成的巨噬细胞；或者(3)如果分化方法不驱动由iPSC生成的单核细胞的分化，其可以是实质上纯净的由iPSC生成的单核细胞。
在各种实施方式中，在本文公开的过程中，特别是通过在生物反应器中培养，由多能干细胞(例如诱导多能干细胞)生成临床上有意义的量的单核吞噬细胞(或髓系单核性细胞(myeloid monocytic cell))。由多能干细胞，特别是iPSC生成的临床上有意义的量的单核吞噬细胞可储存(如冷冻)或在培养中保持，用于在患者施用时以大量使用，而不必从患者中分离出单核吞噬细胞(或单核细胞)并使用它们。从多能干细胞、特别是诱导多能干细胞开始，与从需要治疗的患者或受试者获得的自体单核细胞或巨噬细胞相比，本文所述的生成的单核吞噬细胞可更不倾向于基因突变，并且可具有更少的疾病突变。
在一些实施方式中，改善受试者、特别是衰老的受试者(例如，年龄在40至50岁之间、50至60岁之间、60至70岁之间、70至80岁之间、80至90岁之间、90至100岁之间或大于100岁的人)的认知功能的方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由受试者的自体iPSC生成的单核吞噬细胞。在一些实施方式中，治疗患有神经退行性障碍的受试者的方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由受试者的自体iPSC分化的单核吞噬细胞。在一些实施方式中，减轻、治疗或延迟受试者的神经退行性障碍发作的方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由受试者的自体iPSC分化的单核吞噬细胞。在进一步的实施方式中，治疗或预防方法包括向患有、被怀疑为患有或处于发展出与单核吞噬细胞缺陷或缺乏有关的疾病或障碍的风险中的受试者施用由自体iPSC生成的单核吞噬细胞。在一些实施方式中，治疗或预防方法包括向患有、被怀疑为患有或处于发展出与巨噬细胞缺陷或缺乏有关的疾病或障碍的受试者施用由自体iPSC生成的单核吞噬细胞，其中所施用的单核吞噬细胞在施用到受试者中之后产生巨噬细胞。在还另外的实施方式中，减少炎症的方法包括向患有、被怀疑为患有或处于发展出与炎症相关的疾病或障碍的风险中的受试者施用由自体iPSC生成的单核吞噬细胞；任选地，其中，所施用的单核吞噬细胞在受试者中施用后产生巨噬细胞。与炎症相关的疾病或障碍可以是神经退行性疾病或障碍。
在其它实施方式中，改善受试者、特别是衰老的受试者(例如，年龄在40至50岁之间、50至60岁之间、60至70岁之间、70至80岁之间、80至90岁之间、90至100岁之间或大于100岁的人)的认知功能的方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由受试者的自体iPSC生成的髓系单核性细胞或单核细胞，其中，所述髓系单核性细胞或单核细胞在向受试者施用前未被刺激分化成小胶质细胞、树突状细胞或巨噬细胞。在一些实施方式中，治疗患有神经退行性障碍的受试者的方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由受试者的自体iPSC生成的髓系单核性细胞或单核细胞，其中，所述髓系单核性细胞或单核细胞在向受试者施用前未被刺激分化成小胶质细胞、树突状细胞或巨噬细胞。在一些实施方式中，减轻、治疗或延迟受试者的神经退行性障碍发作的方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由受试者的自体iPSC生成的髓系单核性细胞或单核细胞，其中，所述髓系单核性细胞或单核细胞在向受试者施用前未被刺激分化成小胶质细胞、树突状细胞或巨噬细胞。在进一步的实施方式中，治疗或预防的方法包括向患有、被怀疑为患有或处于发展出与单核细胞或单核吞噬细胞的缺陷或缺乏有关的疾病或障碍的风险中的受试者施用由受试者的自体iPSC生成的髓系单核性细胞或单核细胞，其中，所述髓系单核性细胞或单核细胞在向受试者施用前未被刺激分化成小胶质细胞、树突状细胞或巨噬细胞。在一些实施方式中，治疗或预防的方法包括向患有、被怀疑为患有或处于发展出与巨噬细胞的缺陷或缺乏有关的疾病或障碍的风险中的受试者施用由受试者的自体iPSC生成的髓系单核性细胞或单核细胞，其中，所施用的髓系单核性细胞或单核细胞在施用至受试者中后产生巨噬细胞。在又另外的实施方式中，减少炎症的方法包括向患有、被怀疑为患有或处于发展出与炎症相关的疾病或障碍的风险中的受试者施用，其中，所述髓系单核性细胞或单核细胞在向受试者施用前未被刺激分化成小胶质细胞、树突状细胞或巨噬细胞。与炎症相关的疾病或障碍可以是神经退行性疾病或障碍。在替代性的实施方式中，治疗或预防的方法、或减少炎症的方法包括向受试者施用来自受试者的自体iPSC的髓系单核性细胞，其中，所施用的髓系单核性细胞在施用至受试者中之前进一步分化成巨噬细胞。
在各种实施方案中，包括施用从多能干细胞(优选从iPSC)分化的单核吞噬细胞的方法不包括向受试者施用血浆或骨髓；或者，这些方法中的受试者不接受血浆或骨髓移植。在替代性的实施方案中，包括施用从多能干细胞(优选从iPSC)分化的单核吞噬细胞的方法是附加于受试者的血浆或骨髓移植疗法的。在另一种实施方案中，包括施用从多能干细胞分化的单核吞噬细胞的方法用于如下的受试者，所述受试者对血浆输注或对骨髓移植疗法的反应是无效的或涉及发病并发症。
在所述方法的各种实施方式中，单核吞噬细胞在如下过程中由多能干细胞生成，所述过程包括在诱导髓系分化的条件下在细胞培养基中培养多能干细胞，从而生成髓系谱系细胞(优选单核细胞)，并且该过程不包括在小胶质细胞分化培养基或树突状细胞分化培养基中接触或培养所生成的细胞。例如，由多能干细胞生成单核吞噬细胞(或髓系谱系细胞)的过程不包括在(a)IL-34、(b)IL-34和GM-CSF、(c)IL-4或(d)IL-4和GM-CSF的存在下培养或接触所生成的细胞。因此，用于本文公开的一种或多种方法中的由多能干细胞生成的单核吞噬细胞(优选单核细胞)不是小胶质细胞或树突状细胞。因此，本文公开的改善受试者的认知功能的方法，或治疗患有神经退行性障碍的受试者的方法，或减轻、治疗或延迟受试者的神经退行性障碍的发作的方法，或治疗或预防患有、被怀疑为患有或处于发展出与巨噬细胞或单核细胞缺陷或缺乏有关的疾病或障碍的风险中的受试者的方法，不包括施用由多能干细胞生成的小胶质细胞或树突状细胞。在另外的实施方式中，该过程进一步排除了在巨噬细胞分化培养基中或在巨噬细胞分化刺激物存在的情况下接触或培养所生成的细胞。例如，在这些另外的情况下，由多能干细胞生成单核吞噬细胞(或髓系谱系细胞)的过程不包括在以下物质存在的情况下培养或接触所生成的细胞：(a)IL-34，(b)IL-34和GM-CSF，(c)IL-4，(d)IL-4和GM-CSF，或(e)IFN-γ和IL-4中的一种或两种以及M-CSF。也就是说，生成单核吞噬细胞的过程不包括使所生成的细胞与以下任何一种进行培养：(a)IL-34，(b)IL-34和GM-CSF的组合，(c)IL-4，(d)IL-4和GM-CSF的组合，(e)M-CSF和IFN-γ的组合，以及(f)M-CSF和IL-4的组合。“组合”中的多种试剂可同时或依次加入培养基中。或者，该过程可进一步包括在巨噬细胞分化培养基中或在巨噬细胞分化刺激物存在的情况下接触或培养所生成的细胞。例如，由多能干细胞生成单核吞噬细胞(或髓系谱系细胞)的过程不包括在(a)IL-34、(b)IL-34和GM-CSF、(c)IL-4或(d)IL-4和GM-CSF的存在下培养或接触所生成的细胞，但包括使所生成的细胞与IFN-γ和IL-4中的一种或两种以及M-CSF进行培养或接触。
具体而言，在一些情况下，由多能干细胞生成单核吞噬细胞的过程包括在诱导髓系分化的条件下，在细胞培养基中培养多能干细胞，其中，所述培养包括使多能干细胞与处于无血清培养基中的第一组合物接触，所述第一组合物包含BMP-4，所述培养基含有bFGF，含有bFGF和TGFβ，或含有bFGF、TGFβ、氨基丁酸、哌啶酸和氯化锂。在各种方面，所述培养包括使多能干细胞与处于mTeSR1培养基中的第一组合物接触，所述第一组合物包含BMP-4，所述mTeSR1培养基含有bFGF、TGFβ、氨基丁酸、哌啶酸和氯化锂中的全部或一种、两种、三种或四种。
在诱导髓系分化的条件下在细胞培养基中培养多能干细胞可进一步包括使从涉及第一组合物的步骤中获得的细胞与第二组合物接触，所述第二组合物包含包括bFGF、VEGF、SCF或其组合在内的一种或多种或全部因子。在各种方面，使细胞与第二组合物接触是指将细胞培养基更换成有第二组合物的培养基，或使细胞培养基与第二组合物接触。在各种方面，第二组合物包含由bFGF、VEGF或SCF，或bFGF、VEGF和SCF的组合所组成的造血因子；并且优选处于无血清培养基中。
在诱导髓系分化的条件下在细胞培养基中培养多能干细胞可进一步包括使从涉及第二组合物的步骤中获得的细胞与第三组合物接触，所述第三组合物包含包括SCF、IL-3、血小板生成素、M-CSF、FLT3配体或其组合在内的一种或多种或全部因子。在各种方面，使细胞与第三组合物接触是指将细胞培养基更换成有第三组合物的培养基，或使细胞培养基与第三组合物接触。在各种方面，第三组合物包括由SCF、IL-3、血小板生成素、M-CSF或FLT3配体，或SCF、IL-3、血小板生成素、M-CSF和FLT3配体的组合所组成的造血因子；优选处于无血清培养基中。
在诱导髓系分化的条件下在细胞培养基中培养多能干细胞可进一步包括使从涉及第三组合物的步骤中获得的细胞与第四组合物接触，所述第四组合物包含包括M-CSF、GM-CSF、FLT3配体或其组合在内的一种或多种或全部因子。在各种方面，使细胞与第四组合物接触是指将细胞培养基更换成有第四组合物的培养基，或使细胞培养基与第四组合物接触。在各种方面，第四组合物包括由M-CSF、GM-CSF或FLT3配体，或M-CSF、GM-CSF和FLT3配体的组合组成的造血因子。
在一个实施方式中，由多能干细胞生成单核吞噬细胞的过程包括(a)将多能干细胞以贴壁培养与包含BMP-4但不包含血清的第一组合物进行培养；(b)将通过步骤(a)获得的细胞以贴壁培养与包含bFGF、VEGF和SCF但不包含血清的第二组合物进行培养；(c)将通过步骤(b)获得的细胞以贴壁培养与包含SCF、IL-3、血小板生成素、M-CSF和FLT3配体但不包含血清的第三组合物进行培养；以及(d)将通过步骤(c)获得的细胞以贴壁培养与包含M-CSF、GM-CSF和FLT3配体的第四组合物进行培养，其中，产生/收集巨噬细胞和/或单核细胞。或者，由多能干细胞生成单核吞噬细胞的过程可在悬浮培养中进行。例如，步骤(d)可在悬浮培养中进行，例如在含有包含M-CSF、GM-CSF和FLT3配体的第四组合物的生物反应器中。表1显示，在生物反应器中以悬浮培养进行培育的细胞是活的。在悬浮培养中的培养包括在替换细胞培养基时收集存在于培养物上清液中的细胞，并将收集的细胞加回到细胞培养物中。
在一些实施方式中，由多能干细胞生成单核吞噬细胞的过程包括进行以下四个步骤中的一个或多个：第一，使细胞培养物与处于培养基中的包含BMP4的第一组合物接触，其中，当细胞培养物最初与第一组合物接触时，细胞培养物包含多能干细胞；第二，使细胞培养物与处于造血细胞培养基中的包含bFGF、SCF和VEGF-A中的一种或多种(例如bFGF、SCF和VEGF-A中的每一种)的第二组合物接触；第三，使细胞培养物与处于造血细胞培养基中的包含SCF、IL-3、TPO、M-CSF和FLT3配体中的一种或多种(例如SCF、IL-3、TPO、M-CSF和FLT3配体中的每一种)的第三组合物接触；以及第四，使细胞培养物与处于造血细胞培养基中的包含M-CSF、FLT3配体和GM-CSF中的一种或多种(例如M-CSF、FLT3配体和GM-CSF中的每一种)的第四组合物接触，从而生成单核吞噬细胞。在一些实施方式中，上述四个步骤都依次进行。在各种实施方式中，所生成的单核吞噬细胞不被进一步分化或刺激成为小胶质细胞或树突状细胞。在另外的实施方式中，所生成的单核吞噬细胞不被进一步分化或刺激成为巨噬细胞；而或者，所生成的单核吞噬细胞可以被分化以获得至少一些巨噬细胞。在一些此类实施方式中，用于上述四个步骤中任一步骤的培养基是无血清培养基。在一些此类实施方式中，用于上述四个步骤中任一步骤的培养基是化学成分限定的培养基。在一些此类实施方式中，上述四个步骤中的所有或任一步骤是在用细胞外基质包覆的平皿或孔板中进行的。在一些方面，所述细胞外基质是从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞中提取的重建基底膜制剂。
在一个实施方式中，由多能干细胞生成单核吞噬细胞的过程包括：在补充有骨形态发生蛋白4(BMP-4)的第一培养基中孵育多能干细胞，从而形成经第一培养基处理的细胞；在补充有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和干细胞因子(SCF)的第二培养基中孵育经第一培养基处理的细胞，从而形成经第二培养基处理的细胞；在补充有SCF、白细胞介素3(IL-3)、血小板生成素(TPO)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和FLT3配体的第三培养基中孵育经第二培养基处理的细胞，从而形成经第三培养基处理的细胞；以及在补充有M-CSF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和FLT3配体的第四培养基中孵育经第三培养基处理的细胞，从而形成经第四培养基处理的细胞，其是由多能干细胞分化而来的单核吞噬细胞。
在一个实施方式中，由多能干细胞生成单核细胞的过程包括：在补充有BMP-4的第一培养基中孵育iPSC，从而形成经第一培养基处理的细胞；在补充有bFGF、VEGF和SCF的第二培养基中孵育经第一培养基处理的细胞，从而形成经第二培养基处理的细胞；在补充有SCF、IL-3、TPO、M-CSF和FLT3配体的第三培养基中孵育经第二培养基处理的细胞，从而形成经第三培养基处理的细胞；以及在补充有M-CSF、GM-CSF和FLT3配体的第四培养基中孵育经第三培养基处理的细胞，从而形成经第四培养基处理的细胞，其是由多能干细胞分化而来的单核细胞。由iPSC生成的所获得的单核细胞适合用于移植、输液或以其它方式施用至有需要的患者。
一些方面提供了，第一培养基是无饲养层培养基mTeSR，并补充有BMP-4。BMP-4可被添加到第一培养基中，最终浓度在10ng/mL至200ng/mL之间、或40ng/mL至160ng/mL之间、或60ng/mL至120ng/mL之间、或约80ng/mL。在一些方面，BMP-4的浓度为5ng/mL至150ng/mL。在一些方面，BMP-4的浓度为10ng/mL至100ng/mL。在一些方面，BMP-4的浓度为20ng/mL至80ng/mL。在进一步的方面，第一培养基是标准mTeSR培养基，而不是mTeSR定制培养基；因此第一培养基是含有bFGF、TGFβ、GABA、哌啶酸和氯化锂的mTeSR。这种含有补充剂的第一培养基可以以一个或多个新鲜体积用于培育干细胞约3天，或从第1天到第4天。在一些方面，适合维持干细胞的组织培养基被用作第一培养基。在其它方面，适合干细胞分化的组织培养基被用作第一培养基。
“TeSR”是无血清、无外源性(xeno-free)的培养基，其被证明支持hPSC的衍化和长期不依赖于饲养层的培养，并且是由Tenneille Ludwig及其同事开发(Ludwig TE等，NatBiotechnol.24:185-7，2006)“TeSR”的配方包括高水平的bFGF，伴有TGF、GABA、哌啶酸和氯化锂。Ludwig等的该原始出版物描述了包括四种人类组分(胶原蛋白IV、纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白)的细胞支持基质的使用。Ludwig及同事进一步开发了对该培养基的改良(“mTeSR1”)，其中确实包含了一些动物来源的蛋白质，但保留了完全限定和无血清的优点，并支持hPSC的自我更新，而不需要饲养细胞(Ludwig TE等，Nat Methods 3:637-46，2006)。根据Ludwig TE等，Nat Methods 3:637-46，2006，mTeSR1培养基包含：DMEM/F12、StockB(包含溶解的牛血清白蛋白、硫胺素、还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸2-磷酸镁盐、硒、微量元素B、微量元素C、胰岛素、铁饱和转铁蛋白)、斑马鱼bFGF、TGFβ1、哌啶酸、GABA、氯化锂、脂质、L-谷氨酰胺-β巯基乙醇、MEM NEAA和NaHCO3，其在混合后使用NaOH将pH调节至7.4，并使用结晶NaCl将渗透压调节至340mOsMol至350mOsMol，并优选在使用前过滤灭菌。
一些方面提供了，第二培养基为无血清培养基(例如StemPro-34)，并补充有(1)终浓度在5ng/mL和100ng/mL之间、或10ng/mL和50ng/mL之间、或20ng/mL和35ng/mL之间、或约25ng/mL的bFGF；(2)终浓度在约10ng/mL和200ng/mL之间、或约40ng/mL和120ng/mL之间、或约60ng/mL和100ng/mL之间、或约80ng/mL的VEGF；以及(3)终浓度在约10ng/mL和500ng/mL之间、或30ng/mL和300ng/mL之间、或50ng/mL和150ng/mL之间、或80ng/mL和120ng/mL之间、或约100ng/mL的SCF。这种含有补充剂的第二培养基可以以一个或多个新鲜体积用于培育细胞约2天，从第4天到第6天。
一些方面提供了，第三培养基是无血清培养基(例如StemPro-34)，并补充有(1)终浓度在5ng/mL和100ng/mL之间、或25ng/mL和75ng/mL之间、或40ng/mL和60ng/mL之间、或约50ng/mL的SCF；(2)终浓度在5ng/mL和100ng/mL之间、或25ng/mL和75ng/mL之间、或40ng/mL和60ng/mL之间、或约50ng/mL的IL-3；(3)终浓度在0.5ng/mL和20ng/mL之间、或1ng/mL和10ng/mL之间、或3ng/mL和7ng/mL之间、或约5ng/mL的TPO；(4)终浓度在5ng/mL和100ng/mL之间、或25ng/mL和75ng/mL之间、或40ng/mL和60ng/mL之间、或约50ng/mL的M-CSF；以及(5)终浓度在5ng/mL和100ng/mL之间、或25ng/mL和75ng/mL之间、或40ng/mL和60ng/mL之间、或约50ng/mL的FLT3(或FLT3配体)。这种含有补充剂的第三培养基可以以一个或多个新鲜体积用于培育细胞约6天或7天，例如从第6天到第12天或第13天。
一些方面提供了，第四培养基是无血清培养基(例如StemPro-34)，并补充有：(1)终浓度在5ng/mL和100ng/mL之间、或25ng/mL和75ng/mL之间、或40ng/mL和60ng/mL之间、或约50ng/mL的M-CSF；(2)终浓度在约5ng/mL和50ng/mL之间、或10ng/mL和40ng/mL之间、或20ng/mL和30ng/mL之间、或约25ng/mL的GM-CSF；以及(3)终浓度在5ng/mL和100ng/mL之间、或25ng/mL和75ng/mL之间、或40ng/mL和60ng/mL之间、或约50ng/mL的FLT3(或FLT3配体)。
另外的方面提供了，在阶段2-阶段4中，可使用任何合适的造血细胞培养基作为第二、第三和第四培养基。在一个实施方式中，造血细胞培养基是“StemPro-34”。StemPro-34培养基的组成在本领域是已知的，并在例如标题为“造血细胞培养营养补充剂”的EP0891419(或US20040072349、US20100297090)以及WO1997033978(或US20040072349、US20100297090)中进行了描述，其内容在此通过引用并入。然而，本领域技术人员将认识到，存在与StemPro-34培养基在其培养造血细胞的适用性方面相当的数种其它类型的培养基——可以使用其中任一培养基。
在各种情况下，只要能在该浓度获得感兴趣的细胞，每一步骤中使用的细胞因子等(包括造血因子)的浓度不受限制。在一些方面，各步骤中细胞培养基中的bFGF浓度为10ng/mL至100ng/mL。在一些方面，各步骤中细胞培养基中的bFGF浓度为20ng/mL至50ng/mL。在一些方面，各步骤中细胞培养基中的bFGF浓度为约25ng/mL。在一些方面，各步骤中细胞培养基中VEGF的浓度为20ng/mL至100ng/mL。在一些方面，各步骤中细胞培养基中VEGF的浓度为30ng/mL至70ng/mL。在一些方面，各步骤中细胞培养基中VEGF的浓度为约50ng/mL。在一些方面，各步骤中细胞培养基中SCF的浓度为20ng/mL至100ng/mL。在一些方面，各步骤中细胞培养基中的SCF浓度为30ng/mL至70ng/mL。在一些方面，各步骤中细胞培养基中SCF的浓度为约50ng/mL。对于IL-3，一些情况下浓度为5ng/mL至100ng/mL。在一些方面，IL-3的浓度可为30ng/mL至70ng/mL。在其它方面，IL-3的浓度可以是约50ng/mL。对于TPO，浓度为1ng/mL至25ng/mL。在一些方面，TPO的浓度优选为1ng/mL至10ng/mL。在一些方面，TPO的浓度为约5ng/mL。在各个方面，对于Flt3-配体(FLT3L)，浓度为10ng/mL至100ng/mL。在一些方面，FLT3L的浓度为30ng/mL至70ng/mL。在一些方面，FLT3L的浓度为约50ng/mL。在各个方面，对于GM-CSF，浓度为5ng/mL至100ng/mL。在一些方面，GM-CSF的浓度优选为10ng/mL至50ng/mL。在一些方面，GM-CSF的浓度为约25ng/mL。在各个方面，对于M-CSF，浓度为5ng/mL至100ng/mL。在一些方面，M-CSF的浓度优选为30ng/mL至70ng/mL，或更优选为50ng/mL。
在各种方面，由多能干细胞(优选由iPSC)生成单核吞噬细胞的过程包括按以下组合使用各自的因子：
在第一细胞培养基中，BMP-4为60ng/mL至100ng/mL；
在第二细胞培养基中，bFGF为15ng/mL至30ng/mL，VEGF为60ng/mL至100ng/mL，以及SCF为80ng/mL至120ng/mL；
在第三细胞培养基中，SCF为40ng/mL至60ng/mL，IL-3为40ng/mL至60ng/mL，TPO为4ng/mL至6ng/mL，M-CSF为40ng/mL至60ng/mL，以及FLT3L为40ng/mL至60ng/mL；并且
在第四细胞培养基中，M-CSF为40ng/mL至60ng/mL，GM-CSF为15ng/mL至30ng/mL，以及FLT3L为40ng/mL至60ng/mL。
各种实施方式还提供了，就各步骤的时间段而言，上述步骤(a)(或“阶段1”)进行不少于2天，优选不少于2天且不超过6天，更优选4天。上述步骤(b)(或“阶段2”)进行不少于1天，优选不少于1天且不超过5天，更优选2天。上述步骤(c)(或“阶段3”)进行不少于5天，优选不少于6天，并且不超过14天，更优选9天。上述步骤(d)(或“阶段4”)进行不少于3天，优选不少于3天且不超过90天。在一些实施方式中，步骤(d)(或“阶段4”)进行至少55天或60天，并且直至约90天。
在一些实施方式中，在生物反应器中进一步培养所生成的单核吞噬细胞，使其生长到至少1×106个细胞的数量级的临床相关数量。在一些实施方式中，由多能干细胞生成单核吞噬细胞的过程在生物反应器中进行，从步骤(a)(“阶段1”)、步骤(b)(“阶段2”)、步骤(c)(“阶段3”)或步骤(d)(“阶段4”)中的任何一个开始。如实施例3中所示，由多能干细胞生成并在生物反应器中增殖(持续多种天数，从1-10天、11-20天、21-30天、31-40天、41-50天、50-60天或更长)的单核吞噬细胞显示出与在孔板中生成的单核吞噬细胞相似的基因表达谱和单核细胞/巨噬细胞标志物表达水平。
本领域已知的生物反应器通常适用于生长iMP，以获得用于施用的临床相关数量。示例性生物反应器包括搅拌瓶，也称为搅拌罐生物反应器，其中的叶轮混合使细胞保持悬浮，并且流体移动有助于营养物质和废物的物质运输。除了搅拌瓶，我们也考虑使用摇床袋系统和/或系统用于iMP的规模放大生产。例如，摇床袋系统包括摇床(包括基部并提供平台，例如以托盘形状，任选地进一步包括加热器和/或热电偶)和一个或多个细胞培养摇床袋(用于包封细胞培养物，并适合放置在平台上)。摇床产生平滑的摇动、波浪运动，该运动提供温和、高效的混合和气体转移。细胞培养摇床袋通常包含用于将液体和/或空气运进和运出袋子的端口。/>是指气体可渗透快速膨胀。G-REX生物反应器让细胞无限制地且不受干扰地获得营养物质和氧气，以产生大量细胞，省去了集成系统中需要的复杂硬件和培养基替换。
在各种实施方式中，在本文公开的过程中由多能干细胞(例如iPSC)生成的骨髓单核性细胞或单核吞噬细胞对单核细胞/巨噬细胞标志物如CD14、CD16、CD64、CD11b、CD11c、CD71呈阳性，由此被称为iMP(由iPSC生成的单核吞噬细胞)，或在各种情况下包括由iPSC生成的单核细胞和/或由iPSC生成的巨噬细胞(在优先权申请US 63/234,984中被称为iMAC)，并且其不再表达或几乎不表达造血干细胞标志物CD34。在各种实施方式中，由干细胞(例如由iPSC)生成的单核吞噬细胞不是小胶质细胞，因为分化方法不包括在小胶质细胞培养基中培养任何所生成的细胞。分化的单核吞噬细胞可在新鲜体积的所述四种培养基(含补充剂)中培养，直至收获。在各种实施方式中，分化方法进一步包括或伴随着通过在各阶段补充新鲜体积的培养基来扩增细胞，并且任选地传代细胞。在一些实施方案中，向受试者直接施用收获的细胞，任选地伴随一些稀释或浓缩。在各种实施方式中，来自经第四培养基处理的细胞的至少50％、60％、70％、80％或90％的收获细胞是单核细胞。优选地，至少50％的在第四培养基之后收获的细胞是单核细胞。更优选地，至少70％或约70％的在第四培养基之后收获的细胞是单核细胞。可使用靶向抗原(例如CD34、CD11b、CD11c、CD14和CD16)的抗体来分析细胞，以确定表达单核细胞/巨噬细胞标志物的细胞的百分比。
在其它实施方案中，源自干细胞的收获的单核吞噬细胞被冻存，以在储存和运输步骤中保持产品稳定性。在一些方面，从过程中生成的收获的单核吞噬细胞被纯化，例如，通过CD14标志物。CD14阳性细胞的纯化可通过本领域技术人员熟知的方法进行，并且方法不受限制。例如，可以使用CD14 MicroBead或流式细胞仪纯化细胞。在一些方面，在不通过一种或多种标志物进行进一步分选，特别是不通过标志物C3CR1分选的情况下收获单核吞噬细胞。
在各种实施方式中，可在生物反应器中培养由多能干细胞生成的显著量的单核吞噬细胞，例如达到(在包含两剂以上的疗法中每剂，或每个疗法)至少1×106、1×107或1×108的数量级的临床上有意义的量，并且优选地，在生物反应器中培养的单核吞噬细胞在至少5天、10天、2周、3周、4周或更长的时间内保持基因图谱(包括巨噬细胞标志物或单核细胞/巨噬细胞标志物的表达量)。在一些实施方式中，由多能干细胞生成的单核吞噬细胞(特别是通过在生物反应器中培养而处于临床上有意义的量的单核吞噬细胞)在处于生物反应器培养中或冷冻贮存中一段时间(例如、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月或更长时间)后，与由多能干细胞新鲜生成的单核吞噬细胞(其可在“阶段4”分化的7天内收集)相比，在至少95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％或50％的水平上保持基因图谱(包括单核细胞/巨噬细胞标志物的表达量)。
值得注意的是，在各种实施方式中，与天然存在的单核细胞或天然存在的巨噬细胞或天然存在的单核吞噬细胞相比，所生成的iMP具有差异性的基因表达。所生成的iMP可与天然存在的对应物相比对相似的标志物呈阳性，并且在功能测试中尤其是在体内表现相似，从而具有实施例中证明的治疗功效。iPSC和天然存在的巨噬细胞/单核细胞都不具有增殖性，但如实施例2和实施例3所详述，本发明提供了由iPSC分化而来的包囊(cyst)，这样iMP可以从包囊出芽脱落，并从而在生产中扩大到治疗量(或临床上有意义的数量)。
在本方法的各种实施方式中，在两次以上的暴露中向受试者施用包含单核吞噬细胞群的组合物。在一个实施方式中，向受试者施用包含单核吞噬细胞群的组合物至少3剂。在一个实施方式中，向受试者施用包含由iPSC生成的单核吞噬细胞群的组合物4剂-10剂。在一个实施方式中，向受试者施用包含由iPSC生成的单核吞噬细胞群的组合物6剂-12剂。在一些实施方案中，每周一次、每两周一次/每周两次(biweekly)、每两个月一次/每月两次(bimonthly)、或每月一次，或根据受试者的需要施用组合物。在一些实施方案中，每次暴露至受试者的组合物可以包含至少106个细胞、107个细胞、108个细胞、109个细胞、1010个细胞或1011个细胞。在各种实施方案中，细胞的治疗有效剂量取决于患者的需求、年龄、生理状况和健康状态，以及要达到的组织大小和治疗目标、植入部位、病理程度(神经元水平的恶化)、选择的移动模式和治疗策略。在一些实施方案中，低剂量的细胞被反复移植。这些细胞可用于治疗神经急性或慢性损伤，和/或延迟神经退行性疾病和神经元疾病的发作、减轻或治疗神经退行性疾病和神经元疾病。
治疗方法的各种实施方式适用于衰老的哺乳动物，例如年龄为至少50岁、至少60岁、至少70岁、至少80岁或至少90岁的人。
在其它实施方式中，本文公开的方法用于发展出或被诊断为患有神经退行性疾病(如阿尔茨海默病)的受试者。在进一步的实施方式中，本文公开的方法用于首次表现出阿尔茨海默病的病状的受试者，例如当检测到淀粉样蛋白和小胶质细胞激活时。在又另外的实施方式中，本文公开的方法用于显著受患于严重的阿尔茨海默病的受试者、或已被诊断患有阿尔茨海默病至少6个月、1年、2年或更长时间的受试者，并且所述方法减轻或逆转病状。在某些实施方式中，本方法的神经退行性疾病或神经元疾病选自帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症、Rett综合征、弥漫性白质脑病合并球样变、遗传性弥漫性白质脑病合并轴索球样变、额颞叶退行性变(FTLD)、家族性FTLD、精神分裂症、自闭症谱系障碍、亨廷顿舞蹈症、路易体痴呆、小脑共济失调、Stein-leventhal综合征、脊髓损伤、癫痫、卒中变为局部缺血组。
在另外的实施方式中，本文公开的方法用于患有阿尔茨海默病的受试者(例如，表现出阿尔茨海默病的迹象或症状，或被诊断为患有阿尔茨海默病)，但受试者没有肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
在另外的实施方式中，本文公开的方法用于患有巨噬细胞缺乏或与巨噬细胞缺陷或缺乏相关的疾病或障碍的受试者，因此施用由iPSC生成的单核吞噬细胞可在施用后在受试者中产生巨噬细胞。
各种实施方式提供了，本文公开的方法进一步包括选择患有神经退行性疾病、显示出神经退行性疾病的迹象或处于发展出患神经退行性疾病的风险中的受试者接受由多能干细胞生成的单核吞噬细胞的施用。各种实施方式规定，本文公开的方法进一步包括从患有神经退行性疾病、显示出神经退行性疾病的迹象或处于发展出神经退行性疾病的风险中的受试者处获得自体体细胞(如成纤维细胞、血细胞)，然后通过本领域已知的重编程过程由自体体细胞生成iPS细胞，从而获得由iPS细胞生成的单核吞噬细胞以用于施用至受试者。另外的实施方式规定，本文公开的方法进一步包括在生物反应器中生长所生成的单核吞噬细胞，以获得至少1×106或1×107个细胞。
另外的实施方式提供了由多能干细胞生成单核吞噬细胞(或髓系单核性细胞，或髓系谱系细胞)的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
在补充有骨形态发生蛋白4(BMP-4)的第一培养基中孵育干细胞，从而形成经第一培养基处理的细胞；
在补充有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和干细胞因子(SCF)的第二培养基中孵育经第一培养基处理的细胞，从而形成经第二培养基处理的细胞；
在补充有SCF、白细胞介素3(IL-3)、血小板生成素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和FLT3配体的第三培养基中孵育经第二培养基处理的细胞，从而形成经第三培养基处理的细胞；以及
在补充有M-CSF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和FLT3配体的第四培养基中孵育经第三培养基处理的细胞，从而形成经第四培养基处理的细胞，其是由干细胞分化而来的巨噬细胞或单核细胞，
其中，所述方法不包括在IL-34、或IL-34和GM-CSF的组合、或IL-4、或IL-4和GM-CSF的组合、或M-CSF和IFN-γ的组合、或M-CSF和IL-4的组合的存在下进行培养。
在分化方法的一些方面，所述方法不包括在小胶质细胞分化培养基或树突状细胞分化培养基中孵育经第四培养基处理的细胞。在一些方面，至少50％的经第四培养基处理的细胞是单核细胞；或者，从步骤(d)(或“阶段4”)获得的细胞是实质上纯净的单核吞噬细胞(其包括单核细胞和巨噬细胞)，其特征在于标志物CD14、CD16、CD64、CD11b、CD11c和CD71的表达。在分化方法的一些方面，所生成的单核吞噬细胞不是小胶质细胞，不是树突状细胞，且所生成的单核吞噬细胞对CD11b、CD11c、CD14和CD16中的一个或多个标志物呈阳性。
在一些方面，单核吞噬细胞由iPSC分化而来，iPSC通过对来自受试者(例如，来自健康人类受试者、年轻人(例如，在5-11岁、12-16岁、17-18岁、19-21岁、22-34岁或35-49岁的年龄组内的人)或年轻健康的人类受试者)的血细胞(优选外周血单个核细胞(PBMC))进行重编程来制备。在进一步的实施方式中，单核吞噬细胞由通过对从受试者获得的成纤维细胞进行重编程而制备的iPSC分化而来。
在一些实施方式中，将血细胞重编程为iPSC的方法在WO2017219000、美国专利号10,221,395和美国专利号10,745,671中公开，通过引用将其并入本文。例如，生成源自血细胞的iPSC的方法包括：将一定量的EBNA1和包括Oct-4、Sox-2、Klf-4、1-Myc、Lin-28、SV40大T抗原(“SV40LT”)和靶向p53的短发夹RNA(“shRNA-p53”)在内的重编程因子递送到一定量的血细胞中；以及将血细胞在重编程培养基中培养至少4天，其中，递送EBNA1和重编程因子并在重编程培养基中进行培养生成源自血细胞的诱导多能干细胞，其中，所述重编程因子被编码在在四个源自oriP/EBNA1的载体中，包括编码Oct4、Sox2、SV40LT和Klf4的第一载体，编码Oct4和shRNA-p53的第二载体，编码Sox2和Klf4的第三载体，以及编码1-Myc和Lin-28的第四载体；并且其中，第五个源自oriP/EBNA1的载体编码EBNA1。
在一些方面，单核吞噬细胞由来自某物种的干细胞或诱导多能干细胞分化而来，并用于治疗相同物种的受试者。在一些方面，单核吞噬细胞是由来自年龄年轻的某物种的干细胞或诱导多能干细胞分化而来的，例如，所述干细胞获得自或重编程自从某物种的受试者中获得的体细胞，所述某物种的受试者的年龄比该物种平均寿命的前半部分更年轻。在一些方面，所述单核吞噬细胞由小鼠干细胞分化而来，所述小鼠干细胞获得自小于4月龄(例如3-4月龄之间、2-3月龄之间、1-2月龄之间)的小鼠。在一些方面，单核吞噬细胞是由重编程自十多岁、二十多岁、或三十多岁或四十多岁的人的体细胞的iPSC生成的，并且当人出现衰老或神经退行性疾病或障碍时使用。在另一个方面，单核吞噬细胞分化自具有认知损害或神经退行性疾病/障碍的人类受试者，或老龄的人类受试者(例如，至少40岁、至少50岁、至少60岁、至少70岁或至少80岁)。在另一个方面，单核吞噬细胞分化自老龄小鼠(例如约11-13月龄)。
在各种实施方式中，本发明提供了药物组合物。所述药物组合物包括单核吞噬细胞群，其来源于干细胞，例如，从诱导多能干细胞分化而来。在一些实施方式中，使用患者自身(自体)细胞以产生单核吞噬细胞。在其它实施方式中，使用捐赠(同种异体)细胞以产生单核吞噬细胞。从干细胞分化而来的单核吞噬细胞可保持在液体悬浮液或制剂中，直至施用。
所公开的方法可改善认知功能和/或神经健康。例如，与治疗前受试者的状况相比，经治疗的受试者可具有改善的空间工作记忆和/或改善的短期记忆。与对照相比，经治疗的受试者还可以具有增加的突触转运体水平、增加的小胶质细胞水平和/或增加的星形胶质细胞水平。在一些方面，对照可以是没有用本文公开的细胞疗法治疗的患有神经退行性障碍的患者。在其它方面，对照可以是治疗前受试者的基线水平。或者，经治疗的受试者可以表现出与年轻和/或健康受试者可比的认知功能或神经健康。
还提供了通过本文公开的分化方法由干细胞分化而来的单核吞噬细胞。在各个方面，提供了通过本文公开的过程由iPSC生成的单核细胞。在各种实施方案中，由诱导多能干细胞分化的单核吞噬细胞与一种或多种赋形剂以组合物或药物组合物的形式提供。
优选地，单核吞噬细胞由受试者的自体干细胞分化而来，所生成的单核吞噬细胞(通常在扩增后)将被施用至所述受试者。例如，将来自哺乳动物的血细胞或成纤维细胞或其它体细胞重编程为诱导多能干细胞，然后通过本文公开的分化方法将所述诱导多能干细胞分化为单核吞噬细胞；并且将获得的单核吞噬细胞输注/移植或以其它方式注射给需要改善认知功能或患有神经退行性障碍的所述哺乳动物。在其它实例中，将健康或年轻哺乳动物的体细胞重编程为诱导多能干细胞；并将获得的单核吞噬细胞输注、移植或注射给需要改善认知功能或患有神经退行性障碍的哺乳动物。在一个实施方式中，多潜能(multipotent)干细胞是小鼠、猪、猴、绵羊或人的胚胎干细胞。在另一个实施方式中，实验者是患者，更优选人类患者，并且多潜能干细胞重编程自人类患者自身组织细胞。将体细胞重编程为诱导多能干细胞(或多潜能干细胞)的另外程序是已知的，例如，如在Zhao等，iScience 23，101192，2020和在美国专利号9,534,205、9,394,524、9,540615和9,771,563中所述，通过引用的方式将其并入本文。
一些实施方式提供了减轻受试者中炎症或治疗患有与炎症相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含由iPSC生成的单核吞噬细胞，其中，所述单核吞噬细胞通过包括以下或基本由以下组成的过程由iPSC生成：
在补充有骨形态发生蛋白4(BMP-4)的第一培养基中孵育iPSC，从而形成经第一培养基处理的细胞；
在补充有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和干细胞因子(SCF)的第二培养基中孵育经第一培养基处理的细胞，从而形成经第二培养基处理的细胞；
在补充有SCF、白细胞介素3(IL-3)、血小板生成素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和FLT3配体的第三培养基中孵育经第二培养基处理的细胞，从而形成经第三培养基处理的细胞；以及
在补充有M-CSF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和FLT3配体的第四培养基中孵育经第三培养基处理的细胞，从而形成经第四培养基处理的细胞，其是由iPSC分化而来的单核吞噬细胞。
一些实施方式提供了用于改善受试者的认知功能或治疗患有神经退行性障碍的受试者，或减轻、治疗或延迟受试者的神经退行性障碍发作的方法，其中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含由iPSC生成的单核吞噬细胞，其中，所述单核吞噬细胞通过包括以下或基本上由以下组成的过程从iPSC分化而来：
在补充有骨形态发生蛋白4(BMP-4)的第一培养基中孵育iPSC，从而形成经第一培养基处理的细胞；
在补充有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和干细胞因子(SCF)的第二培养基中孵育经第一培养基处理的细胞，从而形成经第二培养基处理的细胞；
在补充有SCF、白细胞介素3(IL-3)、血小板生成素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和FLT3配体的第三培养基中孵育经第二培养基处理的细胞，从而形成经第三培养基处理的细胞；以及
在补充有M-CSF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和FLT3配体的第四培养基中孵育经第三培养基处理的细胞，从而形成经第四培养基处理的细胞，其是由iPSC分化而来的单核吞噬细胞。
在一些实施方式中，受试者是老龄人类。在一些实施方式中，受试者患有阿尔茨海默病和/或肌萎缩性侧索硬化症。在一些实施方式中，包含iMP的药物组合物通过静脉内施用。在一些实施方式中，包含iMP的药物组合物通过腹膜内注射施用。在一些实施方式中，所述方法包括进一步进行行为测定(学习和记忆研究)、神经健康检查和炎症水平测量中的一项或多项。在一些实施方式中，在施用包含从干细胞分化而来的单核吞噬细胞的药物组合物后，受试者表现出相对于受试者治疗前的基线降低的炎症水平和/或改善的神经健康、认知功能(由一种或多种行为研究测定)。
在各个方面，与患有神经退行性障碍但未接受巨噬细胞或单核细胞治疗的对照受试者相比，本文公开的一种或多种方法引起认知功能改善(例如，在一种或多种行为测试中表征)或突触转运(如VGLUT1)水平改善。
在其它方面，与对照水平相比，本文公开的一种或多种方法引起认知功能改善(例如，在一种或多种行为测试中表征)或突触转运(如VGLUT1)水平改善，所述对照水平是受试者在接受由多能干细胞生成的巨噬细胞和/或单核细胞治疗前的基线水平。
药物组合物可含有药学上可接受的赋形剂或运载体(如缓冲剂、盐、聚合物、蛋白质和防腐剂)，所述赋形剂或运载体被添加以使细胞稳定或提供生理渗透压。“药学上可接受的赋形剂”意指可用于制备一般而言安全、无毒并期望的药物组合物的赋形剂，并且包括对于兽医用途和人用药物用途而言可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体。在配制和患者使用前最终收获的细胞也可带有残余量的细胞培养补充剂。因此，本文公开的组合物可包括赋形剂，所述赋形剂是指在制剂中使用的组分以及可能残留在最终产物中的辅助材料(如细胞培养补充剂)。赋形剂的实例包括但不限于人血清白蛋白、二甲基亚砜(DMSO)、氯化钙、氯化钾、氯化钠、乳酸钠、水、葡聚糖及其组合。“药学上可接受的运载体”是指药学上可接受的材料、组合物或溶媒，其参与将感兴趣的化合物从身体的一个组织、器官或部分携带或运输到身体的另一个组织、器官或部分。例如，运载体可以是液体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，或它们的组合。运载体适用于与其可能与之接触的任何组织或器官进行接触，这意味着它不得携带毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或超过其治疗益处的任何其它并发症的风险。
在各种实施方式中，根据本发明的药物组合物可被配制为用于通过任何施用途径递送。“胃肠外”是指通常与注射有关的施用途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、椎管内、胸骨内、鞘内、宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。通过胃肠外途径，组合物可以处于用于输液或注射的溶液或悬浮液的形式。通常，组合物通过注射施用。这些施用的方法是本领域技术人员已知的。
在进一步的实施方式中，所公开的治疗和/或预防方法进一步包括向患有神经退行性疾病(如阿尔茨海默病)的受试者施用一种或多种药物或标准疗法。在一些实施方案中，本发明的药物组合物与一种或多种药物或标准疗法同时施用。在一些实施方案中，本发明的药物组合物与一种或多种药物或标准(目前批准的)疗法分开施用。合适的药物或目前批准的疗法包括加兰他敏、利斯的明、多奈哌齐、美金刚、阿杜那单抗(aducanumab，靶向淀粉样蛋白-β的聚集形式的人抗体)。
另外的实施方式提供了使用如本文所述生成的单核吞噬细胞或使用本文所述方法产生的单核吞噬细胞进行药物筛选的方法，包括但不限于高通量筛选方法。例如，在一个实施方式中，本发明提供了鉴别可用于治疗或预防与单核细胞和/或巨噬细胞缺陷或缺乏有关的疾病或障碍的化合物的方法，该方法包括：使通过本文公开的方法生成的单核吞噬细胞与候选化合物接触，并确定候选化合物是否改善了单核细胞或巨噬细胞的缺陷或缺乏。在一些实施方式中，鉴别化合物的方法是高通量的方法。在一些实施方式中，经鉴别的化合物可用于治疗或预防人或哺乳动物中的疾病或障碍。在一些实施方式中，单核吞噬细胞是自体的或由自体细胞(包括由自体体细胞重编程的iPSC)生成。在一些实施方式中，单核吞噬细胞是同种异体的或由同种异体细胞(包括由同种异体细胞重编程的iPSC)生成。在一些实施方式中，与巨噬细胞和/或单核细胞缺陷或缺乏相关的疾病或障碍是阿尔茨海默病。在一些实施方式中，与巨噬细胞和/或单核细胞缺陷或缺乏有关的疾病或障碍是帕金森病。
实施例
提供以下实施例以更好地说明要求保护的发明，而不应被解释为限制本发明的范围。就提及的特定材料的而言，其仅是出于说明目的，而不旨在限制本发明。在不行使创造能力和不脱离本发明范围的情况下，本领域的技术人员可以开发出等同的手段或反应物。
实施例1.
使用来自年轻受试者的血液、血浆或骨髓来恢复老龄受试者的认知功能具有显著的实际缺点，所述缺点限制了它们潜在的治疗价值。诱导多能干细胞(iPSC)提供了生成自体疗法的能力。
此处，我们寻求确定对在使用年轻血浆和骨髓的研究中观察到的有益作用负责的细胞类型，并且我们由iPSC生成了单核吞噬细胞(iMP)，其表达低水平的造血干细胞标志物CD34，以及高水平的单核/巨噬细胞标志物CD11b、CD14和CD16；并且我们通过尾静脉注射将它们施用至老龄的、基因上免疫受损的NOD-scid-γ(NSG)小鼠。(年轻小鼠为3-4月龄，老龄小鼠为11-13月龄。)小鼠每三天接受治疗，持续22天(图1)，并对多项行为测定进行测试。我们发现了在自发交替测试中的空间工作记忆(图3A、图3B)以及在新物体放置测定中的海马依赖性短期记忆(图4B)显著改善。此外，用iMP进行的治疗对数种关键的神经元健康指数有显著影响，所述神经元健康指数包括突触转运体VGLUT1(图5B)，其在老龄小鼠中减少，但随治疗恢复；并且对小胶质细胞和星形胶质细胞的数量和形态有显著影响(图6A、图6B和图8)。见于老龄动物中的星形胶质细胞和小胶质细胞数量增加以及小胶质细胞分支长度减少通过用iMP进行的治疗被逆转。这些发现指示，免疫细胞，特别是单核细胞和巨噬细胞，可能对之前在输注年轻血浆或骨髓移植后观察到的再生效应负责。重要的是，我们发现iMP在衰老中具有显著的再生潜力。
此外，我们已开始在5xFAD小鼠(阿尔茨海默病小鼠模型)中测试iMP的潜力(图9A)，并且在新物体识别研究中，甚至在这些小鼠开始发展出病状的3月龄时发现改善(图9C)。我们还将研究具有明显病状的8月龄5xFAD小鼠，并且我们预计iMP治疗将更显著地影响这些更老的5xFAD小鼠中的行为和神经健康/炎症结果。
这些研究证明了iMP在衰老和神经退行性变中在改善认知和神经健康方面的潜在益处。源自iPSC的单核吞噬细胞可以模拟年轻血浆和骨髓移植的效果，并可用于受试者以恢复认知功能，作为衰老和阿尔茨海默病的治疗法。
实施例2.
使用以下分化方案从iPSC分化出iMP。
使用EZ Passage Tool以低密度对iPSC进行传代；目标是每孔中120个集落。
使用EZ Passage Tool仅切开iPSC孔的中心。
吸出培养基。
使用3mL新鲜培养基，将集落从平板上吹打下来。避免刮擦！
移除集落悬浮液并转移到新的15mL锥形管中。将集落悬浮液稀释至约120个集落/mL(目测)。注：需要大量稀释集落悬浮液(甚至向悬浮液添加多至10mL的培养基)。
注：如果需要，根据细胞系调整集落悬浮液的浓度(即，对于附着力差的种系，增加浓度；并对于附着力强的种系，降低浓度)。
从平板上吸去Matrigel，并用1mL培养基/孔替换。
向每孔加入1mL集落悬浮液，转移到培养箱中并水平和垂直(z轴&x轴)各向振荡4次。
将集落静止以附着过夜。
集落日常维护
清除符合任何以下条件的任何分化的细胞和集落：
·比大多数集落小得多或大得多
·在其旁边有分化的细胞
·与其它集落太近(即随时间的推移将生长至彼此重合)
·孔有超过15个集落(理想的孔将有10-12个集落)
·任何奇形怪状的集落(即新月形/完全不接近圆形)
直径一致的集落分布均匀是重要的。
在代表各分化阶段的明视野培养图像(5X)中，如果分化恰当地进行，应看到相似的菌落形态。此外，请注意，随着分化的进行，集落将变得非常“杂乱”，其是它们应该有的样子。
分化开始
当所有集落直径最小为0.7mm，并且大多数直径为1.0mm(在evos 4X上直径为7厘米)时，开始阶段1培养基(mTeSR*+80ng/mL BMP4)。这是D0(第0天)。*与在Stem CellReports，vol.8，1516-1524，2017中所述的使用mTeSR定制培养基的Douvaras等不同，我们使用标准mTeSR(例如STEMCELL Technology，目录号85850，至少包含bFGF和TGFβ)。Douvaras等在Stem Cell Reports，vol.8，1516-1524，2017(补充)中描述，他的mTeSR定制培养基是不含氯化锂、GABA、哌啶酸、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β(TGFβ1)的mTeSR1培养基(Stem Cell Technologies)。
阶段1
阶段1的开始为D0。
每天补料1mL/孔的阶段1培养基，直到第4天。也就是说，每天吸出上清液并每天加入1mL新鲜培养基，直至第4天。
在阶段1结束时，将全部培养基在紧临阶段2之前更换为阶段2培养基。
阶段2
在第4天，将细胞转入阶段2培养基(StemPro-34SFM+25ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、80ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)、100ng/mL干细胞因子(SCF))，2mL/孔。
在阶段2结束时，在紧临阶段3之前更换全部培养基。
阶段3
在第6天，将细胞转入阶段3(StemPro-34 SFM+50ng/mL SCF、50ng/mL IL-3、5ng/mL血小板生成素(TPO)、50ng/mL巨噬细胞CSF(M-CSF)、50ng/mL FLT3-配体(FLT3L))，2mL/孔。
在第10天更换全部培养基。
在D10更换培养基，再次以2mL/孔向细胞补料阶段3培养基(吸出上清液并新鲜补料)。
在阶段3结束时，紧临阶段4之前更换全部培养基。
注：包囊形成开始发生(好迹象)。
阶段4(收集阶段)：
在D12或D13或D14，将细胞转入阶段4培养基(StemPro-34SFM+50ng/mL M-CSF、25ng/mL GM-CSF、50ng/mL FLT3L)2mL/孔(完全吸去上清液，然后加入阶段4培养基)。
随后不再吸液，因为包囊松散地附着在孔板上，并且我们收集漂浮在悬浮液中的细胞，每周两次(即每周一或周二和周五)向细胞补料，2mL/孔的阶段4。无抽吸。
注：将每周两次向细胞补料，其中一次补料是在收集后。包囊松散地附着在板上，并且单核细胞或单核吞噬细胞从包囊出芽脱落，并漂浮在悬浮液中。因此，每周一次，通过移液吸管收集含有漂浮细胞的培养基，并将其旋转沉降，留下细胞团粒(pellet)，所述细胞团粒可之后用于施用。补料应间隔3或4天；以及收集漂浮细胞并将其旋转沉降，然后吸出旧培养基，并将细胞团粒重新悬浮在新鲜培养基中，再补料回平板。在方案的该处，Douvaras等(Stem Cell Reports，vol.8，pp:1516-1524，2017年6月6日)进行每周一次的分选以仅收集CD14+/CX3CR1+细胞，然后继续通过将这些细胞暴露于GM-CSF和IL34中2周来将这些细胞进一步分化为小胶质细胞。相反，我们没有分选这些细胞，而是收集这种更未成熟的细胞类型用于治疗我们的衰老和神经退行性变的动物模型。我们没有在小胶质细胞培养基(RPMI-1640，含2mM GlutaMAX-I、10ng/mL GM-CSF和100ng/mL IL-34)中培养细胞。
实施例3.用以生产临床相关数量的iMP的生物反应器中的规模放大过程，以及表征。
一旦达到阶段4(实施例2中约D14)，细胞已形成松散地附着至板的包囊。iMP从这些包囊出芽脱落，然后漂浮在悬浮液中。例如，用细胞刮刀将iMP包囊挖起，并转移到低速磁力搅拌板(如DURA-MAGTM)上的搅拌瓶生物反应器(如)中。将挖起的包囊调整为悬浮培养24小时，之后打开搅拌板并将其设定为30转/min。在生物反应器中，包囊漂浮，并且iMP继续从包囊上出芽脱落，并且产生的iMP被收集用于进一步分析或程序。
我们还对起始密度进行了微调：单层接种密度为约100,000个细胞/cm2。我们使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)印章来铺板蛋白质(如细胞外基质蛋白质或matrigel)的小“岛”，供细胞附着，即在离散/分开的“岛”中“接种”，使包囊在分化过程中间隔开来，而不是遍布培养装置的表面。
我们还利用RNA测序技术比较了以下的基因表达：在生物反应器中培育15天的iMP、在生物反应器中培育55天的iMP、如实施例2所示在孔板中培养的iMP和从实施例2所示孔板中培养的细胞的冷冻瓶中复苏的iMP以及作为对照的iPSC。图10A和图10B显示，这四种条件下的iMP在层次聚类分析和主成分分析方面彼此相似。图11显示了四组中的每一组中各基因的相对表达比例。
我们对在不同天数从生物反应器培养收集的细胞总数(包括活细胞和死细胞)进行计数，显示出高于65％至少48天的细胞的持续高活力(表1)。
表1.对于每个给定的从生物反应器收集的日期，活细胞的数量vs.死细胞的数量，以及计算的活力百分比(活力＝活细胞的数量÷(活细胞的数量+死细胞的数量))。
日期 活 死 活力(％)
首日日期 5,300,000 1,150,000 82.2
首日日期+7天 16,100,000 6,800,000 70.3
首日日期+12天 10,300,000 1,850,000 84.8
首日日期+18天 9,900,000 3,300,000 75
首日日期+28天 25,800,000 8,600,000 75
首日日期+38天 18,100,000 8,000,000 69.3
首日日期+48天 13,850,000 6,250,000 68.9
到目前为止，我们使用的是125mL烧瓶或500mL烧瓶，但该过程可根据需要改变规模至超过那些容量。
除了RNA-Seq分析，我们还进行了流式细胞术、蛋白质印迹和吞噬作用测定(珠摄取)。
在上文的具体实施方式中对本发明的多种实施方式进行了描述。虽然这些描述直接描述了上述实施方式，但是应当理解，本领域技术人员可以设想对本文所示和描述的特定实施方式的修改和/或变化。落入本说明书范围内的任何此类修改或变化也旨在被包括在其中。除非特别指出，本发明人的意图是使说明书和权利要求中的词语和短语被赋予对适用领域的普通技术人员而言普通和习惯的含义。
申请人在提交申请时已知的本发明的各种实施方式的上述描述已被呈现出，并且旨在用于说明和描述的目的。本说明书并不旨在穷举，也不旨在将本发明限制于所公开的精确形式，并且鉴于上述教导，许多修改和变化是可能的。所述实施方式用于解释本发明的原理及其实际应用，并使本领域的其他技术人员能够在各种实施方式中以适应于所设想的特定用途的各种修改来利用本发明。因此，并不旨在将本发明限制于为实现本发明而公开的特定实施方式。
虽然已经示出和描述了本发明的特定实施方式，但对本领域技术人员将显而易见的是，基于本文的教导，可以在不背离本发明及其更广泛方面的情况下进行改变和修改，因此，所附权利要求应在其范围内包括在本发明的真正精神和范围内的所有此类改变和修改。本领域的技术人员将理解，一般而言，本文中使用的术语通常旨在作为“开放式”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于”等)。
尽管开放式术语“包含(comprising)”作为例如包括(including)、含有(containing)或具有(having)等术语的同义词在本文中用于描述和要求保护本发明，但本发明或其实施方式也可以使用替代术语(例如，“由……组成(consisting of)”或“基本上由……组成(consisting essentially of)”)来描述。

Claims (30)

1.一种改善受试者的认知功能或治疗患有神经退行性障碍的受试者的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用治疗有效量的组合物，从而改善所述受试者的认知功能或治疗患有所述神经退行性障碍的所述受试者，所述组合物包含由诱导多能干细胞(iPSC)生成的单核吞噬细胞，
其中，所述单核吞噬细胞在以下过程中由所述iPSC生成，所述过程包括在诱导髓系分化的条件下，在细胞培养基中培养所述iPSC，引起单核吞噬细胞的生成，并且
其中，所述培养不包括在包含白细胞介素34(IL-34)或包含IL-34和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的小胶质细胞分化培养基中使生成的单核吞噬细胞接触，并且所述培养不包括在包含白细胞介素4(IL-4)或包含IL-4和GM-CSF的树突状细胞分化培养基中使生成的单核吞噬细胞接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单核吞噬细胞包括单核细胞；并且
任选地，其中，在所述施用后，所述单核吞噬细胞在所述受试者体内产生巨噬细胞，或者任选地，其中，在诱导巨噬细胞分化的条件下在细胞培养基中进一步培养所述单核吞噬细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述培养包括使iPSC与包含骨形态发生蛋白(BMP-4)的第一组合物接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述培养进一步包括：
在所述第一组合物的存在下培养iPSC之后，使所述细胞培养基与第二组合物接触，所述第二组合物包含选自于由bFGF、血管内皮生长因子(VEGF)、干细胞因子(SCF)及其组合所组成的组中的一种或多种因子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述培养进一步包括：
使所述细胞培养基与第三组合物接触，所述第三组合物包含选自于由SCF、白细胞介素3(IL-3)、血小板生成素(TPO)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、Fms样酪氨酸激酶3配体(FLT3配体)及其组合所组成的组中的一种或多种因子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述培养进一步包括：
使所述细胞培养基与第四组合物接触，所述第四组合物包含选自于由M-CSF、GM-CSF和FLT3配体及其组合所组成的组中的一种或多种因子。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括使所述细胞培养基与所述第一组合物接触约4天，使所述细胞培养基与所述第二组合物接触约2天，使所述细胞培养基与所述第三组合物接触约6天至8天，和/或使所述细胞培养基与所述第四组合物接触约3天至90天。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中，包含BMP-4的所述第一组合物处于mTeSR1培养基中，所述mTeSR1培养基含有bFGF、TGFβ、GABA、哌啶酸和氯化锂中的一种或多种；并且所述第一组合物是无血清的，并且其中，所述第二组合物、所述第三组合物和/或所述第四组合物独立地处于无血清造血细胞培养基中，任选地是StemPro-34无血清培养基。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述单核吞噬细胞表达标志物，所述标志物包括CD11b、CD14、CD16、CD64、CD11c、CD71或其组合。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述过程进一步包括在生物反应器中培养以获得至少1×106个、5×106个或1×107个的所述单核吞噬细胞。
11.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，iPSC来源于外周血单个核细胞(PBMC)或来源于成纤维细胞；任选地，所述PBMC和所述成纤维细胞获得自所述受试者。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述受试者是50岁以上的人类。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述受试者是患有神经退行性障碍的受试者，所述神经退行性障碍选自于由以下所组成的组：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森病、多发性硬化症(MS)、Rett综合征、弥漫性白质脑病合并球样变、遗传性弥漫性白质脑病合并轴索球样变、额颞叶退行性变(FTLD)、家族性FTLD、精神分裂症和自闭症谱系障碍。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述施用后在所述受试者中测量以下的一项或多项：与对照受试者相比或与在施用前所述受试者的相应水平相比，所述受试者的空间工作记忆改善、短期记忆改善、突触转运体水平增加、小胶质细胞分支长度增加。
15.一种生成单核吞噬细胞的方法，所述方法包括：
在诱导髓系分化的条件下，在细胞培养基中培养诱导多能干细胞，引起单核吞噬细胞的生成，其中，所述培养包括使所述诱导多能干细胞与包含骨形态发生蛋白(BMP-4)的第一组合物接触，
在所述第一组合物的存在下培养所述诱导多能干细胞后，使所述细胞培养基与第二组合物接触，所述第二组合物包含选自于由bFGF、血管内皮生长因子(VEGF)和干细胞因子(SCF)及其组合所组成的组中的一种或多种因子，
在所述第二组合物的存在下进行培养后，使所述细胞培养基与第三组合物接触，所述第三组合物包含选自于由SCF、白细胞介素3(IL-3)、血小板生成素(TPO)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和Fms样酪氨酸激酶3配体(FLT3配体)及其组合所组成的组中的一种或多种因子，以及
在所述第三组合物的存在下进行培养后，使所述细胞培养基与第四组合物接触，所述第四组合物包含选自于由M-CSF、GM-CSF和FLT3配体及其组合所组成的组中的一种或多种因子，从而生成所述单核吞噬细胞，
其中，所述培养不包括在包含白细胞介素34(IL-34)或包含IL-34和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的小胶质细胞分化培养基中使生成的单核吞噬细胞接触，并且所述培养不包括在包含白细胞介素4(IL-4)或包含IL-4和GM-CSF的树突状细胞分化培养基中使生成的单核吞噬细胞接触。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述第一、第二、第三和第四组合物处于无血清培养基中；任选地，所述第一组合物处于mTeSR1培养基中，并且所述第二、第三和第四组合物处于StemPro-34培养基中。
17.根据权利要求15所述的方法，所述方法包括使所述细胞培养基与所述第一组合物接触约4天，使所述细胞培养基与所述第二组合物接触约2天，使所述细胞培养基与所述第三组合物接触约6天至8天，和/或使所述细胞培养基与所述第四组合物接触约3天至90天。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中，所述培养包括在生物反应器中进行培养以获得至少1×106个、5×106个或1×107个所述单核吞噬细胞的群；任选地，所述生物反应器是搅拌罐生物反应器。
19.使用以下方法生成的单核吞噬细胞，所述方法包括：
(1)以贴壁培养在包含骨形态发生蛋白4(BMP-4)的第一细胞培养基中培养多能干细胞；
(2)以贴壁培养在包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和干细胞因子(SCF)的第二细胞培养基中培养通过步骤(1)获得的细胞；
(3)以贴壁培养在包含SCF、白细胞介素3(IL-3)、血小板生成素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和FLT3配体的第三细胞培养基中培养通过步骤(2)获得的细胞；以及
(4)以悬浮培养在包含M-CSF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和FLT3配体的第四细胞培养基中培养通过步骤(3)获得的细胞，其中，生成巨噬细胞和/或单核细胞；
其中，所述方法不包括在包含白细胞介素34(IL-34)或包含IL-34和GM-CSF的小胶质细胞分化培养基中使生成的单核吞噬细胞接触，并且所述培养不包括在包含白细胞介素4(IL-4)或包含IL-4和GM-CSF的树突状细胞分化培养基中使生成的单核吞噬细胞接触。
20.根据权利要求19所述的单核吞噬细胞，所述单核吞噬细胞通过所述方法生成，其中，所述多能干细胞为人诱导多能干细胞。
21.根据权利要求18所述的单核吞噬细胞，所述单核吞噬细胞通过所述方法生成，其中，所述第一、第二、第三和第四细胞培养基中的每一种均不包含血清；任选地，所述第一组合物处于mTeSR1培养基中，所述mTeSR1培养基含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGFβ)、氨基丁酸(GABA)、哌啶酸和氯化锂中的一种或多种或全部；并且任选地，所述第二、第三和第四组合物处于StemPro-34培养基中。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的单核吞噬细胞，其中，所述单核吞噬细胞对CD11b、CD14、CD16、CD64、CD11c、CD71或其组合呈阳性。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的单核吞噬细胞，所述单核吞噬细胞通过所述方法生成，其中，步骤(4)、(3)、(2)和(1)中任一项或多项的所述培养包括在生物反应器中培养。
24.一种治疗患有与巨噬细胞缺陷或缺乏有关的疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含根据权利要求19-23中任一项所述的单核吞噬细胞的组合物，其中，所述单核吞噬细胞在向所述受试者施用后产生巨噬细胞。
25.一种生成单核吞噬细胞并治疗患有神经退行性障碍的受试者或需要改善认知功能的受试者的方法，所述方法包括：
在诱导髓系分化的条件下，在细胞培养基中培养诱导多能干细胞，引起单核吞噬细胞的生成，其中，所述培养包括使所述诱导多能干细胞与包含骨形态发生蛋白(BMP-4)的第一组合物接触，
在所述第一组合物的存在下培养所述诱导多能干细胞后，使所述细胞培养基与第二组合物接触，所述第二组合物包含选自于由bFGF、血管内皮生长因子(VEGF)和干细胞因子(SCF)及其组合所组成的组中的一种或多种因子，
在所述第二组合物的存在下进行培养之后，使所述细胞培养基与第三组合物接触，所述第三组合物包含选自于由SCF、白细胞介素3(IL-3)、血小板生成素(TPO)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和Fms样酪氨酸激酶3配体(FLT3配体)及其组合所组成的组中的一种或多种因子，以及
在所述第三组合物的存在下进行培养之后，使所述细胞培养基与第四组合物接触，所述第四组合物包含选自于由M-CSF、GM-CSF和FLT3配体及其组合所组成的组中的一种或多种因子，从而生成所述单核吞噬细胞，
其中，所述培养不包括在包含白细胞介素34(IL-34)或包含IL-34和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的小胶质细胞分化培养基中使生成的单核吞噬细胞接触，并且所述培养不包括在包含白细胞介素4(IL-4)或包含IL-4和GM-CSF的树突状细胞分化培养基中使生成的单核吞噬细胞接触；以及
向所述受试者施用治疗有效量的包含生成的单核吞噬细胞的组合物，从而治疗患有所述神经退行性障碍的受试者或改善所述受试者的认知功能。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述培养不包括在包含干扰素γ(IFN-γ)和IL-4中的一种或两种以及M-CSF的巨噬细胞分化培养基中使生成的单核吞噬细胞接触。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述培养进一步包括在巨噬细胞分化培养基中使生成的单核吞噬细胞接触。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述巨噬细胞分化培养基包含M-CSF和IL-4。
29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述巨噬细胞分化培养基包含M-CSF和干扰素γ(IFN-γ)。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的方法，其中，所述培养包括在生物反应器中培养以生成至少1×106个、5×106个或1×107个的单核吞噬细胞的群，从而向所述受试者施用所述生成的单核吞噬细胞群。
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