CN101649305B - 一种从人脐带血cd34+细胞扩增巨核祖细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从人脐带血CD34+细胞扩增巨核祖细胞的方法，我们将磁珠分选的脐带血CD34+造血祖细胞接种于照射的人骨髓间充质干细胞上，在含有重组人血小板生成素(rhTPO)的无血清培养基中培养7天，通过细胞计数、流式细胞表型检测和巨核细胞集落形成实验(CFU-MK assay)分析扩增巨核祖细胞的效果。采用本发明的方法扩增巨核祖细胞，与现有方法相比，培养条件更接近体内天然的骨髓造血微环境，扩增巨核祖细胞的数量更多，而且间充质干细胞所分泌的细胞因子和添加的rhTPO均符合临床应用的标准。因此，本发明为巨核祖细胞体外扩增提供了一条新途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种扩增人巨核祖细胞(megakaryocyte progenitor cell)的方法，具体地说涉及体外在人骨髓间充质干细胞支持下由脐带血CD34+细胞扩增人巨核祖细胞的方法。
背景技术
血小板减少是大剂量化疗的一种严重并发症，常出现于造血干细胞移植后。在过去的几十年里，血小板输注的需求大大增加。但输注血小板风险高而且价格昂贵，因此人们开始寻求其它可替代的方法。一些研究表明给患者输注体外扩增的巨核祖细胞(CD34+/CD41a+细胞)已成为缩短造血干细胞移植后血小板减少时间的一种新方法(Bruno S，Gunetti M，Gammaitoni L，et al.In vitro and in vivo megakaryocytedifferentiation of fresh and ex vivo expanded cord blood cells：rapidand transient megakaryocyte reconsttitution.Haematologica，2003；88：379-387.Bertolini F，Battaglia M，Pedrazzoli P，et al.Megakaryocytic progenitors can be generated ex vivo and safelyadministered to autologous peripheral blood progenitor celltransplant recipients.Blood，1997；89：2679-2688.)。目前，扩增巨核祖细胞的主要方法是采用含不同细胞因子组合的无血清培养体系。例如使用TPO、IL-11和肝素3种细胞因子能有效地由人脐带血CD34+细胞扩增出巨核祖细胞(Feng Y，Zhang L，Xiao ZJ，et al.An effective and simpleexpansion system for megakaryocyte progenitor cells using acombination of heparin with thrombopoietin and interleukin-11.ExpHematol，2005；33：1537-1543.何祎，孟恒星，张宇光等.脐血CD34+细胞体外扩增脐血巨核祖细胞的研究.中国实验血液学杂志，2008；16：1121-1125.)。另外，采用含TPO、IL-3和SCF的无血清培养基也能从人脐带血CD133+细胞中扩增出大量巨核祖细胞(王丽，陈代雄，方宁等.脐血CD133+细胞体外扩增巨核系祖细胞的研究.中国实验血液学杂志，2008；16：645-649.)，添加GM-CSF可以进一步增强这一细胞因子组合扩增巨核祖细胞的效果(陈舒，朱发明，何吉等.GM-CSF对脐而CD34+巨核祖细胞体外扩增及分化的影响.中国实验血液学杂志，2005；13：1041-1043.)。
现有使用不同细胞因子组合扩增巨核祖细胞的方法与体内天然造血环境中巨核细胞的产生过程相差甚远。巨核细胞生成是一个复杂、多阶段的细胞和生物学过程，它包括造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)的定向分化以及巨核祖细胞的增殖、成熟和终末分化。而这一过程是在由造血干细胞、间充质干细胞、基质细胞以及细胞外基质构成的造血微环境中进行的。目前扩增巨核祖细胞所用的大多数细胞因子尚未达到临床应用的标准，而且其扩增巨核祖细胞的数量有限。所以，迫切需要找到一种接近体内生理状态、符合临床应用要求的高效扩增巨核祖细胞的方法，以缓解大剂量化疗患者在造血干细胞移植后血小板减少的症状。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是通过建立间充质干细胞与造血祖细胞的共培养体系，提供一种培养条件接近体内天然造血微环境的扩增巨核祖细胞的方法，应用该方法培养扩增巨核祖细胞可以得到更大的数量，并且间充质干细胞所分泌的细胞因子以及添加的重组人血小板生成素(rhTPO)均符合临床应用的标准。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种从人脐带血CD34+细胞扩增巨核祖细胞的方法，包括以下步骤：
(1)分离人脐带血单个核细胞，分选CD34+细胞，检测分选细胞的纯度；
(2)分离培养人骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定；
(3)用完全培养基重悬接种骨髓间充质干细胞，待细胞生长至大量汇合时，照射细胞，将CD34+细胞重悬于含TPO的无血清培养基中，接种到照射过的骨髓间充质干细胞上进行培养。
所述完全培养基组成是：体积比DMEM/F12∶MCDB201＝6∶4，体积百分比浓度2％胎牛血清，体积百分比浓度1％胰岛素-转铁蛋白-硒复合物ITS，10-8mol/L地塞米松，10ng/mL表皮生长因子EGF，2ng/mL成纤维细胞生长因子bFGF，100U/mL青/链霉素和2mmol/L谷氨酰胺。
所述完全培养基组成是α-MEM，体积百分比浓度20％胎牛血清，4ng/mL成纤维细胞生长因子bFGF。
所述完全培养基组成是DMEM，体积百分比浓度10％V/V胎牛血清和50U/mL青/链霉素。
所述待骨髓间充质干细胞生长至大量汇合时，细胞汇合程度为80％-90％。
所述照射细胞的照射剂量为8-12Gy。
所述无血清培养基的TPO的浓度为20-30ng/mL。
所述CD34+细胞的接种密度为(4-6)×105细胞/T-25培养瓶。
在含TPO的无血清培养基中培养7天。
本发明的有益效果是：提供了一种扩增人巨核祖细胞的新方法，即将分选的脐带血CD34+细胞与照射的人骨髓间充质干细胞共培养，在含有低浓度TPO的无血清培养体系中扩增巨核祖细胞。利用本方法能够由脐带血CD34+细胞扩增出大量的CD34+/CD41a+巨核祖细胞。培养第7天流式细胞表型检测和巨核细胞集落形成实验的结果表明，与没有间充质干细胞做滋养层的对照组相比，CD34+细胞与间充质干细胞共培养组产生更多的巨核祖细胞(p＜0.05)。此外，本发明使用的巨核祖细胞扩增体系比不同细胞因子组合扩增体系更接近体内天然造血微环境，而且骨髓间充质干细胞分泌的细胞因子和添加的重组人TPO均符合临床应用的标准。
附图说明
图1是本发明脐带血CD34+细胞与人骨髓间充质干细胞共培养7天后进行巨核细胞集落形成实验的典型CFU-MK照片。(A)小巨核细胞集落(3-10细胞/集落)，(B)中等大小巨核细胞集落(11-50细胞/集落)，标尺等于50μm。
具体实施方式
以下结合具体实施方式来对本发明做进一步说明：
本发明的具体步骤依次包括分离纯化脐带血CD34+细胞，将其接种于照射过的人骨髓间充质干细胞上，在含TPO的无血清培养基中培养7天，通过细胞计数、流式细胞表型检测和巨核细胞集落形成实验分析扩增巨核祖细胞的效果。
以下的浓度除特殊标注外，均为体积百分比浓度。
实施例1.
(1)分离纯化脐带血CD34+细胞
按脐带血：羟乙基淀粉体积比5∶1的比例向脐带血中加入羟乙基淀粉，充分混匀，静置30分钟以上沉降红细胞。吸取上层清液，加至淋巴细胞分离液(密度为1.077g/mL)上，密度梯度离心后收集单个核细胞，用PBS/EDTA溶液洗涤2次。根据单个核细胞数加入适量CD34磁珠抗体，4℃避光孵育30分钟，采用MiniMACS免疫磁性吸附分离装置分离和纯化CD34+细胞。取部分细胞用鼠抗人PE-CD34单克隆抗体标记，流式细胞仪检测分选细胞的平均纯度为95.8％±0.8％。
(2)人骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定
无菌条件下采集健康献髓者(年龄：30-40岁)骨髓3-5ml，加到等量淋巴细胞分离液上，密度梯度离心后收集单个核细胞，用DMEM/F12培养基洗涤2次。用完全培养基(体积比DMEM/F12∶MCDB201＝6∶4，2％胎牛血清，1％ITS，10-8mol/L地塞米松，10ng/mL EGF，2ng/mL bFGF，100U/mL青/链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)重悬细胞，接种于T-25培养瓶，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养。3天后全量换液，弃去不贴壁的细胞，换上新鲜的上述完全培养基，以后每3-4天换液一次，待细胞生长至80％汇合时进行传代培养。倒置显微镜下可观察到骨髓间充质干细胞为纺锤形，贴壁生长，细胞呈旋涡状或编织状排列。
用0.125％胰蛋白酶消化处于对数生长期第5代人骨髓间充质干细胞，用PBS洗1次，分别加入PE或FITC标记的鼠抗人CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166、CD34、CD45、HLA-ABC、HLA-DR单克隆抗体，以及PE-鼠IgG1和FITC-鼠IgG1同型对照4μL，充分混匀，4℃避光孵育45分钟，加入1mL含1％胎牛血清的PBS洗1次，用400μL 2％多聚甲醛重悬细胞，上流式细胞仪检测。发现细胞表达CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166和HLA-ABC，不表达HLA-DR、CD34和CD45。
将第5代骨髓间充质干细胞以2-4×104/孔接种于6孔培养板内，24小时后细胞贴壁，分别换成成脂诱导培养液(IMDM、10％胎牛血清、10-6mol/L地塞米松、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μg/mL胰岛素、60μmol/L吲哚美辛、100U/mL青/链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)或成骨诱导培养液(IMDM、10％胎牛血清、10-7mol/L地塞米松、0.2mmol/L 2-磷酸抗坏血酸、10mmol/L 2-磷酸甘油、100U/mL青/链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)，以后每3-4天换液1次，诱导3周。成脂诱导的细胞经油红O染色证实，脂滴被染成红色；成骨诱导的细胞经von Kossa染色，可见钙盐沉积形成的结节。证明我们分离的间充质干细胞具有脂肪和骨分化潜能。
(3)扩增巨核祖细胞
将人骨髓间充质干细胞用上述完全培养基重悬接种于1个T-25培养瓶，待细胞生长至80％汇合时，10Gy照射细胞，弃掉培养基，用含有25ng/mL rhTPO的无血清培养基重悬脐带血CD34+细胞，以5×105细胞/瓶接种于铺有照射过骨髓间充质干细胞的T-25培养瓶，同时以相同密度接种1个无间充质干细胞的T-25培养瓶作为对照组，将培养瓶置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养，3-4天后，半量换液。
(4)检测巨核祖细胞的扩增效果
培养第7天，收集对照组和共培养组悬浮细胞计数并进行CD34和CD41a流式双标细胞表型检测。将细胞(要求每份待测样本细胞数≥2×105)用PBS洗1次，分别加入鼠抗人FITC-CD34、PE-CD41a单克隆抗体以及FITC-鼠IgG1、PE-鼠IgG1同型对照各4μL，充分混匀，4℃避光孵育45分钟(为调节荧光补偿，同时做2个单阳管)，加入1mL含1％胎牛血清的PBS洗1次，用400μL2％多聚甲醛重悬细胞，上机检测。如表1所示，7天后有骨髓间充质干细胞做滋养层的共培养组悬浮细胞扩增倍数(7.9)高于无间充质干细胞做滋养层的对照组(3.4)。统计学分析结果表明，培养7天后共培养组CD34+/CD41a+巨核祖细胞的数量(413.3±185.2)明显高于对照组(109.5±69.5，p＜0.05)。
巨核细胞集落形成实验(CFU-MK assay)检测体外培养第7天对照组和共培养组巨核祖细胞所占的百分比。培养第7天，从2个T-25培养瓶中各取5000个悬浮细胞，用1mL半固体培养基(IMDM，10％马血清，100ng/mL rhTPO，55μmol/L 2-巯基乙醇，1％甲基纤维素，100U/mL青/链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)重悬并充分混匀后接种于1个24孔培养板的2个孔，每孔0.5mL。培养12天后，计数两组的巨核细胞集落(CFU-MK)。每个巨核细胞集落的细胞数从3个到几十个不等，根据每个集落的巨核细胞数将其分为小(3-10细胞/集落)、中(11-50细胞/集落)、大(＞50细胞/集落)三类，见图1。如表2所示，共培养组产生巨核细胞集落的总数(214.0±44.3)明显多于对照组(24.7±8.0，p＜0.05)。此外，共培养组产生小巨核细胞集落和中等大小巨核细胞集落的数量(177.3±35.1，36.7±9.5)均多于对照组(22.7±7.5，2.0±1.0；p＜0.05)。
实施例2.
(1)分离纯化脐带血CD34+细胞
按脐带血∶羟乙基淀粉体积比5∶1的比例向脐带血中加入羟乙基淀粉，充分混匀，静置30分钟以上沉降红细胞。吸取上层清液，加至淋巴细胞分离液(密度为1.077g/mL)上，密度梯度离心后收集单个核细胞，用PBS/EDTA溶液洗涤2次。根据单个核细胞数加入适量CD34磁珠抗体，4℃避光孵育30分钟，采用MiniMACS免疫磁性吸附分离装置分离和纯化CD34+细胞。取部分细胞用鼠抗人PE-CD34单克隆抗体标记，流式细胞仪检测分选细胞的平均纯度为95.8％±0.8％。
(2)人骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定
无菌条件下采集健康献髓者(年龄：30-40岁)骨髓3-5ml，加到等量淋巴细胞分离液上，密度梯度离心后收集单个核细胞，用α-MEM培养基洗涤2次。用完全培养基(α-MEM，20％胎牛血清，4ng/mL bFGF)重悬细胞，接种于T-25培养瓶，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养。3天后全量换液，弃去不贴壁的细胞，换上新鲜的上述完全培养基，以后每3-4天换液一次，待细胞生长至80％汇合时进行传代培养。倒置显微镜下可观察到骨髓间充质干细胞为纺锤形，贴壁生长，细胞呈旋涡状或编织状排列。
用0.125％胰蛋白酶消化处于对数生长期第5代人骨髓间充质干细胞，用PBS洗1次，分别加入PE或FITC标记的鼠抗人CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166、CD34、CD45、HLA-ABC、HLA-DR单克隆抗体，以及PE-鼠IgG1和FITC-鼠IgG1同型对照4μL，充分混匀，4℃避光孵育45分钟，加入1mL含1％胎牛血清的PBS洗1次，用400μL 2％多聚甲醛重悬细胞，上流式细胞仪检测。发现细胞表达CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166和HLA-ABC，不表达HLA-DR、CD34和CD45。
将第5代骨髓间充质干细胞以2-4×104/孔接种于6孔培养板内，24小时后细胞贴壁，分别换成成脂诱导培养液(IMDM、10％胎牛血清、10-6mol/L地塞米松、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μg/mL胰岛素、60μmol/L吲哚美辛、100U/mL青/链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)或成骨诱导培养液(IMDM、10％胎牛血清、10-7mol/L地塞米松、0.2mmol/L 2-磷酸抗坏血酸、10mmol/L 2-磷酸甘油、100U/mL青/链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)，以后每3-4天换液1次，诱导3周。成脂诱导的细胞经油红O染色证实，脂滴被染成红色；成骨诱导的细胞经von Kossa染色，可见钙盐沉积形成的结节。证明我们分离的间充质干细胞具有脂肪和骨分化潜能。
(3)扩增巨核祖细胞
将人骨髓间充质干细胞用上述完全培养基重悬接种于1个T-25培养瓶，待细胞生长至90％汇合时，10Gy照射细胞，弃掉培养基，用含有25ng/mL rhTPO的无血清培养基重悬脐带血CD34+细胞，以5×105细胞/瓶接种于铺有照射过骨髓间充质干细胞的T-25培养瓶，同时以相同密度接种1个无间充质干细胞的T-25培养瓶作为对照组，将培养瓶置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养，3-4天后，半量换液。
(4)检测巨核祖细胞的扩增效果
培养第7天，收集对照组和共培养组悬浮细胞计数并进行CD34和CD41a流式双标细胞表型检测。将细胞(要求每份待测样本细胞数≥2×105)用PBS洗1次，分别加入鼠抗人FITC-CD34、PE-CD41a单克隆抗体以及FITC-鼠IgG1、PE-鼠IgG1同型对照各4μL，充分混匀，4℃避光孵育45分钟(为调节荧光补偿，同时做2个单阳管)，加入1mL含1％胎牛血清的PBS洗1次，用400μL2％多聚甲醛重悬细胞，上机检测。如表1所示，7天后有骨髓间充质干细胞做滋养层的共培养组悬浮细胞扩增倍数(7.9)高于无间充质干细胞做滋养层的对照组(3.4)。统计学分析结果表明，培养7天后共培养组CD34+/CD41a+巨核祖细胞的数量(413.3±185.2)明显高于对照组(109.5±69.5，p＜0.05)。
巨核细胞集落形成实验(CFU-MK assay)检测体外培养第7天对照组和共培养组巨核祖细胞所占的百分比。培养第7天，从2个T-25培养瓶中各取5000个悬浮细胞，用1mL半固体培养基(IMDM，10％马血清，100ng/mL rhTPO，55μmol/L 2-巯基乙醇，1％甲基纤维素，100U/mL青/链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)重悬并充分混匀后接种于1个24孔培养板的2个孔，每孔0.5mL。培养12天后，计数两组的巨核细胞集落(CFU-MK)。每个巨核细胞集落的细胞数从3个到几十个不等，根据每个集落的巨核细胞数将其分为小(3-10细胞/集落)、中(11-50细胞/集落)、大(＞50细胞/集落)三类，见图1。如表2所示，共培养组产生巨核细胞集落的总数(214.0±44.3)明显多于对照组(24.7±8.0，p＜0.05)。此外，共培养组产生小巨核细胞集落和中等大小巨核细胞集落的数量(177.3±35.1，36.7±9.5)均多于对照组(22.7±7.5，2.0±1.0；p＜0.05)。
实施例3.
(1)分离纯化脐带血CD34+细胞
按脐带血∶羟乙基淀粉体积比5∶1的比例向脐带血中加入羟乙基淀粉，充分混匀，静置30分钟以上沉降红细胞。吸取上层清液，加至淋巴细胞分离液(密度为1.077g/mL)上，密度梯度离心后收集单个核细胞，用PBS/EDTA溶液洗涤2次。根据单个核细胞数加入适量CD34磁珠抗体，4℃避光孵育30分钟，采用MiniMACS免疫磁性吸附分离装置分离和纯化CD34+细胞。取部分细胞用鼠抗人PE-CD34单克隆抗体标记，流式细胞仪检测分选细胞的平均纯度为95.8％±0.8％。
(2)人骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定
无菌条件下采集健康献髓者(年龄：30-40岁)骨髓3-5ml，加到等量淋巴细胞分离液上，密度梯度离心后收集单个核细胞，用DMEM培养基洗涤2次。用完全培养基(DMEM，10％胎牛血清，50U/mL青/链霉素)重悬细胞，接种于T-25培养瓶，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养。3天后全量换液，弃去不贴壁的细胞，换上新鲜的上述完全培养基，以后每3-4天换液一次，待细胞生长至80％汇合时进行传代培养。倒置显微镜下可观察到骨髓间充质干细胞为纺锤形，贴壁生长，细胞呈旋涡状或编织状排列。
用0.125％胰蛋白酶消化处于对数生长期第5代人骨髓间充质干细胞，用PBS洗1次，分别加入PE或FITC标记的鼠抗人CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166、CD34、CD45、HLA-ABC、HLA-DR单克隆抗体，以及PE-鼠IgG1和FITC-鼠IgG1同型对照4μL，充分混匀，4℃避光孵育45分钟，加入1mL含1％胎牛血清的PBS洗1次，用400μL 2％多聚甲醛重悬细胞，上流式细胞仪检测。发现细胞表达CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166和HLA-ABC，不表达HLA-DR、CD34和CD45。
将第5代骨髓间充质干细胞以2-4×104/孔接种于6孔培养板内，24小时后细胞贴壁，分别换成成脂诱导培养液(IMDM、10％胎牛血清、10-6mol/L地塞米松、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μg/mL胰岛素、60μmol/L吲哚美辛、100U/mL青/链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)或成骨诱导培养液(IMDM、10％胎牛血清、10-7mol/L地塞米松、0.2mmol/L 2-磷酸抗坏血酸、10mmol/L 2-磷酸甘油、100U/mL青/链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)，以后每3-4天换液1次，诱导3周。成脂诱导的细胞经油红O染色证实，脂滴被染成红色；成骨诱导的细胞经von Kossa染色，可见钙盐沉积形成的结节。证明我们分离的间充质干细胞具有脂肪和骨分化潜能。
(3)扩增巨核祖细胞
将人骨髓间充质干细胞用上述完全培养基重悬接种于1个T-25培养瓶，待细胞生长至85％汇合时，10Gy照射细胞，弃掉培养基，用含有25ng/mL rhTPO的无血清培养基重悬脐带血CD34+细胞，以5×105细胞/瓶接种于铺有照射过骨髓间充质干细胞的T-25培养瓶，同时以相同密度接种1个无间充质干细胞的T-25培养瓶作为对照组，将培养瓶置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养，3-4天后，半量换液。
(4)检测巨核祖细胞的扩增效果
培养第7天，收集对照组和共培养组悬浮细胞计数并进行CD34和CD41a流式双标细胞表型检测。将细胞(要求每份待测样本细胞数≥2×105)用PBS洗1次，分别加入鼠抗人FITC-CD34、PE-CD41a单克隆抗体以及FITC-鼠IgG1、PE-鼠IgG1同型对照各4μL，充分混匀，4℃避光孵育45分钟(为调节荧光补偿，同时做2个单阳管)，加入1mL含1％胎牛血清的PBS洗1次，用400μL2％多聚甲醛重悬细胞，上机检测。如表1所示，7天后有骨髓间充质干细胞做滋养层的共培养组悬浮细胞扩增倍数(7.9)高于无间充质干细胞做滋养层的对照组(3.4)。统计学分析结果表明，培养7天后共培养组CD34+/CD41a+巨核祖细胞的数量(413.3±185.2)明显高于对照组(109.5±69.5，p＜0.05)。
巨核细胞集落形成实验(CFU-MK assay)检测体外培养第7天对照组和共培养组巨核祖细胞所占的百分比。培养第7天，从2个T-25培养瓶中各取5000个悬浮细胞，用1mL半固体培养基(IMDM，10％马血清，100ng/mL rhTPO，55μmol/L 2-巯基乙醇，1％甲基纤维素，100U/mL青/链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)重悬并充分混匀后接种于1个24孔培养板的2个孔，每孔0.5mL。培养12天后，计数两组的巨核细胞集落(CFU-MK)。每个巨核细胞集落的细胞数从3个到几十个不等，根据每个集落的巨核细胞数将其分为小(3-10细胞/集落)、中(11-50细胞/集落)、大(＞50细胞/集落)三类，见图1。如表2所示，共培养组产生巨核细胞集落的总数(214.0±44.3)明显多于对照组(24.7±8.0，p＜0.05)。此外，共培养组产生小巨核细胞集落和中等大小巨核细胞集落的数量(177.3±35.1，36.7±9.5)均多于对照组(22.7±7.5，2.0±1.0；p＜0.05)。
表1
数据表示为平均值±标准差，*p＜0.05(与对照组相比)。
表2
巨核细胞集落数表示为平均值±标准差，*p＜0.05(与对照组相比)。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (4)
1.一种从人脐带血CD34+细胞扩增巨核祖细胞的方法，包括以下步骤：
(1)分离人脐带血单个核细胞，分选CD34+细胞，检测分选细胞的纯度；
(2)分离培养人骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定；
(3)用完全培养基重悬接种骨髓间充质干细胞，待细胞生长至细胞汇合程度为80％-90％时，照射剂量为8-12Gy照射细胞，将CD34+细胞重悬于含TPO浓度为20-30ng/mL的无血清培养基中，接种到照射过的骨髓间充质干细胞上进行培养，所述CD34+细胞的接种密度为(4-6)×105细胞/T-25培养瓶，在含TPO的无血清培养基中培养7天。
2.根据权利要求1所述的从人脐带血CD34+细胞扩增巨核祖细胞的方法，其特征在于，所述完全培养基组成是：体积比DMEM/F12∶MCDB201＝6∶4，体积百分比浓度2％胎牛血清，体积百分比浓度1％胰岛素-转铁蛋白-硒复合物ITS，10-8mol/L地塞米松，10ng/mL表皮生长因子EGF，2ng/mL成纤维细胞生长因子bFGF，100U/mL青/链霉素和2mmol/L谷氨酰胺。
3.根据权利要求1所述的从人脐带血CD34+细胞扩增巨核祖细胞的方法，其特征在于，所述完全培养基组成是α-MEM，体积百分比浓度20％胎牛血清，4ng/mL成纤维细胞生长因子bFGF。
4.根据权利要求1所述的从人脐带血CD34+细胞扩增巨核祖细胞的方法，其特征在于，所述完全培养基组成是DMEM，体积百分比浓度10％V/V胎牛血清和50U/mL青/链霉素。
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