JPWO2019059234A1 - 血小板の製造方法、血小板製剤の製造方法、および血液製剤の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
グリシンおよびシステインの少なくとも一方の存在下、前記血小板産生工程を実施することを特徴とする。
前記血小板は、前記本発明の血小板の製造方法で得られたことを特徴とする。
前記血小板は、前記本発明の血小板の製造方法で得られたことを特徴とする。
本発明の血小板の製造方法は、巨核球から血小板を産生する血小板産生工程(以下、「産生工程」ともいう)を含み、グリシンおよびシステインの少なくとも一方の存在下、前記血小板産生工程を実施することを特徴とする。本発明の血小板の製造方法は、グリシンおよびシステインの少なくとも一方の存在下、前記血小板産生工程を実施することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の血小板の製造方法は、例えば、後述の本発明の血小板製剤の製造方法、血液製剤の製造方法、血小板製剤、および血液製剤の説明を援用できる。
参考文献1:Nakamura S et al, “Expandable megakaryocyte cell lines enable clinically applicable generation of platelets from human induced pluripotent stem cells.”, Cell Stem Cell, 2014, vol.14, No.4, pages 535-548
参考文献2:小黒秀行ら、「ポリコーム群蛋白複合体による幹細胞の老化制御」、再生医療、2007年、第6巻、第4号、26−32頁
参考文献3:Jesus Gil et.al, “ Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all”, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2007, vol.7, pages 667-677
参考文献4:Soo-Hyun Kim et.al., “ Absence of p16INK4a and truncation of ARF tumor suppressors in chickens”, PNAS, 2003, vol.100, No.1, pages 211-216
SR1:200nmmol/L以上1000mmol/L未満
CH-223191:0.2μmol/L以上4μmol/L未満
GNF351:20nmol/L以上300nmol/L未満
TMF:2.5μmol/L以上40μmol/L未満
DMF:2.5μmol/L以上40μmol/L未満
本発明の血小板は、前記本発明の血小板の製造方法により得られたことを特徴とする。本発明の血小板は、前記本発明の血小板の製造方法により得られたことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の血小板は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
本発明の血小板製剤の製造方法は、前述のように、血小板から血小板製剤を製造する製剤工程を含み、前記血小板は、前記本発明の血小板の製造方法で得られたことを特徴とする。本発明の血小板製剤の製造方法は、前記血小板が、前記本発明の血小板の製造方法で得られたことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の血小板製剤の製造方法は、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
本発明の血小板製剤は、前記本発明の血小板製剤の製造方法により得られたことを特徴とする。本発明の血小板製剤は、前記本発明の血小板製剤の製造方法により得られたことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の血小板製剤は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法および血小板製剤の製造方法の説明を援用できる。
本発明の血液製剤の製造方法は、前述のように、血小板と他の成分とを混合することにより、血液製剤を製造する血液製剤工程を含み、前記血小板は、前記本発明の血小板の製造方法で得られたことを特徴とする。本発明の血液製剤の製造方法は、前記血小板が、前記本発明の血小板の製造方法で得られたことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の血液製剤の製造方法は、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
本発明の血液製剤は、前記本発明の血液製剤の製造方法により得られたことを特徴とする。本発明の血液製剤は、前記本発明の血液製剤の製造方法により得られたことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の血液製剤は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法および血液製剤の製造方法の説明を援用できる。
本発明の血小板の産生能向上剤は、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の血小板の産生能向上剤は、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の血小板の産生能向上剤は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
本発明の血小板の生理活性向上剤は、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の血小板の生理活性向上剤は、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の血小板の生理活性向上剤は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
本発明は、血小板の産生能向上のための、グリシンおよびシステインの少なくとも一方の使用である。また、本発明は、血小板の生理活性向上のための、グリシンおよびシステインの少なくとも一方の使用である。本発明は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
高密度培養時に、前記巨核球の血小板産生能の低下および産生された血小板の生理活性が低下すること、ならびに高密度培養をグリシン存在下で実施することにより、前記巨核球の血小板産生能を向上できることおよび産生された血小板の生理活性を向上できることを確認した。
不死化巨核球は、以下の手順で作製した。
ヒトiPS細胞(TKDN SeV2:センダイウイルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来iPS細胞)から、下記参考文献5に記載の方法に従って、血球細胞への分化培養を実施した。具体的には、ヒトES/iPS細胞コロニーを20ng/mL VEGF(R&D SYSTEMS社製)存在下でC3H10T1/2フィーダ細胞と14日間共培養して造血前駆細胞(Hematopoietic Progenitor Cells;HPC)を作製した。培養条件は、37℃、20%O2、5%CO2で実施した(特に記載がない限り、以下同条件)。
参考文献5:Takayama N. et al., “Transient activation of c-MYC expression is critical for efficient platelet generation from human induced pluripotent stem cells”, J. Exp. Med., 2010, vo.13, pages 2817-2830
遺伝子導入システムは、レンチウイルスベクターシステムを利用した。レンチウイルスベクターは、Tetracycline制御性のTet-on(登録商標)遺伝子発現誘導システムベクターである。LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G(下記参考文献6)のmOKSカセットをc-MYC、BMI1、またはBCL-xLに組み替えることで作製した。c-MYC、BMI1、またはBCL-xLが導入されたベクターを、それぞれ、LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G、LVTRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G、およびLV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2Gとした。c-MYC、BMI1、およびBCL-xLウイルスは、293T細胞へ前記レンチウイルスベクターで遺伝子導入することにより作製した。得られたウイルスを目的の細胞に感染させることによって、c-MYC、BMI1、およびBCL-xL遺伝子が目的の細胞のゲノム配列に導入される。安定的にゲノム配列に導入されたこれらの遺伝子は、培地にドキシサイクリン(clontech#631311)を加えることによって強制発現させることができる。
参考文献6:Kobayashi, T.et al., “Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells.”, Cell, 2010, vol.142, No.5, pages 787-799
予めC3H10T1/2フィーダ細胞を播種した6 well plate上に、前記(1−1)の方法で得られたHPCを5×104cells/wellとなるように播種し、BMI1ウイルスおよびc-MYCウイルスを用いたレンチウイルス法にてc-MYCおよびBMI1を強制発現させた。このとき、細胞株1種類につき6 wellずつ使用した。具体的には、それぞれMOI(multiplicity of infection)20となるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション(32℃、900rpm、60分間遠心)で感染させた。前記スピンインフェクションは、12時間おきに2回実施した。培地は、基本培地(15% Fetal Bovine Serum (GIBCO)、1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO)、1% Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS-G) (GIBCO)、0.45 mmol/L 1-Thioglycerol (Sigma-Aldrich)、50μg/mL L-Ascorbic Acid (Sigma-Aldrich)を含有するIMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) (Sigma-Aldrich))に、50 ng/mL Human thrombopoietin (TPO)(R&D SYSTEMS)、50 ng/mL Human Stem Cell Factor (SCF) (R&D SYSTEMS)および2μg/mL Doxycycline (Dox、clontech #631311)となるようにそれぞれを添加した培地(以下、分化培地)に、さらに、Protamineを最終濃度が10 μg/mLとなるように添加した培地を用いた。
前記(1−3)の方法でc-MYCおよびBMI1ウイルスの感染を実施した日を感染0日目として、以下の通り、c-MYC遺伝子およびBMI1遺伝子が導入されたHPCを培養することで、巨核球自己増殖株をそれぞれ作製した。c-MYC遺伝子およびBMI1遺伝子の強制発現は、培地に1μg/mL DOXとなるようにDOXを添加することにより実施した。
感染2日目に、ピペッティングにて上記の方法で得られたウイルス感染済み血球細胞を回収し、1200rpm、5分間遠心操作を行って上清を除去した後、新しい分化培地で懸濁して新しいC3H10T1/2フィーダ細胞上に播種した(6well plate)。感染9日目に同様の操作をすることによって継代を実施した。前記再播種時は、細胞数を計測後、1×105 cells/2mL/wellとなるようにC3H10T1/2フィーダ細胞上に播種した(6well plate)。
感染2日目と同様の操作を実施した。細胞数を計測後3×105 cells/10mL/100mm dishとなるように、C3H10T1/2フィーダ細胞上に播種した(100mm dish)。
ウイルス感染済み血球細胞を回収し、細胞1.0×105個あたり、抗ヒトCD41a-APC抗体(BioLegend)、抗ヒトCD42b-PE抗体(eBioscience)、および抗ヒトCD235ab-pacific blue(BioLegend)抗体を、それぞれ2μL、1μL、および1μLを用いて、前記血球細胞と抗体とを反応させた。前記反応後、FACS Verse(商標)(BD Biosciences)を用いて解析した。感染14日目において、CD41a陽性率が50%以上である細胞を、巨核球自己増殖株とした。
前記感染14日目の巨核球自己増殖株に、BCL-xLウイルスを用いたレンチウイルス法にてBCL-xLを遺伝子導入した。MOI 10になるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション(32℃、900rpm、60分間遠心)で感染させた。BCL-xL遺伝子の強制発現は、培地に1μg/mL DOXとなるようにDOXを添加することにより実施した。
・感染14日目〜感染18日目
前記(1−5)の方法で得られたBCL-xL遺伝子を導入した巨核球自己増殖株を回収し、1200rpm、5分間遠心操作を行った。前記遠心後、沈殿した細胞を新しい分化培地で懸濁した後、新しいC3H10T1/2フィーダ細胞上に2×105cells/2mL/wellとなるように播種した(6well plate)。
BCL-xL遺伝子を導入後の巨核球自己増殖株を回収し、細胞数を計測後、3×105 cells/10mL/100mm dishとなるように播種した。
BCL-xL遺伝子を導入後の巨核球自己増殖株を回収し、細胞数を計測後、1×105 cells/10mL/100mm dishとなるように播種した。以後、4−7日毎に同様にして継代を行い、維持培養を行った。なお、継代時には、新たな分化培地に懸濁の上、播種した。
FBS(シグマ#172012 lot.12E261)15%
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 2mmol/L
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μmol/L
アスコルビン酸(sigma #A4544) 50μg/mL
Puromycin (sigma #P8833-100MG) 2μg/mL
SCF (和光純薬#193-15513) 50ng/mL
TPO様作用物質200ng/mL
DOXを含まない培地で培養することで強制発現を解除した。具体的には、前記(1)の方法で得た不死化巨核球細胞株(SeV2-MKCL)を、PBS(-)で2度洗浄し、下記血小板産生培地に懸濁した。細胞の播種密度は、4.0×105 cells/mL(×4)とした。また、前記血小板産生培地には、所定濃度分(1、5、もしくは10、または10、20、もしくは40mmol/L)のグリシンを添加した。なお、前記血小板産生培地は、0.6〜0.8mmol/Lのグリシンを含む。したがって、グリシン添加後の前記血小板産生培地におけるグリシン濃度は、約2〜約41mmol/Lである。
FBS 15%またはhuman plasma 5%
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 4mmol/L
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μmol/L
アスコルビン酸 (sigma #A4544) 50μg/mL
SCF (和光純薬#193-15513) 50ng/mL
TPO様作用物質200ng/mL
ADAM阻害剤15μmol/L
芳香族炭化水素受容体(AhR)阻害剤(SR1) 750nmol/L、またはGNF351(Calbiochem #182707) 500nmol/L
ROCK阻害剤10μmol/LまたはY39983(Chemscene LLC #CS-0096)500nmol/L
Urokinase 5U/mL
Heparin 10U/mL、または低分子heparin(SANOFI、クレキサン)1U/mL
前記実施例1(2)で得られた血小板について、血小板の生理活性を、フローサイトメータを用いて測定した。具体的には、1.5mLマイクロチューブに希釈液900μLを添加し、血小板産生後の培養液100μLを添加し、混合した。得られた溶液のうち200μLをFACSチューブに分注し、下記標識抗体を添加して染色し、フローサイトメータで血小板におけるCD62pおよびPAC−1のMFIを分析した。また、前記NCについても同様にフローサイトメータで分析後、NCにおけるCD62pおよびPAC−1のMFIを基準として、各サンプルにおけるCD62pおよびPAC−1のMFIの増加割合を算出した。これらの結果を図2に示す。
・血小板の生理活性の測定
0.5μL 抗CD42a抗体PB標識(eBioscience 48-0428-42)
0.5μL 抗CD42b抗体PE標識(Bio Legend 303906)
0.5μL 抗CD62p抗体APC標識(Bio Legend 304910)
10μL 抗PAC-1抗体FITC標識(BD 303704)
細胞の播種密度を、1.0×105 cells/mL(×1)、2.0×105 cells/mL(×2)、3.0×105 cells/mL(×3)、4.0×105 cells/mL(×4)、または8.0×105 cells/mL(×8)とし、SR1に代えて、0.5μmol/LのGNF-351を含む血小板産生培地を用い、前記血小板産生培地に、10mmol/L分のグリシンおよび20U/mL分のヘパリンを添加した以外は、前記実施例1(2)と同様にして血小板を産生させ、血小板の数をカウントした。さらに、得られた血小板について、血小板の劣化状態を、アネキシンVの陽性率に基づき、評価した。具体的には、血小板におけるアネキシンVの陽性率の測定は、前記血小板産生後の培養液100μLをFACSチューブに分注し、下記標識抗体およびタンパク質を添加して染色を行い、フローサイトメータ分析直前にアネキシンV binding buffer(BD Biosciences)で5倍希釈し、分析した。また、コントロールは、細胞の播種密度を、1.0×105 cells/mL(×1)、3.0×105 cells/mL(×3)、または4.0×105 cells/mL(×4)とし、グリシンおよびヘパリンを添加しなかった以外は、同様にして、分析した。これらの結果を図3に示す。
・血小板のダメージの測定
1.0μL 抗CD41a抗体APC標識(Bio Legend 303710)
1.0μL 抗CD42b抗体PE標識(Bio Legend 303906)
5μL Annexin V FITC標識(BD Biosciences 556419)
高密度培養をシステイン存在下で実施することにより、産生された血小板の生理活性を向上できることを確認した。
異なる多能性細胞から誘導した巨核球を用い、前記高密度培養時に、前記巨核球の血小板産生能が低下すること、および前記高密度培養をグリシン存在下で実施することにより、前記巨核球の血小板産生能を向上できることを確認した。
前記実施例1(1−6)で得られた不死化巨核球細胞株(SeV2-MKCL)に、国際公開第2010/134526の方法に従って、センダイウイルスベクターにより、c-MYC、OCT3/4、SOX2、およびKLF4を導入することにより、iPS細胞を誘導した。つぎに、前記ヒトiPS細胞(TKDN SeV2)に代えて、誘導したiPS細胞を用いた以外は、前記実施例1(1−1)〜(1−6)と同様にして、不死化巨核球細胞株を誘導した。さらに、得られた不死化巨核球細胞株について、前記実施例1(2)と同様にして、血小板の数をカウントし、血小板の濃度を算出した。そして、前記血小板の産生開始時の巨核球の細胞密度(播種密度)と、前記血小板の濃度とに基づき、前記P/M比を算出した。コントロールは、前記細胞の播種密度を1.0×105 cells/mL(×1)または4.0×105 cells/mL(×4)とし、前記グリシン未添加の血小板産生培地を用いた以外は、同様にして、血小板の濃度およびP/M比を算出した。これらの結果を図5に示す。
前記ヒトiPS細胞(TKDN SeV2)に代えて、ヒトiPS細胞(NIH5およびNIH8)を用いた以外は、前記実施例1(1−1)〜(1−6)と同様にして、不死化巨核球細胞株を誘導した。そして、得られた不死化巨核球細胞株について、前記細胞の播種密度を4.0×105 cells/mL(×4)または6.0×105 cells/mL(×6)とし、培養日数を5日間とした以外は、前記実施例1(2)と同様にして、血小板の数をカウントし、血小板の濃度を算出した。コントロールは、前記細胞の播種密度を1.0×105 cells/mL(×1)、4.0×105 cells/mL(×4)、または6.0×105 cells/mL(×6)とし、前記グリシン未添加の血小板産生培地を用いた以外は、同様にして血小板の濃度を算出した。これらの結果を図6に示す。
Claims (13)
- 巨核球から血小板を産生する血小板産生工程を含み、
グリシンおよびシステインの少なくとも一方の存在下、前記血小板産生工程を実施することを特徴とする、血小板の製造方法。 - 前記グリシンの濃度が、2mmol/L以上である、請求項1記載の血小板の製造方法。
- 前記グリシンの濃度が、6mmol/L以上である、請求項1または2記載の血小板の製造方法。
- 前記グリシンの濃度が、11〜21mmol/Lである、請求項1から3のいずれか一項に記載の血小板の製造方法。
- 前記システインの濃度が、2mmol/L以上である、請求項1から4のいずれか一項に記載の血小板の製造方法。
- 前記システインの濃度が、2〜11mmol/Lである、請求項1から5のいずれか一項に記載の血小板の製造方法。
- 前記血小板の産生開始時の巨核球の細胞密度が、3×105細胞/mL以上である、請求項1から6のいずれか一項に記載の血小板の製造方法。
- 前記巨核球は、不死化巨核球である、請求項1から7のいずれか一項に記載の血小板の製造方法。
- 前記巨核球は、多能性細胞に由来する、請求項1から8のいずれか一項に記載の血小板の製造方法。
- 前記多能性細胞は、人工多能性幹細胞である、請求項9記載の血小板の製造方法。
- 前記巨核球は、ヒト由来である、請求項1から10のいずれか一項に記載の製造方法。
- 血小板から血小板製剤を製造する製剤工程を含み、
前記血小板は、請求項1から11のいずれか一項に記載の血小板の製造方法で得られたことを特徴とする、血小板製剤の製造方法。 - 血小板と他の成分とを混合することにより、血液製剤を製造する血液製剤工程を含み、
前記血小板は、請求項1から11のいずれか一項に記載の血小板の製造方法で得られたことを特徴とする、血液製剤の製造方法。
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