JPWO2011129371A1 - ５−ＦＵ単独及びＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用時の抗腫瘍効果を増強する遺伝子群 - Google Patents

Abstract

５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する遺伝子群を見出す。５−フルオロウラシル感受性増感剤であって、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子をコードするヌクレオチド断片を含む、増感剤。

Description

本発明は、抗癌剤の感受性増強作用を有する遺伝子のスクリーニング方法、５−フルオロウラシル感受性増感剤、それを含む抗癌剤キット、５−フルオロウラシル感受性を判定するための診断薬、５−フルオロウラシル感受性抑制剤に関する。

肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）は世界中で増加している悪性腫瘍の一種であり、日本における癌死亡者数の第３位を占めている。このＨＣＣに対しては、近年の様々な診断・治療法の開発及び進歩によって、治療成績は向上している。しかし、その一方で、ＨＣＣ患者の多くが、肝炎等の慢性肝疾患を経た発癌であるため、治療後に再発する症例が極めて多く、高度進行型症例の増加が問題となっている。この高度進行型ＨＣＣは、既存の治療法の奏功率が極めて低く、より治療効果の高い新規治療法の開発が望まれていた。

これに対して、近年、抗ウイルス活性を有するサイトカインｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α（ＩＦＮ−α）と抗癌剤５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ）を併用するＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法が、高い有効性を示すとの結果が複数の施設から報告され、進行型ＨＣＣに対する新規治療法として期待されている。

ＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法の感受性に関する遺伝子についての研究は幾つか行われている。例えば、非特許文献１は、遺伝子解析からＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法の効果予測を行おうとする論文である。また、非特許文献２は、肝癌細胞の５−ＦＵに対する感受性遺伝子を報告している。

また、特許文献１には、癌患者の悪性度や化学療法に対する応答を予測するシステムが説明されている。さらに、特許文献２には、癌の進行、転帰および予後を診察するマーカーが説明されている。そして、特許文献３には、アンチセンスＲＮＡと５ＦＵとの併用による癌治療について説明されている。

特表２００９−５０６７７７号公報 特開２００９−５１５１４８号公報 特表２００５−５０４５２２号公報

黒川 幸典 他、「６．肝細胞癌・化学療法感受性予測−ＩＦＮ／５−ＦＵ併用療法の効果予測」、肝臓、４６巻、１０号、（２００５）、３５−３９頁 Hoshida Y et al., "Identification of genes associated with sensitivity to 5-fluorouracil and cisplatin in hepatoma cells.", J Gastroenterol. 2002 Nov;37 Suppl 14:92-5.

しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
第一に、進行型ＨＣＣ治療法として、注目されているＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法であるが、高度進行型ＨＣＣに対する奏功率は約５０％である（S obi, et al. Cancer. 2006. 106, 1990-7.）。そのため、この治療法を用いても、約半数の患者においては治療効果が得られず、全てのＨＣＣ患者に対して好ましい効果を期待できるわけではなく、より治療効果の高い新規治療法の開発が望まれる。

第二に、非特許文献１〜２では、ＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法の感受性に関する遺伝子を網羅的に見つけることは困難であり、未だＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法の感受性との関係が未解明の遺伝子が多く存在すると想定される。なお、非特許文献１〜２では、実際に後述する実施例で示す遺伝子を発見できていない。

第三に、特許文献３〜４でも、ＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法の感受性に関する遺伝子を網羅的に見つけることは困難であり、未だＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法の感受性との関係が未解明の遺伝子が多く存在すると想定される。なお、特許文献３では、遺伝子としてＥＸＴ１、薬剤として５−ＦＵ、癌として肝癌を例に挙げているが、実際にはＥＸＴ１が５−ＦＵの感受性を高めるかどうか実験していない。なお、特許文献４では、癌の進行、転帰および予後を診断するマーカーとしてＴＧＦＢＲ２、癌として肝臓癌、アジュバント化学療法として５ＦＵを例に挙げているが、実際にはＴＧＦＢＲ２が５−ＦＵの感受性を高めるかどうか実験していない。

第四に、特許文献５では、５−ＦＵの感受性に関する遺伝子をそもそも探索すらしていない。そのため、特許文献５では、後述する実施例で示す遺伝子には特に触れていない。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する遺伝子群を見出すことを目的とする。

本発明によれば、５−フルオロウラシル感受性増感剤であって、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子をコードするヌクレオチド断片を含む、増感剤が提供される。

この構成によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する作用を有することが後述する実施例において実証されているＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかをコードするヌクレオチド断片を含むため、増感剤自体としても５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する効果が得られる。

また、本発明によれば、５−フルオロウラシル感受性増感剤であって、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を発現するベクターを含む、増感剤が提供される。

この構成によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する作用を有することが後述する実施例において実証されているＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかを発現するベクターを含むため、増感剤自体としても５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する効果が得られる。

また、本発明によれば、５−フルオロウラシル感受性増感剤であって、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子のコードする蛋白質を含む、増感剤が提供される。

この構成によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する作用を有することが後述する実施例において実証されているＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のコードする蛋白質を含むため、増感剤自体としても５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する効果が得られる。

また、本発明によれば、抗癌剤キットであって、上記の増感剤と、５−フルオロウラシルと、を含む、キットが提供される。

この構成によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する作用を有することが後述する実施例において実証されているＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子を用いた増感剤を含むため、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果が増強されて優れた抗腫瘍効果が得られる。

また、本発明によれば、５−フルオロウラシル感受性抑制剤であって、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを含む、抑制剤が提供される。

この構成によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する作用を有することが後述する実施例において実証されているＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかの発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを含むため、抑制剤自体としても５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を抑制する効果が得られる。

また、本発明によれば、５−フルオロウラシル感受性を判定するための診断薬であって、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定するための試薬を含む、診断薬が提供される。

この構成によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する作用を有することが後述する実施例において実証されているＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかの発現量を測定するための試薬を含むため、被験者の生体内におけるＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかの発現量を測定することで、被験者が５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果が効きやすい体質であるかどうか判定するための診断薬として利用できる。

また、本発明によれば、抗癌剤の感受性増強作用を有する遺伝子のスクリーニング方法であって、（ｍ）哺乳動物の所定の癌細胞株にリボザイムライブラリーを導入する工程と、（ｎ）リボザイムライブラリーが導入された癌細胞を所定の抗癌剤で処理する工程と、（ｏ）抗癌剤で処理された癌細胞のうち生存細胞からリボザイムを回収して新規なリボザイムライブラリーを得る工程と、を含み、リボザイムライブラリーが、標的認識配列特異的にｍＲＮＡを切断し、遺伝子発現を抑制する複数のリボザイムを含み、各リボザイムが認識する標的認識配列がランダム化された複数の配列である、ランダム化リボザイムライブラリーであり、（ｐ）（ｍ）、（ｎ）および（ｏ）の工程を複数回繰り返して得られるリボザイムライブラリーが認識する標的認識配列を検出する工程と、（ｑ）検出された標的認識配列に対応する遺伝子情報をゲノムデータベースから抽出する工程と、 をさらに含む、スクリーニング方法が提供される。

この方法によれば、リボザイムライブラリーが、標的認識配列特異的にｍＲＮＡを切断し、遺伝子発現を抑制する複数のリボザイムを含むため、上記の工程を複数回繰り返して得られるリボザイムライブラリーには、抗癌剤の感受性増強作用を有する遺伝子の発現を抑制するリボザイムが濃縮されて多く含まれていることになる。そのため、こうして得られるリボザイムライブラリーが認識する標的認識配列を検出して、検出された標的認識配列に対応する遺伝子情報をゲノムデータベースから抽出すれば、抗癌剤の感受性増強作用を有する遺伝子を高確率で見出すことが可能である。

本発明によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強するＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子またはそれらの遺伝子がコードする蛋白質を用いて、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強することができる。また、本発明によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強するＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを用いて、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を抑制することができる。

また、本発明によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強するＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかの発現量を測定するための試薬を用いて、被験者が５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果が効きやすい体質であるかどうか判定することができる。また、本発明によれば、標的認識配列特異的にｍＲＮＡを切断し、遺伝子発現を抑制する複数のリボザイムを用いて、抗癌剤の感受性増強作用を有する遺伝子を高確率で見出すことが可能である。

実施例のスクリーニング法で用いるプラスミドの構築について説明するための概念図である。 実施例のスクリーニング法で用いるリボザイムの構造について説明するための概念図である。 実施例のスクリーニング法で用いるランダムリボザイムライブラリーについて説明するための概念図である。 実施例のスクリーニング法について説明するための概念図である。 実施例のスクリーニング法による５−ＦＵ抵抗性の亢進を示すグラフである。 実施例のスクリーニング法で見出した５−ＦＵ感受性増強遺伝子の発現抑制による５−ＦＵ抵抗性の亢進を示すグラフである。 ５−ＦＵ感受性増強遺伝子のｓｉＲＮＡおよびアデノウイルス発現ベクターの投与による５−ＦＵ感受性の増強・抑制のメカニズムを説明するための概念図である。 ５ＦＵＳＧｓ発現アデノウイルスプラスミドの構築について説明するための概念図である。 コントロールアデノウイルスプラスミドの構築について説明するための概念図である。 Ａｄ−５ＦＵＳＧｓによる遺伝子過剰発現確認を示す電気泳動写真である。 実施例のスクリーニング法で見出した５−ＦＵ感受性増強遺伝子の強制発現による５−ＦＵ感受性の亢進を示すグラフである。 実施例のスクリーニング法で見出した５−ＦＵ感受性増強遺伝子の強制発現によるＩＮＦ−α／５−ＦＵ感受性の亢進を示すグラフである。 Ａｄ／ＴＧＦＢＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙによるＩＦＮ−α／５−ＦＵ感受性の亢進（ｉｎ ｖｉｖｏ）を示すグラフである。 ＴＧＦＢＲ２，ＥＸＴ１過剰発現による５−ＦＵ及びＩＦＮ−α／５−ＦＵ誘導性アポトーシスの増強を示す蛍光顕微鏡写真（図１０ａ）およびグラフ（図１０ｂ）である。 ＴＧＦＢＲ２過剰発現によるＴＧＦ−βシグナル活性化及びアポトーシス関連タンパク発現の変化を示すグラフ（図１１ａ、図１１ｂ）および電気泳動写真（図１１ｃ）である。 ＥＸＴ１過剰発現によるアポトーシス亢進に対するＥＲストレスの関与を示すグラフ（図１２ａ、図１２ｂ）および電気泳動写真（図１２ｃ）である。 ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１過剰発現によるヒト肝癌モデルマウスへの効果を示すグラフである。 肝癌患者におけるＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１のｍＲＮＡ発現を示すグラフ（図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ）である。

＜用語の説明＞
（１）相同性
本明細書において、「相同性」とは、２つもしくは複数間のアミノ酸配列の同一のアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定したものである。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。また、いかなる保存的置換も同一と考えない。また、最適に整列した状態において、オーバーラップするアミノ酸を含めた全アミノ酸残基に対する、同一のアミノ酸数の割合を意味する。整列のための方法、割合の算定方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られており、一般的な配列分析プログラム（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓなど）を使用して測定することができる。また「相同性」は、２つもしくは複数間のＤＮＡ鎖、または２つもしくは複数間のＲＮＡ鎖において、同一の塩基の割合を、上記と同様に当該技術分野で公知の方法に従って算定したものである。

（２）ストリンジェントな条件
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば（１）洗浄のための低イオン強度と高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いる、（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、および７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いる、または（３）４２℃において５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸と、４２℃において０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中での洗浄および５５℃のホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣにてストリンジェントな洗浄を含む条件であっても良い。また中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中において、３７℃で一晩インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中３７〜５０℃でのフィルターの洗浄のような条件である。なお、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者によって容易に決定でき、一般的にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存する。一般に、長いプローブは適当なアニーリングのために高温を必要とし、短いプローブは低温を必要とする。また一般に、ストリンジェンシーは塩濃度に逆比例する。

（３）ハイブリダイズ
また、本明細書において、ポリヌクレオチドに適用される場合の「ハイブリダイズ」とは、ヌクレオチドの塩基間の水素結合等によってヌクレオチド間の対ができる性質のことを表す。塩基対はワトソン・クリック型塩基対、フーグスティーン型塩基対、または任意の他の配列特異的な形で生じうる。

以下、本発明の実施の形態について説明する。
＜ヌクレオチド断片を含む５−フルオロウラシル感受性増感剤＞
本実施形態における５−フルオロウラシル感受性増感剤は、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子をコードするヌクレオチド断片を含む、増感剤である。この構成によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する作用を有することが後述する実施例において実証されているＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかをコードするヌクレオチド断片を含むため、増感剤自体としても５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する効果が得られる。

ここで、この５−フルオロウラシル感受性増感剤は、５−フルオロウラシルを投与した場合の癌細胞の死亡率を向上させる（生存率を低下させる）ものであればよく、特に限定するものではないが、例えば母集団が正規分布に従うと仮定できる場合にはパラメトリック検定であるスチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）において有意差があれば好ましい。すなわち、スチューデントのｔ検定において片側検定でｐ＜０．０５となればよく、より好ましくは片側検定でｐ＜０．０３となればよく、最も好ましくは片側検定でｐ＜０．０１となればよい。なお、スチューデントのｔ検定は特に片側検定に限定するわけではなく、両側検定で行っても良い。さらに、母集団が正規分布に従うと仮定できない場合には、ノンパラメトリック検定として、マン・ホイットニーのＵ検定などを行って有意差の有無を検定しても良い。

（ｉ）ＰＲＡＫＧ２遺伝子
本実施形態の５−フルオロウラシル感受性増感剤に含まれるヌクレオチド断片にコードされるＰＲＡＫＧ２遺伝子は、哺乳動物のＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニット（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ，ｇａｍｍａ ２ ｎｏｎ−ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）をコードする遺伝子であればよく、特に限定するものではないが、例えば、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１４２２の５'−ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇａｍｍａ−２ ｉｓｏｆｏｒｍ ａ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］をコードする遺伝子）などを好適に用いることができる。なぜなら、このヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子に５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する効果があることは、後述の実施例で実証されているからである。なお、上記遺伝子に関する塩基配列等の詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。

もっとも、本実施形態の５−フルオロウラシル感受性増感剤に含まれるヌクレオチド断片にコードされるＰＲＡＫＧ２遺伝子は、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子の変異型遺伝子であってもよい。なぜなら、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子との相同性の高い遺伝子であれば、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子と同様に哺乳動物細胞における５−フルオロウラシル感受性を増強させる可能性が高いからである。ここで、変異型とは、個体間のＤＮＡ配列の差異に起因するものを含む。

具体的には、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子の変異型遺伝子は、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（すなわちヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子の塩基配列の縮重配列）からなる変異型遺伝子であってもよい。なぜなら、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子の縮重配列からなる変異型遺伝子がコードするアミノ酸配列は野生型遺伝子がコードするアミノ酸配列と同じであるため、この変異型遺伝子から発現される蛋白質の機能は野生型遺伝子から発現される蛋白質と同じだからである。なお、どのような塩基配列が縮重配列にあたるかは、ユニバーサルコドンの対応表を用いて当業者であれば容易に理解することが可能である。

また、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子の変異型遺伝子は、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる変異型遺伝子であってもよい。また上記「１若しくは数個」は好ましくは３０個以下であり、より好ましくは２０個以下であり、より好ましくは１５個以下であり、より好ましくは１０個以下であり、より好ましくは５個以下であり、好ましくは４個以下であり、より好ましくは３個以下であり、より好ましくは２個以下であり、さらに好ましくは１個である。なぜならば、変異型遺伝子の塩基配列が、野生型の遺伝子の塩基配列に対して塩基の欠失、置換若しくは付加が少ないほど、野生型の遺伝子の塩基配列をコードする遺伝子に近い特性を有していることになるからである。

なお、この変異型遺伝子の塩基配列のコードするアミノ酸配列が、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子のコードするアミノ酸配列に対して１または数個の置換がある場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換していることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、および、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらの各グループ内のアミノ酸同士の置換は保存的置換と総称される。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci U SA. 1984Sep; 81(18): 5662-5666., Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25; 10(20): 6487-6500., Wang et al., Science. 1984 Jun 29; 224 (4656): 1431-1433.）。

また、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子の変異型遺伝子は、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする基配列からなる変異型遺伝子であってもよい。ここで上記「８０％以上」は好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上である。なぜならば、異型遺伝子の塩基配列が、野生型の遺伝子の塩基配列に対して相同性が高いほど、野生型の遺伝子の塩基配列をコードする遺伝子に近い特性を有していることになるからである。

また、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子の変異型遺伝子は、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる変異型遺伝子であってもよい。なぜなら、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる変異型遺伝子は、野生型の遺伝子の塩基配列に対して相同性が高いため、野生型の遺伝子の塩基配列をコードする遺伝子に近い特性を有していることになるからである。

（ｉｉ）ＴＧＦＢＲ２遺伝子
本実施形態の５−フルオロウラシル感受性増感剤に含まれるヌクレオチド断片にコードされるＴＧＦＢＲ２遺伝子は、哺乳動物のＴＧＦ−β２型受容体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩ）をコードする遺伝子であればよく、特に限定するものではないが、例えば、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：７０４８のｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ， ｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩ（７０／８０ｋＤａ）［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］をコードする遺伝子）などを好適に用いることができる。なぜなら、このヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子に５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する効果があることは、後述の実施例で実証されているからである。なお、上記遺伝子に関する塩基配列等の詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。

もっとも、本実施形態の５−フルオロウラシル感受性増感剤に含まれるヌクレオチド断片にコードされるＴＧＦＢＲ２遺伝子は、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子の変異型遺伝子であってもよい。なぜなら、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子との相同性の高い遺伝子であれば、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子と同様に哺乳動物細胞における５−フルオロウラシル感受性を増強させる可能性が高いからである。ここで、変異型とは、個体間のＤＮＡ配列の差異に起因するものを含む。

具体的には、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子の変異型遺伝子は、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（すなわちヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子の塩基配列の縮重配列）からなる変異型遺伝子であってもよい。なぜなら、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子の縮重配列からなる変異型遺伝子がコードするアミノ酸配列は野生型遺伝子がコードするアミノ酸配列と同じであるため、この変異型遺伝子から発現される蛋白質の機能は野生型遺伝子から発現される蛋白質と同じだからである。なお、どのような塩基配列が縮重配列にあたるかは、ユニバーサルコドンの対応表を用いて当業者であれば容易に理解することが可能である。

また、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子の変異型遺伝子は、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる変異型遺伝子であってもよい。また上記「１若しくは数個」は好ましくは３０個以下であり、より好ましくは２０個以下であり、より好ましくは１５個以下であり、より好ましくは１０個以下であり、より好ましくは５個以下であり、好ましくは４個以下であり、より好ましくは３個以下であり、より好ましくは２個以下であり、さらに好ましくは１個である。なぜならば、変異型遺伝子の塩基配列が、野生型の遺伝子の塩基配列に対して塩基の欠失、置換若しくは付加が少ないほど、野生型の遺伝子の塩基配列をコードする遺伝子に近い特性を有していることになるからである。

なお、この変異型遺伝子の塩基配列のコードするアミノ酸配列が、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子のコードするアミノ酸配列に対して１または数個の置換がある場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換していることが好ましい。アミノ酸側鎖の性質についての説明は既に行ったので繰り返さない。

また、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子の変異型遺伝子は、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする基配列からなる変異型遺伝子であってもよい。ここで上記「８０％以上」は好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上である。なぜならば、異型遺伝子の塩基配列が、野生型の遺伝子の塩基配列に対して相同性が高いほど、野生型の遺伝子の塩基配列をコードする遺伝子に近い特性を有していることになるからである。

また、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子の変異型遺伝子は、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる変異型遺伝子であってもよい。なぜなら、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる変異型遺伝子は、野生型の遺伝子の塩基配列に対して相同性が高いため、野生型の遺伝子の塩基配列をコードする遺伝子に近い特性を有していることになるからである。

（ｉｉｉ）ＥＸＴ１遺伝子
本実施形態の５−フルオロウラシル感受性増感剤に含まれるヌクレオチド断片にコードされるＥＸＴ１遺伝子は、哺乳動物の小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｔｙｐｅ ＩＩ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子であればよく、特に限定するものではないが、例えば、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２１３１のＥＸＴ１ ｅｘｏｓｔｏｓｅｓ （ｍｕｌｔｉｐｌｅ）１［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］をコードする遺伝子）などを好適に用いることができる。なぜなら、このヒト野生ＥＸＴ１遺伝子に５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する効果があることは、後述の実施例で実証されているからである。なお、上記遺伝子に関する塩基配列等の詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。

なお、このＥＸＴ１遺伝子にコードされている哺乳動物の小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素は、ヘパラン硫酸の生合成における糖鎖延長反応に関係している（ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈａｉｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ ｏｆ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）。

もっとも、本実施形態の５−フルオロウラシル感受性増感剤に含まれるヌクレオチド断片にコードされるＥＸＴ１遺伝子は、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子の変異型遺伝子であってもよい。なぜなら、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子との相同性の高い遺伝子であれば、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子と同様に哺乳動物細胞における５−フルオロウラシル感受性を増強させる可能性が高いからである。ここで、変異型とは、個体間のＤＮＡ配列の差異に起因するものを含む。

具体的には、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子の変異型遺伝子は、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（すなわちヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子の塩基配列の縮重配列）からなる変異型遺伝子であってもよい。なぜなら、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子の縮重配列からなる変異型遺伝子がコードするアミノ酸配列は野生型遺伝子がコードするアミノ酸配列と同じであるため、この変異型遺伝子から発現される蛋白質の機能は野生型遺伝子から発現される蛋白質と同じだからである。なお、どのような塩基配列が縮重配列にあたるかは、ユニバーサルコドンの対応表を用いて当業者であれば容易に理解することが可能である。

また、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子の変異型遺伝子は、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる変異型遺伝子であってもよい。また上記「１若しくは数個」は好ましくは３０個以下であり、より好ましくは２０個以下であり、より好ましくは１５個以下であり、より好ましくは１０個以下であり、より好ましくは５個以下であり、好ましくは４個以下であり、より好ましくは３個以下であり、より好ましくは２個以下であり、さらに好ましくは１個である。なぜならば、変異型遺伝子の塩基配列が、野生型の遺伝子の塩基配列に対して塩基の欠失、置換若しくは付加が少ないほど、野生型の遺伝子の塩基配列をコードする遺伝子に近い特性を有していることになるからである。

なお、この変異型遺伝子の塩基配列のコードするアミノ酸配列が、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子のコードするアミノ酸配列に対して１または数個の置換がある場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換していることが好ましい。アミノ酸側鎖の性質についての説明は既に行ったので繰り返さない。

また、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子の変異型遺伝子は、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする基配列からなる変異型遺伝子であってもよい。ここで上記「８０％以上」は好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上である。なぜならば、異型遺伝子の塩基配列が、野生型の遺伝子の塩基配列に対して相同性が高いほど、野生型の遺伝子の塩基配列をコードする遺伝子に近い特性を有していることになるからである。

また、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子の変異型遺伝子は、ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる変異型遺伝子であってもよい。なぜなら、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる変異型遺伝子は、野生型の遺伝子の塩基配列に対して相同性が高いため、野生型の遺伝子の塩基配列をコードする遺伝子に近い特性を有していることになるからである。

＜ベクターを含む５−フルオロウラシル感受性増感剤＞
本実施形態に係る５−フルオロウラシル感受性増感剤は、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を発現するベクターを含む、増感剤である。この構成によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する作用を有することが後述する実施例において実証されているＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかを発現するベクターを含むため、増感剤自体としても５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する効果が得られる。

具体的には、本実施形態に用いる発現ベクターは、ベクターと、そのベクターに作動可能に連結されてなるＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子と、を備える。このベクターは、後述する実施例で示すように、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子（およびその遺伝子のコードする蛋白質）を好適に発現することが可能である。

（ｉ）アデノウイルスベクター
ここで、このベクターとしては、特に限定されず、一般的な哺乳動物細胞に導入可能なベクターを利用可能であるが、例えば、後述する実施例で用いられているアデノウイルスベクターを好適に用いることができる。アデノウイルスは最もよく研究されているウイルスのひとつであり、現在汎用されているアデノウイルスベクターはＥ１遺伝子を欠損しているため、Ｅ１遺伝子を持続的に発現している特殊な細胞（２９３細胞）でのみ増殖することができ、通常の細胞には感染することは可能であるが増殖することはないため、アデノウイルスベクターは安全かつ高効率なベクターとして、遺伝子機能解析などの基礎研究から遺伝子治療の分野まで広く利用されている。アデノウイルスベクターを用いれば、以下のような利点が得られる。１）高力価のウイルスを得ることができる。１０^８〜１０^９ＰＦＵ／ｍｌ程度のウイルス液を容易に得ることができる。さらに１０^１１ＰＦＵ／ｍｌ程度まで濃縮することも可能である。そのため、接着性の細胞ではほぼ１００％の細胞に遺伝子導入することが可能である。２）広い動物種に用いることができる。３）増殖細胞だけではなく静止期の細胞にも感染・発現できる。４）神経系を含む多くの分化・未分化動物培養細胞をターゲットにすることができ、さらに動物個体への直接注入・投与による遺伝子発現が可能である。

組換えアデノウイルスを作成するには、「完全長ＤＮＡ導入法」あるいは「ＣＯＳ−ＴＰＣ法」のいずれの方法を用いても良い。完全長ＤＮＡ導入法とは、制限消化処理した組換えコスミドを２９３細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎすることにより、組換えアデノウイルスを取得する方法である。完全長ＤＮＡ導入法では、細胞内での相同組換えが必要ないため、親ウイルスの混入はなく、得られる組換えアデノウイルスのほとんどが目的ウイルスである。「ＣＯＳ−ＴＰＣ法」とは、組換えコスミド およびＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ−ＴＰＣを２９３細胞にｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、２９３細胞内でおこる相同組換えを利用することにより、組換えアデノウイルスを作製する方法である。Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ−ＴＰＣには、本来アデノウイルスゲノムＤＮＡの両末端に結合している末端タンパク質（ＴＰ； Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が結合している。そのため、高効率に組換えアデノウイルスを作製することができ、ほぼ確実に目的ウイルスを得ることができる。

＜蛋白質を含む増感剤＞
本実施形態に係る５−フルオロウラシル感受性増感剤は、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子のコードする蛋白質を含む、増感剤である。この構成によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する作用を有することが後述する実施例において実証されているＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかがコードする蛋白質を含むため、増感剤自体としても５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する効果が得られる。

このＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかがコードする蛋白質を得る場合には、その蛋白質は人工的に化学合成されてもよいが、細胞培養を用いる生産方法によって得ることが安価かつ大量に生産可能であるため好ましい。具体的には、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかがコードする蛋白質を大量生産した上で分離・精製するために、上記のアデノウイルスベクターを感染させた哺乳動物細胞からＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかがコードする蛋白質を分離・精製するための一般的な方法を用いることができる。具体的には、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかがコードする蛋白質を大量生産した大哺乳動物細胞を破壊後、通常用いられる分離精製手段を用いることにより行うことができる。哺乳動物細胞の破壊には、例えば、超音波処理、高圧ホモジナイザー処理、浸透圧ショック法などが好適に用いられる。ＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかがコードする蛋白質の分離精製手段には、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いることができる。

（ｉ）ＰＲＡＫＧ２遺伝子のコードするＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼ
本実施形態の５−フルオロウラシル感受性増感剤に含まれるＰＲＡＫＧ２遺伝子のコードする蛋白質は、哺乳動物のＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニット（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ，ｇａｍｍａ ２ ｎｏｎ−ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）であればよく、特に限定するものではないが、例えば、ヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニット（５'−ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇａｍｍａ−２ ｉｓｏｆｏｒｍ ａ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］）などを好適に用いることができる。なぜなら、このヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットに５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する効果があることは、後述の実施例で実証されているからである。なお、上記ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットに関するアミノ酸配列等の詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。

もっとも、本実施形態の５−フルオロウラシル感受性増感剤に含まれるＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼは、ヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットの変異型蛋白質であってもよい。なぜなら、ヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットとの相同性の高い蛋白質であれば、ヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットと同様に哺乳動物細胞における５−フルオロウラシル感受性を増強させる可能性が高いからである。ここで、変異型とは、個体間のアミノ酸配列の差異に起因するものを含む。

具体的には、ヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットの変異型蛋白質は、ヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットのアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列からなる変異型蛋白質であってもよい。また上記「１若しくは数個」は好ましくは３０個以下であり、より好ましくは２０個以下であり、より好ましくは１５個以下であり、より好ましくは１０個以下であり、より好ましくは５個以下であり、好ましくは４個以下であり、より好ましくは３個以下であり、より好ましくは２個以下であり、さらに好ましくは１個である。なぜならば、変異型蛋白質のアミノ酸配列が、野生型の蛋白質のアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が少ないほど、野生型のＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットに近い特性を有していることになるからである。

なお、この変異型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットのアミノ酸配列が、ヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットのアミノ酸配列に対して１または数個の置換がある場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換していることが好ましい。なお、アミノ酸側鎖の性質について既に説明したので繰り返さない。

また、ヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットの変異型蛋白質は、ヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる変異型蛋白質であってもよい。ここで上記「８０％以上」は好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上である。なぜならば、変異型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットのアミノ酸配列が、野生型の蛋白質のアミノ酸配列に対して相同性が高いほど、野生型のＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットに近い特性を有していることになるからである。

また、ヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットの変異型蛋白質は、ヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットをコードする遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなる変異型蛋白質であってもよい。なぜなら、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなる変異型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットは、野生型の蛋白質のアミノ酸配列に対して相同性が高いため、野生型のＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットに近い特性を有していることになるからである。

（ｉｉ）ＴＧＦＢＲ２遺伝子のコードするＴＧＦ−β２型受容体
本実施形態の５−フルオロウラシル感受性増感剤に含まれるＴＧＦＢＲ２遺伝子のコードする蛋白質は、哺乳動物のＴＧＦ−β２型受容体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩ）であればよく、特に限定するものではないが、例えば、ヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ， ｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩ（７０／８０ｋＤａ）［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］）などを好適に用いることができる。なぜなら、このヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体に５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する効果があることは、後述の実施例で実証されているからである。なお、上記ＴＧＦ−β２型受容体に関するアミノ酸配列等の詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。

もっとも、本実施形態の５−フルオロウラシル感受性増感剤に含まれＴＧＦ−β２型受容体は、ヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体の変異型蛋白質であってもよい。なぜなら、ヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体との相同性の高い蛋白質であれば、ヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体と同様に哺乳動物細胞における５−フルオロウラシル感受性を増強させる可能性が高いからである。ここで、変異型とは、個体間のアミノ酸配列の差異に起因するものを含む。

具体的には、ヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体の変異型蛋白質は、ヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列からなる変異型蛋白質であってもよい。また上記「１若しくは数個」は好ましくは３０個以下であり、より好ましくは２０個以下であり、より好ましくは１５個以下であり、より好ましくは１０個以下であり、より好ましくは５個以下であり、好ましくは４個以下であり、より好ましくは３個以下であり、より好ましくは２個以下であり、さらに好ましくは１個である。なぜならば、変異型蛋白質のアミノ酸配列が、野生型の蛋白質のアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が少ないほど、野生型のＴＧＦ−β２型受容体に近い特性を有していることになるからである。

なお、この変異型ＴＧＦ−β２型受容体のアミノ酸配列が、ヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体のアミノ酸配列に対して１または数個の置換がある場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換していることが好ましい。なお、アミノ酸側鎖の性質について既に説明したので繰り返さない。

また、ヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体の変異型蛋白質は、ヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる変異型蛋白質であってもよい。ここで上記「８０％以上」は好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上である。なぜならば、変異型ＴＧＦ−β２型受容体のアミノ酸配列が、野生型の蛋白質のアミノ酸配列に対して相同性が高いほど、野生型のＴＧＦ−β２型受容体に近い特性を有していることになるからである。

また、ヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体の変異型蛋白質は、ヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体をコードする遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなる変異型蛋白質であってもよい。なぜなら、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなる変異型ＴＧＦ−β２型受容体は、野生型の蛋白質のアミノ酸配列に対して相同性が高いため、野生型のＴＧＦ−β２型受容体に近い特性を有していることになるからである。

（ｉｉｉ）ＥＸＴ１遺伝子のコードする小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素
本実施形態の５−フルオロウラシル感受性増感剤に含まれるＥＸＴ１遺伝子のコードする蛋白質は、哺乳動物の小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｔｙｐｅ ＩＩ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）であればよく、特に限定するものではないが、例えば、ヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素（ＥＸＴ１ ｅｘｏｓｔｏｓｅｓ （ｍｕｌｔｉｐｌｅ）１［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］）などを好適に用いることができる。なぜなら、このヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素に５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する効果があることは、後述の実施例で実証されているからである。なお、上記小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素に関するアミノ酸配列等の詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。

なお、このＥＸＴ１遺伝子にコードされている哺乳動物の小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素は、ヘパラン硫酸の生合成における糖鎖延長反応に関係している（ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈａｉｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ ｏｆ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）。

もっとも、本実施形態の５−フルオロウラシル感受性増感剤に含まれる小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素は、ヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素の変異型蛋白質であってもよい。なぜなら、ヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素との相同性の高い蛋白質であれば、ヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素と同様に哺乳動物細胞における５−フルオロウラシル感受性を増強させる可能性が高いからである。ここで、変異型とは、個体間のアミノ酸配列の差異に起因するものを含む。

具体的には、ヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素の変異型蛋白質は、ヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列からなる変異型蛋白質であってもよい。また上記「１若しくは数個」は好ましくは３０個以下であり、より好ましくは２０個以下であり、より好ましくは１５個以下であり、より好ましくは１０個以下であり、より好ましくは５個以下であり、好ましくは４個以下であり、より好ましくは３個以下であり、より好ましくは２個以下であり、さらに好ましくは１個である。なぜならば、変異型蛋白質のアミノ酸配列が、野生型の蛋白質のアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が少ないほど、野生型の小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素に近い特性を有していることになるからである。

なお、この変異型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素のアミノ酸配列が、ヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素のアミノ酸配列に対して１または数個の置換がある場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換していることが好ましい。なお、アミノ酸側鎖の性質について既に説明したので繰り返さない。

また、ヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素の変異型蛋白質は、ヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる変異型蛋白質であってもよい。ここで上記「８０％以上」は好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上である。なぜならば、変異型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素のアミノ酸配列が、野生型の蛋白質のアミノ酸配列に対して相同性が高いほど、野生型の小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素に近い特性を有していることになるからである。

また、ヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素の変異型蛋白質は、ヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなる変異型蛋白質であってもよい。なぜなら、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなる変異型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素は、野生型の蛋白質のアミノ酸配列に対して相同性が高いため、野生型の小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素に近い特性を有していることになるからである。

＜５−フルオロウラシル／インターフェロンαへの感受性増感剤＞
これまで説明してきた上記の実施形態の増感剤は、いずれも５−フルオロウラシルおよびインターフェロンαの併用時における５−フルオロウラシルおよびインターフェロンαへの感受性を増強する、増感剤としても活用できる。後述する実施例で、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子には、５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における抗腫瘍作用を増強する効果があることが実証されているため、当業者であればＰＲＡＫＧ２遺伝子にも５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における抗腫瘍作用を増強する効果があると想定できるためである。

また、後述する実施例で、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のコードするＴＧＦ−β２型受容体およびＥＸＴ１遺伝子のコードする小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素には、５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における抗腫瘍作用を増強する効果があることが実証されているため、当業者であればＰＲＡＫＧ２遺伝子のコードするＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットにも５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における抗腫瘍作用を増強する効果があると想定できるためである。

＜投与形態および剤形＞
これまで説明してきた上記の実施形態の増感剤を生体に投与する際の投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、眼内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、全身または局部的に投与することができる。投与経路は、好ましくは静脈内投与をあげることができる。また、投与経路は、５−フルオロウラシルまたはインターフェロンαの投与経路と同一である必要はない。

投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。さらに、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。

非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつこの増感剤を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。この担体としては具体的には乳糖、グリセリンなどが例示できる。このインテグリンα８β１およびリガンドの結合阻害剤と、用いる担体の性質により、エアロゾル、ライパウダーなどの製剤化が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

また、上記増感剤は、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。

また、投与方法は患者の年齢、症状、対象臓器等などにより適宜選択することができる。この増感剤の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重、併用する抗癌剤の種類および量などにより異なる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。また、別の適切な化学療法薬と併用で投与してもよい。

＜抗癌剤キット＞
本実施形態の抗癌剤キットは、これまで説明してきた上記の実施形態の増感剤と、５−フルオロウラシルと、を含む、キットである。この構成によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する作用を有することが後述する実施例において実証されているＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子（またはこれら遺伝子のコードする蛋白質）を用いた増感剤を含むため、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果が増強されて優れた抗腫瘍効果が得られる。

ここで、本明細書において、「５−フルオロウラシル」（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）とは、フッ化ピリミジン系の代謝拮抗剤であり、抗悪性腫瘍薬（抗がん剤）として用いられる化合物を含む。この化合物は、ウラシルの５位水素原子がフッ素原子に置き換わった構造をしている。この化合物は、１９５６年にＤｕｓｈｉｎｓｋｙらによって合成され、その後Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒらを中心として基礎および臨床にわたる広範な研究で抗悪性腫瘍剤としての評価が確立された。代表商品としては、「５−ＦＵ協和」（協和発酵キリン）シリーズが市販されている。

また、本実施形態に係る抗癌剤キットは、これまで説明してきた上記の実施形態の増感剤と、５−フルオロウラシルと、にくわえて、さらにインターフェロンαを含む、キットであってもよい。後述する実施例で、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子には、５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における抗腫瘍作用を増強する効果があることが実証されているため、当業者であればＰＲＡＫＧ２遺伝子にも５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における抗腫瘍作用を増強する効果があると想定できるためである。

また、後述する実施例で、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のコードするＴＧＦ−β２型受容体およびＥＸＴ１遺伝子のコードする小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素には、５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における抗腫瘍作用を増強する効果があることが実証されているため、当業者であればＰＲＡＫＧ２遺伝子のコードするＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼγ２非触媒サブユニットにも５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における抗腫瘍作用を増強する効果があると想定できるためである。

ここで、本明細書において、「インターフェロン」（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、略号：ＩＦＮ）とは、動物体内で病原体（特にウイルス）や腫瘍細胞などの異物の侵入に反応して細胞が分泌する蛋白質を含む。この蛋白質は、ウイルス増殖の阻止や細胞増殖の抑制、免疫系および炎症の調節などの働きをする。また、この蛋白質は、サイトカインの一種である。この蛋白質は、医薬品としてはＣ型肝炎・多発性骨髄腫等の悪性腫瘍の治療に用いられている。

また、本明細書において、「インターフェロンα」（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α、略号：ＩＦＮ−α）とは、ＩＦＮ−α：１３種類（１，２，４，５，６，７，８，１０，１３，１４，１６，１７，２１）を含む。ＩＦＮαを用いた医薬品としては、例えば、スミフェロン（Ｒ）：腎癌・多発性骨髄腫・慢性骨髄性白血病・ヘアリー細胞白血病・亜急性硬化性全脳炎・ＨＴＬＶ−１脊髄症・Ｂ型肝炎・Ｃ型肝炎、オーアイエフ（Ｒ）：慢性骨髄性白血病・Ｂ型肝炎・Ｃ型肝炎などが市販されている。なお、本明細書において、「インターフェロンα」には、ＩＦＮα２ｂを用いた市販薬であるイントロンＡ（Ｒ）：Ｂ型肝炎・Ｃ型肝炎、ＰＥＧ−ＩＦＮα２ａを用いた市販薬であるペガシス（Ｒ）：Ｃ型肝炎、ＰＥＧ−ＩＦＮα２ｂを用いた市販薬であるペグイントロン（Ｒ）：Ｃ型肝炎、Ｃ−ＩＦＮαを用いた市販薬であるアドバフェロン（Ｒ）：Ｃ型肝炎なども含まれる。

＜５−フルオロウラシル感受性抑制剤＞
本実施形態に係る５−フルオロウラシル感受性抑制剤は、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを含む、抑制剤である。この構成によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する作用を有することが後述する実施例において実証されているＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかの発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを含むため、抑制剤自体としても５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を抑制する効果が得られる。

本実施形態に係る５−フルオロウラシル感受性抑制剤を用いれば、例えば経口または静脈注射などで全身または広範囲に５−フルオロウラシルを投与した場合に、癌巣が存在しない部位に注射剤などで５−フルオロウラシル感受性抑制剤を注入することができる。このようにすれば、癌巣が存在しない部位において５−フルオロウラシルによる深刻な副作用が発生する可能性を低減することができる。また、癌巣が存在しない部位に注射剤などで５−フルオロウラシル感受性抑制剤を注入し、一方で癌巣には注射剤などで５−フルオロウラシル感受性増感剤を注入すれば、癌巣が存在しない部位において５−フルオロウラシルによる深刻な副作用が発生する可能性を低減しつつも、癌巣では５−フルオロウラシルによる抗腫瘍作用を増強することができる。

ここで、この５−フルオロウラシル感受性抑制剤は、５−フルオロウラシルを投与した場合の癌細胞の死亡率を低下させる（生存率を向上させる）ものであればよく、特に限定するものではないが、例えば母集団が正規分布に従うと仮定できる場合にはパラメトリック検定であるスチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）において有意差があれば好ましい。すなわち、スチューデントのｔ検定において片側検定でｐ＜０．０５となればよく、より好ましくは片側検定でｐ＜０．０３となればよく、最も好ましくは片側検定でｐ＜０．０１となればよい。なお、スチューデントのｔ検定は特に片側検定に限定するわけではなく、両側検定で行っても良い。さらに、母集団が正規分布に従うと仮定できない場合には、ノンパラメトリック検定として、マン・ホイットニーのＵ検定などを行って有意差の有無を検定しても良い。

なお、上記の抑制剤は、いずれも５−フルオロウラシルおよびインターフェロンαの併用時における５−フルオロウラシルおよびインターフェロンαへの感受性を抑制する、抑制剤としても活用できる。後述する実施例で、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子には、５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における抗腫瘍作用を増強する効果があることが実証されているため、当業者であればＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子の発現を抑制すれば、５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における抗腫瘍作用を抑制する効果があると想定できるためである。また、当業者であればＰＲＡＫＧ２遺伝子の発現を抑制すれば、５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における抗腫瘍作用を抑制する効果があることも同様に想定できるためである。

（ｉ）ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）とは２１−２３塩基対から成る低分子二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象に関与しており、ｍＲＮＡの破壊によって配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。

そのため、本実施形態に係る５−フルオロウラシル感受性抑制剤は、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の塩基配列の一部分に対応する２１−２３塩基対を含む二本鎖ＲＮＡからなるｓｉＲＮＡを含むことが好ましい。このような二本鎖ＲＮＡからなるｓｉＲＮＡであれば、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現を効果的に抑制することができ、その結果５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を抑制する効果が得られる。

（ｉｉ）ｓｈＲＮＡ
ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）とは２１−２３塩基対から成る低分子二本鎖ＲＮＡが１つのループ構造を介して一本鎖としてつながった形のＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡもＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象に関与しており、ｍＲＮＡの破壊によって配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。

そのため、本実施形態に係る５−フルオロウラシル感受性抑制剤は、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の塩基配列の一部分に対応する２１−２３塩基対を含む二本鎖ＲＮＡが１つのループ構造を介して一本鎖としてつながった形のｓｈＲＮＡを含むことが好ましい。このようなヘアピン構造を有するｓｈＲＮＡであれば、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現を効果的に抑制することができ、その結果５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を抑制する効果が得られる。

（ｉｉｉ）アンチセンスＲＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）
アンチセンスＲＮＡとは、標的ｍＲＮＡに相補的な配列を持つアンチセンスＲＮＡである。このように標的ｍＲＮＡに相補的な配列を持つアンチセンスＲＮＡを、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズさせると、標的ｍＲＮＡが翻訳されることを妨げるので、標的ｍＲＮＡの発現を抑制することになる。なお、同様の現象は、標的ｍＲＮＡに相補的な配列を持つアンチセンスＤＮＡでも実現可能である。

そのため、本実施形態に係る５−フルオロウラシル感受性抑制剤は、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の塩基配列の少なくとも一部分（全部でもよい）に対応するアンチセンスＲＮＡを含むことが好ましい。このようなアンチセンスＲＮＡであれば、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現を効果的に抑制することができ、その結果５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を抑制する効果が得られる。なお、アンチセンスＲＮＡの代わりにアンチセンスＤＮＡを用いても良い。

＜診断薬＞
本実施形態に係る５−フルオロウラシル感受性を判定するための診断薬は、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定するための試薬を含む、診断薬である。この構成によれば、５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する作用を有することが後述する実施例において実証されているＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかの発現量を測定するための試薬を含むため、被験者の生体内におけるＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかの発現量を測定することで、被験者が５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果が効きやすい体質であるかどうか判定するための診断薬として利用できる。

ここで、診断薬の使用方法は特に限定しないが、例えば、被験者の生体内における細胞、血液、血清、体液、または病理切片等と、標準的な細胞等において、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかの発現量を検査、比較することで診断が可能である。例えば、これらの発現量が所定の閾値を超えていれば、被験者が５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果が効きやすい体質であると判定することができる。一方、これらの発現量が所定の閾値を下回れば、被験者が５−フルオロウラシルの抗腫瘍効果が効きにくい体質であると判定することができる。この閾値は、例えば健常者の発現量の平均値の１．５倍以上に設定してもよく、２倍以上に設定してもよく、５倍以上に設定してもよく、１０倍以上に設定してもよい。また、この閾値は、例えば健常者の発現量の平均値よりも標準偏差の２倍以上大きい場合に設定してもよく、標準偏差の５倍以上大きい場合に設定してもよく、標準偏差の１０倍以上大きい場合に設定してもよい。

あるいは、被験者の生体内におけるＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかの発現量が、例えば健常者の発現量に比べて有意差が認められるほど大きいかどうかで判定してもよい。有意差があるかどうかの判定としては、例えば母集団が正規分布に従うと仮定できる場合にはパラメトリック検定であるスチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）において有意差があれば好ましい。すなわち、スチューデントのｔ検定において片側検定でｐ＜０．０５となればよく、より好ましくは片側検定でｐ＜０．０３となればよく、最も好ましくは片側検定でｐ＜０．０１となればよい。なお、スチューデントのｔ検定は特に片側検定に限定するわけではなく、両側検定で行っても良い。さらに、母集団が正規分布に従うと仮定できない場合には、ノンパラメトリック検定として、マン・ホイットニーのＵ検定などを行って有意差の有無を検定しても良い。

なお、上記の診断薬は、いずれも被験者が５−フルオロウラシルおよびインターフェロンαの併用時における５−フルオロウラシルおよびインターフェロンの抗腫瘍効果が効きやすい体質であるかどうか判定するためのする、診断薬としても活用できる。後述する実施例で、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子には、５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における抗腫瘍作用を増強する効果があることが実証されているため、当業者であればＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子の発現量を測定すれば、５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における被験者の感受性を判定するために活用できると想定できるためである。また、当業者であればＰＲＡＫＧ２遺伝子の発現量を測定すれば、５−フルオロウラシル／インターフェロンαの併用時における被験者の感受性を判定するために活用できると想定できるためである。

被験者の生体内におけるＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかの発現量の測定のための試薬は、特に限定するものではないが、例えば、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を含むプローブを用いて測定することができる。この方法を用いれば、被験者の生体内におけるＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかのｍＲＮＡの発現量を好適に測定することができる。また、これらのプローブは、蛍光色素または放射性同位元素で標識されていることが好ましい。このように標識すれば簡便な方法で感度良くこれらのｍＲＮＡの発現量を測定することができる。

もっとも、被験者の生体内におけるＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかの発現量の測定のための試薬は、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子がコードする蛋白質の発現量を測定するための試薬であってもよい。具体的には、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子のコードする蛋白質に特異的に結合する抗体を好適に用いることができる。この方法を用いれば、被験者の生体内におけるＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子またはＥＸＴ１遺伝子のいずれかがコードする蛋白質の発現量を好適に測定することができる。また、これらの抗体は、蛍光色素または放射性同位元素で標識されていることが好ましい。このように標識すれば簡便な方法で感度良くこれらの蛋白質の発現量を測定することができる。

＜スクリーニング方法＞
本実施形態に係る抗癌剤の感受性増強作用を有する遺伝子のスクリーニング方法は、哺乳動物の所定の癌細胞株にリボザイムライブラリーを導入する工程と、リボザイムライブラリーが導入された癌細胞を所定の抗癌剤で処理する工程と、抗癌剤で処理された癌細胞のうち生存細胞からリボザイムを回収して新規なリボザイムライブラリーを得る工程と、を含む。すなわち、本実施形態に係る遺伝子のスクリーニング方法は、いわば「改変型ランダムリボザイム法」と言えるものである。

この「改変型ランダムリボザイム法」では、基質認識部位をランダマイズしたリボザイムライブラリーを用いて、有用な遺伝子を機能の面から探索できる方法(ジーンディスカバリーシステム)である。この「改変型ランダムリボザイム法」の概要としては、リボザイムライブラリーを細胞内で機能させ、ある着目した細胞の表現型(癌細胞への抗癌剤の感受性が抑制されるなど)が現れた細胞を回収して、そこで発現しているリボザイムの標的認識配列を解析すると、その着目した表現型と細胞内でリボザイムに切断された遺伝子の配列との関係を知ることができる。

そのため、本実施形態に係るスクリーニング方法で用いるリボザイムライブラリーとしては、標的認識配列特異的にｍＲＮＡを切断し、遺伝子発現を抑制する複数のリボザイムを含み、各リボザイムが認識する標的認識配列がランダム化された複数の配列である、ランダム化リボザイムライブラリーを用いている。本実施形態に係るスクリーニング方法では、このようなランダム化リボザイムライブラリーを用いて、上記の工程を複数回繰り返して得られるリボザイムライブラリーが認識する標的認識配列を検出する工程と、こうして検出された標的認識配列に対応する遺伝子情報をゲノムデータベースから抽出する工程と、をさらに含むため、癌細胞への抗癌剤の感受性を抑制するリボザイムライブラリーが濃縮されることになる。そして、そのリボザイムライブラリーには、癌細胞への抗癌剤の感受性を増強する遺伝子を認識する標的認識配列が含まれているので、その標的認識配列に対応する遺伝子は、まさに、癌細胞への抗癌剤の感受性を増強する遺伝子であるということになるわけである。

なお、この「改変型ランダムリボザイム法」では、各リボザイムに標識された各標的認識配列に特異的な波長を有する蛍光色素を検出する形で各リボザイムを検出してもよい。このようにすれば、蛍光色素の波長を検出するだけで、各リボザイムに標識された各標的認識配列を同定することができ、簡単に感度良くスクリーニングを行うことができる。

以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。

例えば、上記実施の形態では、ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子、そしてそれらの変異型遺伝子を中心に説明したが、特にヒト由来遺伝子に限定する趣旨ではない。すなわち、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子の由来は特に限定せず、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、またはチンパンジーであっても良い。好ましくは、マウス、ラット、サル、チンパンジー、およびヒトであり、特に好ましくはヒトである。なぜならば、ヒトであればヒトの疾患の治療や、治療薬等の開発に利用できるためである。また、マウス、ラット、サル、およびチンパンジーは、世界中で研究用のモデル動物として汎用され多くの特性が明らかになっているため、これらの生物の上記遺伝子の発現を制御することで、治療薬等の開発のために特に有用な情報が得られる。

以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜材料と方法＞
（ｉ）使用した試薬
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium粉末、10 mL 10% NaOHCO₃、
5 mL 100×glucose、10 mL 50×glutamine
PBS（-）: 137 mM NaCl、8.10 mM Na₂HPO₄・12H₂O、2.68 mM KCl、1.47 mM KH₂PO₄
Trypsin/EDTA solution: Nacalai Tesque、0.25% Trypsin、1 mM EDTA
IFN-α: 300万U/mL イントロンA（Schering-Plough Corporation）
5-FU: 協和発酵工業株式会社
TetraColor ONE: TetraColor ONE（SEIKAGAKU CORPORATION）
Solution I: 50 mM glucose、25 mM Tris pH8.0、10 mM EDTA
Solution II: 0.2 N NaOH、1% SDS
Solution III: 5 M acetic acid:5 M potassium acetate=2:3
フェノール/クロロホルム: TE飽和フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール
=25:24:1
LB培地: Nacalai Tesque
LB寒天培地: Lennox、Becton Dickinson
SOB（Mg-）培地: 10 g Bacto Tryptone、2.5 g Yeast Extract、5 mL 5% NaCl、5 mL 250 mM KCl
SOC培地: SOB（Mg-）50 mL、1 M MgCl₂ 500 mL、2 M MgSO₄ 250 μL、
1 M glucose 1 mL
RIPA Buffer: 50mM Tris-HCl（pH7.9）、150mM NaCl、1%NP-40、
0.5% Sodium Deoxycholate、0.1% SDS、
protease inhibitor（Complete: Roche）、
phosphatase inhibitor（Phos stop: Roche）
1次抗体: rabbit anti-V5 antibody（MBL）
2次抗体: horse radish peroxidase（HRP）標識 donkey anti-Rabbit IgG
（GEヘルスケア）
ウエスタン検出試薬: ECL Western Blotting Detection Reagents（GEヘルスケア）

（ｉｉ）細胞培養
ＨＣＣ細胞株は、１０ｃｍ細胞培養皿（ＦＡＬＣＯＮ）上にて、１０％ウシ胎児血清（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ，ＩＮＣ）を含むＤＭＥＭを用いて、５％ＣＯ_２、３７℃、１００％湿度下において培養した。７０〜９０％コンフルエントになった状態でＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２００μＬを加えて細胞を剥がし、１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心し細胞を回収、１ｄｉｓｈ分を４ｄｉｓｈに分けて継代した。

（ｉｉｉ）ＷＳＴ ａｓｓａｙ
「細胞培養」に示した方法によって、７０〜９０％コンフルエントになったＨＣＣ細胞株を回収し、９６穴プレート（ＦＡＬＣＯＮ）の各ｗｅｌｌに１００μＬずつ捲いた。２４時間後に５−ＦＵ及びＩＦＮ−αを加えて３７℃でインキュベートした。薬剤処理３日後に１０％ ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥ １００μＬを加え、３７℃、２時間インキュベートし、９６穴用Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＭＲＰ−Ａ４ｉ、ＴＯＳＯＨ）を用いて吸光度（測定波長４５０ｎｍ／対照波長６００ｎｍ）を測定した。測定結果は、試薬のみの吸光度との差をとり、細胞のみの吸光度とし、これを生細胞数とした。

（ｉｖ）アルカリ溶菌法
３７℃、オーバーナイトで振盪培養した大腸菌液（ＤＨ５α）１．５ｍＬを１５，０００ｒｐｍ、５分、室温で遠心分離した。上清を除去し、ペレットに１００μＬ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉを加えてボルテックスで攪拌した後、１５０μＬ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩを加えて転倒混和した。次に、２００μＬ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩを加えて転倒混和後、１５，０００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心分離した。上清回収後、３００μＬフェノール／クロロホルムを加えてボルテックスで攪拌し、１５，０００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心分離した。上清に１ｍＬ １００％エタノールを加えて転倒混和した後、１５，０００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心した。上清除去後１ｍＬ ７０％エタノールを加えて洗い、１５，０００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心した。最後に上清を除き、風乾後に滅菌水５０μＬに溶かした。

（ｖ）ランダムリボザイムライブラリーの構築
（ｖ−１）ａｔｔＢ１−ｔＲＮＡＶａｌ−ＲＲｚ−ａｔｔＢ２の構築
以下の方法でｔＲＮＡＶａｌプロモーター下流にＲＲｚを挿入した（図１）。

（ｖ−１−１）
ランダムな塩基配列をそれぞれ８、７塩基有したＲＲｚ１、ＲＲｚ２プライマーを２０ｐｍｏｌずつ用いてＰＣＲによってアニーリングし、ＲＲｚ遺伝子を合成した（図１Ａ）。ＰＣＲにはＫＯＤ Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、９４℃２分で１サイクル、９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１０秒で２０サイクル行った。

（ｖ−１−２）
合成したＲＲｚ遺伝子をテンプレートとして、ＲＲｚ３、ＲＲｚ４プライマー（表１）を３０ｐｍｏｌずつ用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにはＫＯＤ Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、９４℃２分で１サイクル、９４℃１５秒、６１℃３０秒、６８℃１０秒で２０サイクル行った。この反応によって下流にａｔｔＢ２配列を有するＲＲｚ遺伝子を合成した（図１Ａ）。

（ｖ−１−３）
１００ｐｇ ｐｉＧＥＮＥ ｔＲＮＡ ｐｕｒ（ｉＧＥＮＥ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）をテンプレートとして、ＲＲｚ５、ＲＲｚ６プライマー（表１）を１０ｐｍｏｌずつ用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにはＫＯＤ Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、９４℃２分で１サイクル、９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１０秒で２６サイクル行った。この反応によって上流にａｔｔＢ１配列を有するｔＲＮＡＶａｌプロモーターを合成した（図１Ｂ）。

（ｖ−１−４）
（ｖ−１−２）、（ｖ−１−３）の生成物をテンプレートに、ＲＲｚ４、ＲＲｚ５プライマー（表１）を１０ｐｍｏｌ用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにはＫＯＤ Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、９４℃２分で１サイクル、９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１０秒で２５サイクル行った。この反応によって上流にａｔｔＢ１配列、下流にａｔｔＢ２を有するｔＲＮＡＶａｌ−ＲＲｚを合成した（図１Ｃ）。

（ｖ−１−５）
（ｖ−１−４）のＰＣＲ終了後、ＰＣＲ反応液を電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ゲルからＤＮＡを抽出した。その後、ＮＡＰ−５ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて再度ＤＮＡを生成し、これをａｔｔＢ１−ｔＲＮＡＶａｌ−ＲＲｚ−ａｔｔＢ２とした。

（ｖｉ）ｐＥＮＴＲ−ＲＲｚの構築
３０ｎｇ ａｔｔＢ１−ｔＲＮＡＶａｌ−ＲＲｚ−ａｔｔＢ２、３００ｎｇ ｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μＬ ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を混合し、２５℃、１８時間反応させた。これによって、ａｔｔＢ１−ｔＲＮＡＶａｌ−ＲＲｚ−ａｔｔＢ２に含まれるａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２とｐＤＯＮＲ２２１に含まれるａｔｔＰ１及びａｔｔＰ２との配列間で組換え反応を行った（図１Ｄ）。その後、２μｇ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、３７℃で１０分反応させた。この反応によって作成したａｔｔＢ１−ｔＲＮＡＶａｌ−ＲＲｚ−ａｔｔＢ２を有するプラスミドをｐＥＮＴＲ−ＲＲｚとした。

（ｖｉｉ）ＲＲｚライブラリーの構築
構築したｐＥＮＴＲ−ＲＲｚ ２μＬを２００μＬのｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｉｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉに、エレクトロポレーション（２，５００Ｖ、２５μＦ、２０１ｋΩ）によって導入した。遺伝子導入後、ＳＯＣ培地を加え、２ｍＬの大腸菌液を３７℃で１時間振盪培養した。この大腸菌液のうち４μＬは５０倍希釈して、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを加えたＬＢ寒天培地（Ｌｅｎｎｏｘ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にまき、３７℃で２４時間インキュベートし、コロニー数を数え、総量２ｍＬ中の大腸菌数を求めた。残りの大腸菌液は３，５００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、ペレットを２０％グリセロールを含む５００μＬのＬＢ培地に懸濁し、グリセロールストックとして−８０℃で保存した。この作業を大腸菌数の総計が約６００万個に達するまで繰り返し行った。その後、保存していた全てのグリセロールストックを３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地１Ｌに加え、１２時間以上十分な濁度が得られるまで振盪培養した。この大腸菌よりＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡは１μｇ／μＬとなるようにＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）バッファーに溶解し、これをＲＲｚライブラリーとした。

（ｖｉｉｉ）シークエンス解析
構築したＲＲｚライブラリーから１００個のコロニーを選択し、アルカリ溶菌法によって、リボザイムプラスミドを回収した後、ＲＲｚ４、ＲＲｚ５プライマー（表１）を用いてリボザイム配列を調べた。解析には、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘを使用し、９５℃ １０秒、５０℃ ５秒、６０℃ ２分３０秒で４０サイクル反応させた。

（ｉｘ）スクリーニング
ＲＲｚライブラリーを、ＨｅｐＧ２に一過性に導入し、５μｇ／ｍＬ ５−ＦＵ処理を３日間行った。その後、細胞からプラスミドを回収し、再度ＨｅｐＧ２へと導入した。これを１サイクルとして１０回のサイクルを繰り返した（図２Ｂ）。

（ｘ）プラスミドの導入
６穴プレートに細胞を３．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ捲き、３７℃ ＣＯ_２インキュベーター内で、２４時間インキュベートした。インキュベート後、５４μＬ ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、２μｇのプラスミドＤＮＡを導入した。また、６ｃｍ細胞培養皿、９６穴プレートの場合は細胞数（５．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、３．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、ＦｕＧＥＮＥ６量（０．０５μＬ、７μＬ）、プラスミドＤＮＡ量（０．１５μＬ、２μＬ）を変更して行った。

（ｘｉ）ｓｉＲＮＡの導入
９６穴プレートに細胞を５．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ捲き、３７℃ＣＯ_２インキュベーター内で、２４時間インキュベートした。インキュベート後、０．２μＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、４ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを導入した。

（ｘｉｉ）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＲＴ反応には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。０．５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして使用し、ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして、６５℃ ５分で１サイクル、４２℃ １２０分、７０℃ １０分で１サイクル反応させ、ｃＤＮＡを合成した。反応後のｃＤＮＡは２０倍希釈してＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲに用いた。

（ｘｉｉｉ）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ反応には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲによって合成したｃＤＮＡ ５μＬをテンプレートとして使用し、各遺伝子に対するプライマーを用いて反応させた。

（ｘｖ）Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ
（ｘｖ−１）タンパク質回収
ＨＣＣ細胞株（ＨＬＦ、ＨｕＨ７、ＨｅｐＧ２）を３．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ−ｄｉｓｈ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ずつ捲き、２４時間後に遺伝子導入を行った。遺伝子導入４８時間後に１×ＰＢＳ（−）で２回ｗａｓｈし、ＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒを加え、セルスクレイパー（住友ベークライト）で細胞を回収した。回収した細胞を１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清をｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に使用した。

（ｘｖ−２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
回収した上清に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）により分離した。泳動条件は、２０ｍＡで２時間行った。泳動後のゲルは、セミドライ式トランスファー装置を用いて、１００ｍＡ、１時間反応させ、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅメンブレンに転写した。

（ｘｖ−３）Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ
５％スキムミルク（雪印）／ＴＢＳ−０．１％Ｔでブロッキングを行った後、抗Ｖ５抗体（１：３，０００）を用いて室温で１時間、１次抗体反応を行った。反応終了後、メンブレンをＴＢＳ−０．１％Ｔで３回ｗａｓｈした。次に、ＨＲＰ標識 ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗体（１：５，０００）を使用して室温で１時間、２次抗体反応を行った。反応終了後、ＴＢＳ−０．１％Ｔで３回ｗａｓｈした。その後、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ及びＬＡＳ−１０００ ｓｙｓｔｅｍ（ＦＵＪＩ ＦＩＬＭ）を用いて、バンドを検出した。

＜実施例１：５−ＦＵ感受性の増感遺伝子のスクリーニング＞
本実施例では、より奏功率の高い新規治療法開発によるＨＣＣ患者の長期予後改善を目的とし、高度進行型ＨＣＣ患者におけるＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法感受性増強による治療効果増強を目指し、ＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法感受性に寄与する遺伝子の同定を行った。その結果、複数の感受性増強遺伝子を同定した。

感受性増強遺伝子のスクリーニングには、標的認識配列特異的にｍＲＮＡを切断し、遺伝子発現を抑制するＲＮＡ酵素であるリボザイム（図２Ａ）によるライブラリーを使用した。このライブラリーはリボザイムの認識配列をランダムに６００万通り有しており、網羅的な遺伝子発現抑制が可能である（図２Ｂ）。

構築したライブラリーを用いて以下のスクリーニングを行った（図２Ｃ）。ヒトＨｅｐＧ２細胞株において、作製したリボザイムライブラリー導入後に５−ＦＵ単剤で処理を行い、５０％増殖抑制濃度での５−ＦＵへの抵抗性の増強を指標にスクリーニングを行った。３日間の薬剤処理後、生存細胞からリボザイムを回収し、ＨｅｐＧ２細胞への再導入を繰り返した。最終的に得られたリボザイムの認識配列から、ＢＬＡＳＴを用いて候補遺伝子を抽出した。同定した遺伝子については、アデノウイルスによる強制発現系を用いて、５−ＦＵ単独、及びＩＦＮ−α／５−ＦＵ感受性増強作用を検討した。１０回のスクリーニングを行い、５−ＦＵへの抵抗性は回を増す毎に増加した（図３）。

このライブラリー中のリボザイムが有する標的認識配列をもとに、ＢＬＡＳＴによって５−ＦＵ感受性に寄与する遺伝子を５遺伝子（表１：ＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１、ＰＯＬＲ４Ｊ２、ＦＯＸＰ２）に絞り込んだ。

このうち、偽遺伝子であるＰＯＬＲ２Ｊ４、および発現が確認できなかったＦＯＸＰ２を除外し、残りの３遺伝子（ＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１）についてさらに検討した。

＜実施例２：５−ＦＵ感受性の確認およびＩＦＮ−α／５−ＦＵ感受性の検討＞
ＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１のｓｉＲＮＡを作成した。

これらのｓｉＲＮＡを用いてＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１の遺伝子発現を抑制すると、５−ＦＵに対する感受性が３遺伝子全てで有意に減少した（図４Ａ）。なぜなら、ＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１を標的とするｓｉＲＮＡを投与すると、ＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１の遺伝子発現が抑制されて、その結果５−ＦＵに対する感受性が抑制されるためである（図４Ｂ）。

また、ＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１の強制発現用のアデノウイルスベクターおよびコントロールアデノウイルスベクターをそれぞれ作成した（図５、図６）。これらのベクターを用いて３遺伝子の強制発現を行うことにより、ＨｅｐＧ２細胞中にＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１の遺伝子がコードする蛋白質がそれぞれ過剰発現した（図７）。

また、これらのベクターを用いて３遺伝子の強制発現を行うことにより、５−ＦＵへの感受性は有意に増加した（図８Ａ）。なぜなら、ＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１を過剰発現するアデノウイルスベクターを投与すると、ＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１の遺伝子発現が過剰発現されて、その結果５−ＦＵに対する感受性が増強されるためである（図４Ｂ）。さらに、これらのうち２遺伝子（ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１）はＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用時においても、ＩＦＮ−α／５−ＦＵへの感受性を有意に増強した（図８Ｂ）。

＜実施例３：ＩＦＮ−α／５−ＦＵ感受性のｉｎ ｖｉｖｏでの確認＞
以下の条件でマウスにＴＧＦＢＲ２の強制発現用のアデノウイルスベクターを腹腔内注射することによって投与し、ＩＦＮ−α／５−ＦＵの感受性の変化を観察した（図９）。

Mouse: male BALB/cAJcl-nu/nu
Xenograft cell line: HepG2 (5×106 cells)
Drug concentration: 15 mg/kg/day 5-FU (i.p.)
10,000 units/body IFN-α (s.c.)
Administration time: 1 time/3 days
Tumor volume (TV) calculation: measure 1/week using calipers
(TV=Length×(Width)2/2)
Adenovirus: 2×108 pfu 1 time/5 days

＜実施例４：ＴＧＦＢＲ２，ＥＸＴ１過剰発現による５−ＦＵ及びＩＦＮ−α／５−ＦＵ誘導性アポトーシスの増強の確認＞
（４−１）ヘキスト染色
ＴＧＦＢＲ２，ＥＸＴ１過剰発現による５−ＦＵ及びＩＦＮ−α／５−ＦＵ誘導性アポトーシスの増強を確認するために、以下の手順でヘキスト染色を行った。まず、ＨｅｐＧ２へのアデノウイルス感染によるＬａｃＺ、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１遺伝子過剰発現後、５μｇ／ｍＬ ５−ＦＵ及び２００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ−α処理を行った。４８時間後、１０μＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を添加し、１時間後に蛍光顕微鏡による観察を行った。観察結果として、蛍光顕微鏡写真を図１０ａに示す。

この実験では、ヘキスト染色でクロマチンの凝集の様子を観察し、クロマチンの凝集が見られればアポトーシスが亢進していると解釈する。図１０ａの実験結果を見ると、明らかに、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した上で、ＴＧＦＢＲ２又はＥＸＴ１を過剰発現させた場合には、クロマチンの凝集が見られるためアポトーシスが亢進していることが明らかである。

（４−２）カスパーゼ３／７活性化測定
ＴＧＦＢＲ２，ＥＸＴ１過剰発現による５−ＦＵ及びＩＦＮ−α／５−ＦＵ誘導性アポトーシスの増強を確認するために、以下の手順でカスパーゼ３／７活性化測定を行った。まず、ＬａｃＺ、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１発現細胞（ＨｅｐＧ２）に対して５μｇ／ｍＬ ５−ＦＵ及び２００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ−α処理を行った。４８時間後にＣａｐｓａｐｓｅ−Ｇｌｏ３／７ ａｓｓａｙ ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ）付属のマニュアルに従い、カスパーゼ３及び７活性を測定した。測定結果をグラフにまとめて図１０ｂに示す。

この実験では、アポトーシスを起こすカスパーゼカスケードにおけるエフェクターであるカスパーゼ３とカスパーゼ７の活性を測定し、カスパーゼ３とカスパーゼ７の活性が上昇すればアポトーシスが亢進していると解釈する。図１０ｂの実験結果を見ると、明らかに、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した上で、ＴＧＦＢＲ２又はＥＸＴ１を過剰発現させた場合には、カスパーゼ３とカスパーゼ７の活性が有意に上昇しているためアポトーシスが亢進していることが明らかである。

なお、図１０の＊印は、ｔ検定（ｎ＝３）においてｐ＜０．０５（両側検定）であることを意味している。また、図１０の＋印は、対応するコントロールの測定結果に対してｔ検定（ｎ＝３）においてｐ＜０．０５（両側検定）であることを意味している。さらに、図１０の＋＋印は、対応するコントロールの測定結果に対してｔ検定（ｎ＝３）においてｐ＜０．０１（両側検定）であることを意味している。これらの＊、＋、＋＋の意味は、図１１〜図１３でも同様である。また、ｎ＝３であることは、図１１〜図１３でも同様である。

＜実施例５：ＴＧＦＢＲ２過剰発現によるＴＧＦ−βシグナル活性化及びアポトーシス関連タンパク発現の変化の確認＞
（５−１）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＲＴ） Ｒｅａｃｔｉｏｎ
ＴＧＦＢＲ２過剰発現によるＴＧＦ−βシグナル活性化について検討するために、以下の手順でｃＤＮＡ合成を行った。まず、ＬａｃＺ、ＴＧＦＢＲ２発現細胞（ＨｅｐＧ２）に対して５μｇ／ｍＬ ５−ＦＵ及び２００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ−α処理を行った。薬剤処理４８時間後にＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＲＴ反応には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。０．５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして使用し、ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして、６５℃５分で１サイクル、４２℃１２０分、７０℃１０分で１サイクル反応させ、ｃＤＮＡを合成した。反応後のｃＤＮＡは２０倍希釈してＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲに用いた。

（５−２）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ
次いで、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ反応には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲによって合成したｃＤＮＡ ５μＬをテンプレートとして使用し、ＴＧＦβ１の遺伝子に対するプライマーを用いて、反応を行った。測定結果をグラフにまとめて図１１ａに示す。

この実験では、アポトーシスを起こすＴＧＦβ１のｍＲＮＡ発現量を測定し、ＴＧＦβのｍＲＮＡ発現量が上昇すればＴＧＦ−βが関係するシグナル伝達経路を介してアポトーシスが亢進していると解釈している。実験結果を見ると、対応するコントロールの測定結果に比べて、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した場合にはＴＧＦβ１のｍＲＮＡ発現量が有意に上昇している。このことから、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵによる薬剤処理によって、ＴＧＦ−βが関係するシグナル伝達経路を介してアポトーシスが亢進していることが明らかである。しかしながら、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した上で、ＴＧＦＢＲ２を過剰発現させた場合にも特に、ＴＧＦβ１のｍＲＮＡ発現量が有意には上昇していない。そのため、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した上で、ＴＧＦＢＲ２を過剰発現させた場合にＴＧＦ−βが関係するシグナル伝達経路を介してアポトーシスがさらに亢進されるかどうかは不明である。

なお、図１１の＊印は、ｔ検定（ｎ＝３）においてｐ＜０．０５（両側検定）であることを意味している。また、図１１のＮ．Ｓ．印は、ｔ検定（ｎ＝３）において有意差なし（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔの略）であることを意味している。この＊、Ｎ．Ｓ．の意味は、図１２〜図１３でも同様である。

（５−３）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ
ＴＧＦＢＲ２過剰発現によるＴＧＦ−βシグナル活性化について検討するために、以下の手順でＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙを行った。まず、レポーター遺伝子ｐ３ＴＰ−Ｌｕｘ及び内部コントロール遺伝子としてｐｈＲＬ−ＴＫをＦｕＧＥＮＥ６により一過性に導入したＨｅｐＧ２細胞に対し、５ＦＵＳＧｓ過剰発現アデノウイルス感染させた。感染２４時間後にＤＭＳＯ； Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）、５μｇ／ｍＬ ５−ＦＵ、２００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ−αでそれぞれ処理し、薬剤処理４８時間後にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ蛍光を検出した。グラフの各数値は、内部コントロールで補正した上で、薬剤未処理ＬａｃＺ過剰発現群の値を１としている。測定結果をグラフにまとめて図１１ｂに示す。

この実験では、アポトーシスを起こすＴＧＦ−βのレポーターベクターであるｐ３ＴＰ−Ｌｕｘから発現するホタルルシフェラーゼの活性を測定し、ホタルルシフェラーゼの活性が上昇すれば、ＴＧＦ−βの転写活性が上昇しており、ＴＧＦ−βが関係するシグナル伝達経路を介してアポトーシスが亢進していると解釈している。ここで、ｐ３ＴＰ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、ＴＧＦ−βによって選択的に誘導されるＰＡＩ−１プロモーターの−７４０／−６３６領域にヒトコラゲナーゼ遺伝子由来の三つのＴＲＥエレメント（Ｓｍａｄを介して活性化されるＴＧＦ−βファミリーの一つａｃｔｉｖｉｎ経路に特異的なエレメント）を結合させた配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子が接続されている。そのため、ＴＧＦ−βの転写活性が上昇すると、ｐ３ＴＰ−Ｌｕｃレポータープラスミドからのホタルルシフェラーゼの過剰発現が誘導されるためである。実験結果を見ると、明らかに、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した上で、ＴＧＦＢＲ２を過剰発現させた場合には、ホタルルシフェラーゼの活性が有意に上昇しているため、ＴＧＦ−βの転写活性が上昇していることが明らかである。すなわち、ＴＧＦ−βが関係するシグナル伝達経路を介してアポトーシスが亢進していることが明らかである。

（５−４）Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ
ＴＧＦＢＲ２過剰発現によるアポトーシス関連タンパク質の発現の変化について検討するために、以下の手順でＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔを行った。

＜タンパク質回収＞
ＨｅｐＧ２を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ−ｄｉｓｈずつ捲き、５時間後にアデノウイルスによるＴＧＦＢＲ２の遺伝子導入を行った。遺伝子導入１９時間後に５μｇ／ｍＬ ５−ＦＵ及び２００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ−α処理を行った。４８時間後、１×ＰＢＳ（−）で２回ｗａｓｈし、ＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒを加え、セルスクレイパーで細胞を回収した。回収した細胞を１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清をｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に使用した。

＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
回収した上清に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。泳動条件は、２０ｍＡで２時間行った。泳動後のゲルは、セミドライ式トランスファー装置を用いて、１００ｍＡ、１時間反応させ、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅメンブレンに転写した。

＜Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ＞
５％スキムミルク／ＴＢＳ−０．１％Ｔでブロッキングを行った後、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬ、ＡＣＴの各遺伝子のコードするタンパク質に対する抗体を用いて４℃でオーバーナイト、１次抗体反応を行った。反応終了後、メンブレンをＴＢＳ−０．１％Ｔで３回ｗａｓｈした。次に、各１次抗体に対するＨＲＰ標識２次抗体（１：３，０００）を使用して室温で１時間、２次抗体反応を行った。反応終了後、ＴＢＳ−０．１％Ｔで３回ｗａｓｈした。その後、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｇｅｎｔｓ及びＬＡＳ−４０００ ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬ、ＡＣＴのバンドを検出した。測定結果を電気泳動写真として図１１ｃに示す。

この実験では、ＢＡＸの発現量が増大しており、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬの発現量が減少していれば、アポトーシスが亢進していると解釈している。ここで、Ｂａｘは細胞質に存在するが、ｄｅａｔｈシグナルに従ってミトコンドリアへと移動し、そこでシトクロムｃの放出を促進し、アポトーシスを誘導する。また、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬは、ミトコンドリア外壁に存在し、シトクロムｃの放出を抑制して、アポトーシスを抑制する。そのため、ＢＡＸの発現量が増大しており、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬの発現量が減少していれば、アポトーシスが亢進していると解釈できる。実験結果を見ると、明らかに、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した上で、ＴＧＦＢＲ２を過剰発現させた場合には、ＢＡＸの発現量が増大しており、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬの発現量が減少しているため、アポトーシスが亢進していることが明らかである。なお、コントロールであるＡＣＴ（アクチン）の発現量は特に変化が見られない。

＜実施例６：ＥＸＴ１過剰発現によるアポトーシス亢進に対するＥＲストレスの関与の確認＞
（６−１）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ
ＥＸＴ１過剰発現によるアポトーシス亢進に対するＥＲストレスの関与について検討するために、実施例５の場合と同様の手法でＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを行った。測定結果をグラフにまとめて図１２ａおよび図１２ｂに示す。

この実験では、アポトーシスを引き起こすＥＲストレスに応答して発現量が増大することが知られているＤＤＩＴ３（ＣＨＯＰ）のｍＲＮＡ発現量およびＨＳＰＡ５（ＢＩＰ）のｍＲＮＡ発現量を測定し、ＤＤＩＴ３（ＣＨＯＰ）およびＨＳＰＡ５（ＢＩＰ）のｍＲＮＡ発現量が上昇すればアポトーシスを引き起こすＥＲストレスが増大していると解釈している。実験結果を見ると、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した上で、ＥＸＴ１を過剰発現させた場合、ＤＤＩＴ３（ＣＨＯＰ）およびＨＳＰＡ５（ＢＩＰ）のｍＲＮＡ発現量が有意に上昇している。そのため、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した上で、ＥＸＴ１を過剰発現させた場合にアポトーシスを引き起こすＥＲストレスが増大していることが明らかである。

（６−２）Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ
ＥＸＴ１過剰発現によるアポトーシス関連タンパク質の発現の変化について検討するために、実施例５の場合と同様の手法でＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔを行った。測定結果を電気泳動写真として図１２ｃに示す。

この実験では、アポトーシスを引き起こすＥＲストレスに応答して発現量が増えるＡＴＦ４の発現量を測定し、ＡＴＦ４の発現量が上昇すればアポトーシスを引き起こすＥＲストレスが増大していると解釈する。実験結果を見ると、明らかに、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した上で、ＥＸＴ１を過剰発現させた場合には、ＡＴＦ４の発現量が増大しているため、アポトーシスを引き起こすＥＲストレスが増大していることが明らかである。なお、コントロールであるＡＣＴ（アクチン）の発現量は特に変化が見られない。

＜実施例７：ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１過剰発現によるヒト肝癌モデルマウスへの効果＞
ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１過剰発現によるヒト肝癌モデルマウスへの効果を確認するために、以下の手順でＩｎ Ｖｉｖｏ実験を行った。まず、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス皮下にヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２；６．８×１０^６個／マウス）を移植した。移植約３週後に、腫瘍部へＬａｃＺ、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１遺伝子をアデノウイルスを用いて直接導入した。アデノウイルス感染後１日後から、２０，０００Ｕ／ｂｏｄｙ／ｄａｙ ＩＦＮ−αを皮下注射、３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ ５−ＦＵを腹腔内注射によって投与した。また、アデノウイルス、薬剤処理は３日ごとに行い、腫瘍径は、７日ごとにデジタルノギスを用いて長径と単径を測定し、以下の計算式によって求めた。腫瘍径（ＴＶ）＝長径×（短径）^２／２。実験結果をまとめてグラフとして図１３に示す。

この実験では、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト肝癌モデルマウスに投与した場合に、腫瘍サイズの増加を抑制できれば、肝癌に対する抗腫瘍効果が得られていることを示す薬理データであると解釈する。実験結果を見ると、明らかに、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した上で、ＴＧＦＢＲ２およびＥＸＴ１を過剰発現させた場合には、腫瘍サイズの増加が有意に抑制されており、抗腫瘍効果が実証されている。

＜実施例８：肝癌患者におけるＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１の発現＞
ＨＣＣ患者におけるＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１のｍＲＮＡ発現を検討するために、以下の手順でｍＲＮＡ発現の解析を行った。まず、非Ｂ非Ｃ、Ｂ型、Ｃ型のＨＣＣ患者の癌部、非癌部それぞれ７、７、２７症例より採取した組織よりＲＮＡを回収した。次いで、これらのＲＮＡのサンプルを用いて、上記の実施例５および実施例６と同様の手法によって、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法によりＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１のｍＲＮＡ発現を解析した。

この実験では、非Ｂ非Ｃ、Ｂ型、Ｃ型の肝癌患者の癌部、非癌部でのＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２およびＥＸＴ１のｍＲＮＡ発現量を測定した結果、Ｂ型の肝癌患者の癌部では非癌部に比べて有意にＴＧＦＢＲ２のｍＲＮＡ発現量が減少していることが判明した。また、非Ｂ非Ｃ型の肝癌患者の癌部では非癌部に比べて有意にＥＸＴ１のｍＲＮＡ発現量が減少していることが判明した。なお、図１４の＊印は、対応のあるｔ検定（Ｐａｉｒｅｄ−ｔ−ｔｅｓｔ）においてｐ＜０．０５（両側検定）であることを意味している。また、図１４の＊＊印は、対応のあるｔ検定（Ｐａｉｒｅｄ−ｔ−ｔｅｓｔ）においてｐ＜０．０１（両側検定）であることを意味している。

そのため、Ｂ型の肝癌患者の癌部において、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した上で、ＴＧＦＢＲ２を過剰発現させた場合には、特に抗腫瘍効果が増大する可能性が示唆される。また、非Ｂ非Ｃ型の肝癌患者の癌部において、５−Ｆｕ単独又はＩＦＮ−ａ／５−ＦＵを添加した上で、ＥＸＴ１を過剰発現させた場合には、特に抗腫瘍効果が増大する可能性が示唆される。

＜結果の考察＞
以上の結果より、ランダムリボザイムライブラリーを用いたファンクショナルスクリーニングによって同定した５−ＦＵ感受性寄与遺伝子（５ＦＵＳＧｓ：ＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１）の強制発現によって、５−ＦＵ感受性を増強されたことが分かる。すなわち、本研究で同定した３遺伝子（ＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１）は、５−ＦＵ単独及びＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用時の感受性を増強することが示された。

また、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１のアデノウイルスベクターによる過剰発現は、ＨｅｐＧ２細胞のＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法の感受性をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増強した。さらに、ＴＧＦＢＲ２のアデノウイルスベクターによる過剰発現は、マウスの腫瘍組織のＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法への感受性をｉｎ ｖｉｖｏにおいて増強した。そのため、これらの遺伝子を使用することによって、５−ＦＵ単独、ＩＦＮ−α／５−ＦＵ併用療法が適応されている種々の悪性腫瘍患者の長期予後改善が期待される。

また、５−ＦＵおよびＩＦＮ−α／５−ＦＵは、種々の悪性腫瘍に使用されている抗がん剤であるため、ＰＲＫＡＧ２、ＴＧＦＢＲ２、ＥＸＴ１の３種類の遺伝子は、進行型肝細胞癌のみでなく、他の悪性腫瘍に対しても抗癌剤の増感剤として有効である可能性が期待される。

以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

Claims (29)

1. ５−フルオロウラシル感受性増感剤であって、
   ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子をコードするヌクレオチド断片を含む、増感剤。
2. 請求項１記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
   前記ＰＲＡＫＧ２遺伝子が、
   （ａ）ヒト野生型ＰＲＡＫＧ２遺伝子、および
   （ｂ）（ａ）の遺伝子の変異型遺伝子であって、哺乳動物細胞における５−フルオロウラシル感受性を増強させる遺伝子、
   を含む、増感剤。
3. 請求項２記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
   前記変異型遺伝子が、
   （ｂ−１）（ａ）の遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる変異型遺伝子、
   （ｂ−２）（ａ）の遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる変異型遺伝子、
   （ｂ−３）（ａ）の遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする基配列からなる変異型遺伝子、
   （ｂ−４）（ａ）の遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる変異型遺伝子、
   を含む、増感剤。
4. 請求項１記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
   前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子が、
   （ｃ）ヒト野生型ＴＧＦＢＲ２遺伝子、および
   （ｄ）（ｃ）の遺伝子の変異型遺伝子であって、哺乳動物細胞における５−フルオロウラシル感受性を増強させる遺伝子、
   を含む、増感剤。
5. 請求項４記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
   前記変異型遺伝子が、
   （ｄ−１）（ｃ）の遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる変異型遺伝子、
   （ｄ−２）（ｃ）の遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる変異型遺伝子、
   （ｄ−３）（ｃ）の遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする基配列からなる変異型遺伝子、
   （ｄ−４）（ｃ）の遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる変異型遺伝子、
   を含む、増感剤。
6. 請求項１記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
   前記ＥＸＴ１遺伝子が、
   （ｅ）ヒト野生型ＥＸＴ１遺伝子、および
   （ｆ）（ｅ−１）の遺伝子の変異型遺伝子であって、哺乳動物細胞における５−フルオロウラシル感受性を増強させる遺伝子、
   を含む、増感剤。
7. 請求項６記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
   前記変異型遺伝子が、
   （ｆ−１）（ｅ）の遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる変異型遺伝子、
   （ｆ−２）（ｅ）の遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる変異型遺伝子、
   （ｆ−３）（ｅ）の遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする基配列からなる変異型遺伝子、
   （ｆ−４）（ｅ）の遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる変異型遺伝子、
   を含む、増感剤。
8. ５−フルオロウラシル感受性増感剤であって、
   ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を発現するベクターを含む、増感剤。
9. 請求項８記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
   前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、
   増感剤。
10. ５−フルオロウラシル感受性増感剤であって、
    ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子のコードする蛋白質を含む、増感剤。
11. 請求項１０記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
    前記ＰＲＡＫＧ２遺伝子のコードするＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼが、
    （ｇ）ヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼ、および
    （ｈ）（ｇ）の変異型キナーゼであって、哺乳動物細胞における５−フルオロウラシル感受性を増強させるキナーゼ、
    を含む、増感剤。
12. 請求項１１記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
    前記変異型キナーゼが、
    （ｈ−１）（ｇ）のヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼのアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列からなる変異型キナーゼ、
    （ｈ−２）（ｇ）のヒト野生型ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる変異型キナーゼ、
    （ｈ−３）（ａ）の遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列がコードするアミノ酸配列からなる変異型キナーゼ、
    を含む、増感剤。
13. 請求項１０記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
    前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のコードするＴＧＦ−β２型受容体が、
    （ｉ）ヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体、および
    （ｊ）（ｉ）の変異型受容体であって、哺乳動物細胞における５−フルオロウラシル感受性を増強させる受容体、
    を含む、増感剤。
14. 請求項１３記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
    前記変異型受容体が、
    （ｊ−１）（ｉ）のヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列からなる変異型受容体、
    （ｊ−２）（ｉ）のヒト野生型ＴＧＦ−β２型受容体のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる変異型受容体、
    （ｊ−３）（ｃ）の遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列がコードするアミノ酸配列からなる変異型受容体、
    を含む、増感剤。
15. 請求項１０記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
    前記ＥＸＴ１遺伝子のコードする小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素が、
    （ｋ）ヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素、および
    （ｌ）（ｋ）の変異型糖転移酵素であって、哺乳動物細胞における５−フルオロウラシル感受性を増強させる糖転移酵素、
    を含む、増感剤。
16. 請求項１５記載の５−フルオロウラシル感受性増感剤において、
    前記変異型糖転移酵素が、
    （ｌ−１）（ｋ）のヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列からなる変異型糖転移酵素、
    （ｌ−２）（ｋ）のヒト野生型小胞体内在性ＩＩ型膜貫通糖転移酵素のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる変異型糖転移酵素、
    （ｌ−３）（ｅ）の遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列がコードするアミノ酸配列からなる変異型糖転移酵素、
    を含む、増感剤。
17. 請求項１に記載の増感剤において、
    ５−フルオロウラシルおよびインターフェロンαの併用時における５−フルオロウラシルおよびインターフェロンαへの感受性を増強する、増感剤。
18. 請求項１に記載の増感剤において、
    注射剤である、増感剤。
19. 抗癌剤キットであって、
    請求項１に記載の増感剤と、
    ５−フルオロウラシルと、
    を含む、キット。
20. 請求項１９記載の抗癌剤キットであって、
    さらにインターフェロンαを含む、キット。
21. ５−フルオロウラシル感受性抑制剤であって、
    ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを含む、抑制剤。
22. ５−フルオロウラシル感受性を判定するための診断薬であって、
    ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定するための試薬を含む、診断薬。
23. 請求項２２記載の診断薬において、
    前記試薬が、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を含むプローブである、診断薬。
24. 請求項２３記載の診断薬において、
    前記プローブが蛍光色素または放射性同位元素で標識されている、診断薬。
25. ５−フルオロウラシル感受性を判定するための診断薬であって、
    ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子がコードする蛋白質の発現量を測定するための試薬を含む、診断薬。
26. 請求項２５記載の診断薬において、
    前記試薬が、ＰＲＡＫＧ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ２遺伝子およびＥＸＴ１遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子のコードする蛋白質に特異的に結合する抗体である、診断薬。
27. 請求項２６記載の診断薬において、
    前記抗体が蛍光色素または放射性同位元素で標識されている、診断薬。
28. 抗癌剤の感受性増強作用を有する遺伝子のスクリーニング方法であって、
    （ｍ）哺乳動物の所定の癌細胞株にリボザイムライブラリーを導入する工程と、
    （ｎ）前記リボザイムライブラリーが導入された癌細胞を所定の抗癌剤で処理する工程と、
    （ｏ）前記抗癌剤で処理された癌細胞のうち生存細胞からリボザイムを回収して新規なリボザイムライブラリーを得る工程と、
    を含み、
    前記リボザイムライブラリーが、標的認識配列特異的にｍＲＮＡを切断し、遺伝子発現を抑制する複数のリボザイムを含み、各リボザイムが認識する標的認識配列がランダム化された複数の配列である、ランダム化リボザイムライブラリーであり、
    （ｐ）前記（ｍ）、（ｎ）および（ｏ）の工程を複数回繰り返して得られるリボザイムライブラリーが認識する標的認識配列を検出する工程と、
    （ｑ）前記検出された標的認識配列に対応する遺伝子情報をゲノムデータベースから抽出する工程と、
    をさらに含む、スクリーニング方法。
29. 請求項２８記載のスクリーニング方法において、
    前記（ｐ）の工程が、各リボザイムに標識された各標的認識配列に特異的な波長を有する蛍光色素を検出する工程を含む、
    スクリーニング方法。