JP2001136979A - 癌化学療法剤効果増強遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】腫瘍細胞の癌化学療法剤に対する感受性を増強
させる新規DNAを提供する。 【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ： （ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細
胞に対する癌化学療法剤の効果を増強する活性を有する
ＤＮＡ等に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞に対する癌化
学療法剤の効果を増強する活性を有する新規蛋白質、該
蛋白質をコードするＤＮＡ、細胞に対する癌化学療法剤
の効果を増強する活性を有する新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを
含むベクター、該ベクターを導入された腫瘍細胞等の宿
主、該腫瘍細胞を用いた癌化学療法剤またはその増強剤
の検索方法等に関する。

【０００２】

【従来の技術】アポトーシスまたはプログラムされた細
胞死は、全動物において進化的に保存されている、正常
で生理学的な細胞の自殺プログラムである。この遺伝子
によって調節されているプログラムは、発生およびホメ
オスタシスにおいて重要な役割を果たしている。アポト
ーシスにおいては細胞表面の湾曲、核クロマチンの凝
縮、染色体ＤＮＡの断片化等の現象が特徴的に観察され
る。

【０００３】アポトーシス経路の調節異常は、癌、自己
免疫疾患、ウイルス感染、神経変性性疾患およびAIDSな
どのヒトの種々の疾患に関わっている（Thompson, C.
B., Science,267:1456-1462, 1995）。アポトーシスは
また、腫瘍発生を直接制御していること、多くの腫瘍細
胞は正常のアポトーシスのメカニズムが崩れ、プログラ
ム細胞死が阻止されていることが報告されている（Will
iams, G. T., Cell, 65:1097-1098, 1991; Kerr, J.
F., Winterford, C.M., Harmon, B. V., Cancer, 73:20
13-2026, 1994）。in vitro、in vivoおよび臨床的に、
化学療法剤が腫瘍細胞にアポトーシスによる細胞死を誘
起すること（Kaufmann, S. H., Cancer Res., 49:5870-
5878, 1989; Meyn, R.E., Stephens, L. C., Hunter,
N. R., Milas,L., Cancer Chem. & Pharm.,33:410-414,
1994; Gorczyca, W., Bigman, K., Mittelman, A., Ah
med, T., Gong,J., Melamed, M. R., Darzynkiewicz,
Z., Leukemia, 7:659-670, 1993）が報告されており、
癌の進展においてだけでなく、癌治療においてもアポト
ーシスが重要な役割を果たしていることが示唆されてい
る（Fisher, D. E., Cell, 78:539-542, 1994; Hannun,
Y. A., Blood, 89:1845-1853, 1997）。すなわち、腫
瘍細胞に対し癌化学療法剤に対する感受性を増強させる
化合物が得られれば、このような化合物は腫瘍細胞にア
ポトーシスを誘導することができ、癌に対する有効な治
療薬となる。

【０００４】一方、腫瘍細胞に導入して発現させること
により癌化学療法剤の効果を増強する遺伝子としては、
野生型p53遺伝子が知られている。野生型p53遺伝子を導
入された細胞はシスプラチンなどのDNA傷害性を持つ癌
化学療法剤に対する感受性が増す（Fujiwara, T., et a
l., Cancer Res. 54:2287-2291, 1994）。これは、p53
遺伝子導入によって腫瘍細胞が癌化学療法剤誘発性のア
ポトーシスを起こしやすくなったためであると考えられ
ている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、マウス
NIH3T3細胞より新規DNAを取得し、該DNAを再度NIH3T3細
胞に導入したところ、細胞中で、ある蛋白質の発現が阻
害される結果、該細胞の癌化学療法剤に対する抵抗性が
現れることを見出した。すなわち、本発明のＤＮＡ又は
蛋白質はNIH3T3細胞の癌化学療法剤に対する感受性を著
しく増強させる効果があることを見出し、本発明を完成
した。

【０００６】すなわち、本発明は、腫瘍細胞に対する癌
化学療法剤の効果を増強する活性を有する新規DNA等に
関する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、 （１）以下の(a)または(b)の蛋白質： （ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むことからなる蛋
白質、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において1若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつ、細胞に対する癌化学療法剤
の効果を増強する活性を有する蛋白質に関し、 さら
に、これら蛋白質のアミノ酸配列中の少なくとも１００
個の連続したアミノ酸配列からなり、細胞に対する癌化
学療法剤の効果を増強する活性を有する蛋白質に関する
ものである。また本発明は、上記本発明に係る蛋白質に
対するモノクローナル抗体を提供するものである。

【０００８】本発明は、また、 （２） （１）記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、 （３） 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ： （ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細
胞に対する癌化学療法剤の効果を増強する活性を有する
ＤＮＡに関し、さらに、 別の観点において、本発明
は、配列番号１のヌクレオチド配列と９５％以上の相同
性を有するヌクレオチド配列を含むことから成り、かつ
細胞に対する癌化学療法剤の効果を増強する活性を有す
るＤＮＡに関する。また、本発明は、上記のDNAのヌク
レオチド配列中の少なくとも３００個の連続したヌクレ
オチド配列からなり、かつ細胞に対する癌化学療法剤の
効果を増強する活性を有するDNA断片に関する。

【０００９】更にまた、本発明は、上記のDNAまたはそ
の断片に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関す
る。

【００１０】本発明は、また、 （４） （２）または（３）記載のＤＮＡを含むことか
らなるベクター、 （５） （４）記載のベクターを導入された宿主、 （６） 大腸菌ＤＨ５α−ＴＡＳＰ ＳＡＮＫ７１２９
９株（FERM BP-6850）である（５）記載の宿主、 （７） 腫瘍細胞である（５）記載の宿主、 （８） （７）記載の宿主を被検物質存在下で培養し、
該被検物質の該宿主に対する毒性効果を測定することを
特徴とする、癌化学療法剤の検索方法、 （９） 腫瘍細胞を被検物質存在下で培養し、該腫瘍細
胞中における、配列番号１のヌクレオチド配列とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするｍRNAの発現
量を測定することを特徴とする、癌化学療法剤の増強剤
の検索方法、等に関する。

【００１１】さらに本発明は、 （１０）以下の(a)または(b)の蛋白質： （ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むことからなる
蛋白質、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において1
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつ、細胞に対する癌化学療
法剤の効果を増強する活性を有する蛋白質、 （１１）（１０）記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、 （１２）以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ： （ａ）配列番号９のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号９のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細
胞に対する癌化学療法剤の効果を増強する活性を有する
ＤＮＡ、 （１３）（１１）または（１２）記載のＤＮＡを含むこ
とからなるベクター、 （１４）（１３）記載のベクターを導入された宿主、 （１５）腫瘍細胞である（１４）記載の宿主、 （１６）（１５）記載の宿主を被検物質存在下で培養
し、該被検物質の該宿主に対する毒性効果を測定するこ
とを特徴とする、癌化学療法剤の検索方法、 （１７）腫瘍細胞を被検物質存在下で培養し、該腫瘍細
胞中における、配列番号９のヌクレオチド配列とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするｍRNAの発現
量を測定することを特徴とする、癌化学療法剤の増強剤
の検索方法、に関する。

【００１２】更にまた、本発明は、ヒト腫瘍細胞の化学
療法に対する感受性を診断する試薬を提供するものであ
り、特に上記DNAまたはその断片に対するアンチセンス
オリゴヌクレオチド、および／または上記蛋白質に対す
る抗体を含有する試薬を提供する。

【００１３】更に本発明は、上記本発明に係るDNA若し
くはその断片、上記本発明に係る蛋白質若しくはその断
片を使用した、ヒトの細胞におけるアポトーシスを促進
または抑制する試薬のスクリーニング方法を提供する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明の実施に際して個々の実験
の手順については、本明細書中に特に明示のない限り、
当該分野において公知の手順に従って行うことができ
る。また、本明細書において開示された手順は例示的な
ものであり、本発明はこれらに特に限定されるものでは
ない。

【００１５】遺伝子工学的操作 制限酵素によるDNAの切断、プラスミドベクターへのサ
ブクローニング、大腸菌へのトランスフォーメーショ
ン、DNAのアガロースゲル電気泳動法、SDS−ポリアクリ
ルアミド電気泳動法（SDS-PAGE）などの基本的な遺伝子
工学・生化学的操作については、村松正實編、ラボマニ
ュアル遺伝子工学増補版（丸善、1990）などに記載の一
般的な方法に従うものであり、特に限定されるものでは
ない。

【００１６】細胞系および細胞培養 NIH３T３などの細胞系はNational Cancer Institute（N
IH, Bethesda, MD）から入手可能である。細胞は、例え
ば熱不活性化ウシ胎児血清１０％およびカナマイシン１
００μｇ／ｍｌを添加したDMEM培地（ニッスイ）中で、
二酸化炭素５％および空気９５％の湿潤条件下（CO₂ イ
ンキュベーター（ESPEC, BNA121D））で３７℃ に維持
する。これらの培養条件については当該分野において公
知であり、当業者はこれらを本発明の実施に支障のない
範囲において変更することができる。

【００１７】DNA DNAの配列は、pCR2.1プラスミドベクター（Invitroge
n、Carlsbad、CA）にサブクローニングされたDNAを鋳型
とし、Applied Biosystem社のABI PRISM BigDyeTermina
tor Cycle Sequencing Ready Reaction Kitにより蛍光
標識されたDNAをABI PRISM 310 Genetic Analyzerにて
解析することにより決定した。

【００１８】上記のように配列決定された本発明のDNA
を含むpCR2.1プラスミドベクター（Invitrogen、Carlsb
ad、CA）にて形質転換した大腸菌DH5a株は、1999年８月
19日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に
国際寄託され、寄託番号FERM BP-6850が付された。得ら
れた遺伝子は、TASP（Testis-Specific Adriamycin Sen
sitivity Protein）遺伝子と命名された。従って、本発
明のDNAは、上記寄託微生物より得ることができる。

【００１９】本発明に使用できるDNAとしては、上記の
ようにして配列決定されたヌクレオチド配列からなるDN
Aの他、（イ）該DNAとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつ細胞に対する癌化学療法剤の効果を
増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA、（ロ）
上記配列から推定されるアミノ酸配列からなる蛋白質お
よび該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸
が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ細胞に対する癌化学療法剤の効果を増強する活
性を有する蛋白質をコードするDNA、および／または
（ハ）上記配列と９５％以上の相同性を有するDNAであ
って、細胞に対する癌化学療法剤の効果を増強する活性
を有するDNAが含まれる。

【００２０】ストリンジェントな条件とは、例えば、ナ
トリウム濃度が１５〜１５０ｍＭ、好ましくは１５〜３
０ｍＭであり、温度が３７〜８０℃、好ましくは５０〜
６５℃での条件をいう。

【００２１】このような本発明の各種DNAは、上記のよ
うにして配列決定されたヌクレオチド配列からなるDNA
の情報に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル
法（Hunkapiller, M. et al. (1984) Nature, 310, 105
-111）等の定法に従い、核酸の化学合成により製造する
こともできる。

【００２２】なお、所望アミノ酸に対するコドンはそれ
自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば利用す
る宿主のコドン使用頻度を考慮して定法に従い決定でき
る（Grantham, R. et al. (1981) Nucleic Acid Res.
9, r43-r74）。さらに、これらヌクレオチド配列のコド
ンの一部改変は、定法に従い、所望の改変をコードする
合成オリゴヌクレオチドから成るプライマーを利用した
サイトスペシフィック・ミュータジェネシス（site spe
cific mutagenesis: Mark, D.F. et al. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666）等に従うこと
ができる。

【００２３】ここで「細胞に対する癌化学療法剤の効果
を増強する活性」とは、ヒト細胞中におけるその発現の
増大によって、その細胞に対する癌化学療法剤の効果を
増強する活性をいい、そのメカニズムは特に限定される
ものではない。

【００２４】DNA断片 本発明に係るDNA断片は、上記DNA配列中の少なくとも1
００個の連続したヌクレオチド配列からなり、細胞に対
する癌化学療法剤の効果を増強する活性を有するもので
ある。

【００２５】本発明に係るDNAまたはその断片をプラス
ミドベクターやウイルスベクターのようなベクターへ挿
入し、発現および増幅を行うことができる。そして該DN
Aまたはその断片は、PCR増幅などのためのプローブ、遺
伝子発現や染色体の再構成を検出するためのプローブと
して利用することも可能である。

【００２６】上記ベクター中には、細胞内における該DN
Aの転写を促進するプロモーター配列、複製開始点、選
択マーカーをコードする遺伝子等を有していても良い。
本発明において使用可能なベクターとしては、Ausubel
ら（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley
Interscience, New York, New York, 1987）に記載され
たもの等が挙げられる。

【００２７】また、上記ベクターを用いて本発明に係る
蛋白質を産生するために導入し得る宿主細胞としては、
例えば大腸菌のような原核生物の細胞、例えば酵母、昆
虫、哺乳動物の培養細胞のような真核生物の細胞が挙げ
られる。

【００２８】DNAを宿主細胞に導入するための方法は当
該分野において公知である。例えば上記Ausubelらに記
載の形質転換法、リン酸カルシウム沈降法、マイクロイ
ンジェクション法、エレクトロポレーション法、リポフ
ェクション法、感染などが挙げられる。

【００２９】蛋白質 本発明に係る蛋白質は、上記のDNAから推定されるアミ
ノ酸配列からなる蛋白質、またはそのアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞に対する癌化
学療法剤の効果を増強する活性を有する蛋白質である。

【００３０】また、本発明に係る蛋白質は、上記の本発
明に係る蛋白質のアミノ酸配列中の少なくとも１００個
の連続したアミノ酸配列からなり、細胞に対する癌化学
療法剤の効果を増強する活性を有するものである。例え
ば、少なくとも２０個のアミノ酸を含む蛋白質断片を、
本発明に係る蛋白質に対して特異的な抗体を産生させる
ための免疫原として使用することができる。この断片
は、例えば本発明に係る蛋白質中のアミノ酸配列であっ
て、他の公知の蛋白質中にないアミノ酸配列を含むもの
等が挙げられる。

【００３１】上記蛋白質は、標準的な組換え発現系にお
いて製造するか、あるいは小さいペプチド断片の場合に
は化学的に合成することができる。

【００３２】上記の蛋白質は、そのものを下記の試薬と
して、または試薬のスクリーニングのために使用するこ
とができる。

【００３３】アンチセンスオリゴヌクレオチド 本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記
DNAの少なくとも一部に対して相補的な、またはハイブ
リダイズするヌクレオチドであって、DNA、RNAのいずれ
であっても良く、また機能に支障がない限りにおいて修
飾されたものであっても良い。

【００３４】モノクローナル抗体 本発明に係る蛋白質または蛋白質に対するモノクローナ
ル抗体は、当該分野で周知の標準的な免疫化およびスク
リーニング方法（例えばKohlerら、Nature, 256:495, 1
975; Sambrookら、Molecular Cloning, Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press（1989））を用いてまずハイブ
リドーマを作製し、クローニング手段を使用して製造す
ることができる。

【００３５】これらモノクローナル抗体は、予め公知の
方法によって標識した後、診断および治療に必要とされ
る量を抗原である本発明に係る蛋白質またはその断片に
in vitroまたはin vivoで特異的に結合させて腫瘍など
の疾患の診断または治療に使用することができる。診断
および治療に必要とされる量は、当該分野において公知
の手段によって容易に決定することができる。モノクロ
ーナル抗体は、本発明に係る蛋白質に対して高い特異性
を有しており、該蛋白質の詳細な機能の解析、定量、お
よび免疫沈降法やアフィニティークロマトグラフィーに
よる該蛋白質の単離・精製に利用することができる。

【００３６】ここで抗体としては、インタクトな免疫グ
ロブリン分子のみでなく、本発明に係る蛋白質のエピト
ープに対して特異的に結合し得るFab断片などの断片で
あっても良い。

【００３７】試薬 本発明に係るDNAは、これに対応するｍRNAまたは蛋白質
の発現量を測定することによって、ヒトの腫瘍細胞の化
学療法に対する感受性を診断することができる。具体的
には、例えばヒトの組織から摘出した細胞または培養細
胞におけるmRNAの発現量などを測定する。

【００３８】腫瘍細胞 本発明に係るDNAに対応するｍRNAまたは蛋白質は正常ヒ
ト組織では脳、胎盤などに多く発現しているが、肝臓、
腎臓、肺などにはあまり発現していない。よってこれら
の臓器由来の癌である肝癌、腎癌、肺癌などには本発明
に係るDNAに対応するｍRNAまたは蛋白質は発現が低いと
推定される。よってこれらの臓器由来の癌細胞である肝
癌細胞HepG2、腎癌細胞A498、肺癌細胞A549などに本発
明のDNAを導入して、癌化学療法剤のスクリーニング、
あるいは癌化学療法剤の効果増強物質のスクリーニング
に使用することができる。

【００３９】スクリーニング方法 本発明に係るDNA若しくはその断片、および蛋白質若し
くはその断片を使用して、ヒト腫瘍に対する治療および
予防のための試薬のスクリーニング方法が提供される。

【００４０】マウスNIH3T3細胞中で本発明のDNAに対応
する生体内遺伝子の発現を阻害すると、癌化学療法剤に
耐性を獲得する。すなわち、該遺伝子の産物は癌化学療
法剤の作用に密接に関与しており、癌細胞において該遺
伝子が高発現しているか、又は該遺伝子産物である蛋白
質が活発に機能している場合に、癌細胞に対する癌化学
療法剤の効果が増強される。

【００４１】従って、本発明のＤＮＡを導入された癌細
胞は、癌化学療法剤の検索に使用することができる。

【００４２】また、腫瘍細胞中の該遺伝子の発現を高
め、その細胞の癌化学療法剤に対する感受性を増大せし
める化合物は、癌化学療法剤の増強剤として使用し得
る。本発明のＤＮＡを直接腫瘍細胞に導入することによ
り癌における癌化学療法剤の作用を増強することも可能
である。

【００４３】本発明のDNAは、このような生体内遺伝子
の発現の程度を測定するためのプローブとして使用する
こともできる。その測定法としては、ノザーン・ブロッ
ティング法等が挙げられ、それらの方法は当業者に周知
である。

【００４４】また、前記生体内遺伝子の発現を誘導する
化合物を生体内に投与すると、該遺伝子によりコードさ
れる蛋白質が発現される。かかる蛋白質を前述の抗体を
用いて免疫学的に測定すれば、癌患者の癌化学療法剤に
対する感受性を高い確度で推定することができる。

【００４５】他方、癌の化学療法においては、骨髄、消
化管上皮、心筋などの正常細胞に対する毒性が問題とな
る。

【００４６】上記とは逆に、該遺伝子の発現を低下させ
る、あるいは該遺伝子産物の活性を阻害するような働き
を持つ低分子化合物を用いることにより、これら正常細
胞における癌化学療法剤の毒性を軽減することが可能で
ある。該遺伝子のアンチセンスを直接正常細胞に導入す
ることにより、癌化学療法剤の毒性を軽減し得る。

【００４７】

【実施例】以下実施例により本発明をさらに詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されない。

【００４８】実施例１ TASP遺伝子のクローニング マウスNIH3T3細胞よりmRNAを抽出し、これに対するｃDN
Aを合成した。これをG418耐性選択マーカーをもつLNCX
レトロウイルスベクター（Miller, A. D. andRosman,G.
J. Biotechniques 7:980-986, 1989）に組み込み、レ
トロウイルス発現ライブラリーを作成し、最初にこのプ
ラスミドライブラリーをリン酸カルシウム法によりレト
ロウイルスパッケージング細胞PA317に導入した。遺伝
子導入されたPA317細胞の培養上清をNIH3T3細胞の培養
液に加えることによりNIH3T3細胞にレトロウイルスを導
入した。

【００４９】レトロウイルスを感染させたNIH3T3細胞を
耐性マーカーであるG418（600 μg/ml）を含有する10%
牛胎児血清添加DMEM培地中で培養することにより、NIH3
T3細胞のcDNAが組み込まれたレトロウイルスが感染して
G418耐性となった細胞を選択した。

【００５０】上記Ｇ４１８耐性細胞を、35 ng/mlのアド
リアマイシンを含む10%牛胎児血清添加DMEM培地で培養
し、アドリアマイシン耐性となったクローンAc2を樹立
した。

【００５１】このAc2細胞のDNAを抽出した。レトロウィ
ルスベクターLNCX中の外来遺伝子の外側に存在するヌク
レオチド配列に基き作成した二つのプライマー：5'- ga
gacgccatccacgctgttttga -3'（配列表の配列番号３）お
よび5'- ccccgggcctacaggtggggtctttcattcc -3'（配列
表の配列番号４）を用いて、95℃で30秒、55℃で30秒、
72℃で1分のサイクルを36回繰り返すPCRを行い、Ac2細
胞染色体中に組み込まれた約1.1 kbの外来cDNA断片を単
離した。単離されたcDNA断片のヌクレオチド配列をAppl
ied Biosystem社のABI PRISM 310 Genetic Analyzerを
用いて解析した結果、このcDNA断片は新規蛋白質のC末
端付近のアミノ酸残基をコードすることが推定された。
そこで、Clontech社（Palo Alto, CA）のMarathon-read
y cDNAを鋳型として5'-RACE（Rapid Amplification ofc
DNA ends）法により、さらに５'側の上流部分を含むcDN
Aを得た。独立して得られた4クローンのヌクレオチド配
列をそれぞれ決定したところ、各クローン間でヌクレオ
チド配列に差が無いことが確認された。使用したクロー
ンのマップを図1に示す。

【００５２】こうして得られたcDNAを制限酵素で切断
後、T4 DNA ligaseにより連結し、一本のcDNAクローン
とした。このcDNAは450アミノ酸をコードするオープン
リーディングフレームを有していた。このヌクレオチド
配列を配列番号1、推定アミノ酸配列を配列番号2として
配列表に示す。このｃDNAを含むpCR2.1プラスミドベク
ター（Invitrogen、Carlsbad、CA）にて形質転換した大
腸菌DH5a株は、1999年 8月19 日に通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、寄託番号FE
RM BP-6850が付された。得られた遺伝子は、TASP（Test
is-Specific Adriamycin Sensitivity Protein）遺伝子
と命名された。

【００５３】最初にAc2細胞から得られたcDNA断片はレ
トロウィルスベクターLNCXに逆方向に挿入されていたこ
と、Ac2細胞ではこの遺伝子のアンチセンスmRNAが発現
していたことが明らかとなった。

【００５４】実施例２ レトロウイルスの再導入 実施例１で得られたAc2細胞株より、組み込まれたレト
ロウイルスを回収し、実施例1記載の方法に従い、新た
にNIH3T3細胞に導入して、この外来ｃＤＮＡが逆方向に
導入されたレトロウイルスの導入による癌化学療法剤耐
性の獲得が再現できるかを検証した。

【００５５】まずAc2細胞300万個を10 cmディッシュに
まいた。次いで、米国Fred Hutchinson癌センターのA.
D. Miller博士より供与されたレトロウイルスのヘルパ
ープラスミドpSAM（20 μg）をLipofectamine Reagent
（20 μl）(GIBCO BRL）の双方を混合し、Opti-MEM培地
(GIBCO BRL）6 mlで希釈後、Ac2細胞の培養ディッシュ
に加えた。6時間後に培養液を10%牛胎児血清添加RPMI16
40培地10 mlに換えてさらに培養を続け、pSAM導入2日後
にこの細胞の培養上清10 ml中のレトロウイルスを回収
した。このレトロウイルス液2 mlを10 mlの10%牛胎児血
清添加DMEM培地とともに新しいNIH3T3細胞10万個をまい
た10 cmディッシュに加え、遺伝子感染導入を行った。
レトロウイルスを感染させたNIH3T3細胞を600 μg/mlの
G418を含む10%牛胎児血清添加DMEM培地で選択してG418
耐性となった細胞を得た。このG418耐性細胞および親株
のNIH3T3細胞を種々の濃度のアドリアマイシン（2.5〜1
0 ng/ml）又はパクリタキセル（12.5〜100ng/ml）存在
下で培養した。これら癌化学療法剤添加5日後の細胞数
を計測し、癌化学療法剤の感受性を調べた。

【００５６】その結果、Ac2細胞に組み込まれていたレ
トロウイルスを再導入されたNIH3T3細胞はアドリアマイ
シン、パクリタキセルの双方に対し約1.5倍の耐性を獲
得した（図２）。

【００５７】よって、該遺伝子の発現を阻害するとNIH3
T3細胞がアドリアマイシン耐性を獲得することが示され
た。すなわち、細胞内の該遺伝子産物は、細胞の癌化学
療法剤に対する感受性に関与していることが示された。

【００５８】実施例３ ヒトｃＤＮＡのクローニング 実施例１で得られたマウスｃＤＮＡと高い相同性を有す
るヒトｃＤＮＡ（以下「ヒトホモログ」という）を単離
し、その構造を決定した。インターネットのゲノムネッ
トＷＷＷサーバー（GenomeNet WWW Server、http://ww
w.genome.ad.jp）で、実施例１で得られたマウスｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列に高い相同性を有するｃＤＮＡを
データベース上で検索したところ、ＥＳＴクローンであ
るATCC357410およびATCC3026594の配列がヒトホモログ
であると推定された。

【００５９】これらのＥＳＴクローンをアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より入手
し、Perkin Elmer社のABI PRISM 377 DNA Sequencerを
用いてそれらの両末端のヌクレオチド配列を決定した。
その結果、ATCC357410は、ヒトホモログのコーディング
領域のほぼ中央部の一部を、ATCC3026594はヒトホモロ
グのＣ末端をコードしている部分と推定された。

【００６０】次いで、ヒトホモログのＮ末端をコードす
る領域のｃＤＮＡを単離するため、アドバンテージｃＤ
ＮＡ ＰＣＲキット（Clontech社製）を用いてＲＡＣＥ
（Rapid Amplification of cDNA Ends）法によるｃＤＮ
Ａの単離を行った。このＰＣＲでは、Human fetal brai
n Marathon-ready cDNA（Clontech社製）を鋳型とし、A
TCC357410の配列をもとにして作製したアンチセンスプ
ライマー：5'- ccagggatcg gagcaggtag gtttggtcac -3'
（73AS：配列表の配列番号５）；および5'- ccatcctaat
acgactcact atagggc -3'（アダプタープライマー１：
配列表の配列番号６）の２本のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして、上記ＰＣＲキットを用いて、９５℃で
５秒、７２℃で２分３０秒の反応を５回、次いで９５℃
で５秒、７０℃で２分３０秒の反応を５回、最後に９５
℃で５秒、６８℃で２分３０秒の反応を２５回繰り返
し、増幅されたｃＤＮＡを得た。これをｐＣＲ２．１プ
ラスミドにサブクローニングした後、Perkin Elmer社の
ABI PRISM 377 DNA Sequencerを用いてヌクレオチド配
列を決定した。このＰＣＲにより、ヒトホモログのＮ末
端側をコードするｃＤＮＡ断片が単離された。

【００６１】次に、ＰＣＲ法を用いて、ヒトホモログの
コーディング領域全長を単離した。このＰＣＲでは、Hu
man fetal brain Marathon-ready cDNA（Clontech社
製）を鋳型とし、下記配列：5'- aaccgcggag atgggcgag
a ccatgtcaaa gaggctgaag ctccacctgg gaggggaggc agaa
atggag g -3'（hAc2-Sst-64-S：配列表の配列番号
７）；および5'- ccctcgagct ttttgcacct tttaatccct c
ttcga -3'（hAc2-Xho-1369-AS：配列表の配列番号８）
の２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、上
記ＰＣＲキットを用いて、９４℃で３０秒、６８℃で３
分の反応を３０回繰り返し、増幅されたｃＤＮＡを得
た。これをｐＣＲ２．１プラスミドにサブクローニング
した後、Perkin Elmer社のABI PRISM 377 DNA Sequence
rを用いてヌクレオチド配列を決定した。ＰＣＲは、４
本のチューブを用いて、同じ条件で独立に実施し、得ら
れた４つのクローンのヌクレオチド配列をそれぞれ決定
した。４つのクローンの配列解析結果を比較し、ＰＣＲ
による変異と推定される部分は補正して、ヒトホモログ
のコーディング領域のヌクレオチド配列とそれから予想
されるアミノ酸配列を決定した。このｃＤＮＡは４５０
アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを
有し、また実施例１で得られたマウスｃＤＮＡとも高い
相同性を有していた。このヌクレオチド配列を配列番号
９、推定されるアミノ酸配列を配列番号１０に示した。

【００６２】

【発明の効果】本発明により、腫瘍細胞の癌化学療法剤
に対する感受性を増強させる新規DNAが提供される。さ
らに、本発明の検索（スクリーニング）系により、新た
な癌化学療法剤やこれに対する増強剤、さらには癌化学
療法剤による副作用を低減させる医薬等を得ることが可
能になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ac2cDNAの解析図

【図２】LNCX/Ac2レトロウィルス感染NIH3T3細胞の薬剤
感受性図

【配列表フリーテキスト】配列番号３：癌化学療法剤効
果増強遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマー 配列番号４：癌化学療法剤効果増強遺伝子を増幅するた
めのＰＣＲプライマー 配列番号５：癌化学療法剤効果増強遺伝子を増幅するた
めのＰＣＲプライマー 配列番号６：癌化学療法剤効果増強遺伝子を増幅するた
めのＰＣＲプライマー 配列番号７：癌化学療法剤効果増強遺伝子を増幅するた
めのＰＣＲプライマー 配列番号８：癌化学療法剤効果増強遺伝子を増幅するた
めのＰＣＲプライマー

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tsuruo, Takashi Japanese Foundation of Cancer Research Sankyo Company, Limited <120> A Gene Which Enhances The Sensitivity of Tumor Cells to Antitumor Drugs <130> 2000105KK <140> <141> <150> JP HEI11-247137 <151> 1999-09-01 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2505 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (425)..(1774) <400> 1 ctgggctggt gaaatgcagt ccgtttggtg atggagcatc tgaaggtgcg cttttccctg 60 gtctgcaaat cgctcacact ttgaatgaac ccatctttac aggctttccc tactggaacg 120 tgagctttct aggcgtgcgt tttctctaga atctctcgga aggacacggc cacgggagag 180 gcgagggtaa ctgggagact gtgcggctcg gcgggctggg ccgtcaggct gagagctgct 240 gctgggaggg cgtgactggc gaaggctgga ggttcggctt tttcgcgcta gctgcatcca 300 gatgtgcaag ccactgttct ccaggaaggc ttcgccgcgg agccccggcc caaacgcctt 360 ccaggaggtt tgtccctgcc tgcgcgccgt gccctgagct ctcaggcagg gaaagcgcgc 420 ggac atg ggc gag acc atg tca aag aga ctc aag ttc cac cta gga gag 469 Met Gly Glu Thr Met Ser Lys Arg Leu Lys Phe His Leu Gly Glu 1 5 10 15 gcg gag atg gag gag cgg tcg ttc ccc aat ccc ttc cca gac tat gaa 517 Ala Glu Met Glu Glu Arg Ser Phe Pro Asn Pro Phe Pro Asp Tyr Glu 20 25 30 gcc gcc gcc tcc gcc gca ggg ctc gcc gct gga agt gcg gag gaa acc 565 Ala Ala Ala Ser Ala Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ser Ala Glu Glu Thr 35 40 45 ggc cgt gtc tgc cct ctc ccc acc acg gaa gac ccg ggc ctc cct ttc 613 Gly Arg Val Cys Pro Leu Pro Thr Thr Glu Asp Pro Gly Leu Pro Phe 50 55 60 cac cct aac ggg aag att gtt ccc aac ttc ata aag cgt atc cag acc 661 His Pro Asn Gly Lys Ile Val Pro Asn Phe Ile Lys Arg Ile Gln Thr 65 70 75 aaa atc aaa gat ctt ctg cag cag atg gag gaa gga ctg aag aca gcg 709 Lys Ile Lys Asp Leu Leu Gln Gln Met Glu Glu Gly Leu Lys Thr Ala 80 85 90 95 gac cct cat gac tgc tct gca tat act ggt tgg aca ggc ata gca ctt 757 Asp Pro His Asp Cys Ser Ala Tyr Thr Gly Trp Thr Gly Ile Ala Leu 100 105 110 ttg tac ctg cag ctg tac cgg gtc act ggt gac cag acc tac ctg ctt 805 Leu Tyr Leu Gln Leu Tyr Arg Val Thr Gly Asp Gln Thr Tyr Leu Leu 115 120 125 cga tcc ctg gat tac gtg aag aga aca ctc cga aat ttg agt ggt cgc 853 Arg Ser Leu Asp Tyr Val Lys Arg Thr Leu Arg Asn Leu Ser Gly Arg 130 135 140 aga gtc act ttc ctt tgt gga gat gct ggg ccc ctt gct gtg gga gct 901 Arg Val Thr Phe Leu Cys Gly Asp Ala Gly Pro Leu Ala Val Gly Ala 145 150 155 gtg ata tat cat aaa ctc aaa agt gaa tgt gag tcc cag gaa tgc atc 949 Val Ile Tyr His Lys Leu Lys Ser Glu Cys Glu Ser Gln Glu Cys Ile 160 165 170 175 aca aaa ctt cta cag atg cat aga act att gtc tgt caa gag tca gag 997 Thr Lys Leu Leu Gln Met His Arg Thr Ile Val Cys Gln Glu Ser Glu 180 185 190 ctt cct gat gaa ctg ctg tat gga cga gca gga tac ctg tat gcc tta 1045 Leu Pro Asp Glu Leu Leu Tyr Gly Arg Ala Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu 195 200 205 ctg tac ctg aac aca gag att ggc cct ggc act gtt ggt gag aca gct 1093 Leu Tyr Leu Asn Thr Glu Ile Gly Pro Gly Thr Val Gly Glu Thr Ala 210 215 220 att aaa gag gta gtc agt gct att att gag tcg gga aag agt cta tca 1141 Ile Lys Glu Val Val Ser Ala Ile Ile Glu Ser Gly Lys Ser Leu Ser 225 230 235 agg gaa gaa agg aaa tct gag cgc tgc ccc ctg ctc tat cag tgg cac 1189 Arg Glu Glu Arg Lys Ser Glu Arg Cys Pro Leu Leu Tyr Gln Trp His 240 245 250 255 aga aaa caa tat gtt gga gca gcc cat ggt atg gct ggc atc tac tac 1237 Arg Lys Gln Tyr Val Gly Ala Ala His Gly Met Ala Gly Ile Tyr Tyr 260 265 270 atg cta atg cag cca gaa gca aaa gtg gac caa gaa acc tta acc gaa 1285 Met Leu Met Gln Pro Glu Ala Lys Val Asp Gln Glu Thr Leu Thr Glu 275 280 285 atg gtg aaa ccc agc att gat tat gtg cgc cat aaa aaa ttc cga tct 1333 Met Val Lys Pro Ser Ile Asp Tyr Val Arg His Lys Lys Phe Arg Ser 290 295 300 gga aat tat cca tca tca tta agc aat gaa aca gat cga ttg gtc cac 1381 Gly Asn Tyr Pro Ser Ser Leu Ser Asn Glu Thr Asp Arg Leu Val His 305 310 315 tgg tgc cat ggt gct cca gga gtc atc cac gtg ctc tta cag gca tac 1429 Trp Cys His Gly Ala Pro Gly Val Ile His Val Leu Leu Gln Ala Tyr 320 325 330 335 cag gtt ttt aag gag gaa aaa tac ttg aaa gag gcc atg gag tgt agc 1477 Gln Val Phe Lys Glu Glu Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Met Glu Cys Ser 340 345 350 gat gtg att tgg cag cga ggt ctg ctc cgg aaa ggt tat gga atc tgc 1525 Asp Val Ile Trp Gln Arg Gly Leu Leu Arg Lys Gly Tyr Gly Ile Cys 355 360 365 cat gga acc tct ggc aat ggc tat tcc ttt ttg tcc ctt tat cgc ctg 1573 His Gly Thr Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Phe Leu Ser Leu Tyr Arg Leu 370 375 380 acg cag gat aag aag tat ctc tat cga gct tgt aag ttt gca gag tgg 1621 Thr Gln Asp Lys Lys Tyr Leu Tyr Arg Ala Cys Lys Phe Ala Glu Trp 385 390 395 tgt cta gat tac gga gca cat gga tgc cgc att cct gac aga cct tat 1669 Cys Leu Asp Tyr Gly Ala His Gly Cys Arg Ile Pro Asp Arg Pro Tyr 400 405 410 415 tcc ctc ttt gaa ggt atg gct ggt gct gtt cac ttc ctt tct gac atc 1717 Ser Leu Phe Glu Gly Met Ala Gly Ala Val His Phe Leu Ser Asp Ile 420 425 430 ttg gta cca gag aca gca cgg ttt cca gca ttt gaa ctt ggc ttt ttg 1765 Leu Val Pro Glu Thr Ala Arg Phe Pro Ala Phe Glu Leu Gly Phe Leu 435 440 445 cag aag gat taaaaaggtg caaaaagaca actaacatac ccgttggacc 1814 Gln Lys Asp 450 aaaaggccac ctggattagt gcctgacaca gaacccactg taaaccctaa aagaagaaga 1874 cgacaggaca gaaaccttca caagccccct ttgttgcaaa gacccccaat tagagcatga 1934 gcgatagaaa tcatgtcatc agcattctgt gacagcgtgt cccttaaagg tgtgaaatct 1994 gaatccttca tctctaggct ccttctagtg tgcatgtttc ttggtgcttg tcttataggt 2054 gtaaattgaa taactagaaa agccacactc attacatgaa ctcttagctg agcacatgtg 2114 agtgttaaag gtgacaggca cacatttttg tatatagtat ctaaactagg gtatcatctc 2174 tatcaacaca gaaacagttg tgtgatgtct gtcttgacca tcagctagca gatctagata 2234 tcctgtgaga atacatgtta gcattttcca tgggcatgcg tgagaggcag cctcccaaac 2294 ccgaatgaag ggcaggtcag tgtgcactgc agagctcagg aaggcacaat tgacacctcc 2354 tccctctgtg tgtcttgtgg tcaatgtaat taatggctaa gcattaggaa ttctgagaca 2414 tttactcaga tacatattat taaaacagat acctccttac tgttttcaga atagcttatt 2474 actatataaa acagagtagc tgtaatgcca g 2505 <210> 2 <211> 450 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Gly Glu Thr Met Ser Lys Arg Leu Lys Phe His Leu Gly Glu Ala 1 5 10 15 Glu Met Glu Glu Arg Ser Phe Pro Asn Pro Phe Pro Asp Tyr Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Ser Ala Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ser Ala Glu Glu Thr Gly 35 40 45 Arg Val Cys Pro Leu Pro Thr Thr Glu Asp Pro Gly Leu Pro Phe His 50 55 60 Pro Asn Gly Lys Ile Val Pro Asn Phe Ile Lys Arg Ile Gln Thr Lys 65 70 75 80 Ile Lys Asp Leu Leu Gln Gln Met Glu Glu Gly Leu Lys Thr Ala Asp 85 90 95 Pro His Asp Cys Ser Ala Tyr Thr Gly Trp Thr Gly Ile Ala Leu Leu 100 105 110 Tyr Leu Gln Leu Tyr Arg Val Thr Gly Asp Gln Thr Tyr Leu Leu Arg 115 120 125 Ser Leu Asp Tyr Val Lys Arg Thr Leu Arg Asn Leu Ser Gly Arg Arg 130 135 140 Val Thr Phe Leu Cys Gly Asp Ala Gly Pro Leu Ala Val Gly Ala Val 145 150 155 160 Ile Tyr His Lys Leu Lys Ser Glu Cys Glu Ser Gln Glu Cys Ile Thr 165 170 175 Lys Leu Leu Gln Met His Arg Thr Ile Val Cys Gln Glu Ser Glu Leu 180 185 190 Pro Asp Glu Leu Leu Tyr Gly Arg Ala Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Leu 195 200 205 Tyr Leu Asn Thr Glu Ile Gly Pro Gly Thr Val Gly Glu Thr Ala Ile 210 215 220 Lys Glu Val Val Ser Ala Ile Ile Glu Ser Gly Lys Ser Leu Ser Arg 225 230 235 240 Glu Glu Arg Lys Ser Glu Arg Cys Pro Leu Leu Tyr Gln Trp His Arg 245 250 255 Lys Gln Tyr Val Gly Ala Ala His Gly Met Ala Gly Ile Tyr Tyr Met 260 265 270 Leu Met Gln Pro Glu Ala Lys Val Asp Gln Glu Thr Leu Thr Glu Met 275 280 285 Val Lys Pro Ser Ile Asp Tyr Val Arg His Lys Lys Phe Arg Ser Gly 290 295 300 Asn Tyr Pro Ser Ser Leu Ser Asn Glu Thr Asp Arg Leu Val His Trp 305 310 315 320 Cys His Gly Ala Pro Gly Val Ile His Val Leu Leu Gln Ala Tyr Gln 325 330 335 Val Phe Lys Glu Glu Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Met Glu Cys Ser Asp 340 345 350 Val Ile Trp Gln Arg Gly Leu Leu Arg Lys Gly Tyr Gly Ile Cys His 355 360 365 Gly Thr Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Phe Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Thr 370 375 380 Gln Asp Lys Lys Tyr Leu Tyr Arg Ala Cys Lys Phe Ala Glu Trp Cys 385 390 395 400 Leu Asp Tyr Gly Ala His Gly Cys Arg Ile Pro Asp Arg Pro Tyr Ser 405 410 415 Leu Phe Glu Gly Met Ala Gly Ala Val His Phe Leu Ser Asp Ile Leu 420 425 430 Val Pro Glu Thr Ala Arg Phe Pro Ala Phe Glu Leu Gly Phe Leu Gln 435 440 445 Lys Asp 450 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to amplify a DNA fragment of a gene which enhances a sensitivity of tumor cells to antitumor drugs <400> 3 gagacgccat ccacgctgtt ttga 24 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to amplify a DNA fragment of a gene which enhances a sensitivity of tumor cells to antitumor drugs <400> 4 ccccgggcct acaggtgggg tctttcattc c 31 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to amplify a DNA fragment of a gene which enhances a sensitivity of tumor cells to antitumor drugs <400> 5 ccagggatcg gagcaggtag gtttggtcac 30 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to amplify a DNA fragment of a gene which enhances a sensitivity of tumor cells to antitumor drugs <400> 6 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 7 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to amplify a DNA fragment of a gene which enhances a sensitivity of tumor cells to antitumor drugs <400> 7 aaccgcggag atgggcgaga ccatgtcaaa gaggctgaag ctccacctgg gaggggaggc 60 agaaatggag g 71 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to amplify a DNA fragment of a gene which enhances a sensitivity of tumor cells to antitumor drugs <400> 8 ccctcgagct ttttgcacct tttaatccct cttcga 36 <210> 9 <211> 1630 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (56)..(1405) <400> 9 ctgcagcgcc gggacaggag gtttgtcccc gcccgcgcgc cgtaccgcgg cggag atg 58 Met 1 ggc gag acc atg tca aag agg ctg aag ctc cac ctg gga ggg gag gca 106 Gly Glu Thr Met Ser Lys Arg Leu Lys Leu His Leu Gly Gly Glu Ala 5 10 15 gaa atg gag gaa cgg gcg ttc gtc aac ccc ttc ccg gac tac gag gcc 154 Glu Met Glu Glu Arg Ala Phe Val Asn Pro Phe Pro Asp Tyr Glu Ala 20 25 30 gcc gcc ggg gcg ctg ctc gcc tcc gga gcg gcc gaa gag aca ggc tgt 202 Ala Ala Gly Ala Leu Leu Ala Ser Gly Ala Ala Glu Glu Thr Gly Cys 35 40 45 gtt cgt ccc ccg gcg acc acg gat gag ccc ggc ctc cct ttt cat cag 250 Val Arg Pro Pro Ala Thr Thr Asp Glu Pro Gly Leu Pro Phe His Gln 50 55 60 65 gac ggg aag atc att cat aat ttc ata aga cgg atc cag acc aaa att 298 Asp Gly Lys Ile Ile His Asn Phe Ile Arg Arg Ile Gln Thr Lys Ile 70 75 80 aaa gat ctt ctg cag caa atg gaa gaa ggg ctg aag aca gct gat ccc 346 Lys Asp Leu Leu Gln Gln Met Glu Glu Gly Leu Lys Thr Ala Asp Pro 85 90 95 cat gac tgc tct gct tat act ggc tgg aca ggc ata gcc ctt ttg tac 394 His Asp Cys Ser Ala Tyr Thr Gly Trp Thr Gly Ile Ala Leu Leu Tyr 100 105 110 ctg cag ttg tac cgg gtc aca tgt gac caa acc tac ctg ctc cga tcc 442 Leu Gln Leu Tyr Arg Val Thr Cys Asp Gln Thr Tyr Leu Leu Arg Ser 115 120 125 ctg gat tac gta aaa aga aca ctt cgg aat ctg aat ggc cgc agg gtc 490 Leu Asp Tyr Val Lys Arg Thr Leu Arg Asn Leu Asn Gly Arg Arg Val 130 135 140 145 acc ttc ctc tgt ggg gat gct ggc ccc ctg gct gtt gga gct gtg att 538 Thr Phe Leu Cys Gly Asp Ala Gly Pro Leu Ala Val Gly Ala Val Ile 150 155 160 tat cac aaa ctc aga agt gac tgt gag tcc cag gaa tgt gtc aca aaa 586 Tyr His Lys Leu Arg Ser Asp Cys Glu Ser Gln Glu Cys Val Thr Lys 165 170 175 ctt ttg cag ctc cag aga tcg gtt gtt tgc caa gaa tca gac ctt cct 634 Leu Leu Gln Leu Gln Arg Ser Val Val Cys Gln Glu Ser Asp Leu Pro 180 185 190 gat gag ctg ctt tat gga cgg gca ggt tat ctg tat gcc tta ctg tac 682 Asp Glu Leu Leu Tyr Gly Arg Ala Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Leu Tyr 195 200 205 ctg aac aca gag ata ggt cca ggc acc gtg tgt gag tca gct att aaa 730 Leu Asn Thr Glu Ile Gly Pro Gly Thr Val Cys Glu Ser Ala Ile Lys 210 215 220 225 gag gta gtc aat gct att att gaa tcg ggt aag act ttg tca agg gaa 778 Glu Val Val Asn Ala Ile Ile Glu Ser Gly Lys Thr Leu Ser Arg Glu 230 235 240 gaa aga aaa acg gag cgc tgc ccg ctg ttg tac cag tgg cac cgg aag 826 Glu Arg Lys Thr Glu Arg Cys Pro Leu Leu Tyr Gln Trp His Arg Lys 245 250 255 cag tac gtt gga gca gcc cat ggc atg gct gga att tac tat atg tta 874 Gln Tyr Val Gly Ala Ala His Gly Met Ala Gly Ile Tyr Tyr Met Leu 260 265 270 atg cag ccg gca gca aaa gtg gac caa gaa acc ttg aca gaa atg gtg 922 Met Gln Pro Ala Ala Lys Val Asp Gln Glu Thr Leu Thr Glu Met Val 275 280 285 aaa ccc agt att gat tat gtg cgc cac aaa aaa ttc cga tct ggg aat 970 Lys Pro Ser Ile Asp Tyr Val Arg His Lys Lys Phe Arg Ser Gly Asn 290 295 300 305 tac cca tca tca tta agc aat gaa aca gac cgg ctg gtg cac tgg tgc 1018 Tyr Pro Ser Ser Leu Ser Asn Glu Thr Asp Arg Leu Val His Trp Cys 310 315 320 cac ggc gcc ccg ggg gtc atc cac atg ctc atg cag gcg tac aag gtc 1066 His Gly Ala Pro Gly Val Ile His Met Leu Met Gln Ala Tyr Lys Val 325 330 335 ttt aag gag gag aag tac ttg aaa gag gcc atg gag tgt agc gat gtg 1114 Phe Lys Glu Glu Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Met Glu Cys Ser Asp Val 340 345 350 att tgg cag cga ggt ttg ctg cgg aag ggc tac ggg ata tgc cat ggg 1162 Ile Trp Gln Arg Gly Leu Leu Arg Lys Gly Tyr Gly Ile Cys His Gly 355 360 365 act gct ggc aac ggc tat tcc ttc ctg tcc ctt tac cgt ctc acg cag 1210 Thr Ala Gly Asn Gly Tyr Ser Phe Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Thr Gln 370 375 380 385 gat aag aag tac ctc tac cga gct tgc aag ttt gca gag tgg tgt cta 1258 Asp Lys Lys Tyr Leu Tyr Arg Ala Cys Lys Phe Ala Glu Trp Cys Leu 390 395 400 gat tac gga gca cac ggg tgc cgc att cct gac aga ccc tat tcg ctc 1306 Asp Tyr Gly Ala His Gly Cys Arg Ile Pro Asp Arg Pro Tyr Ser Leu 405 410 415 ttt gaa ggc atg gct ggc gct att cac ttt ctc tct gat gtc ctg gga 1354 Phe Glu Gly Met Ala Gly Ala Ile His Phe Leu Ser Asp Val Leu Gly 420 425 430 cca gag aca tca cgg ttt cca gca ttt gaa ctt gac tct tcg aag agg 1402 Pro Glu Thr Ser Arg Phe Pro Ala Phe Glu Leu Asp Ser Ser Lys Arg 435 440 445 gat taaaaggtgc aaaaagacaa ctaaaatacc catttggacc aaaagccgcc 1455 Asp 450 agattgctta gtgcctgaca cagaaacaac tgggaatcct gaaagagaag cagacaccgt 1515 cacaggcccc tctggttaga ctagcatgag tgaccgaagc catccatcaa cattttctaa 1575 cagcaccctc atcaatataa aatatgactt cttcacaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1630 <210> 10 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Gly Glu Thr Met Ser Lys Arg Leu Lys Leu His Leu Gly Gly Glu 1 5 10 15 Ala Glu Met Glu Glu Arg Ala Phe Val Asn Pro Phe Pro Asp Tyr Glu 20 25 30 Ala Ala Ala Gly Ala Leu Leu Ala Ser Gly Ala Ala Glu Glu Thr Gly 35 40 45 Cys Val Arg Pro Pro Ala Thr Thr Asp Glu Pro Gly Leu Pro Phe His 50 55 60 Gln Asp Gly Lys Ile Ile His Asn Phe Ile Arg Arg Ile Gln Thr Lys 65 70 75 80 Ile Lys Asp Leu Leu Gln Gln Met Glu Glu Gly Leu Lys Thr Ala Asp 85 90 95 Pro His Asp Cys Ser Ala Tyr Thr Gly Trp Thr Gly Ile Ala Leu Leu 100 105 110 Tyr Leu Gln Leu Tyr Arg Val Thr Cys Asp Gln Thr Tyr Leu Leu Arg 115 120 125 Ser Leu Asp Tyr Val Lys Arg Thr Leu Arg Asn Leu Asn Gly Arg Arg 130 135 140 Val Thr Phe Leu Cys Gly Asp Ala Gly Pro Leu Ala Val Gly Ala Val 145 150 155 160 Ile Tyr His Lys Leu Arg Ser Asp Cys Glu Ser Gln Glu Cys Val Thr 165 170 175 Lys Leu Leu Gln Leu Gln Arg Ser Val Val Cys Gln Glu Ser Asp Leu 180 185 190 Pro Asp Glu Leu Leu Tyr Gly Arg Ala Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Leu 195 200 205 Tyr Leu Asn Thr Glu Ile Gly Pro Gly Thr Val Cys Glu Ser Ala Ile 210 215 220 Lys Glu Val Val Asn Ala Ile Ile Glu Ser Gly Lys Thr Leu Ser Arg 225 230 235 240 Glu Glu Arg Lys Thr Glu Arg Cys Pro Leu Leu Tyr Gln Trp His Arg 245 250 255 Lys Gln Tyr Val Gly Ala Ala His Gly Met Ala Gly Ile Tyr Tyr Met 260 265 270 Leu Met Gln Pro Ala Ala Lys Val Asp Gln Glu Thr Leu Thr Glu Met 275 280 285 Val Lys Pro Ser Ile Asp Tyr Val Arg His Lys Lys Phe Arg Ser Gly 290 295 300 Asn Tyr Pro Ser Ser Leu Ser Asn Glu Thr Asp Arg Leu Val His Trp 305 310 315 320 Cys His Gly Ala Pro Gly Val Ile His Met Leu Met Gln Ala Tyr Lys 325 330 335 Val Phe Lys Glu Glu Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Met Glu Cys Ser Asp 340 345 350 Val Ile Trp Gln Arg Gly Leu Leu Arg Lys Gly Tyr Gly Ile Cys His 355 360 365 Gly Thr Ala Gly Asn Gly Tyr Ser Phe Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Thr 370 375 380 Gln Asp Lys Lys Tyr Leu Tyr Arg Ala Cys Lys Phe Ala Glu Trp Cys 385 390 395 400 Leu Asp Tyr Gly Ala His Gly Cys Arg Ile Pro Asp Arg Pro Tyr Ser 405 410 415 Leu Phe Glu Gly Met Ala Gly Ala Ile His Phe Leu Ser Asp Val Leu 420 425 430 Gly Pro Glu Thr Ser Arg Phe Pro Ala Phe Glu Leu Asp Ser Ser Lys 435 440 445 Arg Asp 450

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ ４Ｃ０８４ 1/68 33/50 Ｚ ４Ｈ０４５ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｍ 33/50 33/53 33/566 33/577 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 48/00 33/577 Ａ６１Ｐ 35/00 // Ａ６１Ｋ 38/00 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 48/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 杉本 芳一 千葉県柏市東中新宿１−14−２ (72)発明者 塚原 里美 東京都渋谷区幡ヶ谷３−69−２ 中條方 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 BB20 CB02 DA12 DA13 DA14 DA36 DA78 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 AA12 BA80 CA04 CA09 CA12 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 GA18 HA01 HA12 HA17 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ53 QQ61 QQ98 QR31 QR32 QR55 QR62 QR77 QR80 QS24 QS25 QS34 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 DA14 4B065 AA91X AA91Y AA93Y AB01 AC10 AC14 BA02 BA25 BB37 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 BA04 BA22 CA18 NA14 ZB262 ZC752 4H045 AA10 BA10 CA40 EA28 EA51 FA72 FA74 HA05

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の(a)または(b)の蛋白質： （ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むことからなる蛋
   白質、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において1若し
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列からなり、かつ、細胞に対する癌化学療法剤
   の効果を増強する活性を有する蛋白質。
2. 【請求項２】請求項1記載の蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ： （ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
   （ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと
   ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細
   胞に対する癌化学療法剤の効果を増強する活性を有する
   ＤＮＡ。
4. 【請求項４】請求項２または３記載のＤＮＡを含むこと
   からなるベクター。
5. 【請求項５】請求項４記載のベクターを導入された宿
   主。
6. 【請求項６】大腸菌ＤＨ５α−ＴＡＳＰ ＳＡＮＫ71299
   株（FERM BP-6850）である請求項５記載の宿主。
7. 【請求項７】腫瘍細胞である請求項５記載の宿主。
8. 【請求項８】請求項７記載の宿主を被検物質存在下で培
   養し、該被検物質の該宿主に対する毒性効果を測定する
   ことを特徴とする、癌化学療法剤の検索方法。
9. 【請求項９】腫瘍細胞を被検物質存在下で培養し、該腫
   瘍細胞中における、配列番号１のヌクレオチド配列とス
   トリンジェントな条件下でハイブリダイズするｍRNAの
   発現量を測定することを特徴とする、癌化学療法剤の増
   強剤の検索方法。
10. 【請求項１０】以下の(a)または(b)の蛋白質： （ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むことからなる
    蛋白質、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において1
    若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
    たアミノ酸配列からなり、かつ、細胞に対する癌化学療
    法剤の効果を増強する活性を有する蛋白質。
11. 【請求項１１】請求項1０記載の蛋白質をコードするＤ
    ＮＡ。
12. 【請求項１２】以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ： （ａ）配列番号９のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
    （ｂ）配列番号９のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと
    ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細
    胞に対する癌化学療法剤の効果を増強する活性を有する
    ＤＮＡ。
13. 【請求項１３】請求項１１または１２記載のＤＮＡを含
    むことからなるベクター。
14. 【請求項１４】請求項１３記載のベクターを導入された
    宿主。
15. 【請求項１５】腫瘍細胞である請求項１４記載の宿主。
16. 【請求項１６】請求項１５記載の宿主を被検物質存在下
    で培養し、該被検物質の該宿主に対する毒性効果を測定
    することを特徴とする、癌化学療法剤の検索方法。
17. 【請求項１７】腫瘍細胞を被検物質存在下で培養し、該
    腫瘍細胞中における、配列番号９のヌクレオチド配列と
    ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするｍRNA
    の発現量を測定することを特徴とする、癌化学療法剤の
    増強剤の検索方法。