JP5006045B2 - テロメライシン−gfp遺伝子含有組換えウイルス - Google Patents
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Description
一方、生体内で癌組織や転移リンパ節を検出する試みは、画像診断の分野で研究が進んでいる。例えば、PETによる生物学的診断やニューラルネットワークを駆使した画像解析などが報告されている。また、制限増殖型ウイルスの抗腫瘍活性や安全性を検討した研究報告も散見され(DeWeese TL,van der Poel H,Li S,Mikhak B,Drew R,Goemann M,Hamper U,DeJong R,Detorie N,Rodriguez R,Haulk T,DeMarzo AM,Piantadosi S,Yu DC,Chen Y,Henderson DR,Carducci MA,Nelson WG,Simons JW.A phase I trial of CV706,a replication−competent,PSA selective oncolytic adenovirus,for the treatment of locally recurrent prostate cancer following radiation therapy.Cancer Res 61(20):7464−72,2001)、本発明者も、テロメラーゼのプロモーターを有し、かつ増殖能を有するウイルスを癌細胞に感染させることにより、ウイルスの増殖により癌細胞を死滅ことができることを見出した(Kawashima T,Kagawa S,Kobayashi N,Shirakiya Y,Umeoka T,Teraishi F,Taki M,Kyo S,Tanaka N,Fujiwara T.Related Articles,Links Abstract Telomerase−specific replication−selective virotherapy for human cancer.Clin Cancer Res 10(1):285−92,2004)。
しかし、癌細胞へのターゲッティングの困難さから、術中のin situでの癌検出システムは未だ開発されていない。また、ウイルスを生体内に感染させた場合の癌細胞内動態を、実際に癌組織の可視化に応用した研究はまだ知られていない。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、蛍光標識タンパク質をコードする遺伝子をウイルスゲノムのE3領域に組み込み、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットをE1領域に組み込み、両カセットを発現させることにより、癌細胞を極めて高感度に検出し、しかも、生体内において検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1)ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのE3領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、癌細胞検出用試薬。
(2)ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのE3領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、癌の診断用試薬。
上記(1)及び(2)において、これらの試薬は、体内における検出、診断又はナビゲーション手術のために使用することができる。これらのヒトテロメラーゼプロモーターとしてhTERTプロモーターを、標識タンパク質としてGFPを例示することができる。この標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター又はhTERTプロモーターを使用することができる。さらにウイルスとしては、例えばアデノウイルスが挙げられる。
(3)ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、細胞死誘導関連タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む細胞死誘導カセットがウイルスゲノムのE3領域に組み込まれた組換えウイルスを含む細胞死誘導剤。
この場合、ヒトテロメラーゼのプロモーターがhTERTプロモーターであってもよい。また、細胞死誘導関連タンパク質としては、免疫関連タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質、及びテロメラーゼ関連タンパク質が挙げられる。さらに、例えば、免疫関連タンパク質としてPA28を、アポトーシス誘導タンパク質としてTRAILを、テロメラーゼ関連タンパク質としてAU5を例示することができる。また、細胞死誘導関連タンパク質の発現を制御しうるプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター又はhTERTプロモーターであってもよく、さらにウイルスがアデノウイルスであってもよい。本発明の細胞として、癌細胞を使用することもできる。
(4)上記(1)の試薬を癌細胞に感染させ、当該癌細胞から発する蛍光を検出することを特徴とする、癌細胞の検出方法。
(5)上記(2)の試薬を癌細胞に感染させ、当該癌細胞から発する蛍光を検出することを特徴とする、癌の診断方法。
(6)上記(3)の誘導剤を標的細胞に感染させることを特徴とする、該標的細胞の細胞死を誘導する方法。
図2は、非増殖性ウイルスの増殖を示す図である。
図3は、インビトロにおけるAd−GFP共感染による癌細胞の検出結果を示す図である。
図4は、インビボにおけるAd−GFP共感染によるヒト癌組織の検出結果を示す図である。
図5は、ヒト肺癌細胞へのテロメライシン−GFP感染による形態学的変化を示す図である。
図6は、ヒト肺癌細胞へのテロメライシン−GFP感染によるGFP蛍光発現を示す図である。
図7は、定量的リアルタイムPCRによるテロメライシン−GFP増殖を示す図である。
図8は、ヒト大腸癌細胞へのテロメライシン−GFP感染によるGFP蛍光発現を示す図である。
図9は、定量的リアルタイムPCRによるテロメライシン−GFP増殖を示す図である。
図10は、正常ヒト肺線維芽細胞(NHLF)へのテロメライシン−GFP感染による形態学的変化を示す図である。
図11は、正常ヒト肺線維芽細胞(NHLF)へのテロメライシン−GFP感染によるGFP蛍光発現を示す図である。
図12は、定量的リアルタイムPCRによるテロメライシン−GFP増殖の比較を示す図である。
図13は、蛍光イメージングによるテロメライシン−GFPの腫瘍内増殖・複製を示す図である。
図14は、蛍光イメージングによるテロメライシン−GFPの腫瘍内増殖・複製を示す図である。
図15は、蛍光イメージングによるテロメライシン−GFPのリンパ節転移モデルにおける腫瘍内増殖・複製を示す図である。
図16は、ヌードマウスとHT29ヒト大腸癌細胞を用いた同所性直腸癌モデルにおける組織学的解析を示す図である。
図17は、ヌードマウスとHT29ヒト大腸癌細胞を用いた同所性直腸癌モデルにおける開腹所見を示す図である。
図18は、蛍光イメージングによるHT29直腸腫瘍および傍大動脈リンパ節におけるテロメライシン−GFPの腫瘍内増殖・複製を示す図である。
図19は、蛍光イメージングによる傍大動脈リンパ節におけるテロメライシン−GFPの腫瘍内増殖・複製を示す図である。
図20は、蛍光イメージングによる傍大動脈リンパ節におけるテロメライシン−GFPの腫瘍内増殖・複製を示す図である。
本明細書に記載された参考文献は、参照として本明細書の全体に組み込まれるものとする。
1.癌細胞検出用試薬及び検出方法
本発明は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのE3領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、癌細胞検出用試薬である。また、本発明は、当該試薬を癌細胞に感染させ、当該癌細胞から発する蛍光を検出することを特徴とする、癌細胞の検出方法である。本発明において、「組換えウイルス」とは、後述の複製カセットと標識カセットがゲノムに組み込まれたウイルスをいう。用いられるウイルスは特に限定されないが、安全性等の点からアデノウイルスが好ましい。また、アデノウイルスの中でも、使用の簡便さ等の点からタイプ5のアデノウイルスが特に好ましい。
本発明に使用される組換えウイルスは、アデノウイルスゲノムのE1領域相当する領域に複製カセットが、及びアデノウイルスゲノムのE3領域に相当する領域に標識カセットが組み込まれたものである。複製カセットは、ヒトテロメラーゼプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むものであり、ヒトテロメラーゼプロモーターにより、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子が駆動され、癌細胞特異的およびテロメラーゼ特異的に増殖・複製される。また、標識カセットは、プロモーター及び標識タンパク質をコードする遺伝子を含むものであり、例えばCMV(サイトメガロウイルス)プロモーター又はhTERTプロモーターにより標識タンパク質をコードする遺伝子が駆動される(図1)。
「テロメラーゼプロモーター」は、テロメラーゼの転写開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節する。テロメラーゼとは、真核生物染色体の複製時の短縮に拮抗して、テロメア長を維持する酵素である。このようなテロメラーゼプロモーターの種類は、目的とする遺伝子の発現に用いるウイルスに対応しうる、適切なプロモーターであればいかなるものでもよく、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)のプロモーターが好ましい。hTERTは、その5’末端の上流1.4kbpの領域には、多くの転写因子結合配列が確認されており、その領域がhTERTプロモーターと考えられるが、中でも、翻訳開始部位の上流181bpの配列が下流の遺伝子発現に重要なコア領域である。本発明において、このコア領域を含むものであれば、限定されずに使用することができるが、このコア領域を完全に含む上流378bp程度の配列をhTERTプロモーターとして使用するのが好ましい。この378bp程度の配列は、181bpのコア領域単独の場合と比べて、その遺伝子発現効率が同等であることが確認されている。455bpの長さのhTERTプロモーターの塩基配列を配列番号1に示す。
hTERTプロモーターは、配列番号1に示される塩基配列のほか、配列番号1からなるDNAに対し相補的な塩基配列よりなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつhTERTプロモーター活性を有するヌクレオチドの塩基配列も含まれる。このようなヌクレオチドは、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜2×SSC、0.1%〜0.5%SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1%SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989);特にSection9.47−9.58)等を参照することができる。
本発明において、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含むこととしたのは、IRES配列をE1A遺伝子とE1B遺伝子との間に挿入したものを使用すると、ウイルスが宿主細胞に感染した際に、増殖能が高くなるためである。なお、E1A遺伝子とE1B遺伝子は、E1遺伝子に含まれる遺伝子であるが、このE1遺伝子とは、ウイルスの有するDNA複製に関する初期遺伝子(early:E)と後期遺伝子(late:L)のうちの初期遺伝子の一つをいい、ウイルスゲノムの転写の制御に係わるタンパク質をコードしている。E1A遺伝子によりコードされるE1Aタンパク質は、感染可能なウイルス産生に必要な遺伝子群(E1B、E2、E4等)の転写を活性化する。E1B遺伝子でコードされるE1Bタンパク質は、後期遺伝子(L遺伝子)のmRNAが、感染した宿主細胞の細胞質へ蓄積するのを助け、宿主細胞のタンパク質合成を阻害することで、ウイルスの複製を促進する。E1A遺伝子、E1B遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号2及び配列番号3に示す。
E1A及びE1Bは、それぞれ配列番号2及び配列番号3に示される塩基配列のほか、配列番号2及び配列番号3からなるDNAに対し相補的な塩基配列よりなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ各々E1A及びE1B活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。このような塩基配列は、それぞれ配列番号2及び配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜2×SSC、0.1%〜0.5%SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1%SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989);特にSection9.47−9.58)等を参照することができる。
IRES(Internal Ribosome Entry Site)とは、ピコルナウイルス科に特異的なタンパク質合成開始シグナルであり、18SリボソームRNAの3’末端と相補的な配列があるためリボソーム結合部位としての役割を果たすと考えられている。ピコルナウイルス科のウイルス由来mRNAはこの配列を介して翻訳されることが知られている。IRES配列からの翻訳効率は高く、mRNAの途中からでもキャップ構造非依存的にタンパク質合成が行われる。したがって、本ウイルスでは、ヒトテロメラーゼのプロモーターによりE1A遺伝子とIRES配列の下流にあるE1B遺伝子の両方が独立に翻訳される。IRESを使用すると、テロメラーゼプロモーターの発現制御がE1A遺伝子、E1B遺伝子に独立して及ぶために、E1A遺伝子あるいはE1B遺伝子のいずれか一方をテロメラーゼプロモーターで制御する場合に比べて、ウイルスの増殖をより厳格にテロメラーゼ活性を有する細胞に限定することができる。IRES配列を配列番号4に示す。
また、IRESは、配列番号4に示される塩基配列のほか、配列番号4からなるDNAに対し相補的な塩基配列よりなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつIRES活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。このような塩基配列は、配列番号4で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜2×SSC、0.1%〜0.5%SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1%SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989);特にSection9.47−9.58)等を参照することができる。
また、本発明において、ヒトテロメラーゼのプロモーターはE1遺伝子の上流に有する。テロメラーゼ活性を有する細胞内で増殖を促進することができるからである。
本発明の複製カセットに含まれる遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987)Section 6.1−6.4)又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Moleculer eloning 2nd Edt.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたPCR産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、エチジウムブロマイドを用いる方法、SYBR GreenI(Molecular probes社)を用いる方法、GENECLEAN(フナコシ)、QIAGEN(QIAGEN社)等によるアガロースゲルを用いる方法、DEAE−セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ&スクイーズ法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、DNA断片をアガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463)等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサー(例えば、ABI PRISM(アプライドバイオシステムズ社))を利用して配列を解析することも可能である。
その後、上記のようにして得られた各々の遺伝子を所定の順序となるように連結させる。まず、上記各々の遺伝子を公知の制限酵素等で切断し、切断した当該遺伝子のDNA断片を公知のベクターに公知の方法に従って挿入し、連結する。公知のベクターとしては、脳心筋炎ウイルス(ECMV)のIRES(mRNA内部のリボソーム結合サイト)が含まれていて、1種類のmRNAから2箇所のオープンリーディングフレーム(ORF)を翻訳することが可能なpIRESベクターのほか、大腸菌由来のプラスミド(pCR4、pCR2、pCR2.1、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13など)、枯草菌由来のプラスミド(pUB110、pTP5、pC194など)、酵母由来プラスミド(pSH19、pSH15など)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、pA1−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neoなどが用いられるが、本発明の場合は、pIRESベクターを用いると、マルチクローニングサイトに、順次必要な遺伝子を挿入することにより、「ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子」をこの順に含む複製カセットを作製することができるため、好ましい。DNAの連結には、DNAリガーゼを用いることができる。本発明において、ヒトテロメラーゼとしてhTERTを用いる場合について以下に具体的に説明する。
293細胞等のE1遺伝子を発現している細胞からE1A−S、E1A−AS、E1B−S、E1B−AS等の適当なプライマーを用いて、RT−PCR及び/又はDNA−PCRを行うことによりE1A遺伝子及びE1B遺伝子を増幅し、必要に応じてTAクローニング等の公知の方法を用いて配列を確認した後、公知の制限酵素でE1A及びE1BのDNA断片を切り出す。
次に、本発明に使用されるhTERT−E1A−IRES−E1Bからなる複製カセットは、pIRESベクターのような公知のベクターに『hTERTプロモーター配列−E1A−IRES−E1B』の順になるように各遺伝子を、マルチクローニングサイト等を利用して挿入することにより作製することができる。また、必要に応じて、pShuttleなどの公知ベクターに含まれるサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを公知の制限酵素により取り除き、その部位にphTERT−E1A−IRES−E1Bから適当な制限酵素を用いて切り出した配列を挿入することができる。このように、本発明に使用されるhTERT−E1A−IRES−E1Bからなる複製カセットのみを組込んだアデノウイルスを「テロメライシン」又は「Telomelysin」という。hTERTプロモーターの制御下にアデノウイルスの増殖に必要なE1遺伝子を発現させることによって、ウイルスを癌細胞特異的に増殖させることができる。
本発明の試薬として使用される組換えウイルス中には、複製カセットと共に標識カセットも含む。この「標識カセット」は、例えば、アデノウイルスではE3領域に組み込まれる。
ここで、本発明において使用される組換えウイルスであるウイルスベクター本来の機能は、ウイルス増殖による細胞障害である。従って、本発明の試薬を微小癌組織の診断目的で使用するためには、上記細胞障害が発生する時期はできるだけ遅い方が好ましい。その理由は、細胞が破壊されると本発明の組換えウイルスの増殖で生じた蛍光発現が消失し、その存在部位を同定するのが困難となるためである。
一方、例えば、アデノウイルスE3領域にはE3AおよびE3Bが存在し、E3A領域の11.6kDaのADP(adenovirus death protein)が、細胞障害及びウイルスの拡散を促進する機能を有している。
従って、本発明に使用する組換えウイルスは、ADPを含むE3領域のような細胞障害及びウイルスの拡散を促進する機能を有するタンパク質をコードするウイルスゲノム領域を除去することで細胞死のタイミングを遅らせ、GFP等の蛍光発現による癌組織の同定を容易にしている。
標識カセットを構成する標識タンパク質は、上記ウイルスが増殖した細胞内で発光して可視化されるタンパク質であり、好ましくは蛍光を発する物質が用いられる。このような物質としては、例えば、オワンクラゲ(Aequorea victorea)などの発光クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein:GFP)、それを改変した変異体(GFP バリアント)である、EGFP(Enhanced−humanized GFP)又はrsGFP(red−shift GFP)などが挙げられる。また、黄色蛍光タンパク質(yellow fluorescent protein:YFP)、藍色蛍光タンパク質(cyan fluorescent protein:CFP)、青色蛍光タンパク質(blue fluorescent protein:BFP)、ウミシイタケ(Renilla reniformis)由来のGFPを使用することも可能であり、これらをコードする遺伝子を本発明に使用することができる。
また、上記遺伝子の発現を制御しうるプロモーターとは、目的とする上記遺伝子の発現に用いるウイルスに対応しうる、適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、hTERTプロモーター、SV40後期プロモーター、MMTV LTRプロモーター、RSV LTRプロモーター、SRαプロモーター等が挙げられるがこれに限定されるものではない。好ましくはCMVプロモーター又はhTERTプロモーターを用いることができる。
本発明の標識カセットに含まれる組換え遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987)Section 6.1−6.4)又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Moleculer cloning 2nd Edt.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたPCR産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、エチジウムブロマイドを用いる方法、SYBR GreenI(Molecular probes社)を用いる方法、GENECLEAN(フナコシ)、QIAGEN(QIAGEN社)等によるアガロースゲルを用いる方法、DEAE−セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ&スクイーズ法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、DNA断片をアガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463)等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサー(例えば、ABI PRISM(アプライドバイオシステムズ社))を利用して配列を解析することも可能である。その後、上記のようにして得られた遺伝子をを公知の制限酵素等で切断し、切断した当該遺伝子のDNA断片を、上記標識タンパク質をコードする遺伝子断片の上流に、当該遺伝子を駆動させうるように上記プロモーターをコードする遺伝子断片を配置するように組換え遺伝子を設計する。このとき、プラスミドとして、シャトルプラスミドpHM11などを用いることができる。そして、DNAリガーゼを用いて両遺伝子を連結させ、ベクターに挿入し、標識カセット組換え遺伝子を作製する。
公知のベクターとしては、pShuttleベクター、大腸菌由来のプラスミド(pCR4、pCR2、pCR2.1、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13など)、枯草菌由来のプラスミド(pUB110、pTP5、pC194など)、酵母由来プラスミド(pSH19、pSH15など)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、pA1−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neoなどが用いられる。
その後、上記複製カセット及び標識カセットを含む組換え遺伝子を、適当な制限酵素を用いて切り出し、適当なウイルス発現ベクター挿入することにより、組換えウイルスを作製することができる。ウイルス発現ベクターには、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどが挙げられえるが、上記したように、アデノウイルス、特にタイプ5のアデノウイルスが好ましい。カセットのウイルスへの組み込みは、例えばエレクトロポレーション法、リポソーム法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を用いることができる。
本発明では、具体的には、シャトルプラスミドpHM11にpEGFP−N1(CLONTECH)由来のCMV−EGFP−SV40P(A)を挿入し、このプラスミドのCsp45I断片を、phTERT−E1A−IRES−E1Bを組み込んだpShuttleベクターのClaI部位に挿入することによって得ることができる。
本発明では、具体的には、上記のように作製した組換え遺伝子から、公知の制限酵素により必要な部分の配列を切り出し、Adeno−X Expression System(CLONTECH)等の市販のキットを用いてAdeno−X Viral DNA等のウイルスのDNAに挿入することができる(得られたものを「AdenoX−hAIB」という。)。
そして、このAdenoX−hAIBを公知の制限酵素により線状化した後、293細胞等の培養細胞にトランスフェクションすることで、感染性のある組換えウイルスを作製することができる。
本発明において検出の対象となる癌細胞の種類は、限定されるものではなく、あらゆる種類の癌の細胞を用いることができる。例えば、頭頸部、胃、大腸、肺、肝、前立腺、膵、食道、膀胱、胆嚢・胆管、乳房、子宮、甲状腺、卵巣等における固形癌、あるいは白血病、リンパ腫、肉腫、間葉系腫瘍等に有効である。ヒトの組織由来の癌細胞のほとんどはテロメラーゼ活性の上昇を示しており、本発明はそのようなテロメラーゼ活性により増殖が活発になった癌細胞を全般的に検出することが可能である。
癌細胞では正常細胞と比較してテロメラーゼの発現が極めて高いため、テロメラーゼが含まれる癌細胞においてはhTERTが発現し、複製カセットが機能する。これによりウイルスは増殖し、また増殖によって標識タンパク質の複製も増加することから、標識タンパク質が発現して可視化されることとなる。
したがって、本発明の試薬は、正常細胞では蛍光発色せず、本発明の試薬を含む癌細胞は発光し、癌細胞を視覚的に観察することができる。
組換えウイルスを細胞に感染させるには、例えば、以下の方法がある。まず、ヒト大腸癌細胞SW620、ヒト肺癌細胞A549、H1299等の細胞を適当な培養液が入った培養プレートに播き、炭酸ガス存在下で、37℃で培養する。培養液は、動物細胞培養に一般的に使用されるDMEM、MEM、RPMI−1640などが採用され、必要応じて血清、抗生物質、ビタミン等を添加することができる。培養した細胞に一定量の本ウイルス、例えば、0.1〜10MOI(multiplicity of infection)、好ましくは、1MOIを接種することにより感染させる。MOIとは、一定量の培養細胞に一定量のウイルス粒子を感染させる場合のウイルス量(感染単位)と細胞数の比をいい、ウイルスを細胞に感染させる際の指標として用いられる。
なお、ウイルス増殖を確認するには、ウイルス感染細胞を回収し、DNAを抽出し、本ウイルスが有する適当な遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイムPCRを行うことで定量的に解析することができる。
標識された細胞の検出については、ウイルス増殖がみられる細胞は、励起光をあてることにより所定の蛍光(例えばGFPの場合は緑色蛍光)を発するため、それにより癌細胞を可視化することができる。例えば、ウイルス感染細胞を蛍光顕微鏡下に観察すると、細胞でGFP蛍光発現が見られる。またウイルス感染細胞を経時的に観察するには、CCDカメラを用いて、経時的にGFP蛍光発現を観察することができる。
生体内において細胞をリアルタイムで標識および検出するには、本発明の組換えウイルスを生体内に投与すればよい。
本発明の試薬はそのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等に、注射、鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体(対象となる細胞や臓器)に導入することもできる。投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、一日投与量として、通常有効成分である本発明ウイルスの量を106〜1011PFU(plaque forming units)程度、好ましくは109〜1011PFU程度とするのがよく、1日1回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
生体内においてリアルタイムで標識を観察することは、体内診断薬に用いるメリットがある。これは、いわゆるナビゲーション手術などに有用である。
外科手術において、病変臓器を含めて広範囲の切除を行えば、手術を乗り切った患者では長期生存が得られる。しかし、手術そのものによる合併症の発生率は高くなり、また機能を失うことで術後の日常生活への影響は避けられない。長期生存の遠隔成績を維持しながら、患者の負担を軽減した低侵襲な治療を導入することは、癌治療において重要なことである。
必要最小限の切除を行う手術の縮小化による低侵襲化を目指す場合にほしい情報の一つに転移リンパ節の有無があり、それを知る方法としてセンチネルリンパ節(sentinel node,SN)が注目されている。SNとは腫瘍から最初にリンパ流をうけるリンパ節であり、ここに最初の微小転移が生ずるという仮説がある。この仮説をSN理論という。乳癌では欧米を中心に大規模な臨床試験が開始されているが、その他の固形腫瘍にもこの考え方が通用するかについては未だ不明であり、その検証がはじまったところである。
本発明の試薬による体内癌診断システムは、SNより有効な方法として、癌細胞において蛍光タンパク質を直接発現させ、高感度術中蛍光検出システムにより腫瘍組織又は転移陽性リンパ節を同定する技術、すなわち「ナビゲーション手術」の技術を確立することができる。テロメラーゼ活性を持つ多くの癌細胞では本発明の組換えウイルスが増殖し、例えばGFPの強い緑色蛍光を発することができる。
胃癌の単発リンパ節転移部位の解析から、10%前後のskip転移、すなわち第1群リンパ節を飛び越した第2群以遠リンパ節への初発転移が報告されており、これを根拠としてSNナビゲーションの危険性を唱える意見も多い。しかしながら、本発明の試薬による体内癌診断システムは、腫瘍組織又は転移陽性リンパ節を直接術中にリアルタイムに同定し、切除範囲のナビゲーションとするものであり、独創的かつ画期的であるとともに、よりスムースに手術を進めるためには極めて実用的である。具体的には、SNナビゲーションの際と同様の手技で、本発明の試薬を手術より数日前に内視鏡的に腫瘍部(例えば胃癌や大腸癌周囲の胃・大腸粘膜、胃癌・大腸癌・肺癌・膵癌などの腫瘍内部、等)に注入し、腫瘍浸潤組織、腫瘍転移組織、あるいは所属リンパ節へウイルスが分布し、腫瘍部位又は転移陽性部位でのウイルスが増殖するために十分な時間をおく。
手術時には、開腹後にGFP蛍光励起光源から術野を投射し、特殊3CCDカメラからの映像をフェース・マウント・ディスプレイに投影する。透過レンズを使用することで、実際の術野の視野も確保でき、オーバーラップしたGFP画像により転移陽性リンパ節を検出することができる。さらに、専用フィルターを装着することで、カメラを用いずに肉眼的に蛍光を視認することが可能となる。
2.体外診断用試薬
本発明の試薬は、スクリーニング目的の体外診断薬としても応用可能である。現在、腫瘍マーカーの定量は、肉眼的に検出できない、あるいは原発巣が同定できない癌の存在を知る最も一般的な方法である。しかし、腫瘍マーカーはその癌特異性で必ずしも満足できるものではなく、またすべての癌種を単一のマーカーで検索することは極めて困難である。
テロメラーゼはヒト悪性腫瘍の85%以上で活性の上昇が確認されており、その癌特異性に関しては極めて高いと考えられる。
本発明の試薬を用いた体外的癌診断は、例えば以下の通り行うことができる。
被験者から採取した全血から赤血球を除き、その他の細胞浮遊液に一定の比率(0.1〜10MOI、好ましくは、1MOI)の本発明の試薬を試験管内で混合する。一定の時間(例えば12〜48時間)放置し、癌細胞へのウイルスの感染および増殖を促し、その細胞分画におけるGFP発現をフローサイトメトリーにて定量的に解析する。このシステムを用いて、末梢血中に存在する遊離癌細胞を高感度に検出することが可能となる。この方法は、末梢血中にごく微量にしか存在しない遊離癌細胞を検出するために用いることができる。
3.細胞死誘導剤及び細胞死を誘導する方法
本発明は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、細胞死誘導関連タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む細胞死誘導カセットがウイルスゲノムのE3領域に組み込まれた組換えウイルスを含む細胞死誘導剤を提供する。好ましくは、癌細胞の細胞死の誘導剤として、癌の遺伝子治療、さらに手術後の再発予防、転移の防止及び/又は予防等にも使用できる。
本発明の細胞死誘導剤に含まれる組換えウイルスの細胞死誘導カセットには、プロモーターにより駆動される細胞死を誘導しうるタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれている。
この組換えウイルスに用いられる細胞死誘導カセットには、細胞死誘導関連タンパク質をコードする遺伝子と該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターが含まれる。したがって、例えば本発明の誘導剤を癌細胞に導入すると、癌細胞で特異的にウイルスが増殖する結果、細胞死誘導タンパク質の細胞内発現量が高まり、他の正常細胞を傷つけることなく、癌細胞でのみ細胞死を誘導することができる。
細胞死誘導関連タンパク質をコードする遺伝子とは、特定の細胞の細胞死の誘導に関連するタンパク質をコードする遺伝子をいう。
細胞死誘導関連タンパク質として、例えば以下のものが挙げられ、本発明においてはこれらのタンパク質をコードする遺伝子を組み込むことができる。
たとえば、免疫関連タンパク質として、PA28が挙げられる。PA28は細胞内のプロテアソームを活性化するタンパク質であり、過剰発現により免疫反応を惹起するとともに細胞死も誘導するタンパク質である。また、アポトーシス誘導タンパク質として、TRAILが挙げられる。TRAILは、細胞表面の受容体と結合することでアポトーシス細胞死を誘導する分子をいう。テロメラーゼ関連タンパク質として、AU5が挙げられる。AU5は、テロメラーゼ活性を有する細胞で細胞死を誘導することができる配列を有する。
これらの細胞死誘導関連タンパク質の遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987)Section 6.1−6.4)又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Moleculer cloning 2nd Edt.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたPCR産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、エチジウムブロマイドを用いる方法、SYBR GreenI(Molecular probes社)を用いる方法、GENECLEAN(フナコシ)、QIAGEN(QIAGEN社)等によるアガロースゲルを用いる方法、DEAE−セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ&スクイーズ法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、DNA断片をアガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463)等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサー(例えば、ABI PRISM(アプライドバイオシステムズ社))を利用して配列を解析することも可能である。
また、癌細胞の細胞死の誘導物質として、癌抑制遺伝子も含む。癌抑制遺伝子は癌細胞の増殖を抑える機能を有しているからである。この場合、癌抑制遺伝子は、例えば従来の遺伝子治療で用いられている以下のものが挙げられる。
p53(配列番号11;Accession No.M14694):多種の癌
p15(配列番号12;Accession No.L36844):多種の癌
p16(配列番号13;Accession No.L27211):多種の癌
APC(配列番号14;Accession No.M74088):大腸癌、胃癌、すい臓癌
BRCA−1(配列番号15;Accession No.U14680):卵巣癌、乳癌
DPC−4(配列番号16;Accession No.U44378):大腸癌、すい臓癌
FHIT(配列番号17;Accession No.NM112012):胃癌、肺癌、子宮癌
p73(配列番号18;Accession No.Y11416):神経芽細胞種
PATCHED(配列番号19;Accession No.U59464):基底細胞癌
Rbp110(配列番号20;Accession No.M15400):肺癌、骨肉種
DCC(配列番号21;Accession No.X76132):大腸癌
NF1(配列番号22;Accession No.NM000267):神経繊維腫症1型
NF2(配列番号23;Accession No.L11353):神経繊維腫症2型
WT−1(配列番号24;Accession No.NM000378):ウィルムス腫瘍
これらの癌抑制遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。必要に応じて、DNAシークエンスにて期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。
上記遺伝子の発現を制御しうるプロモーターとは、目的とする遺伝子の発現に用いるウイルスに対応しうる、適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。好ましくはCMVプロモーター又はhTERTプロモーターを用いうるが、これに限定されず、例えば、SV40後期プロモーター、MMTV LTRプロモーター、RSV LTRプロモーター、SRαプロモーター等を用いることができる。
本発明の細胞死誘導剤は、そのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体(対象となる細胞や臓器)に導入することもできる。
また、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま若しくは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤(緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。)などと混合することができる。
本発明の細胞死誘導剤は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、筋肉、腹腔等への局部注射、静脈への注射等が例示される。
投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、一日投与量として、通常有効成分である本発明ウイルスの量を106〜1011PFU(plaque forming units)程度、好ましくは109〜1011PFU程度とするのがよく、1日1回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
また、本発明のウイルスを使用する際には、公知の免疫抑制剤等を用いることにより、生体の免疫を抑制し、該ウイルスが感染し易くすることもできる。更に、本発明のウイルスは、公知の抗癌剤及び放射線からなる群から選ばれる少なくとも1種の抗癌剤を併用することもできる。抗癌剤には、以下のものがあるが、これらに限定されない。
(1)アルキル化活性剤:この製剤は、癌細胞の核酸タンパク質にアルキル基を導入して細胞障害を起こさせる作用を有するものであり、例えばカルボコン、プスルファン(マスタード薬)、ニムスチン(ニトロソウレア類)などがあげられる。
(2)代謝拮抗活性剤:この製剤は、代謝過程で酵素に拮抗して、細胞合成を阻害する作用を有するものであり、例えばメトトレキサート(葉酸系)、メルカプトプリン、(プリン系)、シタラビン(ピリミジン系)、フルオロウラシル、テガフール、カルモフールなどがあげられる。
(3)抗生物質:抗癌作用を有する、アクチノマイシンD、プレオマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシンCなどがあげられる。
(4)微小管阻害活性剤:この製剤は、微小管に作用して抗腫瘍効果を示すものであり、例えばドセタキセル、パクリタキセル(タキサン)、ビノレルビン、ピンクリスチン、ビンブラスチン(アルカロイド系)などがあげられる。
(5)白金製剤:この製剤は、DNA鎖内又は鎖間結合あるいはDNAタンパク質結合を構成して、DNA合成を阻害する作用を有するものであり、例えば、シスプラチン、アルボプラチン、ネダプラチンなどがあげられる。
(6)トポイソメラーゼ阻害活性剤:トポイソメラーゼを阻害する、イリノテカン(トポイソメラーゼI阻害薬)、ポドフィロトキシン誘導体(トポイソメラーゼII阻害薬)などがあげられる。なお、トポイソメラーゼとは、DNAに一時的に切れ目を入れてDNA鎖のリンキング数を変える反応を触媒する酵素である。
本発明の細胞死誘導剤等は、以下の理由で副作用が生じる可能性は極めて低いと考えられ、非常に安全な製剤であるということができる。
(1)正常の体細胞ではテロメラーゼ活性がほとんどなく、また、造血細胞等の浮遊細胞では本発明のウイルスは感染しにくい。
(2)本発明のウイルスは増殖能を有するので、通常の遺伝子治療で用いられている非増殖性ウイルスよりも低い濃度で使用することができる。
(3)本発明のウイルスが過剰に投与された場合であっても、生体内の通常の免疫作用によって抗ウイルス作用が働く。
本発明の組換えウイルスを標的細胞中で感染させることで標的細胞において細胞死を誘導することができる。標的細胞の種類は特に限定されるものではないが、例えば腫瘍細胞、増殖が活発な細胞、テロメラーゼ活性が上昇している細胞などを挙げることができる。
細胞死が誘導されたか否かを判断するには、形態学的観察を以下の方法により行うことができる。すなわち、培養容器の底面に付着した細胞に本発明の組換えウイルスを感染させ一定の時間を経ると、倒立顕微鏡下で細胞は円形化し、底面からはがれて光沢を持った細胞として培養液中に浮遊する。この時点で細胞はその生命を維持する機構に破綻を来たしており、細胞死が誘導されたと判断できる。また、テトラゾリウム塩(MTT、XTTなど)を用いた市販の生細胞アッセイキットでも、細胞死を確認することができる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本実施例は、複製カセットを含むウイルス「テロメライシン(Telomelysin)」と、標識カセットを含む非増殖型ウイルス「Ad−GFP」とを共感染させたときに、インビトロで蛍光を発するかどうかを予備的に検討したものである。
ヒト大腸癌細胞SW620、ヒト肺癌細胞A549、H1299に0.1MOI(multiplicity of infection)のAd−GFPを感染させた(図2)。
その結果、ヒト大腸癌細胞SW620、ヒト肺癌細胞A549、H1299に0.1MOIのAd−GFPを感染させてもほとんど緑色傾向は認められないが、1MOIのTRADを併用すると癌細胞のみで蛍光が検出でき、WI38やNHLFなどのヒト線維芽細胞やヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)などの正常細胞では蛍光はまったく見られなかった(図3)。
本実施例は、複製カセットを含むウイルス「テロメライシン」と、標識カセットを含む非増殖型ウイルス「Ad−GFP」とを共感染させたときに、インビボで蛍光を発するかどうかを予備的に検討したものである。
ヌードマウスの背部皮下に移植したヒト大腸癌SW620およびヒト肺癌A549腫瘍に、8×105PFUのAd−GFPと8×106PFUのTRADを腫瘍内投与し、経時的に蛍光を観察した。
その結果、いずれの腫瘍でも投与後2日目から斑状の蛍光が検出され、14日目までに消失していたことが示された(図4)。
1.テロメラーゼプロモーターとE1遺伝子を含む複製カセット及びGFPタンパク質をコードする遺伝子を含む標識カセットを単一のウイルスに含むGFP発現増殖型ウイルス(テロメライシン−GFP)の作製
テロメライシン−GFPの概要を図1に示す。テロメライシン−GFPは、hTERTプロモーターによりE1A/IRES/E1Bが駆動され、癌細胞特異的およびテロメラーゼ特異的に増殖・複製が認められる一方、さらにE3領域に、プロモーターにより駆動されるオワンクラゲ由来のGFP遺伝子が組み込まれている。したがって、ウイルス増殖がみられる細胞は励起光により緑色蛍光を発し、癌細胞を可視化することが可能となる。
このような非増殖型ウイルスは以下の通り作製した。
2.組換えウイルスの作製。
293細胞から抽出したRNAから以下の特異的プライマー(E1A−S、E1A−AS)及びPCR条件を用いてRT−PCRを行い、897bpのE1A遺伝子を増幅した。
E1A−S:5’−ACA CCG GGA CTG AAA ATG AG−3’(配列番号5)
E1A−AS:5’−CAC AGG TTT ACA CCT TAT GGC−3’(配列番号6)
293細胞から抽出したDNAより以下のプライマー(E1B−S、E1B−AS)を用いてDNA−PCRを行い、1822bpのE1B遺伝子を増幅した。
E1B−S:5’−CTG ACC TCA TGG AGG CTT GG−3’(配列番号7)
E1B−AS:5’−GCC CAC ACA TTT CAG TAC CTC−3’(配列番号8)
PCR液組成、反応条件(サイクル、温度)はE1A遺伝子の場合と同様であった。
それぞれのPCR産物のTAクローニング(TA Cloning kit dual Promoter;Invitrogen)を行い、シークエンスを確認した後、制限酵素EcoRIにより、各々911bp(E1A)、1836bp(E1B)のDNA断片を切り出した。
pIRESベクター(CLONTECH)のMluI切断部位にE1Aを、SalI部位にE1Bをそれぞれ順方向に挿入した(E1A−IRESI−E1B)。
制限酵素MluIおよびBglIIで切り出した455bpのhTERTプロモーター配列を、E1A−IRES−E1BのE1A上流にあるXhoI部位に順方向に挿入した(phTERT−E1A−IRES−E1B)。
pShuttleベクターに含まれるサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを制限酵素MfeIおよびNheI処理により取り除き、その部位にphTERT−E1A−IRES−E1Bより制限酵素NheIおよびNotIで切り出した3828bpの配列を挿入した(pSh−hAIB)。
pEGFP−N1(CLONTECH)をAgeI/NheIで切断し、クレノウ断片で平滑化し自己結合(self−ligation)した(pEGFP−N2)。
このpEGFP−N2をNsiI/AflIIで切断し、T4 DNAポリメラーゼで平滑化しBglIIリンカーを使って、BglII部位を作製した。このBglII断片をpHM11のBamHI部位に挿入した(pHM11−EGFP−N2)。
さらに、pHM11−EGFP−N2のCsp45I断片をphTERT−E1A−IRES−E1Bを組み込んだpShuttleベクター(pSh−hAIB)のClaI部位に挿入した。
作製した組換え遺伝子を制限酵素I−CeuIおよびPI−SceIにより4381bpの配列を切り出し、Adeno−X Expression System(CLONTECH)のAdeno−X Viral DNAに挿入した(AdenoX−hAIB)。AdenoX0−hAIBを制限酵素PacI処理で線状化した後、293細胞にトランスフェクションし、感染性のある組換えアデノウイルスを作製した(以下、「テロメライシン−GFP」という)。
1.ヒト肺癌細胞へのテロメライシン−GFP感染による形態学的変化
インビトロで培養中のヒト非小細胞肺癌由来H1299細胞にテロメライシン−GFPを1MOIおよび10MOIで感染させた。具体的には、24ウェルプレートに5x104個のH1299細胞を蒔き、24時間後に細胞数をカウントして1MOIあるいは10MOIとなるような濃度のウイルスを培養液中に添加した。その後、経時的に倒立顕微鏡下に細胞形態を観察し、ウイルスの細胞障害活性を検討した。
その結果、濃度依存性にまた時間依存性にウイルス増殖による細胞死が誘導された。10MOI感染後120時間では、倒立顕微鏡下にほとんどの細胞が円形となり浮遊していた(図5)。
2.ヒト肺癌細胞へのテロメライシン−GFP感染によるGFP蛍光発現
図6に示した倒立顕微鏡像を蛍光顕微鏡下に観察した。濃度依存性にまた時間依存性にウイルス増殖を示すGFP緑色蛍光が認められた(図6)。10MOI感染後72時間で最も多くの細胞でGFP発現がみられ、その後細胞死の誘導とともにGFP陽性細胞数は減少していた(図6)。
3.定量的リアルタイムPCRによるテロメライシン−GFP増殖の検証
H1299ヒト肺癌細胞に10MO1でテロメライシン−GFPを感染させ、2時間後から26、50、74時間後に細胞を回収し、DNAを抽出した。テロメライシン−GFPが有するE1A遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、ウイルス増殖・複製を定量的に解析した。用いたプライマー及びPCR条件は以下の通りである。
E1A−S:5’−CCT GTG TCT AGA GAA TGC AA−3’(配列番号9)
E1A−AS:5’−ACA GCT CAA GTC CAA AGG TT−3’(配列番号10)
その結果、テロメライシン−GFPは26時間後にはすでに100万倍に増殖しており(図7)、その後プラトーに達するが、やや遅れてGFP蛍光も増強していくことが示された(図7)。
1.ヒト大腸癌細胞へのテロメライシン−GFP感染によるGFP蛍光発現
ヒト大腸癌由来SW620細胞に10MOIでテロメライシン−GFPを感染させ、倒立顕微鏡下および蛍光顕微鏡下に経時的に変化を観察した。
その結果、H1299細胞の際と同様に、時間依存性にウイルス増殖を示すGFP緑色蛍光が認められた(図8)。
2.定量的リアルタイムPCRによるテロメライシン−GFP増殖の検証
H1299細胞と同様に、SW620ヒト大腸癌細胞に10MOIでテロメライシン−GFPを感染させ、2時間後から26、50、74、98時間後に細胞を回収、DNAを抽出し、ウイルス増殖をリアルタイムPCRにて定量的に解析した。リアルタイムPCRの条件(反応液組成、サイクル、時間等)はH1299細胞の場合と同様である。
その結果、テロメライシン−GFPは26時間後には100万倍に増殖しており、その後98時間後までほぼプラトーであった(図9)。
インビトロで培養中の正常ヒト肺線維芽細胞(NHLF)にテロメライシン−GFPを1MOIおよび10MOIで感染させ、倒立顕微鏡下に120時間まで観察した。
その結果、形態学的変化は見られず、細胞死は誘導されなかった(図10)。
2.正常ヒト肺線維芽細胞(NHLF)へのテロメライシン−GFP感染によるGFP蛍光発現
図10の倒立顕微鏡像を蛍光顕微鏡下に観察すると、若干の細胞でGFP蛍光発現は見られるが、細胞密度を考慮すると癌細胞に比べてきわめて稀であった。従って、テロメライシン−GFPはほとんど正常細胞では増殖・複製していないと考えられた(図11)。
3.定量的リアルタイムPCRによるテロメライシン−GFP増殖の検証上記のように、H1299ヒト肺癌細胞、SW620ヒト大腸癌細胞、正常ヒト肺線雑芽細胞(NHLF)に10MOIでテロメライシン−GFPを感染させ、経時的に細胞を回収、DNAを抽出し、リアルタイムPCRにてウイルス増殖を定量的に解析した。
その結果、癌細胞ではテロメライシン−GFPは24時間後には約100万倍に増殖し、72時間後には顕著なGFP蛍光を発していたのに対し、NHLFでは72時間後でも1000倍程度の増殖にとどまり、GFP蛍光もほとんど検出できなかった(図12)。
1.ヌードマウスに移植したH1299ヒト肺癌腫瘍内に107PFUのテロメライシン−GFPを投与し、CCDカメラにて経時的にGFP蛍光発現を観察した。
その結果、24時間以内にテロメライシン−GFP増殖によるGFP蛍光発現が認められるようになり、3日後、5日後とその範囲および輝度が増強した(図13)。
2.上記と同様にして、ヌードマウスに移植したH1299ヒト肺癌腫瘍内に107PFUのテロメライシン−GFPを投与し、1週間後および3週間後に皮下腫瘍を摘出した。CCDカメラにて腫瘍全体および割面でのGFP蛍光発現を観察した。
その結果、摘出腫瘍表面で蛍光発現が微弱な場合も、割面では広い範囲でテロメライシン−GFPの増殖が確認でき、3週間後の組織ではほとんど腫瘍全体で蛍光が認められた(図14)。
3.上記と同様にして、同所性モデルとしてヌードマウスの直腸壁内にHT29ヒト大腸癌細胞を移植し、肉眼的腫瘍を形成した時点で107PFUのテロメライシン−GFPを投与した。CCDカメラにて1週間後にテロメライシン−GFP増殖によるGFP蛍光発現が認められるようになり、その蛍光発現は3週間後でも維持されていた(図15)。
ヌードマウスの直腸壁内にHT29ヒト大腸癌細胞を移植し、肉眼的腫瘍を形成した時点で腫瘍を摘出、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色にて解析した。
その結果、直腸周囲には腫瘍が形成されており、さらに直腸壁内のリンパ管内にも腫瘍細胞塊が確認できた(図16)。
2.ヌードマウスとHT29ヒト大腸癌細胞を用いた同所性直腸癌モデルにおける開腹所見
HT29ヒト大腸癌細胞を直腸壁内に移植後、肉眼的腫瘍が形成された時点で開腹したところ、3個の大動脈周囲のリンパ節(LN)の腫脹が認められた(図17)。
3.蛍光イメージングによるHT29直腸腫瘍および傍大動脈リンパ節におけるテロメライシン−GFPの腫瘍内増殖・複製の検出
CCDカメラによる蛍光イメージングにより、移植されたHT29直腸腫瘍および3個のうち1個の傍大動脈リンパ節においてGFP蛍光発現が認められた(図18)。
4.蛍光イメージングによる傍大動脈リンパ節におけるテロメライシン−GFPの腫瘍内増殖・複製の検出
CCDカメラによる蛍光イメージングにより、傍大動脈リンパ節3個のうち1個のみでGFP蛍光発現が認められた(図19)。
5.蛍光イメージングによる傍大動脈リンパ節におけるテロメライシン−GFPの腫瘍内増殖・複製の検出
傍大動脈リンパ節を組織学的に解析したところ、CCDカメラによる蛍光イメージングによりGFP蛍光発現陽性であった1個のみで転移腫瘍組織が検出され、テロメライシン−GFPの増殖が転移陽性リンパ節のみであることが確認された(図20)。
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配列番号6:プライマー
配列番号7:プライマー
配列番号8:プライマー
配列番号9:プライマー
配列番号10:プライマー
Claims (9)
- ヒトテロメラーゼのプロモーター、アデノウイルスE1A遺伝子、IRES配列及びアデノウイルスE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがアデノウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがアデノウイルスゲノムのE3領域に組み込まれてADP(アデノウイルスデスプロテイン)をコードする領域が除去された組換えアデノウイルスを含む、癌細胞検出用試薬。
- ヒトテロメラーゼのプロモーター、アデノウイルスE1A遺伝子、IRES配列及びアデノウイルスE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがアデノウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがアデノウイルスゲノムのE3領域に組み込まれてADP(アデノウイルスデスプロテイン)をコードする領域が除去された組換えアデノウイルスを含む、癌の診断用試薬。
- 体内における検出、診断又はナビゲーション手術のために使用される、請求項1又は2に記載の試薬。
- ヒトテロメラーゼのプロモーターがhTERTプロモーターである、請求項1又は2に記載の試薬。
- 標識タンパク質がGFP又はEGFPである、請求項1又は2に記載の試薬。
- 標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター又はhTERTプロモーターである、請求項1又は2に記載の試薬。
- 請求項1及び3〜6のいずれか1項に記載の試薬を、被験者から採取した血液中に存在する癌細胞に感染させ、当該癌細胞から発する蛍光を検出することを特徴とする、癌細胞の検出方法。
- 癌細胞検出用試薬の製造における、下記の組換えアデノウイルスの使用。
ヒトテロメラーゼのプロモーター、アデノウイルスE1A遺伝子、IRES配列及びアデノウイルスE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがアデノウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがアデノウイルスゲノムのE3領域に組み込まれてADP(アデノウイルスデスプロテイン)をコードする領域が除去された組換えアデノウイルス - 癌の診断用試薬の製造における、下記の組換えアデノウイルスの使用。
ヒトテロメラーゼのプロモーター、アデノウイルスE1A遺伝子、IRES配列及びアデノウイルスE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがアデノウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがアデノウイルスゲノムのE3領域に組み込まれてADP(アデノウイルスデスプロテイン)をコードする領域が除去された組換えアデノウイルス
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