EA011880B1 - Рекомбинантный вирус, содержащий ген теломелизина-gfp - Google Patents
Рекомбинантный вирус, содержащий ген теломелизина-gfp Download PDFInfo
- Publication number
- EA011880B1 EA011880B1 EA200700694A EA200700694A EA011880B1 EA 011880 B1 EA011880 B1 EA 011880B1 EA 200700694 A EA200700694 A EA 200700694A EA 200700694 A EA200700694 A EA 200700694A EA 011880 B1 EA011880 B1 EA 011880B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- gene
- promoter
- virus
- cell death
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 158
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 108
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 116
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 93
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 59
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 27
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 71
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 59
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 40
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 30
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 28
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 16
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 15
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 11
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 157
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 24
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 23
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 21
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 15
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 15
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 13
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 12
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 8
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 5
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 5
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 4
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 4
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 4
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000013718 rectal benign neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 2
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 2
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 2
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- HMBNQNDUEFFFNZ-UHFFFAOYSA-N 4-ethenoxybutan-1-ol Chemical group OCCCCOC=C HMBNQNDUEFFFNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710197337 Adenovirus death protein Proteins 0.000 description 1
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229940123780 DNA topoisomerase I inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940124087 DNA topoisomerase II inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100030826 Hemoglobin subunit epsilon Human genes 0.000 description 1
- 101000868422 Homo sapiens Sushi, nidogen and EGF-like domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 101100135809 Mus musculus Pcp2 gene Proteins 0.000 description 1
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 1
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000003019 Neurofibromatosis 1 Diseases 0.000 description 1
- 208000024834 Neurofibromatosis type 1 Diseases 0.000 description 1
- 102000007517 Neurofibromin 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010085839 Neurofibromin 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150045048 Ras85D gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 101150017038 Ser gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032853 Sushi, nidogen and EGF-like domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 239000000365 Topoisomerase I Inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000317 Topoisomerase II Inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 229940044684 anti-microtubule agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 229940045696 antineoplastic drug podophyllotoxin derivative Drugs 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- KLNFSAOEKUDMFA-UHFFFAOYSA-N azanide;2-hydroxyacetic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OCC(O)=O KLNFSAOEKUDMFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 201000008806 mesenchymal cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 229950007221 nedaplatin Drugs 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000002761 neurofibromatosis 2 Diseases 0.000 description 1
- 208000022032 neurofibromatosis type 2 Diseases 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- YJGVMLPVUAXIQN-XVVDYKMHSA-N podophyllotoxin Chemical class COC1=C(OC)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@H](O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 YJGVMLPVUAXIQN-XVVDYKMHSA-N 0.000 description 1
- 239000003600 podophyllotoxin derivative Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000005005 sentinel lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- WFWLQNSHRPWKFK-ZCFIWIBFSA-N tegafur Chemical compound O=C1NC(=O)C(F)=CN1[C@@H]1OCCC1 WFWLQNSHRPWKFK-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- 229960001674 tegafur Drugs 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N vinorelbine Chemical compound C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N 0.000 description 1
- 229960002066 vinorelbine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0045—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent agent being a peptide or protein used for imaging or diagnosis in vivo
- A61K49/0047—Green fluorescent protein [GFP]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
- C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к созданию реагента для выявления раковых клеток и для диагностирования рака. В частности, данное изобретение относится к созданию реагента для выявления раковых клеток, включающего рекомбинантный вирус, в котором репликационная кассета, включающая промотор из теломеразы человека, ген Е1А, последовательность IRES и ген Е1В в таком порядке, интегрирована в область Е1 генома вируса и маркирующая кассета с геном, кодирующим маркирующий белок, и промотором, способным регулировать экспрессию гена, кодирующего маркирующий белок, интегрирована в область Е3 генома вируса.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к реагенту для выявления раковых клеток или к диагностированию рака и фактору, индуцирующему гибель клеток.
Известный уровень исследований
Активность теломеразы часто бывает увеличена в клетках, подвергшихся злокачественному преобразованию или в иммортализованных клеточных линиях, причём активность теломеразы трудно определяема в нормальных соматических клетках за исключением клеток зародышевых линий, линий клеток крови и эпителиальных клеток. Поэтому были попытки определения рака на основе теломеразной активности, как индикатора (8Нау IV., Ζου Υ., Нуаша Е., \Угщ1И ν.Ε. Те1ошега8е апй Сапсег. Нит Мо1 Сспс1 10 (7): 677-85, 2001).
С другой стороны, выявление раковых тканей и метастатических лимфатических узлов ίη νίνο интенсивно изучали в области диагностической визуализации. Например, сообщали о биологическом анализе с помощью РЕТ и визуализационного анализа, полностью используя нервную сеть. Далее, сообщали об исследованиях антиопухолевой активности и безопасности вирусов с селективной репликацией (^еVее8е Т.Ь., νаη йег Рое1 Н., Ы 8., М1кНак В., Оге\у К., Соешапп М., Натрег и., Эекпд К., Ое1опе Ν., Койпдиех К., Наи1к Т., ОеМагхо А.М., Р1ап1айо81 8., Υυ О.С., СНеп Υ., Непйегкоп Ό.Κ., Сагйиса М.А., №1коп \\'.С., 81шопк IV. А рНаке I 1па1 о! СУ706, А герНсайоп-сошрекп!, Р8А 8е1ес1ке опсо1уйс айеηον^^и8, Гог (Не 1геа1шеп1 о! 1оса11у гесиггеп! ргок1ак сапсег Го11о\утд гай1а1юп Иегару, Сапсег Кек 61(20):7464-72, 2001). Авторы настоящего изобретения также нашли, что инфицируя раковые клетки вирусом, обладающим теломеразным промотором и способностью к репликации, можно убивать раковые клетки посредством репликации вируса (Ка^акЫша Т., Кадара 8., КоЬауакЫ Ν., 8Ыгак1уа Υ., Ишеока Т., ТегакЫ Е., Такт М., Куо 8., Тапака Ν., апй Еицтага Т., Ке1а1ей Агйскк, Ьшкк АЬккас! Текшегаке-кресйк герйсайопкексЦуе уйоФегару Гог Нишап сапсег, С1ш Сапсег Кек 10(1):285-92, 2004).
Однако ещё не разработана система выявления рака ш кйи при хирургических операциях из-за трудностей целевого выявления раковых клеток. Далее, к настоящему времени не известно исследований, в которых организм инфицировали бы вирусом и кинетику вируса внутри раковых клеток действительно применяли бы для визуализации раковых тканей.
Цели изобретения
Как указано выше, желаемой целью была разработка реагента для выявления раковых клеток или для диагностирования рака и фактора, вызывающего гибель клеток, причём каждый реагент был бы способен визуализировать раковые клетки даже ш νί\Ό.
В результате интенсивных и экстенсивных исследований, направленных на решение вышеуказанных проблем, авторы настоящего изобретения нашли, что возможно выявлять раковые клетки на чрезвычайно высокочувствительном уровне и даже ш νί\Ό путём интеграции гена, включающего меченный флюоресценцией белок, в область Е3 генома вируса и интеграции репликационной кассеты с промотором теломеразы человека, геном Е1А, последовательностью 1КЕ8 и геном Е1В в названном порядке в область Е1, с последующим экспрессированием обеих кассет. Таким образом, цель настоящего изобретения была достигнута.
Существо настоящего изобретения видно из нижеследующего его описания.
(1) Реагент для выявления раковых клеток, включающий рекомбинанатный вирус, в котором репликационная кассета, включающая промотор из теломеразы человека, ген Е1А, последовательность 1КЕ8 и ген Е1 В в названном порядке, интегрирована в область Е1 генома вируса и маркирующая кассета, включающая ген, кодирующий маркирующий белок и промотор, способный регулировать экспрессию гена, кодирующего маркирующий белок, интегрирована в область Е3 генома вируса.
(2) Реагент для диагноза рака, включающий рекомбинантный вирус, в котором репликационная кассета с промотором из теломеразы человека, геном Е1А, последовательностью 1КЕ8 и геном Е1В в названном порядке интегрирована в область Е1 генома вируса и маркирующая кассета, включающая ген, кодирующий маркирующий белок и промотор, способный регулировать экспрессию гена, кодирующего маркирующий белок, интегрирована в область Е3 генома вируса.
По вышеуказанным пп. (1) и (2), эти реагенты могут быть применены для выявления ш νίνΌ, диагностирования и навигационной хирургии. В качестве специфического примера может быть указан промотор теломеразы человека, НТЕКТ. В качестве специфического примера маркирующего белка может быть назван СЕР. В качестве промотора, способного регулировать экспрессию гена, кодирующего маркирующий белок, можно применить, например, цитомегаловирус-промотор или НТЕКТ - промотор. В качестве вируса можно применить, например, аденовирус.
(3) Фактор, вызывающий гибель клеток, включающий рекомбинантный вирус, в котором репликационная кассета с промотором из теломеразы человека, геном Е1А, последовательностью 1КЕ8 и геном Е1 В в названном порядке включены в область Е1 генома вируса, а также кассета, вызывающая гибель клеток, с геном, кодирующим белок, ассоциированный с индукцией гибели клеток, и промотор, способный регулировать экспрессию гена, кодирующего белок, ассоциированный с индукцией гибели клеток, интегрированы в область Е3 генома вируса.
В данном факторе, индуцирующем гибель клеток, промотором из теломеразы человека может быть
- 1 011880 йТЕКТ-промотор. Примеры белков, ассоциированных с индукцией гибели клеток, включают ассоциированные с иммунитетом белки, индуцирующие апоптоз белки и ассоциированные с теломеразой белки. Более точно, можно назвать РА28 как ассоциированный с иммунитетом белок, ТКА1Ь можно назвать как индуцирующий апоптоз белок и ЛИ5 можно назвать как ассоциированный с теломеразой белок. Промотором, способным регулировать экспрессию белка, ассоциированного с индукцией гибели клеток, может быть цитомегаловирус-промотор или йТЕКТ-промотор; вирусом может быть аденовирус. Клеткой, составляющей предмет настоящего изобретения, может быть раковая клетка.
(4) Метод выявления раковых клеток, включающий инфицирование раковых клеток реагентом по вышеуказанному п. (1) и определение флюоресценции, излучаемой раковыми клетками.
(5) Метод диагностирования рака, включающий инфицирование раковых клеток реагентом по вышеуказанному п. (2) и определение флюоресценции, издаваемой раковыми клетками.
(6) Метод индуцирования клеточной гибели целевой клетки, включающий инфицирование целевой клетки фактором, индуцирующим гибель клетки по вышеуказанному п. (3).
Краткое описание фигур
Фиг. 1 представляет собой схему, изображающую структуру теломелизина-СБР.
Фиг. 2 представляет собой схему, изображающую репликацию нереплицирующего вируса.
Фиг. 3 представляет собой схему, изображающую результаты выявления раковых клеток при помощи соинфицирования Лй-СБР ίη νίίτο.
Фиг. 4 представляет собой схему, изображающую результаты выявления раковых тканей человека при помощи соинфицирования Лй-СБР ίη νίνο.
Фиг. 5 представляет собой схему, изображающую морфологические изменения в клетках рака лёгких человека при инфицировании теломелизином-СБР.
Фиг. 6 представляет собой схему, изображающую СБР-флюоресценцию раковых клеток лёгких человека, инфицированных теломелизином-СБР.
Фиг. 7 представляет собой схему, изображающую репликацию теломелизина-СБР, определённую при помощи количественной РСК (полимеразно-цепной реакции) в реальном масштабе времени.
Фиг. 8 представляет собой схему, изображающую СБР-флюоресценцию раковых клеток толстой кишки человека, инфицированных теломелизином-СБР.
Фиг. 9 представляет собой схему, изображающую репликацию теломелизина-СБР, определённую при помощи количественной РСК (полимеразно-цепной реакции) в реальном масштабе времени.
Фиг. 10 представляет собой схему, изображающую морфологические изменения в нормальных клетках-фибробластах лёгких человека (ЫНЬБ) при инфицировании теломелизином-СБР.
Фиг. 11 представляет собой чертёж, изображающий СБР-флюоресценцию нормальных клетокфибробластов лёгких человека (ПНЬБ) при инфицировании теломелизином-СБР.
Фиг. 12 представляет собой схему, изображающую сравнение репликаций теломелизина-СБР, определённых при помощи количественной РСК (полимеразно-цепной реакции) в реальном масштабе времени.
Фиг. 13 представляет собой схему, изображающую внутриопухолевую пролиферацию/репликацию теломелизина-СБР, наблюдаемую путём флюоресцентной визуализации.
Фиг. 14 представляет собой схему, изображающую внутриопухолевую пролиферацию/репликацию теломелизина-СБР, наблюдаемую путём флюоресцентной визуализации.
Фиг. 15 представляет собой схему, изображающую внутриопухолевую пролиферацию/репликацию теломелизина-СБР в модели метастаза в лимфатическом узле, наблюдаемую путём флюоресцентной визуализации.
Фиг. 16 представляет собой схему, показывающую гистологический анализ модели ортотопического рака прямой кишки на безволосой мыши и раковых клетках НТ29 рака толстой кишки человека.
Фиг. 17 представляет собой схему, показывающую результаты вскрытия на модели ортотопического рака прямой кишки на безволосой мыши и раковых клетках НТ29 толстой кишки человека.
Фиг. 18 представляет собой схему, изображающую внутриопухолевую пролиферацию/репликацию теломелизина-СБР в ректальной НТ29 опухоли и околоаортических лимфатических узлах, наблюдаемую путём флюоресцентной визуализации.
Фиг. 19 представляет собой схему, изображающую внутриопухолевую пролиферацию/репликацию теломелизина-СБР в околоаортических лимфатических узлах, наблюдаемую путём флюоресцентной визуализации.
Фиг. 20 представляет собой схему, изображающую внутриопухолевую пролиферацию/репликацию теломелизина-СБР в парааортических лимфатических узлах, наблюдаемую путём флюоресцентной визуализации.
Предпочтительный способ осуществления изобретения
Далее, следует подробное описание настоящего изобретения.
Ссылки, цитированные в настоящей спецификации, включены в неё в их полном виде.
1. Реагент для выявления раковой клетки и метод выявления.
Настоящее изобретение относится к реагенту для выявления раковых клеток, включающему реком
- 2 011880 бинатный вирус, в котором репликационная кассета, включащая промотор из теломеразы человека, ген Е1А, последовательность ΙΚΕ8 и ген Е1В в названном порядке, интегрирована в область Е1 генома вируса и маркирующая кассета, включающая ген, кодирующий маркирующий белок и промотор, способный регулировать экспрессию гена, кодирующего маркирующий белок, интегрирована в область Е3 генома вируса. Далее, настоящее изобретение относится к методу обнаружения раковых клеток, включающему инфицирование раковых клеток данным реагентом и выявление флюоресценции, излучаемой раковыми клетками. В данном изобретении термин «рекомбинантный вирус» означает вирус, в котором репликационная кассета и маркирующая кассета, описанная ниже, интегрированы в геном. Вирус, применяемый в настоящем изобретении, не жестко ограничен, но предпочтителен аденовирус с точки зрения безопасности. Среди аденовирусов аденовирус типа 5 особенно предпочтителен, поскольку с ним легче работать.
Рекомбинантный вирус, применённый в настоящем изобретении, обладает репликационной кассетой, интегрированной в область, соответствующую области Е1 генома аденовируса, и маркирующей кассетой, интегрированной в область, соответствующую области Е4 генома аденовируса. Репликационная кассета включает промотор из теломеразы человека, ген Е1А, последовательность ΙΚΕ8 и ген Е1В в названном порядке. Ген Е1А, последовательность ΙΚΕ8 и ген Е1В активизируются промотором теломеразы человека, что приводит к специфической для раковых клеток и специфической для теломеразы пролиферации/репликации вируса. Маркирующая кассета включает промотор и ген, кодирующий маркирующий белок. Например, ген, кодирующий маркирующий белок, побуждается цитомегаловирусным (СМУ) промотором или ΗΤΕΚΤ-промотором (фиг. 1).
«Теломеразный промотор» определяет сайт инициации транскрипции для теломеразы и прямо регулирует частоту транскрипции. Теломераза представляет собой фермент, который поддерживает длину теломеров, препятствует укорочению теломеров в период репликации эукариотических хромосом. Тип такого теломеразного промотора не особенно ограничен и можно применять любой подходящий теломеразный промотор, совместимый с вирусом, выбранным для экспрессии интересующего нас гена. Например, предпочтителен промотор для транскриптазы человека обратная транскриптаза (11ΤΕΡΤ). Ряд последовательностей, связывающих фактор транскрипции, подтверждён в области 1.4 кЬр в обратном направлении от конца 5' гена 11ΤΕΡΤ. Полагают, что эта область и есть 11ΤΕΡΤ промотор. В частности, последовательность 181 Ьр (п.о. - пар оснований), размещённая в обратном направлении от сайта инициации транскипции, представляет собой сердцевинную область, важную для экспрессии гена, расположенного в прямом направлении. В настоящем изобретении можно применить любую последовательность, включающую эту сердцевинную область. Предпочтительно применить в качестве ΗΤΕΚΤ-промотора обратную последовательность из примерно 378 п.о., содержащую всю сердцевинную область. Было доказано, что эта последовательность из примерно 378 п.о. эквивалентна 181 п.о. сердцевинной области по эффективности генной экспрессии. Последовательность нуклеотидов 11ΤΕΡΤ промотора из 455 п.о. показана в 8ΕΟ Ш N0: 1.
Последовательность нуклеотидов ΗΤΕΚΤ-промотора не ограничена последовательностью, показанной в 8Ε0 ΙΌ N0: 1. Последовательность нуклеотидов, которые при жестких условиях гибридизируют в ДНК, состоящую из нуклеотидной последовательности, дополнительной к ДНК, состоящей из 8Ε0 ΙΌ N0: 1 и обладающей активностью ΗΤΕΚΤ-промотора, также можно включить в качестве последовательности для ΗΤΕΚΤ-промотора. Такие нуклеотиды можно получить из библиотек сДНК или библиотек геномов путём таких известных методов гибридизации, как гибридизация колоний, гибридизация бляшек, Сазерн-блоттинг и др., применяя полинуклеотиды, состоящие из нуклеотидной последовательности 8Ε0 ΙΌ N0: 1 или её части, в качестве зонда. Библиотеки сДНК можно приготовить по методу, описанному в Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Мапиа1 2иб еб. (Со1б 8рпп§ НагЬог Ргезз (1989)). Другая возможность это применение коммерческих библиотек сДНК или библиотек геномов.
При вышеуказанной гибридизации примеры жестких условий включают 1х88С - 2х88С, 0,1-0,5% 8Э8 и 42-68°С. Более специфически, можно дать пример, в котором предгибридизация выполняется при 60-68°С в течение более 30 мин, а затем промывка выполняется в 2х88С, 0,1% 8Ό8 при комнатной температуре в течение 5-15 мин 4-6 раз.
Детальные описания процедур гибридизации можно найти, например, в Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Маииа1 2иб еб. (Со1б 8ргшд НагЬог Ргезз (1989)), в особенности в разделе 9.47-9.58.
Причина, почему ген Е1А, последовательность ΙΚΕ8 и ген Е1В расположены в таком порядке, в настоящем изобретении заключается в том, что вставка последовательности ΙΚΕ8 между геном Е1А и геном Е1 В даёт повышенную способность к репликации вируса, когда клетка-хозяин инфицирована им. Ген Е1А и ген Е1В - это гены, входящие в ген Е1. Это один из ранних генов вирусов, которые имеют ранние (Е) гены и поздние (Ь) гены, который принимает участие в репликации их ДНК и кодирует белок, принимающий участие в транскрипции генома вируса. Белок Е1А, кодируемый геном Ε1Α, активизирует транскрипцию группы генов (Е1В, Е2, Е4, е!с.), необходимых для того, чтобы получился инфекционный вирус. Белок Е1В, кодируемый геном Е1В, способствует накоплению позднего гена (Ь гена) тДНК в цитоплазме инфицированной клетки-хозяина и при этом ингибирует синтез белка а клетке-хозяине. Та
- 3 011880 ким образом, белок Е1В способствует репликации вируса. Нуклеотидные последовательности гена Е1А и гена Е1В показаны в БЕО ΙΌ N0: 2 и БЕО ГО N0: 3 соответственно.
Е1А и Е1В могут иметь кроме нуклеотидных последовательностей, показанных в БЕО ГО N0: 2 и БЕО ГО N0: 3, соответственно, нуклеотидные последовательности, которые гибридизируют при жестких условиях с образованием ОНА. состоящей из БЕО ГО N0: 2 или БЕО ГО N0: 3, и кодируют белок с Е1А или Е1В активностью. Такие нуклеотидные последовательности могут быть получены из библиотек сДНК или библиотек геномов на основе известных методов, таких как гибридизация колоний, гибридизация бляшек, Саузерн-блоттинг и др., с применением полинуклеотида или его части, состоящей из нуклеотидной последовательности БЕО ГО N0: 2 или БЕО ГО N0: 3 в качестве зонда, с ДНК можно получить по методам, описанным в Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Мапиа1 2иб еб. (Со1б Брпид НагЬог Ргезз (1989)). Или же возможно применить коммерческие библиотеки сДНК или библиотеки геномов. При вышеуказанной гибридизации варианты жестких условий включают 1хББС - 2хББС, 0,1-0,5% БИБ и 4268°С. Более специфически, можно дать пример, в котором предгибридизация выполняется при 60-68°С в течение более 30 мин, а затем промывка выполняется в 2хББС, 0,1% БИБ при комнатной температуре в течение 5-15 мин 4-6 раз.
Детальные описания процедур гибридизации можно найти, например, в Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Маииа1 2иб еб. (Со1б Брпид НагЬог Ргезз (1989)), в особенности в разделе 9.47-9.58.
ΙΒΕ8 (1и1егиа1 ВЬозоте Еи!гу Бйе - внутренний сайт входа в рибосому) - это сигнал инициации синтеза белка, специфический для пикорнавируса. Полагают, что сайт служит сайтом для связывания рибосомы, потому что он обладает дополнительной последовательностью к 3' терминальной последовательности 188 рибосомной ДНК. Показано, что тДНА, полученная из вируса, принадлежащего к ркотаутбае, транслируется через эту последовательность. Трансляцонная эффективность через последовательность ГВЕБ высока. Даже из середины тДНК синтез белка происходит независимо от кэп-структуры. Поэтому в вирусе по настоящему изобретению как ген Е1 А, так и ген Е1 В (который расположен в прямом направлении от последовательности ГВЕБ) транслируются независимо промотором теломеразы человека. С применением ГВЕБ осуществляется контроль экспрессии посредством теломеразного промотора независимо на гене Е1А и гене Е1 В. Поэтому в сравнении со случаями, где или ген Е1 А, или Е1 В контролируются теломеразным промотором, репликация вируса может быть более строго приурочена к клеткам, обладающим теломеразной активностью. Последовательность ГВЕБ показана в БЕО ГО N0: 4.
ГВЕБ может иметь, в отличие от нуклеотидных последовательностей, показанных в БЕО ГО N0: 4, нуклеотидные последовательности, которые гибридизируют при жестких условиях в ДНК, состоящие из нуклеотидной последовательности БЕО ГО N0: 4, и кодируют белок с ГВЕБ активностью. Такие нуклеотидные последовательности могут быть получены из библиотек сДНК или библиотек геномов путём таких известных методов гибридизации, как гибридизация колоний, гибридизация бляшек, Сазернблоттинг и др., применяя полинуклеотиды, состоящие из нуклеотидной последовательности БЕО ГО N0: 1 или её части в качестве зонда. Библиотеки сДНК можно приготовить по методу, описанному в Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Маииа1 2иб еб. (Со1б Брпид НагЬог Ргезз (1989)). Другая возможность - это применение коммерческих библиотек сДНК или библиотек геномов. При вышеуказанной гибридизации примеры жестких условий включают 1хББС - 2хББС, 0,1-0,5% БИБ и 42-68°С. Более специфически, можно дать пример, в котором предгибридизация выполняется при 60-68°С в течение более 30 мин, а затем промывка выполняется в 2хББС, 0,1% БИБ при комнатной температуре в течение 5-15 мин 4-6 раз. Детальные описания процедур гибридизации можно найти, например, в Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Маииа1 2иб еб. (Со1б Брпид НагЬог Ргезз (1989)), в особенности в разделе 9.47-9.58.
В настоящем изобретении промотор из теломеразы человека расположен в обратном направлении от гена Е1, поскольку такой промотор может стимулировать репликацию клеток с теломеразной активностью.
Гены, содержащие репликационные кассеты по настоящему изобретению, могут быть получены с помощью обычных методов генной инженерии. Например, в качестве метода генной инженерии можно применить метод синтеза нуклеиновой кислоты с обычно применяемым синтезатором ДНК. Или же, после выделения или синтезирования генетической последовательности, которую намерены использовать в виде матрицы, можно выработать праймеры, специфические для каждого гена, и генетическую последовательность можно амплифицировать с помощью аппарата РСВ (метод РСВ; СиггеиГ Рго!осо1з ш Мо1еси1аг Вю1о§у, 1оЬи ^йеу & Боиз (1987), Бесйои 6.1-6.4); или можно применить метод амплификации гена с применением клонирующего вектора. При обычных навыках в этой области легко выполнить названные выше методы пользуясь, например, руководством Мо1еси1аг С1оишд 2иб Еб., Со1б Брпид НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз (1989). Очистку полученныхе продуктов РСВ можно выполнить известными методами, такими как метод с бромистым этидием, метод с БУВВ зелёным Ι (молекулярные зонды), метод с СЕХЕСЕЕЛХ (ЕииакозЫ), ОМСЕХ (О^СЕХ) и др., применяя агарозный гель, метод с применением фильтра из ИЕАЕ-целлюлозы, метод замораживания-сдавливания или метод с применением диализной трубки. Когда применяют агарозный гель, продукты РСТ подвергают электрофорезу на агарозном геле и получаемые фрагменты ДНК вырезают из геля и очищают. При необходимости, возможно подтвердить обычны
- 4 011880 ми методами секвенирования, что получен ожидаемый ген. Например, с этой целью можно применить метод цепной дидеоксинуклеотидной терминации (8апдег с1 а1. (1977) Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 74: 5463) или подобные методы. Иная возможность - можно также провести анализ последовательности подходящим секвенатором ДНК (например, АВ1 РК18М; Аррйеб Вюзуз1етз).
Далее, полученные индивидуальные гены подвергают лигированию в определённом порядке. Сначала вышеуказанные гены обрабатывают известными ферментами рестрикции и получаемые фрагменты ДНК вводят в известный вектор, в соответствии с известным методом лигирования. К примерам известных векторов относятся вектор р1РЕ8 включающий ΙΡΕ8 (сайт внутреннего входа в рибосому в тДНК) вируса энцефаломиокардита (ЕСМУ) и способный транслировать две открытые рамки считывания (ОВЕз) из одной тРНК; плазмиды, полученные из ЕзсйепсЫа со11 (такие как рСК4, рСР2. рСР2.1. рВВ322, рВВ325, рИС12 и рИС13); плазмиды, полученные из ВасШиз зиЫШз (такие как рИВ110, рТР5 и рС194); плазмиды, полученные из дрожжей (такие как р8Н19 и р8Н15); бактериофаги, такие как λ фаг; вирусы животных, такие как ретровирус, вирус осповакцины (уасшша униз) и бакуловирус; рА1-11, рХТ1, рВс/СМУ, рВс/В8У, рсОХА1/№о и так далее. Для данного изобретения предпочтительно применение р1КЕ8 вектора. С этим вектором возможно приготовить репликационную кассету, содержащую «промотор из теломеразы человека, ген Е1А, последовательность ΙΡΕ8 зедиепсе и ген Е1В» в этом порядке, посредством вставки необходимых генов в мультиклонирующий сайт. Для лигирования ДНКислот можно применить лигазу ДНК. Далее, специально будет описан пример, в котором применена ЙТЕВТ в качестве теломеразы человека.
Ген Е1А и ген Е1В могут быть амплифицированы в клетках с экспрессией гена Е1, таких как клетки 293, путём проведения ВТ-РСВ и/или ΟΝΛ-РСР с применением таких праймеров как Е1А-8, Е1А-А8, Е1В-8 и Е1В-А8. При необходимости, их последовательности можно подтвердить известным методом, таким как ТА клонироание. Затем, фрагменты Е1А и Е1В для ДНК можно вырезать, пользуясь известным ферментом рестрикции.
Затем, можно приготовить репликационную кассету, состоящую из ЙТЕВТ-Е1А-1ВЕ8-Е1В для применения в настоящем изобретении, вводя индивидуальные гены в мультиклонирующий сайт и аналогичный ему известный вектор (такой как вектор р1ВЕ8), чтобы был следующий порядок: «ЙТЕВТ промотор последовательность Е1А-1КЕ8-Е1В». Или же, при необходимости, также возможно удалить цитомегаловирусный (СМУ) промотор из известного вектора, такого как р8йий1е, с помощью известных ферментов рестрикции и ввести в этот сайт последовательность, вырезанную из рйТЕВТ-Е1А-1ВЕ8-Е1В с помощью соответствующих ферментов рестрикции. Аденовирус для применения в настоящем изобретении, с единственной репликационной кассетой, состоящей из ЙТЕВТ-Е1А-1ВЕ8-Е1В назван «Теломелизин». Экспрессируя ген Е1, необходимый для пролиферации аденовируса под контролем ЙТЕВТпромотора, возможно пролиферировать вирус в аспекте, специфическом для рака.
В рекомбинантном вирусе, применённом в качестве реагента в данном изобретении, маркирующая кассета также включена вместе с репликационной кассетой. «Маркирующая кассета» включена в область Е3 генома вируса.
Здесь надо заметить, что первичная функция вирусного вектора, применённого в настоящем изобретении, заключается в цитотоксичности при репликации вируса. Поэтому, чтобы применить реагент по настоящему изобретению с целью диагностирования тканей с микрораком, цитотоксичность должна иметь место как можно позднее. Так обстоит дело, поскольку флюоресценция, вызываемая репликацией рекомбинантного вируса по данному изобретению, исчезает при разрушении клеток и определение места ткани, пораженной микрораком, становится затруднительным.
С другой стороны, Е3А и Е3В существуют в области Е3 аденовируса и 11.6 кЭа АЭР (белок гибели аденовируса) в области Е3А имеет функцию стимулировать цитотоксичность и распространение вируса.
Поэтому в рекомбинантном вирусе, примененном по настоящему изобретению, области вирусного генома, кодирующие белки с функцией стимулировать цитотоксичность и дисперсию вируса (такие как АИР-кодирующий область Е3), удалены, чтобы тем самым отсрочить гибель клетки и облегчить определение раковых клеток на основе эмиссии СЕР флюоресценции или ей подобной.
Маркирующий белок, который составляет маркирующую кассету, представляет собой белок, который светится в тех клетках, в которых реплицировался и визуализирован описанный выше вирус. Предпочтительно употреблять вещество, которое издаёт флюоресценцию. Примеры таких веществ включают, но не исчерпываются ими, зелёный флюоресцирующий белок (СЕР), получаемый из светящихся зелёных медуз, таких как Аедиогеа У1с1опа, СЕР с повышенной люминисценцией (ЕСЕР) или СЕР со смещением в красную сторону (гзСЕР), которые представляют собой видоизменённые варианты СЕР (СЕР уапап1з). Также возможно применять желтый флюоресцирующий белок (УЕР), циановый флюоресцирующий белок (СЕР), синий флюоресцирующий белок (ВЕР) или СЕР, полученный из ВепШа гешЕогт1з. Ген, кодирующий каждый из этих белков, можно применять в настоящем изобретении.
Промотором, способным регулировать экспрессию вышеописанного гена, может быть любой промотор, поскольку он совместим с вирусом, применённым для экспрессии вышеуказанного гена, представляющего интерес. Специфические примеры таких промоторов включают, но не ограничиваются ими, цитомегаловирусный (СМУ) промотор, йТЕВТ-промотор, 8У40 поздний промотор, ММТУ ЬТВ промо
- 5 011880 тор, К8У ЬТК промотор и 8Ка промотор. Предпочтительно, могут быть применены СМУ промотор или 11ТЕКТ-промотор.
Рекомбинантный ген, содержащийся в маркировочной кассете по настоящему изобретению, можно получить с помощью общепринятой методики генной инженерии. Например, в качестве метода генной инженерии можно применить метод синтеза нуклеиновой кислоты с помощью обычно применяемого синтезатора ДНК. Другой путь - после того как изолирована или синтезирована матрица, можно разработать праймеры, специфичные для каждого гена по методу, и генетическая последовательность может быть амплифицирована с помощью аппарата РСК (РСК метод; Сиггеп! Рго!оео18 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬп ^УНеу & 8оп§ (1987), 8есйоп 6.1-6.4); или можно применить метод амплификации гена с помощью клонирующего вектора. При обычном навыке работы в этой области легко осуществить названные методы, руководствуясь, например, Мо1ееи1аг С1ошпд 2'1 Еб., Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк (1989). Очистку полученного продукта РСК можно выполнить известными методами, такими как метод с бромидом этидия, метод с 8УВК зелёным I (молекулярные зонды), метод с ΟΕΝΕΟΈ-ΕΑΝ (ЕипакокЫ), ΟΙΑΟΕΝ (ΟΙΑΟΕΝ), и др. с применением агарозного геля, метод с ИЕАЕ-целлюлозным фильтром, метод замораживания-сдавливания или метод с диализной трубкой. Когда применяют агарозный гель, продукты РСТ подвергают электрофорезу на агарозном геле и получаемые фрагменты ДНК вырезают из геля и очищают. При необходимости, возможно подтвердить обычными методами секвенирования, что получен ожидаемый ген. Например, с этой целью можно применить метод цепной дидеоксинуклеотидной терминации (8апдег е! а1. (1977) Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А 74: 5463) или подобные методы. Иная возможность можно также провести анализ последовательности подходящим секвенатором ДНК (например, ΑΒΙ РК18М; АррПеб Вюкуйешк). Далее, полученные таким образом гены обрабатывают известными ферментами рестрикции. Рекомбинантный ген строится таким образом, что результирующий фрагмент ДНК, результат обработки (кодирующий маркировочный белок) располагается в прямом направлении от фрагмента гена, кодирующего описанный выше промотор. Здесь можно применить в качестве плазмиды бифункциональную (челночную) плазмиду. Два гена (для маркирования белка и промотора) лигитруют с помощью ДНК лигазы и вводят в вектор, чтобы таким образом приготовить рекомбинантный ген для маркирующей кассеты.
В качестве известного вектора можно применить вектор р8Ьий1е, плазмиду, полученную из ЕксйепсЫа сой (такую как рСК4, рСК2, рСК2.1, рВК322, рВК325, рИС12 или рИС13); плазмиду, полученную из ВасШик киЬйШ (такую как рЦВ110, рТР5 или рС194); плазмиду, полученную из дрожжей (такую как р8Н19 или р8Н15); бактериофаг, такой как λ, фаг; вирус животных, такой как ретровирус, вирус вакцинии или бакуловирус; рА1-11, рХТ1, рКс/СМУ, рКс/К8У, рсЭИА1/Иео или им подобные.
Далее, рекомбинантный ген, включающий описанную выше репликационную кассету и маркировочную кассету, вырезают с помощью соответствующих рестрикционных ферментов и вводят в соответствующий вектор вирусной экспрессии, чтобы таким образом приготовить рекомбинантный вирус. Примеры векторов вирусной экспрессии включают аденовирус, ретровирус, вирус вакцинии и бакуловирус. Как описано выше, аденовирус (в особенности аденовирус типа 5) предпочтителен. Для интегрирования кассеты в вирус можно применить такие методы, как электропорация, липосомный метод, сферопластный метод и метод с ацетатом лития.
В данном изобретении, в особенности, рекомбинационный ген может быть приготовлен путём ввода СМУ-ЕСЕР-8У40Р (А) из рЕСЕР-И1 (СЕОИТЕСН) в челночную плазмиду рНМ11 и ввода фрагмента Скр451 этой плазмиды в сайт С1а1 вектора р8йий1е, в который интегрирован рйТЕКТ-Е1А-1КЕ8-Е1В.
В данном изобретении, в особенности, последовательность нужной области может быть вырезана рестрикционными ферментами из рекомбинантного гена, как приготовлялось выше, и введена в ДНК вируса в виде Абепо-Х У1га1 ДНК с применением коммерческого набора, такого как Абепо-Х Ехргекыоп 8у51еш (СЬОИТЕСН) (получаемый продукт обозначается как АбепоХ-11А1В).
Этот АбепоХ-11А1В линеаризируют с помощью известного рестрикционного фермента и затем переносят в культивируемые клетки, такие как клетки 293, чтобы таким образом приготовить инфекционный рекомбинантный вирус.
Диапазон целевых раковых клеток, подлежащих выявлению по данному изобретению, не ограничивается. Можно применять любые раковые клетки. Например, можно применять твёрдые виды рака на голове и шее, в желудке, толстой кишке, лёгком, печени, простате, поджелудочной железе, пищеводе, мочевом пузыре, жёлчном пузыре/жёлчном протоке, груди, матке, щитовидной железе, яичнике и т.д.; или лейкемию, лимфому, саркому, мезенхимальные опухоли или им подобные. Большинство раковых клеток, полученных из тканей человека, проявляют увеличение теломеразной активности. Настоящее изобретение может обнаруживать такие раковые клетки вообще там, где пролиферация активизируется такой теломеразной активностью.
Поскольку экспрессия теломеразы в раковых клетках чрезвычайно велика по сравнению с нормальными клетками, в раковых клетках, содержащих теломеразу, экпрессирована ЬТЕКТ и в них функционирует репликационная кассета. В результате вирус реплицируется, что в свою очередь увеличивает репликацию маркирующего белка. Таким путём экспрессируется и визуализуется маркирующий белок.
- 6 011880
Поэтому, когда реагент по настоящему изобретению не флюоресцирует в нормальных клетках, он даёт флюоресценцию в раковых клетках. Таким образом, становится возможным визуально наблюдать раковые клетки.
Для инфицирования клеток рекомбинантным вирусом можно применять, например, следующий метод. Во-первых, клетки, такие как раковые клетки 8\У620 толстой кишки человека, раковые клетки лёгких человека А549 и Н1299, наносятся на культуральные планшеты с соответствующей культуральной средой и культивируются в присутствии газа СО2 при 37°С. В качестве культуральной среды можно применять таковой, который обычно применяют для культивирования клеток животных, например ΌΜΕΜ, МЕМ или ΚΡΜΙ-1640. При необходимости к ней можно добавлять сыворотку, антибиотики, витамины или подобные им вещества. Культивируемые клетки инфицируются путём посева определённого количества (0,1-10 ΜΟΙ (множественность инфекции), предпочтительно 1 ΜΟΙ) рекомбинантного вируса по настоящему изобретению. ΜΟΙ означает отношение между количеством вируса (инфекционная единица) и количеством клеток, когда определённое количество культивируемых клеток инфицируется определённым количеством частиц вируса. ΜΟΙ применяют как индикатор при заражении клеток вирусом.
Чтобы подтвердить репликацию вируса, клетки, инфицированные вирусом, извлекают и экстрагируют ДНК из них. Затем ДНК подвергают РСК. в реальном масштабе времени, применяя праймеры, направленные на определённый ген, находящийся в вирусе по данному изобретению. Таким образом, возможен количественный анализ.
В отношении выявления маркированных клеток: раковые клетки можно увидеть, потому что клетки с репликацией вируса излучают специфическую флюоресценцию (например, зелёное свечение в случае применения СЕР) при экспозиции на возбуждающее освещение. Например, когда клетки, инфицированные вирусом, наблюдают под флюоресцентным микроскопом, можно наблюдать, что клетки издают СЕР флюоресценцию. Для наблюдения инфицированных клеток во времени, СЕР флюоресценцию можно наблюдать с помощью ССЭ (Сошри1ег Сои1го11еб Экр1ау) камеры.
Для маркирования в реальном времени и выявления интересующих нас клеток ίη νίνο рекомбинантный вирус по настоящему изобретению можно вводить в живой организм.
Реагент по настоящему изобретению можно применять непосредственно к пораженному месту. Другая возможность - реагент по настоящему изобретению можно вводить в живой организм (целевую клетку или орган) любым известным способом, например внутривенной, внутримышечной, интраабдоминальной или подкожной инъекцией; ингаляцией через носовую полость, ротовую полость или лёгкие; через рот; введением внутрь сосудов с помощью катетера и т.д. Уровень доз выбирают соответственно, в зависимости от действующего компонента, пути введения, мишени введения, а также возраста, веса тела, пола, симптомов и других сторон состояния пациента. Обычно уровень доз может быть выбран так, что вирус по настоящему изобретению (активное начало) применяют в виде суточной дозы около 106-10 БОЕ (РЕИ-бляшкообразующих единиц), предпочтительно около 109'-1011 БОЕ. Такое количество дают раз в сутки или оно может быть разделено на несколько порций и дано несколько раз в сутки.
Реагент по настоящему изобретению делает возможным наблюдать метку ίη νίνο в истинном времени. Таким образом, реагент по настоящему изобретению имеет преимущество как применяемый ίη νίνο диагностический агент. Это полезно при так называемой навигационной хирургии.
Если применяют широкое иссечение, включая пораженный орган, при хирургической операции, пациент, переживший хирургическую операцию, может рассчитывать на долгую жизнь. Однако частота осложнений, причиняемых самой хирургической операцией, остаётся высокой. Далее, утрата функционирования иссечённого органа неизбежно влияет на каждодневную жизнь после хирургической операции. При лечении рака важно применять малоинвазивное лечение, что уменьшит тяжесть для пациента при сохранении длительного выживания.
Когда ставят цель минимизировать площадь иссечения, необходимо иметь сведения о наличии или отсутствии метастатических лимфатическх узлов. В качестве метода получения такой информации привлекает внимание «сторожевой лимфоузел» (СУ - 8Ν). СУ - это лимфатический узел, который первым принимает ток лимфы от опухолей, и имеется гипотеза, что первые микрометастазы образуются в таком лимфатическом узле. Эта гипотеза известна как теория СУ. Хотя уже начаты широкомасштабные клинические испытания по отношению к раку груди сначала в Европе и Соединенных Штатах, пока не известно, применима ли эта теория к другим плотным опухолям. Испытания только что начаты.
Система диагноза рака ίη νίνο с применением реагента по настоящему изобретению может привести к разработке технологии создания прямой экспрессии флюоресцентого белка в раковых клетках и определения опухолевых тканей или метастатических лимфатических узлов с помощью высокочувствительной системы флюоресцентного выявления при хирургической операции. Другими словами, можно создать технологию «навигационной хирургии» как метод более чувствительный, чем СУ. Рекомбинантный вирус по настоящему изобретению реплицируется в большом числе раковых клеток с теломеразной активностью, и эти клетки могут издавать, например, сильную зелёную СЕР флюоресценцию.
При анализе метастазов в лимфатических узлах установлено, что около 10% перемещенных метастазов, то есть зарождающиеся метастазы во втором и последующих узлах сообщают о наступлении метастазов во второй группе или более отдалённых лимфатических узлах, переместились от лимфоузла
- 7 011880 первой группы, перескочивших через первую группу лимфатических узлов. На основании этого сообщения многие специалисты указывали на опасность навигации СУ. Однако система диагностирования рака ίη νίνο с применением реагента по настоящему изобретению определяет опухолевые ткани или метастатические лимфатические узлы непосредственно при хирургической операции в реальном масштабе времени и навигации во всём диапазоне иссечения. Эта система оригинальна и создаёт эпоху, а кроме того, она чрезвычайно практична для плавного хода хирургической операции. В частности, реагент по настоящему изобретению вводится эндоскопически в область опухоли (например, в слизистую желудка или толстой кишки вокруг рака желудка или рака толстой кишки; во внутреннюю область таких опухолей, как рак желудка, рак толстой кишки, рак лёгких, рак поджелудочной железы) за несколько дней до хирургической операции тем же ручным способом, как при навигации СУ. Затем нужно достаточное время, чтобы вирус распределился по тканям, инфильтрированным опухолью, метастатическим опухолевым тканям или сопровождающим лимфатическим узлам и реплицировался в опухолевых местах или положительных на метастазы местах.
В период проведения хирургии свет, возбуждающий ОРР флюоресценцию, проецируется от источника света на хирургическое поле после чревосечения и изображения от специальной 3ССЭ камеры проецируются на дисплей (а £асе ιηοιιηΐ б1§р1ау). Применяя переносную лупу можно находить поле зрения в пределах действительного хирургического поля и возможно находить лимфатические узлы, положительные на метастазы, на перекрывающихся ОРР изображениях. Далее, устанавливая специальный фильтр, можно отличать флюоресценцию зрительно, без применения камеры.
2. Реагент для диагностирования ех νίνο
Реагент по настоящему изобретению также применим в качестве агента для диагностирования ех νίνο с целью отбора. В текущей работе количественное определение маркёров опухолей - это самый обычный метод выявления присутствия рака, который нельзя определить зрительно или нельзя определить его первичное место.
Однако маркёры опухолей не всегда удовлетворительны в отношении специфичности для рака. Кроме того, чрезвычайно трудно выявить все виды рака, применив один маркёр.
Было показано, что теломеразная активность злокачественных опухолей человека увеличивается на 85% или более и поэтому её специфичность по отношению к раку чрезвычайно высока.
Диагностирование рака ех νίνο с помощью реагента по настоящему изобретению можно выполнить, например, как описано ниже.
Из общей пробы крови, взятой у пациента, отделяют эритроциты. К оставшейся жидкости со взвесью клеток добавляют реагент по настоящему изобретению в определённом отношении (0,1-10 ΜΟΙ, предпочтительно 1 ΜΟΙ) и смешивают в пробирке. Смесь оставляют на определенное время (например, 12-48 ч), чтобы произошло заражение раковых клеток вирусом и для последующей репликации вируса. Затем, количественно анализируют ОРР экспрессию во фракции клеток с помощью проточной цитометрии. С применением этой системы становится возможно выявить свободные раковые клетки, присутствующие в периферической крови, с высокой степенью чувствительности. Этот метод можно применять для выявления свободных раковых клеток, присутствующих в периферической крови, в очень малом количестве.
3. Агент, индуцирующий гибель клеток, и метод индуцирования гибели клеток
Один из результатов настоящего изобретения - это агент, индуцирующий гибель клеток, включающий рекомбинантный вирус, в котором репликационная кассета с промотором из теломеразы человека, ген Е1А, последовательность ΙΚΕ8 и ген Е1В в таком порядке включены в отдел Е1 генома вируса и кассета, индуцирующая гибель, с геном, кодирующим белок, связанным с индукцией гибели клеток, и промотором, способным регулировать экспрессию гена, кодирующего белок, интегрированы в отдел Е3 генома вируса. Предпочтительно использовать агент, индуцирующий гибель клеток, по данному изобретению в генной терапии раковых заболеваний как агент, индуцирующий гибель раковых клеток, а также для профилактики рецидивов, угнетения и/или профилактики метастазов после хирургии раковых заболеваний.
В кассету, индуцирующую гибель клеток, рекомбинантного вируса, содержащегося в агенте, индуцирующем гибель клеток, по данному изобретению интегрирован ген, которым оперирует промотор и который кодирует белок, способный индуцировать гибель клеток.
В этой кассете, индуцирующей гибель клеток, применённой в составе рекомбинантного вируса, содержатся ген, кодирующий белок, ассоциированный с индукцией гибели клеток, и промотор, способный регулировать экспрессию гена. Поэтому, когда агент, индуцирующий гибель клеток по данному изобретению, вводится в раковые клетки, вирус реплицируется специально в раковых клетках. В результате уровень экспрессии внутри клеток белка, ассоциированного с индукцией гибели клеток, повышается и индукция гибели клеток происходит только в раковых клетках без повреждения нормальных клеток.
Ген, кодирующий белок, ассоциированный с индукцией гибели клеток, соответствует гену, кодирующему белок, ассоциированный с индукцией клеточной гибели в определённой клетке.
Частные примеры белков, ассоциированных с индукцией клеточной гибели, включают следующие белки, но не ограничиваются ими. В данном изобретении может быть введён ген, кодирующий любой из
- 8 011880 этих белков.
Как частный пример белка, ассоциированного с иммунитетом, можно назвать РА28. РА28 - это белок, который активирует внутриклеточные протеасомы. При сверхэкспрессии этот белок вызывает иммунологические реакции и в то же время индуцирует гибель клеток. Как частный пример белка, вызывающего апоптоз, можно назвать ТКА1Ь. ТКА1Ь - это молекула, которая индуцирует гибель апоптозных клеток, связывая рецептор на клеточной поверхности. Как частный пример белка, ассоциированного с теломеразой, можно назвать АИ5. АИ5 имеет последовательность, способную индуцировать клеточную гибель клеток с теломеразной активностью.
Гены этих белков, ассоциированных с индукцией гибели клеток, могут быть получены методами обычной генетической инженерии. Например, как метод генетической инженерии можно назвать метод синтеза нуклеиновой кислоты с помощью обычно употребляемого синтезатора ДНК. Другой вариант после того как выделена или синтезирована нужная в качестве матрицы генетическая последовательность, можно разработать праймеры, специфические для каждого гена, и генетическая последовательность может быть амплифицирована с помощью РСК аппарата (РСК метод; СиггеШ Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг В1о1оду, ίοΐιη \УПеу & 8опз (1987), 8есйоп 6.1-6.4); или можно применить метод амплификации генов с применением клонирующего вектора. При обычном навыке работы в этой области легко выполнить вышеуказанные методы, руководствуясь, например, Мо1еси1аг С1ошпд 2'1 Еб., Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаТогу Ргезз (1989). Очистку полученных продуктов РСК можно выполнить известными методами, таким как метод с бромистым этидием, метод с 8ΥΒΚ зелёным I (молекулярные зонды), метод с ΟΕΝΕίΧΕΑΝ (РипакозЫ), ΟΙΑΟΕΝ (ΟΙΑΟΕΝ) и др., применяя агарозный гель, метод с применением фильтра из ΌΕΑΕцеллюлозы, метод замораживания-сдавливания или метод с применением диализной трубки. Когда применяют агарозный гель, продукты РСК подвергают электрофорезу на агарозном геле и получаемые фрагменты ДНК вырезают из геля и очищают. При необходимости, возможно подтвердить обычными методами секвенирования, что получен ожидаемый ген. Например, с этой целью можно применить метод цепной дидеоксинуклеотидной терминации (8апдег е1 а1. (1977) Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 74: 5463) или подобные методы. Иная возможность - можно также провести анализ последовательности подходящим секвенатором ДНК (например, АВ1 РК18М; Аррйеб ВюзузТетз).
Антионкогены также входят в число веществ, индуцирующих гибель раковых клеток, поскольку антионкогены имеют функцию угнетения репликации раковых клеток. С этой целью можно перечислить следующие антионкогены, применяемые в обычной генной терапии:
р53 (8ЕО ΙΌ N0: 11; Ассеззюп Ио. /номер депонирования/ М14694): разные виды рака;
р15 (8Е0 ΙΌ N0: 12; Ассеззюп Ио. Ь36844): разные виды рака; р16 (8Е0 ΙΌ N0: 13; Ассеззюп Ио. Ь27211): разные виды рака;
АРС (8Е0 ΙΌ N0: 14; Ассеззюп Ио. М74088): рак толстой кишки, рак желудка, рак поджелудочной железы;
ВКСА-1 (8Е0 ΙΌ N0: 15; Ассеззюп №. Ш4680): рак яичника, рак груди;
ЭРС-4 (8Е0 ΙΌ N0: 16; Ассеззюп №. И44378): рак толстой кишки, рак поджелудочной железы;
ΡΗΙΤ (8Е0 ΙΌ N0: 17; Ассеззюп №. NМ 112012): рак желудка, рак лёгких, рак матки;
р73 (8Е0 ΙΌ N0: 18; Ассеззюп №. Υ11416): нейробластома;
РАТСНЕЭ (8Е0 ΙΌ N0: 19; Ассеззюп №. И59464): базально-клеточный рак;
КЬр 10 (8Е0 ΙΌ N0: 20; Ассеззюп №. М1 5400): рак лёгких, остеосаркома;
ОСС (8Е0 ΙΌ N0: 21; Ассеззюп №. Х76132): рак толстой кишки;
N61 (8Е0 ΙΌ N0: 22; Ассеззюп №. NМ 000267): нейрофиброматоз типа 1;
N62 (8Е0 ΙΌ N0: 23; Ассеззюп №. Ь1 1353): нейрофиброматоз типа 2;
^Т-1 (8Е0 ΙΌ N0: 24; Ассеззюп №. NМ 000378): опухоль Вильмса.
Эти антионкогены могут быть получены обычными методами генетической инженерии. Например, в качестве метода генетической инженерии можно применить метод синтеза нуклеиновой кислоты с помощью обычного синтезатора ДНК. Другой вариант - после того как изолирована или синтезирована генетическая последовательность для применения в качестве матрицы, праймеры, специфические для каждого гена, могут быть разработаны и генетическая последовательность может быть амплифицирована с помощью РСК аппарата (метод РСК); или можно применить метод амплификации гена с применением клонирующего вектора. При необходимости, возможно подтвердить обычными методами секвенирования, что получен ожидаемый ген.
В качестве промотора, способного регулировать экспрессию вышеуказанного гена, можно применить любой промотор, поскольку он представляет собой подходящий промотор, совместимый с вирусом, употреблённым для экспрессии интересующего нас гена. Предпочтительно употребить СМУ промотор или ЬТЕКТ промотор. Однако другие промоторы, такие как 8У40 поздний промотор, ММТУ ЬТК промотор, К8У ЬТК промотор и 8Ка промотор также можно применить.
Агент, индуцирующий гибель клеток по настоящему изобретению можно применить прямо к пораженному месту. Другой вариант - агент по настоящему изобретению можно ввести в живой организм (целевую клетку или орган) любым известным способом, например внутривенной, внутримышечной, внутриабдоминальной или подкожной инъекцией; ингаляцией через носовую полость, ротовую полость
- 9 011880 или лёгкие; через рот; через сосуды с помощью катетера и т.п.
К агенту, индуцирующему гибель клеток по настоящему изобретению, можно применять, например, такие методы, как замораживание, чтобы легче с ним было обращаться и затем применять в отдельности или приготовить фармацевтические составы, смешивая с известными фармацевтическими приемлемыми носителями, такими как наполнители, фильтры, бинты, смазки; или известные добавки (такие как буферы, изотонические агенты, хелатирующие агенты, красители, консерванты, ароматизаторы, вкусовые и подслащивающие вещества).
Агент, индуцирующий гибель клеток по настоящему изобретению, можно применять перорально или парэнтерально в зависимости от формы агента, например перорально в виде таблеток, порошков, гранул, пилюль, жидкостей, сиропов и т.п. и парэнтерально в виде инъекций, наружно в виде суппозиториев, глазных капель и т.п. Предпочтительны местная инъекция в мышцы или брюшную полость или внутривенная инъекция.
Уровень дозы выбирают в зависимости от активного ингредиента, пути применения, цели применения, возраста, веста тела, пола, симптомов и других сторон состояния пациента. Обычно уровень дозы может быть выбран так, чтобы вирус по настоящему изобретению (активный ингредиент) принимали в виде суточной дозы около 106-1011 БОЕ (БОЕ - РБИ, бляшкобразующих единиц), предпочтительно около 109-1011 БОЕ. Это количество принимают раз в сутки или оно может быть разделено на несколько порций и тогда его принимают несколько раз в сутки.
При приёме вируса по настоящему изобретению возможно также принимать известный иммунодепрессант или аналог для подавления иммунитета живого организма и облегчения инфицирования вирусом.
Далее, вирус по настоящему изобретению можно применять вместе по крайней мере с одним противораковым агентом, выбранным из группы, состоящей из известных противораковых агентов, и радиации. Отдельные примеры противораковых агентов включают следующие агенты, но не ограничиваются ими.
(1) Алкилирующие агенты: эти агенты вызывают цитотоксичность, вводя алкильные группы в нуклеиновую кислоту/белок раковых клеток. Примеры включают карбокон, бусульфан (горчичные лекарства) и мимустин (нитромочевины).
(2) Антиметаболические агенты: эти агенты оказывают эффект, угнетающий клеточный синтез через влияние антагонистических ферментов в процессах метаболизма. Примеры включают метоторексат (фолаты), меркаптопурин (пурины), цитарабин (пиримидины), фтороурацил, тегафур и кармофур.
(3) Антибиотики: эти агенты имеют противораковое действие. Примеры включают актиномицин Ό, блеомицин, адриамицин и митомицин С.
(4) Антимикротрубочковые агенты: эти агенты действуют на микротрубочки и проявляют противораковое действие. Примеры включают доцетаксел, паклитаксел (таксаны) и винорелбин, винкристин, винбластин (алкалоиды).
(5) Препараты платины: эти препараты угнетают синтез ДНК, образуя перекрёстные связи внутри или между нитями ДНК или поперечные связи ДНК-белок. Примеры включают цисплатин, карбоплатин и недаплатин.
(6) Топоизомеразные ингибиторы: к ним можно отнести иринотекан (ингибитор топоизомеразы I), производные подофиллотоксина (ингибитор топоизомеразы II) и т. п. Топоизомераза - это фермент, который катализирует реакцию изменения числа связей ДНК путём временного обрезания одной или обеих нитей ДНК.
Полагают, что вероятность того, что агент, индуцирующий гибель клеток по данному изобретению, вызовет побочные эффекты, крайне мала по причинам, описанным ниже. Таким образом, агент, индуцирующий гибель клеток по данному изобретению, представляет собой очень безопасный препарат.
(1) Теломеразная активность в нормальных клетках очень мала и вирус по настоящему изобретению едва ли будет инфекционным в поддерживающих клетках, таких как кроветворные клетки.
(2) Поскольку вирус по настоящему изобретению способен к репликации, возможно применять этот вирус при концентрации ниже, чем таковая у обычного, не реплицирующегося компетентного вируса, применяемого в обычной генной терапии.
(3) Даже когда вирус по настоящему изобретению дан в избытке, антивирусное действие происходит через обычную иммунную реакцию живого организма.
Индуцировать клеточную гибель в целевой клетке возможно путём инфицирования целевой клетки рекомбинантным вирусом по настоящему изобретению. Виды целевых клеток не особенно ограничены. Например, можно применять клетки опухолей, клетки с активной репликацией, клетки, чья теломеразная активность увеличена, и т. п.
«Заражение клеток рекомбинантным вирусом» имеет значение, описанное выше. Чтобы подтвердить, индуцирована или нет гибель клеток, можно провести морфологическое исследование, как описано ниже. Вкратце, клетки, прикреплённые ко дну культурального планшета, инфицируют рекомбинантным вирусом по настоящему изобретению. Через определённое время форма клеток становится округлой, и они переходят во взвесь в культуральной среде в виде блестящих клеток, открепившихся от дна. К этому
- 10 011880 времени механизм, поддерживающий жизнь этих клеток, нарушен, и можно отметить, что индуцирована гибель клеток. Иначе также возможно подтвердить гибель клеток с помощью коммерческого набораопределителя жизнеспособных клеток с применением солей тетразолия (например, МТТ, ХТТ).
Ниже настоящее изобретение будет описано более детально на основе следующих примеров. Однако настоящее изобретение не ограничено этими примерами.
Пример 1. Визуализация раковых клеток путём коинфекции ίη νίίτο.
В этом примере предварительно выяснено, может или нет флюоресценция иметь место ίη νίίτο, когда раковые клетки коинфицированы теломелизин-вирусом, содержащим репликационную кассету и нереплицирующий Аб-СЕР вирус, включающий маркировочную кассету.
Раковые клетки толстой кишки человека 8ν620 и раковые клетки лёгких человека А549 и Н1299 были инфицированы 0,1 ΜΟI (множественность инфекции) от Аб-СЕР (фиг. 2).
В результате, тенденция к позеленению была едва различима, когда раковые клетки толстой кишки человека 8\У620 и раковые клетки лёгких человека А549 и Н1299 были инфицированы 0,1 ΜΟΙ (множественность инфекции) от Аб-СЕР. Однако, когда применили совместно 1 ΜΟΙ от ГКАЭ, флюоресценцию можно было различить только в раковых клетках и не было обнаружено флюоресценции в нормальных клетках, таких как клетки-фибробласты человека \УЕ38 и ИНЬР и клетки эндотелия сосудов пупка человека (НИУЕС) (фиг. 3).
Пример 2. Визуализация раковых тканей путём соинфекции ίη νίνο теломелизином и Аб-СЕР.
В этом примере предварительно выясняли, будет ли присутствовать флюоресценция ίη νίνο, когда раковые ткани соинфицированы теломелизин-вирусом, содержащим репликационную кассету и нереплицирующий вирус Аб-СЕР, содержащий маркировочную кассету.
Аб-СЕР (8х105 БОЕ) и ΤΡΑΌ (8х106 БОЕ) были введены внутрь опухолей в раковую опухоль толстой кишки человека 8\У5620 и в раковую опухоль лёгких человека А549, предварительно пересаженные в дорсальную сторону безволосых («голых») мышей. Затем наблюдали флюоресценцию по прошествии некоторого времени.
Во всех опухолях флюоресценция пятнами начала наблюдаться со второго дня введения и исчезала к 14 дню (фиг. 4).
Пример 3. Обнаружение раковых клеток с помощью теломелизина-СЕР.
1. Приготовление экспрессирующего СЕР, репликационно компетентного вируса (теломелизин СЕР), который включает репликационную кассету с теломеразным промотором и ген Е1 и маркировочную кассету с геном, кодирующим СЕР в единичном вирусе.
Очертание теломелизин-СЕР показано на фиг. 1. Теломелизин пролиферирует/реплицирует раковые клетки специфически и теломеразу специфически, поскольку Е1Л/1КЕ8/Е1В управляется 11ТЕКТпромотором. Далее, теломелизин-СЕР также имеет СЕР ген, полученный из Ассцюгса νίοΙοΓία, интегрированный в свою Е3 область, который управляется промотором. Поэтому клетки, в которых наблюдается репликация вируса, издают зелёную флюоресценцию при возбуждающем освещении, что позволяет визуализировать раковые клетки.
Такой репликационно инкомпетентный вирус был приготовлен, как описано ниже.
2. Приготовление рекомбинантного вируса
Из РНК, извлечённой из клеток 293, амплифицировали ген Е1А из 897 п.о. с помощью КТ-РСК, применяя специфические праймеры (Е1Л-8 и Е1Л-Л8) и РСК условия, описанные ниже.
Е1А-8: 5’-АСА ССС ОСА СТО ААА АТС АС-3’ (ЗЕф ГО N0: 5) Е1А-А8: 5’-САС АСО ТТТ АСА ССТ ТАТ ССС-3’ (ЗЕф ΙϋΝΟ: 6)
Состав РСК раствора: 1хРСК буфер
0.2 шМ каждого 6ΝΤΡ3 тМ М^СЕ
2,5 и АтрНТац Οοΐά
0.2 μΜ каждого праймера
Условия реакции: 95°С, 10 мин (95 С, 1 мин; 56’ С, 1 мин; 72” С, 1.5 мин) х 32 цикла
С, 7 мин
С, 5 мин
Из ДНК, извлечённой из клеток 293, ген Е1В из 1822 п.о. был амплифицирован с помощью ΌΝΑРСК с применением следующих праймеров Е1В-8 и Е1В-А8.
Применённый состав РСК раствора и условия реакции (циклы, температура) были те же, как применённые для амплификации гена Е1А.
Каждый продукт РСК был подвергнут ТА клонированию (набор ТА ί,Ίοηίηβ Κίΐ Фиа1 РюпюЮ!·: Ιηνί(το^η), чтобы тем самым подтвердить их последовательность. Затем фрагменты ДНК из 911 п.о. (Е1А) и
- 11 011880
1836 п.о. (Е1В) были вырезаны, соответственно, с помощью рестрикционного фермента ЕсоКЕ
Е1А и Е1В были введены в сайт М1и1 и сайт 8а11, соответственно, вектора р1КЕ8 усс1ог (СЬОХТЕСН) в нормальном положении (Е1А-ШЕ8-Е1В).
Последовательность ЙТЕКТ промотора из 455 п.о., которая была вырезана с помощью рестрикционных ферментов М1и1 и Вд111 была введена в сайт Х1юЕ расположенный в обратном направлении от Е1А в Е1А-ШЕ8-Е1В при нормальной ориентировке (рйТЕКТ-Е1А-1КЕ8-Е1В).
Цитомегаловирусный (СМУ) промотор, содержащийся в р8йий1е векторе, был удалён посредством обработки рестрикционными ферментами М1с1 и Хйе1. Затем, последовательность 3828 п.о., вырезанная из рйТЕКТ-Е1А-1КЕ8-Е1В с помощью рестрикционных ферментов Хйе1 и ΝοΐΙ, была введена в этот сайт (р8й-йА1В).
рЕСЕР-Х1 (СЬОХТЕСН) был обработан с помощью Аде1/Хйе1, затупленного с помощью фрагмента Клёнова и самолигированного (рЕСЕР-Х2).
Этот рЕСЕР-Х2 был обработан №ίΙ/ΛΠΙΙ и затуплен с помощью Т4 ЭХА полимеразы, за чем следовало приготовление сайта Вд111 с применением линкера Вд111. Этот фрагмент Вд111 был введён в сайт ВатН1, принадлежащий рНМ11 (рНМ11-ЕСЕР-Х2).
Далее, фрагмент Сзр451 из рНМ11-ЕСЕР-Х2 быд введён в сайт С1а1 вектор р8йий1е, в который рйТЕКТ-Е1А-1КЕ8-Е1В был интегрирован (р8й-йА1В).
Последовательность А 4381 п.о. была вырезана из таким образом приготовленного рекомбинантого гена (р8й-ЪА1В) с применением рестрикционных ферментов 1-Сеи1 и Р1-8се1 и введена в Абепо-Χ вирусной ДНК системы экспрессии Абепо-Χ (СЬОХТЕСН) (АбепоХ-йА1В). Данный АбепоХ-йА1В был обработан рестрикционным ферментом Рас1 для линеаризации и затем перемещён в клетки 293, чтобы тем самым приготовить инфекционный рекомбинантный аденовирус (здесь и далее именуемый «теломелизин-СЕР»).
Пример 4. Выявление клеток рака лёгких человека.
1. Морфологические изменения в клетках рака лёгких человека, вызванные инфекцией теломелизином-СЕР.
Клетки, извлеченные из немелкоклеточого рака лёгких, Н1299 культивировали ίη уйго и инфицировали теломелизином-СЕР в дозе 1 МО1 или 10 МО1. Конкретно, клетки Н1299 помещали на планшеты с 24 лунками, по 5х104 клеток на лунку. Через 24 ч клетки подсчитывали и добавляли вирус в культуральной среде до концентрации 1 МО1 или 10 МО1. Затем наблюдали морфологию клеток под обращенным микроскопом по прошествии времени, достаточном, чтобы наблюдалась цитотоксическая активность вируса.
В результате, репликация вируса вызывала гибель клеток в зависимости от концентрации и от времени. Через 120 ч после инфицирования 10 МО1 большинство клеток становились круглыми и при рассмотрении в обращенный микроскоп были во взвеси (фиг. 5).
2. Эмиссия СЕР флюоресценции клетками рака лёгких человека, вызванная инфицированием теломелизином-СЕР.
Изображения под обращенным (инвертированным) микроскопом, показанные на фиг. 6, наблюдали под флюоресцентным микроскопом. Наблюдалась зелёная флюоресценция СЕР, указывающая на репликацию вируса в зависимости от концентрации и времени (фиг. 6). Через 72 ч после инфицирования 10 МО1 экспрессия СЕР наблюдалась в максимальном числе клеток. Затем число СЕР-позитивных клеток понижалось и индуцировалась гибель клеток (фиг. 6).
3. Верификация теломелизин-СЕР репликации на основе количественной РСК в реальном времени.
Клетки рака лёгких человека Н1299 инфицировали теломелизином-СЕР в концентрации 10 МО1. Пробы клеток отбирали через 2, 26, 50 и 74 ч после инфицирования и из них извлекали ДНК. Проводили РСК в реальном времени, применяя следующие праймеры, нацеленные на ген Е1А теломелизина-СЕР, чтобы количественно анализировать пролиферацию/репликацию вируса. Праймеры и применённые условия указаны ниже.
Е1А-8: 5’-ССТ ОТО ТОТ АОА ОАА ТОС АА-3’ (8ЕЦ Ю ΝΟ: 9)
Е1А-А8: 5’-АСА ОСТ САА ОТС САА АОО ТТ-3’ (8ЕЦ Ιϋ ΝΟ: 10)
Состав раствора РСК:: 1хЬС Еа5181аг1 ЭХА Маз1ег 8УВК зелёный I тМ МёС12
0.5 μΜ каждого праймера
Кеасйоп Сопбйюпз: 95°С, 10 мин (95°С, 10 с; 60°С, 15 с; 72 С, 8 с) х 40 циклов
70’С,15 с
40’С, 30 с
Результаты показали, что теломелизин-СЕР уже реплицирован в 1,000,000 раз через 26 ч после инфекции (фиг. 7). Затем репликация достигает плато, но СЕР флюоресценция также слегка усиливается
- 12 011880 после репликации (фиг. 7).
Пример 5. Выявление клеток рака толстой кишки человека.
1. Эмиссия СЕР флюоресценции клеток рака толстой кишки человека, вызванная инфицированием теломелизином-СЕР.
Клетки, извлечённые из рака толстой кишки человека, 8^620 были инфицированы теломелизиномСЕР на уровне 10 ΜΟΙ. Изменения в клетках наблюдали по прошествии времени под обращенным микроскопом и флюоресцентным микроскопом.
В результате обнаружена СЕР зелёная флюоресценция, указывающая на репликацию вируса в зависимости от времени, как и в случае клеток Н1299 (фиг. 8).
2. Верификация теломелизин-СЕР репликации с помощью количественной РСК. в реальном времени.
Тем же способом, как и с клетками Н1299, клетки рака толстой кишки человека были инфицированы теломелизином-СЕР на уровне 10 ΜΟΙ. Пробы клеток отбирали через 2, 26, 50, 74 и 98 ч после инфицирования и их низ извлекали ДНК. Затем репликацию вируса количественно анализировали с помощью РСК в реальном масштабе времени. РСК в реальном масштабе времени выполняли с помощью следующих праймеров, направленных на ген Е1А теломелизина-СЕР, чтобы таким образом количественно проанализировать репликацию вируса. Условия РСК в реальном масштабе времени (состав реакционного раствора, цикл, период времени и т.д.) были те же, что и для клеток Н1299.
Результаты показали, что теломелизин-СЕР уже реплицирован в 1,000,000 раз через 26 ч после инфекции и почти достигал плато через 98 ч после инфицирования (фиг. 9).
Пример 6.
1. Морфологические изменения в нормальных клетках-фибробластах лёгких человека (ИНЬЕ), вызванные инфицированием теломелизином-СЕР.
Нормальные клетки-фибробласты лёгких человека (ИНЬЕ) культивировали ίη νίίτο и инфицировали теломелизином-СЕР на уровне 1 ΜΟΙ или 10 ΜΟΙ. Изменения наблюдали под обращенным микроскопом в течение до 120 ч после инфицирования.
Результатом оказалось, что морфологические изменения не отмечены и гибель клеток не была индуцирована (фиг. 10).
2. Эмиссия СЕР флюоресценции нормальными клетками-фибробластами лёгких человека под воздействием инфицирования теломелизином-СЕР
Когда изображения под обращенным микроскопом, показанные на фиг. 10, рассматривали под флюоресцентным микроскопом, в некоторых клетках была обнаружена эмиссия СЕР флюоресценции. Однако, принимая во внимание густоту клеток, эмиссия была чрезвычайно слабой по сравнению с таковой, издаваемой раковыми клетками. Поэтому полагают, что теломелизин-СЕР едва ли пролиферирует/реплициует в нормальных клетках (фиг. 11).
3. Верификация теломелизин-СЕР репликации с помощью количественной РСК в реальном времени.
Клетка рака лёгких человека Н1299, клетка рака толстой кишки человека 8\У620 и нормальная клетка-фибробласт лёгких человека (ИНЬЕ) были инфицированы теломелизином-СЕР на уровне 10 ΜΟΙ, как описано выше. По прошествии времени отбирали пробы клеток и из них извлекали ДНК. Затем количественно анализировали вирусную репликацию с помощью РСК в реальном масштабе времени.
Результаты показали, что теломелизин-СЕР уже реплицировался примерно в 1,000,000 раз в раковых клетках через 24 ч поле инфицирования и издавал заметную СЕР флюоресценцию через 72 ч после инфицирования (фиг. 12). С другой стороны, репликация была лишь около 1000 раз у ИНЬЕ клеток даже через 72 ч после инфицирования и СЕР флюоресценция была едва заметна (фиг. 12).
Пример 7. Выявление пролиферации/репликации теломелизина-СЕР внутри опухоли с помощью флюоресцентной визуализации.
1. Теломелизин-СЕР (107 БОЕ) вводили в опухоль рака лёгких человека Н1299, трансплантированную в безволосых мышей. Затем наблюдали эмиссию СЕР флюоресценции с течением времени с помощью ССИ камеры.
Результаты показали, что эмиссию СЕР флюоресценции, вызванной теломелизин-СЕР репликацией, можно было обнаружить через 24 ч после инфицирования и что уровень свечения постепенно увеличивался через 3 и 5 дней после инфицирования (фиг. 13).
2. Тем же способом, как описано выше, теломелизин-СЕР (107 БОЕ) вводили в опухоль рака лёгких человека Н1299, трансплантированную в безволосых мышей. Через неделю и через три недели подкожную опухоль удаляли. Эмиссию СЕР флюоресценции наблюдали на целой опухоли и на разрезе с помощью ССИ камеры.
В результате, даже когда флюоресценция была слабой на поверхности удалённой опухоли, репликацию теломелизина-СЕР можно было наблюдать в широком диапазоне на поверхности разреза (фиг. 14). В тканях через три недели после инфицирования флюоресцеция была заметна почти по всей поверхности опухоли (фиг. 14).
3. Тем же способом, как описано выше, клетки рака толстой кишки человека НТ29 были трансплан
- 13 011880 тированы в стенку прямой кишки безволосых мышей в качестве ортопической модели и теломелизинСЕР (107 БОЕ) был введён, когда сформировалась большая опухоль. Эмиссия СЕР флюоресценции, вызванной репликацией теломелизина-СЕР, была отмечена через неделю после инфицирования с помощью ССИ камеры (фиг. 15). Флюоресценция продолжалась даже через три недели после инфицирования (фиг. 15).
Пример 8. 1. Гистологический анализ орторопной модели ректального рака с помощью безволосых мышей и клеток рака толстой кишки человека НТ29.
Клетка рака толстой кишки человека НТ29 была трасплантирована в стенку прямой кишки безволосой мыши. Когда образовалась большая опухоль, она была удалена и изучена после окрашивания гематоксилином-эозином (НЕ).
В результате вокруг прямой кишки образовалась опухоль и массу опухолевых клеток можно было обнаружить в лимфатических сосудах стенки прямой кишки (фиг. 16).
2. Результаты вскрытия ортотопической модели рака прямой кишки на безволосых мышах и клетках рака толстой кишки человека НТ29.
Клетка рака толстой кишки человека НТ29 была трансплантирована в стенку прямой кишки и, когда образовалась большая опухоль, было произведено вскрытие. В результате в трёх лимфатических узлах (ΕΝ) была обнаружена припухлость вокруг аорты (фиг. 17).
3. Обнаружение внутриопухолевой пролиферации/репликации теломелизина-СЕР в ректальной опухоли НТ29 и лимфатических узлах около аорты с помощью флюоресцентной визуализации.
Эмиссия СЕР флюоресценции была выявлена на основе флюоресцентной визуализации с помощью ССИ камеры в трансплантированной ректальной опухоли НТ29 и в одном из трёх околоаортных лимфатических узлов (фиг. 18).
4. Выявление внутриопухолевой пролиферации/репликации теломилизина-СЕР в околоаортных лимфатических узлах с помощью флюоресцентной визуализации.
Эмиссия СЕР флюоресценции была обнаружена на основе флюоресцентной визуализации с помощью ССИ камеры только в одном из трёх околоаортных лимфатических узлов (фиг. 19).
5. Выявление внутриопухолевой пролиферации/репликации теломилизина-СЕР в околоаортных лимфатических узлах с помощью флюоресцентной визуализации.
Гистологический анализ околоаортных лимфатических узлов выявил метастатическую опухолевую ткань только в одном лимфатическом узле, который дал позитивную реакцию на СЕР флюоресценцию при флюоресцентной визуализации с помощью ССИ камеры. Таким образом, было подтверждено, что теломелизин-СЕР реплицирует только в положительных на метастаз лимфатических узлах (фиг. 20).
Цитированная литература
Ке1б Т., Са1аш8 Е., ЛЬЬгц77е8е 1., 8ζθ И., Шли Б.М., Лпбге\\'8 1., Капб1еу В., Не18е С., Ирпейагб М., НаШе1б М., Коше Б., КиЬш 1., Κίκη И. Нерайе аПепа1 ш1и8юп о£ а гер11са1юп-8е1еейуе опео1у11е абепоупи (611520): рйа8е II У1га1, 1тшипо1од1е, апб е11шеа1 епброшк. Сапеег Ке8 62 (21): 6070-9, 2002.
Возможность для промышленного использования
В соответствии с настоящим изобретением созданы реагент для выявления раковых клеток и агент, индуцирующий гибель клеток. Поскольку реагент по настоящему изобретению может выявлять раковые клетки с чрезвычайно высокой чувствительностью даже в живом организме, реагент полезен в области так называемой навигационной хирургии и подобных областях.
Свободный текст с перечислением последовательностей.
Ер ΙΌ ΝΟ: 5: Праймер
8Εζ) Ю ΝΟ: 6: Праймер
8Е(} Ю ΝΟ: 7: Праймер
8Εζ>ΙϋΝΟ:8: Праймер
8Εζ) ΙϋΝΟ: 9: Праймер
ЗЕС^) Ю ΝΟ: 10: Праймер
Claims (18)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Реагент для выявления раковых клеток, отличающийся тем, что он включает рекомбинантный вирус, в котором репликационная кассета, включающая промотор из теломеразы человека, ген Е1 А, последовательность 1КЕ8 и ген Е1В в таком порядке, интегрирована в область Е1 генома вируса и маркировочная кассета, включающая ген, кодирующий маркировочный белок, и промотор, способный регулировать экспрессию гена, кодирующего маркировочный белок, интегрирована в область Е3 генома вируса.
- 2. Реагент для диагностирования рака, отличающийся тем, что он включает рекомбинантный вирус, в котором репликационная кассета, включающая промотор из теломеразы человека, ген Е1 А, последовательность 1КЕ8 и ген Е1В в таком порядке, интегрирована в область Е1 генома вируса и маркировочная кассета, включающая ген, кодирующий маркировочный белок, и промотор, способный регулировать экспрессию гена, кодирующего маркировочный белок, интегрирована в область Е3 генома вируса.
- 3. Реагент по пп.1 и 2, отличающийся тем, что реагент применяется для выявления или диагности- 14 011880 рования рака ίη νίνο или для навигационной хирургии.
- 4. Реагент по пп.1 и 2, отличающийся тем, что промотор из теломеразы человека представляет собой ЬТЕКТ промотор.
- 5. Реагент по пп.1 и 2, отличающийся тем, что маркировочный белок представляет собой СБР.
- 6. Реагент по пп.1 и 2, отличающийся тем, что промотор, способный регулировать экспрессию гена, кодирующего маркировочный белок, представляет собой цитомегаловирусный промотор или ЬТЕКТпромотор.
- 7. Реагент по пп.1 и 2, отличающийся тем, что вирус представляет собой аденовирус.
- 8. Агент, индуцирующий гибель клеток, отличающийся тем, что он включает рекомбинантный вирус, в котором репликационная кассета, содержащая промотор из теломеразы человека, ген Е1А, последовательность 1КЕ8 и ген Е1В в таком порядке, интегрирована в область Е1 генома вируса, и кассета, индуцирующая гибель клеток, включающая ген, кодирующий белок, ассоциированный с индукцией гибели клеток, и промотор, способный регулировать экспрессию гена, кодирующего белок, интегрирована в область Е3 генома вируса.
- 9. Агент, индуцирующий гибель клеток, по п.8, отличающийся тем, что промотор из теломеразы человека представляет собой ЬТЕКТ-промотор.
- 10. Агент, индуцирующий гибель клеток, по п.8, отличающийся тем, что белок, ассоциированный с индукцией гибели клеток, представляет собой по крайней мере один из белков, выбранных из группы, состоящей из белка, ассоциированного с иммунитетом, белка, индуцирующего апоптоз, и белка, ассоциированного с теломеразой.
- 11. Агент, индуцирующий гибель клеток, по п.10, отличающийся тем, что белок, ассоциированный с иммунитетом, представляет собой РА28.
- 12. Агент, индуцирующий гибель клеток, по п.10, отличающийся тем, что белок, индуцирующий апоптоз, представляет собой ТКЛ1Е.
- 13. Агент, индуцирующий гибель клеток, по п.10, отличающийся тем, что белок, ассоциированный с теломеразой, представляет собой ЛИ5.
- 14. Агент, индуцирующий гибель клеток, по п.8, отличающийся тем, что промотор, способный регулировать ген, кодирующий белок, ассоциированный с индукцией гибели клеток, представляет собой цитомегаловирусный промотор или ЬТЕКТ-промотор.
- 15. Агент, индуцирующий гибель клеток, по п.8, отличающийся тем, что вирус представляет собой аденовирус.
- 16. Агент, индуцирующий гибель клеток, по п.8, отличающийся тем, что клетка представляет собой раковую клетку.
- 17. Метод выявления раковых клеток, отличающийся тем, что он включает инфицирование раковых клеток реагентом по любому из пп.1 и 3-6 и выявление флюоресценции, излучаемой раковыми клетками.
- 18. Метод индуцирования клеточной гибели в целевой клетке, отличающийся тем, что он включает инфицирование целевой клетки агентом, индуцирующим клеточную гибель, по любому из пп.8-16.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004285383 | 2004-09-29 | ||
| PCT/JP2005/018401 WO2006036004A1 (ja) | 2004-09-29 | 2005-09-28 | テロメライシン-gfp遺伝子含有組換えウイルス |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200700694A1 EA200700694A1 (ru) | 2007-08-31 |
| EA011880B1 true EA011880B1 (ru) | 2009-06-30 |
Family
ID=36099363
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200700694A EA011880B1 (ru) | 2004-09-29 | 2005-09-28 | Рекомбинантный вирус, содержащий ген теломелизина-gfp |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7943373B2 (ru) |
| EP (2) | EP1795604B1 (ru) |
| JP (1) | JP5006045B2 (ru) |
| KR (1) | KR20070059191A (ru) |
| CN (1) | CN101035906A (ru) |
| AT (1) | ATE520420T1 (ru) |
| AU (1) | AU2005288034A1 (ru) |
| BR (1) | BRPI0516191A (ru) |
| CA (1) | CA2581969A1 (ru) |
| EA (1) | EA011880B1 (ru) |
| IL (1) | IL181876A0 (ru) |
| MX (1) | MX2007002999A (ru) |
| NZ (1) | NZ554799A (ru) |
| WO (1) | WO2006036004A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200703294B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2642293C2 (ru) * | 2011-08-23 | 2018-01-24 | Нэшинел Институт оф Биомедикал Инновайшен | Условно реплицирующий аденовирус |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7192208B2 (en) * | 2003-09-02 | 2007-03-20 | Futurelogic, Inc. | Rewritable card printer |
| US20080153580A1 (en) * | 2003-09-12 | 2008-06-26 | Igt | Bezel interface for a card loading system |
| US7494414B2 (en) | 2003-09-12 | 2009-02-24 | Igt | Gaming device having a card management system for the management of circulating data cards |
| US8057296B2 (en) * | 2003-09-12 | 2011-11-15 | Igt | Gaming device including a card processing assembly having vertically-stacked card holders operable with thermally-printable data cards and portable card changeover machines |
| US20080153581A1 (en) * | 2003-09-12 | 2008-06-26 | Igt | Card loading system for a data card unit |
| JP5069871B2 (ja) * | 2006-05-30 | 2012-11-07 | シスメックス株式会社 | 新規な癌細胞検出試料調製用キット及びそれを用いた癌細胞検出用キット |
| JP5010890B2 (ja) * | 2006-10-11 | 2012-08-29 | オリンパス株式会社 | 生体試料解析方法 |
| US8197334B2 (en) | 2007-10-29 | 2012-06-12 | Igt | Circulating data card apparatus and management system |
| US20090181931A1 (en) * | 2008-01-16 | 2009-07-16 | Oncolys Biopharma, Inc. | Antiviral activity of cidofovir against oncolytic viruses |
| JP5400764B2 (ja) * | 2008-04-11 | 2014-01-29 | 国立大学法人 岡山大学 | 中皮腫特異的プロモータおよびその用途 |
| KR20110111377A (ko) * | 2008-12-18 | 2011-10-11 | 시스멕스 가부시키가이샤 | 혈액 시료 중의 암세포의 검출 방법 |
| CN101538556B (zh) * | 2009-01-07 | 2011-09-21 | 四川大学华西第二医院 | 腺病毒选择性互补复制的方法 |
| US9624476B2 (en) | 2011-08-23 | 2017-04-18 | National Institute Of Biomedical Innovation | Conditionally replicating adenovirus |
| CN107267554A (zh) | 2012-03-14 | 2017-10-20 | 萨克生物研究学院 | 腺病毒肿瘤诊断法 |
| CN103088061B (zh) * | 2013-01-15 | 2016-08-03 | 中国科学院微生物研究所 | 一种rna及载体在制备预防和/或治疗肝癌产品中的应用 |
| AU2014236207B2 (en) | 2013-03-14 | 2019-05-23 | Salk Institute For Biological Studies | Oncolytic adenovirus compositions |
| JP5812361B2 (ja) * | 2013-07-11 | 2015-11-11 | 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 | 遺伝子発現制御機構を含む新規Ａｄベクター |
| CA2963293A1 (en) | 2014-10-06 | 2016-04-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for isolation of circulating tumor cells (ctc) |
| DE102015111756A1 (de) * | 2015-07-20 | 2017-01-26 | Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät | Rekombinanter Orf-Virus-Vektor |
| EP3390428B1 (en) | 2016-02-23 | 2019-09-25 | Salk Institute for Biological Studies | High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics |
| KR20180112024A (ko) | 2016-02-23 | 2018-10-11 | 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 | 바이러스 동역학에 미치는 영향 최소화를 위한 치료용 아데노바이러스의 외인성 유전자 발현 |
| JP2019536468A (ja) | 2016-12-12 | 2019-12-19 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | 腫瘍を標的にする合成アデノウイルスおよびその使用 |
| KR102080996B1 (ko) * | 2018-07-23 | 2020-02-25 | 주식회사 코어파마 | 암세포 특이적 아데노바이러스 |
| WO2021010369A1 (ja) * | 2019-07-12 | 2021-01-21 | 学校法人順天堂 | ウイルスを用いた循環腫瘍細胞の検出方法 |
| CN113444730A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-09-28 | 昆明市延安医院 | 一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004033186A (ja) * | 2002-07-08 | 2004-02-05 | Kansai Tlo Kk | 腫瘍細胞において選択的に増殖する腫瘍融解ウイルス |
| JP2004236505A (ja) * | 2003-02-03 | 2004-08-26 | Nagasaki Univ | 細胞死誘発遺伝子を含有するベクターおよび医薬組成物 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7001596B1 (en) * | 1999-11-15 | 2006-02-21 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Oncolytic adenovirus |
| US6635244B2 (en) * | 2000-08-03 | 2003-10-21 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Adenovirus E1B-55K single amino acid mutants and methods of use |
| WO2003010306A1 (en) * | 2001-07-23 | 2003-02-06 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Viral mutants that selectively replicate in targeted human cancer cells |
-
2005
- 2005-06-21 US US11/158,479 patent/US7943373B2/en active Active
- 2005-09-28 CN CNA2005800327883A patent/CN101035906A/zh active Pending
- 2005-09-28 EP EP05790164A patent/EP1795604B1/en active Active
- 2005-09-28 EA EA200700694A patent/EA011880B1/ru active IP Right Revival
- 2005-09-28 EP EP10014555A patent/EP2311499B1/en active Active
- 2005-09-28 WO PCT/JP2005/018401 patent/WO2006036004A1/ja active Application Filing
- 2005-09-28 CA CA002581969A patent/CA2581969A1/en not_active Abandoned
- 2005-09-28 MX MX2007002999A patent/MX2007002999A/es not_active Application Discontinuation
- 2005-09-28 JP JP2006537857A patent/JP5006045B2/ja active Active
- 2005-09-28 NZ NZ554799A patent/NZ554799A/en unknown
- 2005-09-28 KR KR1020077009538A patent/KR20070059191A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-09-28 AT AT05790164T patent/ATE520420T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-09-28 BR BRPI0516191-6A patent/BRPI0516191A/pt not_active Application Discontinuation
- 2005-09-28 AU AU2005288034A patent/AU2005288034A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-03-12 IL IL181876A patent/IL181876A0/en unknown
- 2007-04-05 US US11/696,965 patent/US20080032283A1/en not_active Abandoned
- 2007-04-23 ZA ZA200703294A patent/ZA200703294B/xx unknown
-
2010
- 2010-09-30 US US12/895,120 patent/US20110111480A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004033186A (ja) * | 2002-07-08 | 2004-02-05 | Kansai Tlo Kk | 腫瘍細胞において選択的に増殖する腫瘍融解ウイルス |
| JP2004236505A (ja) * | 2003-02-03 | 2004-08-26 | Nagasaki Univ | 細胞死誘発遺伝子を含有するベクターおよび医薬組成物 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| JACOB D. et al., Suppressing orthotopic pancreatic tumor growth with a fiber-modified adenovector expressing the TRAIL gene from the human telomerase reverse transcriptase promoter. Clinical Cancer Research, 15 May, 2004 (15.05.04), vol.10, pages 3535 to 3541 * |
| KAWASHIMA, T. et al., Telomerase-specific replication-selective virotherapy for human cancer. Clinical Cancer Research, 01 January, 2004 (01.01.04), vol.10, pages 285 to 292 * |
| MIZUGUCHI, H. et al., In vitro ligation-based cloning of foreign DNAs into the E3 and El deletion regions for generation of recombinant adenovirus vectors. BioTechnigues, 2001, vol.30, pages 1112 to 1116 * |
| MIZUGUCHI, H., Basic study for next-generation gene therapy products. Yakugaku Zasshi, 2003, vol.123, pages 761 to 771 * |
| UMEOKA, T. et al., Visualization of intra thoracically disseminated solid tumors in mice with optical imaging by telomerase-specific amplification of a transferred green fluorescent protein gene. Cancer Research, 01 September, 2004 (01.09.04), vol 64, pages 6259 to 6265 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2642293C2 (ru) * | 2011-08-23 | 2018-01-24 | Нэшинел Институт оф Биомедикал Инновайшен | Условно реплицирующий аденовирус |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2005288034A1 (en) | 2006-04-06 |
| MX2007002999A (es) | 2007-08-07 |
| JPWO2006036004A1 (ja) | 2008-05-15 |
| EP2311499B1 (en) | 2012-08-29 |
| US7943373B2 (en) | 2011-05-17 |
| ATE520420T1 (de) | 2011-09-15 |
| EP1795604B1 (en) | 2011-08-17 |
| KR20070059191A (ko) | 2007-06-11 |
| US20110111480A1 (en) | 2011-05-12 |
| CA2581969A1 (en) | 2006-04-06 |
| CN101035906A (zh) | 2007-09-12 |
| EP1795604A1 (en) | 2007-06-13 |
| EP2311499A1 (en) | 2011-04-20 |
| EP1795604A4 (en) | 2008-08-27 |
| IL181876A0 (en) | 2007-07-04 |
| EA200700694A1 (ru) | 2007-08-31 |
| ZA200703294B (en) | 2008-08-27 |
| WO2006036004A1 (ja) | 2006-04-06 |
| BRPI0516191A (pt) | 2008-08-26 |
| US20060067890A1 (en) | 2006-03-30 |
| JP5006045B2 (ja) | 2012-08-22 |
| US20080032283A1 (en) | 2008-02-07 |
| NZ554799A (en) | 2009-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA011880B1 (ru) | Рекомбинантный вирус, содержащий ген теломелизина-gfp | |
| RU2642293C2 (ru) | Условно реплицирующий аденовирус | |
| Chung et al. | Use of L-plastin promoter to develop an adenoviral system that confers transgene expression in ovarian cancer cells but not in normal mesothelial cells | |
| CN101312740A (zh) | Wwox基因、包含该基因的载体和在癌症治疗中的用途 | |
| KR101429696B1 (ko) | 안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도 | |
| Krüger et al. | The bacterial lacZ gene: An important tool for metastasis research and evaluation if new cancer therapies | |
| KR101478869B1 (ko) | 마이크로ｒｎａ를 이용한 조절을 통한 암 특이적 유전자 치료제 | |
| WO2016197592A1 (zh) | 一种长链非编码rna hnf1a-as1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用 | |
| US9624476B2 (en) | Conditionally replicating adenovirus | |
| EP3327137B1 (en) | Host regulation factor for enhancing proliferation and propagation of vaccinia virus | |
| CN104673835A (zh) | 一种高效介导Lnc-MEG3基因过表达的慢病毒载体 | |
| WO2006085689A1 (ja) | テロメライシン併用抗癌剤 | |
| JP2007015997A (ja) | テロメライシン含有抗腫瘍剤耐性克服剤 | |
| NZ622585B2 (en) | Conditionally replicating adenovirus | |
| CN117343959A (zh) | 一种重组病毒及其构建方法和应用 | |
| KR101153844B1 (ko) | Ｋｒａｓ Ｇ１２Ｖ ＲＮＡ를 특이적으로 인지할 수 있는 트랜스-스플라이싱 그룹 Ｉ 리보자임 | |
| CN115927643A (zh) | 一种hsa_circ_0001495分子在肝癌治疗中的应用 | |
| CN115466742A (zh) | 癌基因vgll1及其编码蛋白的应用 | |
| Ji et al. | Synergistic Suppression of Prostatic Cancer Cells by Co-expression of both Mdm2-siRNA and Wide-type P53 Gene in vitro and in vivo | |
| JP2008214201A (ja) | 食道癌細胞の増殖抑制剤及びスクリーニング方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |