CN109355262A - 永生化宫血干细胞系 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种永生化人宫血干细胞系及其制备方法和用途。本发明所提供的永生化人宫血干细胞系具有原代人宫血干细胞的主要功能，是通过慢病毒载体向分离的人正常宫血干细胞中转染SV40Tag和hTERT基因，利用克隆法筛选获得永生化人宫血干细胞系。该永生化人宫血干细胞系可以大规模体外扩增。本发明所述的永生化人宫血干细胞系为基础研究及基因治疗提供充足的MenSCs来源，在细胞替代、基因治疗和再生医学方面具有广泛临床应用前景。

Description

永生化宫血干细胞系
技术领域
本发明涉及一种永生化人宫血干细胞，具体涉及一种能够稳定表达出人端粒酶催化亚基hTERT以及猴病毒40大T抗原SV40Tag的宫血干细胞系。本发明还涉及该干细胞系的建立方法和应用。本发明还涉及一种含有人端粒酶催化亚基基因hTERT以及猴病毒40大T抗原SV40Tag的重组慢病毒载体的构建。
背景技术
干细胞应用于疾病治疗是近年来发展起来的医疗新技术，比之传统治疗方法具有以下优点：①干细胞可修复、替代损伤的细胞和组织；②干细胞分泌多种营养因子，可有效促进组织生长。
胚胎干细胞是干细胞中的重要一种。诸多文献报道了利用胚胎干细胞进行细胞治疗。但是胚胎干细胞保持着肿瘤发生和免疫排斥反应的可能，且目前很难以克服该问题。
间充质干细胞治疗无排异反应，无医学伦理争议，安全可靠，疗效显著。人宫血干细胞(MenSCs)是可应用于再生医学方面及作为基因治疗的靶向细胞，在细胞替代与基因治疗方面具有广泛临床应用前景。但MenSCs许多方面存在有待解决的问题，尤其是自体MenSCs在移植应用中增殖能力有限，原代间充质干细胞随传代次数的增加形态逐渐发生变化，增殖分化能力降低，最终衰老死亡。无法获得临床研究及治疗所需要的细胞量。
解决这一问题的主要途径应包括两个方面：一是增强MenSCs的增殖活力，二是应用异体或异种MenSCs。但异体移植有免疫学问题，因此，永生化的人宫血干细胞的建立是非常有意义的工作。
端粒是染色体末端串连、重复的TTAGGG序列，在正常细胞分裂过程中会逐渐变短。当端粒在一个或多个染色体中缩短到某一极限值时，细胞衰老和生长停止就会发生。端粒的长度是由端粒酶维持的。端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶催化亚基。实验表明，外源性hTERT基因导入细胞可提高端粒酶活性，延缓细胞的衰老，保持了多向分化潜能并没有致瘤倾向。这说明用hTERT基因转染修饰MenSCs可以达到延长MenSCs生命周期、保持多向分化潜能的目的。Simonsen J.L等通过逆转录病毒载体将hTERT转入人骨髓间充质干细胞hMSCs，筛选到的骨髓hMSCs细胞克隆在体外培养到多代，细胞无衰老迹象、并保持了多向分化潜能。
猴肾病毒40(SV40)Tag是乳多空病毒科多型瘤病毒属中的一种小DNA肿瘤病毒。猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化，可使细胞渡过M1期后继续存活、传代培养20-30代，然后细胞又会进入危机期(M2期)，细胞死亡率增加并伴染色体异常，分裂的细胞逐渐减少，绝大多数细胞发生死亡。此病毒的早期蛋白T抗原(SV40Tag)有Rb和p53结合域，使Rb和p53丧失抑瘤蛋白的作用，失去对细胞周期的调控，使细胞分裂加速、无限生长。
发明内容
本发明成功地筛选到了hTERT和SV40Tag阳性的宫血干细胞系，在体外培养已达到100代，远远地超过了宫血干细胞的体外增殖能力，证明成功地获得永生化的人宫血干细胞系。筛选到的细胞系细胞形态及细胞表面抗原均符合人宫血干细胞特征，核型分析表明该细胞仍然是二倍体细胞，保持分化潜能，并且没有致瘤倾向。本发明所建立起的永生化的人宫血干细胞系，解决了细胞取材难及细胞分裂有限的问题，为基础研究及基因治疗提供充足的MenSCs来源，在细胞替代与基因治疗方面具有广泛临床应用前景。
因此，本发明一方面提供了一种永生化人宫血干细胞系，其特征在于其能表达hTERT和SV40Tag。
优选地，本发明的永生化人宫血干细胞系为通过慢病毒载体向分离的人正常宫血干细胞中转染SV40Tag和hTERT，并经筛选获得的永生化人宫血干细胞系。
更具体地，本发明提供了一种永生化人宫血干细胞系，其于2018年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.15584，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物所。
本发明永生化人宫血干细胞系优选地具有如下的生物学特征：(1)能够诱导出成骨细胞；(2)能表达PD-L1蛋白；(3)无致瘤性；和/或(4)多次传代培养后细胞核型为二倍体。
本发明另一方面还提供了一种永生化人宫血干细胞系的制备方法，其中通过慢病毒载体向分离的人正常宫血干细胞中转染SV40T抗原和hTERT基因，并筛选获得永生化人宫血干细胞系。
在本发明的永生化人宫血干细胞系的制备方法中，其中所述慢病毒载体优选地是通过携带hTERT-SV40Tag基因的pLVX-Puro转染慢病毒得到的重组载体。
在本发明所述的永生化人宫血干细胞系的制备方法中，其中所述人正常宫血干细胞优选地为人成体宫血干细胞。
在本发明所述的永生化人宫血干细胞系的制备方法中，其任选地还包括筛选获得所述永生化人宫血干细胞系后，将该永生化人宫血干细胞系体外扩大培养。
在本发明的还一方面，其提供了在本发明所述的永生化人宫血干细胞系或根据本发明的方法所制备的永生化人宫血干细胞系在制备细胞治疗剂中的用途。
在本发明的还一方面，其提供了本发明所述的永生化人宫血干细胞系或根据本发明的方法所制备的永生化人宫血干细胞系在表达外源蛋白中的用途。
本发明通过构建重组慢病毒载体pLVX-hTERT-SV40Tag，将hTERT和SV40Tag基因导入到宫血干细胞中，筛选出了能够稳定表达出hTERT和SV40Tag的宫血干细胞系(以下简称MenSC-hTERT-SV40Tag)，经过细胞培养及各种水平的鉴定，证明已经获得了永生化的宫血干细胞系，该细胞系保持分化能力，没有致瘤倾向，可以作为表达各种抗原与抗体的基因载体。
附图说明
图1：pEGFP-N1载体图谱。
图2：pLVX-Puro载体图谱。
图3：MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系及MenSCs的hTERT和SV40Tag的RT-QPCR凝胶电泳结果，其中：泳道1为SV40Tag；泳道2为hTERT；和泳道3为β-actin。
图4：MenSCs-P2、MenSC-hTERT-SV40Tag-P50及MenSC-hTERT-SV40Tag-P100细胞形态(从左至右)。
图5：用流式细胞仪对MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系进行表面抗原分析。分别对P50代和P100代的MenSC-hTERT-SV40Tag细胞表面抗原CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR进行分析的结果。
图6：MenSCs-P2、MenSC-hTERT-SV40Tag-P50和MenSC-hTERT-SV40Tag-P100的成骨诱导结果(从左至右)。
图7：将MenSCs-P2、传代第50代和第100代的MenSC-hTERT-SV40Tag细胞的裸鼠致瘤实验结果。
图8：免疫组化法检测PD-L1在MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系中表达情况。其中：(A)阴性对照；(B)携带PD-L1基因的腺病毒感染后的MenSC-hTERT-SV40Tag。
具体实施方式
在本发明中基于间充质干细胞体外无法永生的情形，在不产生肿瘤化诱导的情况下，采用外源导入端粒酶逆转录酶基因和SV40Tag基因以保持端粒酶活性，维持端粒长度，得到体外永生化干细胞，并验证其增殖传代能力及致瘤性。
慢病毒载体感染效率高，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在细胞内长时间的表达且安全性高。本发明通过构建重组慢病毒载体pLVX-hTERT-SV40Tag，将hTERT和SV40Tag基因导入宫血干细胞中，整合至宫血干细胞基因组，使宫血干细胞持续表达hTERT和SV40Tag。
本发明的发明人具体进行了以下研究：
1、构建了含有hTERT和SV40Tag的重组慢病毒载体，与病毒骨架质粒共转染293T细胞，成功地包装出含有hTERT和SV40Tag的重组慢病毒，并测定了重组慢病毒的滴度。
2、筛选出阳性的hTERT和SV40Tag细胞系用含有hTERT和SV40Tag重组慢病毒感染第二代人宫血干细胞，在嘌呤霉素的筛选下，成功地筛选出MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系，并继续培养，已成功地将MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系培养到100代。
3、用多种方法证明了上述所得MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系的生物活性以及生物功能：
1)用实时定量PCR及常规PCR技术在DNA、RNA水平检测了hTERT和SV40Tag基因的表达水平明显增加；
2)用端粒酶活性试剂盒(Trapeze telomerase detection kit)方法鉴定MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系具有端粒酶的活性；
3)MenSCs-P2与MenSC-hTERT-SV40Tag-P50和MenSC-hTERT-SV40Tag-P100形态比较；
4)细胞流式分析表明该细胞系表面标记均符合MenSCs特征；
5)用成骨诱导试剂诱导MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系，钙结晶水平升高，证明能够诱导出成骨细胞，表明MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系仍然具有多向分化能力；
6)核型分析表明MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系具有正常的二倍体特征；
7)证实了该细胞系的安全性小鼠致瘤实验表明，建立的MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系在小鼠体内没有致瘤现象，证实该细胞系没有致瘤性，比较安全；
8)在MenSC-hTERT-SV40Tag永生化细胞系中成功表达PD-L1。
试验表明，本发明的永生化宫血干细胞(1)能够诱导出成骨细胞；(2)能表达PD-L1蛋白；(3)无致瘤性；和/或(4)多次传代培养后细胞核型为二倍体。因此，本发明所筛选出的永生化的人宫血干细胞，可以解决干细胞分裂传代有限的问题，为基础研究及基因治疗提供充足的细胞来源。
本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。
为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1永生化人宫血干细胞系的建立及鉴定
1.细胞分离及培养
采用密度梯度离心法从经血中分离得到宫血干细胞，DMEM/F-12+10％FBS常规培养，细胞生长至80％-90％以1∶3传代。
2.重组慢病毒载体hTERT-SV40Tag的构建和鉴定
以pcl-neo-hTERT质粒及SV40Tag质粒为模板，PCR扩增出hTERT(含Xho I和EcoR I酶切位点)和SV40Tag(含Sal I和BamH I酶切位点)完整基因片段，纯化后分别进行Xho I和EcoR I双酶切以及Sal I和BamH I双酶切，纯化回收hTERT和SV40Tag目的片段。以pEGFP-N1(图1)为骨架载体，经Xho I和BamH I双酶切后，利用酶切连接的方法与纯化回收的hTERT和SV40Tag目的片段连接。T4连接酶连接后转化感受态大肠杆菌，提取高纯度的pEGFP-hTERT-SV40Tag质粒，进行Xho I和BamH I双酶切鉴定，酶切产物6300bp左右hTERT-SV40Tag片段。用凝胶回收试剂盒从pEGFP-hTERT-SV40Tag质粒酶切产物中回收纯化hTERT-SV40Tag片段。pLVX-Puro载体(图2)同时进行Xho I和BamH I双酶切，纯化回收线性化的pLVX-Puro载体。纯化的hTERT-SV40Tag片段与线性化的pLVX-Puro载体16℃T4连接酶连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌接种于氨苄青霉素抗性的LB培养基，37℃培养过夜。挑菌过夜培养，提取质粒，进行测序鉴定。鉴定正确后，获得pLVX-hTERT-SV40Tag重组慢病毒载体，将该重组载体瞬时转染HEK293细胞，用免疫荧光的方法，鉴定质粒能否够表出达端粒酶催化亚基hTERT以及SV40Tag。
3.重组慢病毒纯化
用质粒提取试剂盒提取高纯度pLVX-hTERT-SV40Tag重组质粒，并测定浓度。实验前1天，将293T细胞按照4×106的量接种到1个直径10cm的培养皿中，细胞使用含有10％FBS的高糖DMEM培养液培养。实验当日，待细胞密度长到85％-90％时，将提取的高质量的plvx-hTERT-SV40Tag质粒7μg与慢病毒包装质粒混合物36μl及FuGene HD转染试剂75μl混匀，孵育30min后共转染293T细胞，转染后72h收获细胞上清，300g离心后，用0.45μm滤器过滤上清液。使用Clontech公司P24定量检测试剂盒对获得的重组病毒滴度进行检测。结论：成功地包装出了含有hTERT及SV40Tag基因的重组慢病毒，病毒滴度可以达到1×107。
4.重组慢病毒感染MenSC
使用含有10％FBS的DMEM/F-12培养液进行培养，实验前1天，将对数生长期的P1代MenSC接种到六孔板中，细胞汇合度70-90％时，将获得的重组慢病毒按照M0l＝20∶1的量感染细胞，感染时加入8μg/mL的polybrene，感染后6h细胞换液，感染后24-48h加入新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基筛选，以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细胞的培养基。直到抗性群落能被识别出，即对照细胞全部死亡时得到MenSC-hTERT-SV40Tag细胞株，继续传代培养筛选得到的细胞。将该细胞于2018年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.15584，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物所。
实施例2 MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系的生物活性以及生物功能验证
取未感染慢病毒的P2代MenSCs，以及根据实施例1获得的感染后第50代和第100代MenSC-hTERT-SV40Tag细胞进行以下检测：
1.RT-QPCR方法鉴定MenSC-hTERT-SV40Tag细胞株。
提取细胞总RNA，进行RT-QPCR(引物序列见表1)鉴定MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系及MenSCs的hTERT和SV40Tag表达水平的差异。
RT-QPCR凝胶电泳结果显示，MenSCs和MenSC-hTERT-SV40Tag中均能扩增出396bp左右的β-actin。在MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系中，能够扩增出大约422bp的SV40Tag基因片段和244bp的hTERT基因的片段(如图3)，而在未转入hTERT基因和SV40Tag基因的MenSCs中不能够扩增出相应的片段，表明MenSC-hTERT-SV40Tag中外源的hTERT基因和SV40Tag基因已经成功的整合到了细胞基因组中。
RT-QPCR结果显示，MenSC-hTERT-SV40Tag中hTERT的检测Ct值明显低于常规的MenSC细胞的Ct值，表明MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系中hTERT基因在mRNA上水平上的表达量远远大于未经重组慢病毒感染的MenSC。
表1 RT-QPCR引物序列
2.MenSC-hTERT-SV40Tag细胞端粒酶活性检测
按照Roche公司的TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA端粒酶活性检测试剂盒说明书检测取P2代MenSCs，P50代和P100代MenSC-hTERT-SV40Tag细胞端粒酶活性，以P2代MenSCs为对照。收集状态良好的上述细胞各2×105个细胞，冷PBS洗2次，冰上裂解30min，16000×g低温离心20min，取上清3μl加入TRAP反应液并加无核酸酶的水补足50μl进行PCR扩增。反应条件为：25℃，30min；94℃，5min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，90s，30个循环。取2.5μl扩增产物，加入10μl变性液，室温放置10min，加入100μl杂交液，将该混合液加入到链霉亲和素包被的微量反应板中，300r/min，37℃孵育2h，弃上清液，洗板3次，每孔加入100μl地高辛过氧化物酶，300r/min，室温孵育30min，弃上清，洗板5次，加入100μl TMB底物液，15-30min后加入终止液，酶标仪检测450nm处吸光度值，参比波长为690nm，每个样本重复3次。
结果：表明在MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系能够表达出端粒酶，并且该酶具有端粒酶的活性。
表2各株细胞端粒酶活性检测结果
3.MenSC-hTERT-SV40Tag细胞培养
对细胞系继续使用含有10％FBS的DMEM-F12培养液进行培养，培养到了第100代，细胞形态没有发生改变(如图4)，已经远远的超过了普通的人宫血干细胞的细胞传代次数，表明我们已经获得永生化的人宫血干细胞系。
4.细胞表面标记鉴定
用流式细胞仪对MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系进行表面抗原分析。分别对P50代和P100代的MenSC-hTERT-SV40Tag细胞表面抗原CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR进行分析。结果如图5和表3所示。结果表明，建立的细胞系仍然具有MenSCs的细胞表型。
表3各株细胞表面标记检测结果(％)
5.核型分析按照常规的染色体制片技术，对MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系第50代和第100代的细胞进行染色体分析。结果显示细胞核型为二倍体。
6.成骨诱导鉴定
用成骨诱导培养基诱导MenSCs-P2，MenSG-hTERT-SV40Tag-P50，MenSC-hTERT-SV40Tag-P100 4周后，细胞进行茜素红染色，确定细胞是否能够诱导成为成骨细胞。
诱导过程按cyagen成人骨髓间充质干细胞成骨诱导试剂盒说明说进行。
结果如图6所示。经过诱导后的细胞染色，颜色为红色或是深红色，表明有大量的钙结节产生，是成骨细胞的一个重要特征。由图6结果可看出，MenSC-hTERT-SV40Tag-P50和MenSC-hTERT-SV40Tag-P100仍具有较强的成骨分化能力。
7.裸鼠致瘤实验
为了检测建立的MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系是否具有致瘤的倾向及细胞应用的安全性，进行了裸鼠的致瘤实验。接种到裸鼠体内后能否形成恶性肿瘤是检验细胞是癌细胞恶性程度的重要指标。
实验方法：将MenSCs-P2，传代第50代和第100代的MenSC-hTERT-SV40Tag细胞消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×107/ml。选择雄性5周龄裸鼠。各组小鼠分别于前肢皮下注射0.25ml细胞悬液。阳性对照为Hela细胞，接种量为1×106个/只；阴性对照为磷酸盐缓冲液PBS；定期观察裸鼠生长和肿瘤生长情况。
结果如图7所示：裸鼠接种各种细胞25天后，Hela细胞组小鼠颈背部就已经开始呈现出肿瘤，而MenSCs组、MenSC-hTERT-SV40Tag细胞组及PBS组并没有产生。后经过两个月的观察，肿瘤细胞组肿瘤继续增大，且体重减轻，而MenSC-hTERT-SV40Tag细胞组及PBS组仍然没有出现肿瘤的迹象。为接种细胞后45天小鼠经过苯巴比妥钠麻醉后拍摄照片。接种MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系两个月后，裸鼠仍然没有出现肿瘤的倾向，表明MenSC-hTERT-SV40Tag没有致瘤的倾向，是安全的。
实施例3表达PD-L1病毒在MenSC-hTERT-SV40Tag中的表达应用
携带PD-L1基因的腺病毒购于汉恒生物。
实验过程：MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系使用含有10％FBS的DMEM/F-12培养液进行培养，实验前1天，将细胞接种到六孔板中(孔内放有玻片)，次日，细胞达到70-90％，将携带PD-L1基因的腺病毒按照MOI＝10∶1感染细胞。4h后换液。感染后第三天，取出六孔板内细胞爬片，免疫组化检测PD-L1蛋白在MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系中的表达情况。
实验结果如图8所示，DAB显色后，阳性表达呈棕黄色或者褐色。结果表明PD-L1蛋白可以有效地在MenSC-hTERT-SV40Tag细胞系中进行表达。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江生创精准医疗科技有限公司
<120> 永生化宫血干细胞系
<130> JC524
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> hTERT-F
<222> (1)..(20)
<223> hTERT-F
<400> 1
cctcaggcga caaggagcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> hTERT-R
<222> (1)..(20)
<400> 2
agcgggcagt gcgtcttgag 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> SV40T-F
<222> (1)..(18)
<223> SV40T-F
<400> 3
caggcataga gtgtctgc 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> SV40T-R
<222> (1)..(20)
<223> SV40T-R
<400> 4
caacagcctg ttggcatatg 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> β肌动蛋白-F
<222> (1)..(25)
<223> β肌动蛋白-F
<400> 5
tggcaccaca ccttctacaa tgagc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> β肌动蛋白-R
<222> (1)..(25)
<223> β肌动蛋白-R
<400> 6
gcacagcttc tccttaatgt cacgc 25

Claims (10)

1.一种永生化人宫血干细胞系，其特征在于其能表达hTERT和SV40Tag。
2.根据权利要求1所述的永生化人宫血干细胞系，其为通过慢病毒载体向分离的人正常宫血干细胞中转染SV40Tag和hTERT，并经筛选获得的永生化人宫血干细胞系。
3.一种永生化人宫血干细胞系，其于2018年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.15584。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的永生化人宫血干细胞系，其中所述永生化人宫血干细胞系的生物学特征为：(1)能够诱导出成骨细胞；(2)能表达PD-L1蛋白；(3)无致瘤性；和/或(4)多次传代培养后细胞核型为二倍体。
5.权利要求1-4中任一项所述的永生化人宫血干细胞系的制备方法，其中通过慢病毒载体向分离的人正常宫血干细胞中转染SV40T抗原和hTERT基因，并筛选获得永生化人宫血干细胞系。
6.根据权利要求5所述的永生化人宫血干细胞系的制备方法，其中所述慢病毒载体通过携带hTERT-SV40Tag基因的pLVX-Puro转染慢病毒得到的重组载体。
7.根据权利要求5或6所述的永生化人宫血干细胞系的制备方法，其中所述人正常宫血干细胞为人成体宫血干细胞。
8.根据权利要求5或6所述的永生化人宫血干细胞系的制备方法，其还包括筛选获得所述永生化人宫血干细胞系后，将该永生化人宫血干细胞系体外扩大培养。
9.权利要求1～4任一权利要求所述的永生化人宫血干细胞系或根据权利要求5～8任一方法所制备的永生化人宫血干细胞系在制备细胞治疗剂中的用途。
10.权利要求1～4任一权利要求所述的永生化人宫血干细胞系或根据权利要求5～8任一方法所制备的永生化人宫血干细胞系在表达外源蛋白中的用途。
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