CN113106094B - 增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子、筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因启动子技术领域，公开了一种增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子、筛选方法及应用，启动子PEMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子的筛选方法包括：构建合成启动子调控报告基因表达的重组质粒；启动子活性的体外初步筛选；含报告基因的质粒的构建；启动子活性研究实验。本发明提供的增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子PEMS，在体内、体外实验中的表达效率显著高于CMV启动子，在骨骼肌中启动基因表达的强度、特异性及持续时间方面表现优秀，在后续的基因治疗领域具有很大的潜能，可通过肌肉注射在实验动物乃至人体实现生物学功能或进行基因治疗。

Description

增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子、筛选方法及应用
技术领域
本发明属于基因启动子技术领域，尤其涉及一种增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子、筛选方法及应用。
背景技术
目前，在基因治疗中，肌肉注射含目的基因的质粒是持续有效的方法。骨骼肌细胞具有细胞体积大、性能稳定、生命周期长等优点。骨骼肌分布范围广、数量多、体积大，可承受较大容量注射，且注射易操作；其血管丰富，使得细胞表达的功能性分泌蛋白更易进入血液循环系统以发挥治疗作用；重组治疗蛋白可在肌肉组织中持续表达较长时间。基于上述几点，以病人自身骨骼肌细胞来“生产”重组治疗蛋白的基因治疗策略具有很大应用前景。
外源基因进入骨骼肌细胞中表达主要通过病毒或非病毒载体两种方式。病毒载体基因传递效率高，但其制备较难、易引起机体的免疫和炎症反应，甚至能突变产生有活性的病毒颗粒，或引起恶性突变等，因此其临床应用具有较大风险和难度。相比之下，以质粒为代表的非病毒载体有着独特的优势，如低毒性、低免疫原性、低成本、易构建、可携带大片段外源基因等，故而以质粒为载体的基因治疗体系极具研究价值和应用潜力。但是，质粒表达体系在肌肉细胞中的基因表达效率较低是其进行有效基因治疗的重要制约因素，故提高外源基因在肌肉组织中的表达具有重要意义。
外源基因在肌肉组织中的表达强度受多方面因素的影响，主要包括转录调控元件、基因传递材料和基因传递方法等。同时，一些功能基因在异位组织的高表达可能产生安全隐患。因此，基因治疗体系必须兼顾有效性和安全性。外源质粒进入细胞后，所携带功能基因的表达主要受转录调控元件的影响，其中启动子是核心因素，调控着基因表达的强度和时间、空间特性，即，启动子的强度和特异性决定了基因表达的水平和组织特异性。因此，通过构建高效、组织特异性启动子来调控目的基因表达的强度和组织特异性，是一种快捷、高效的策略。
人巨细胞病毒启动子(CMV)是一种广泛应用的病毒启动子，其活性较强，但其表达外源基因几乎没有细胞特异性，基因表达的持续时间也不长。一些天然肌肉特异性启动子，如骨骼肌特异性启动子a-actin启动子、肌球蛋白轻链2(MLC2)启动子、肌球蛋白轻链3F启动子和肌酸激酶(MCK)启动子能在肌肉细胞中特异性激活，其中MLC2启动子的肌肉特异性最高，只能在心肌细胞中激活。但这些天然的肌肉特异性启动子表达外源基因的效率通常远低于CMV等病毒性启动子，因此也限制了其实际应用。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有外源基因进入骨骼肌细胞中表达的方式中，病毒载体基因制备较难、易引起机体的免疫和炎症反应，甚至能突变产生有活性的病毒颗粒，或引起恶性突变等，因此其临床应用具有较大风险和难度。
(2)现有外源基因进入骨骼肌细胞中表达的方式中，质粒表达体系在肌肉细胞中的基因表达效率较低是其进行有效基因治疗的重要制约因素。
(3)现有的天然肌肉特异性启动子表达外源基因的效率通常远低于CMV等病毒性启动子，因此也限制了其实际应用。
解决以上问题及缺陷的难度为：骨骼肌原位基因传递/表达体系主要涉及基因进入骨骼肌细胞、治疗蛋白在细胞中的表达以及治疗基因的选择等关键环节，虽然这一想法由来已久且有诸多独特优势，但其发展却十分缓慢。究其原因，主要在于针对骨骼肌细胞的高效基因传递工具的缺乏，同时基因表达载体的效率和特异性也亟待提高。与此同时，生命科学和医学在飞速发展，越来越多的疾病关键基因和致病机理被确定，为治疗提供了更多的素材。
解决以上问题及缺陷的意义为：开发高效基因传递工具和表达载体、以构建高效骨骼肌原位基因传递/表达体系，并在此基础上科学合理地利用功能基因、建立有效治疗体系，就是本项目的主要目标。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子、筛选方法及应用。
本发明是这样实现的，一种增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子，所述增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子PEMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子的含有增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子PEMS的重组载体，所述含有增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子PEMS的重组载体包括pGL3-EMS-Luc(pEMS-Luc)、pGL3-EMS-E2(pEMS-E2)、pGL3-EMS-LacZ(pEMS-LacZ)、pGL3-EMS-GHRH(pEMS-GHRH)以及pCDNA3.1(+)-EMS-EGFP(pEMS-EGFP)。
本发明的另一目的在于提供一种所述的含有增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子PEMS的重组载体在制备基因治疗用药物中的应用，所述基因治疗通过肌肉注射进行实现。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子的增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子的筛选方法，所述增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子的筛选方法包括以下步骤：
步骤一，构建合成启动子调控报告基因表达的重组质粒；
步骤二，启动子活性的体外初步筛选；
步骤三，含报告基因的质粒的构建；
步骤四，基于报告基因表达的启动子活性研究-体外实验；
步骤五，基于报告基因表达的启动子活性研究-体内实验；
步骤六，基于功能基因表达的启动子活性研究-体内实验。
进一步，步骤一中，所述构建合成启动子调控报告基因表达的重组质粒，包括：
(1)将合成启动子混合片段与TOPO Zero Blunt质粒连接后转化感受态大肠杆菌，得到大量含不同长度Topo-SP质粒的单菌落；
(2)将所有单菌落用LB液体培养基收集到同一试管中，37℃过夜震荡培养，提取Topo-SP混合质粒；
(3)将混合质粒用KpnI/XhoI双酶切，将所有切下的SP片段连于pGL3-E2载体的KpnI/XhoI位点间，得到混合质粒pGL3-SP-E2；
(4)用pGL3-SP-E2混合质粒转化感受态大肠杆菌得到了大量pGL3-SP-E2单菌落，从中挑取233个单菌落分别培养后，提取233个pGL3-SP-E2质粒，命名为pGL3-SP1-233-E2。
进一步，步骤二中，所述启动子活性的体外初步筛选，包括：
用233个质粒pGL3-SP1-233-E2与pGL3-SP301-E2、pGL3-CMV-E2和pGL3-EMS001-005-E2质粒分别转染小鼠成肌细胞C2C12和大鼠成肌细胞L6，利用倒置显微镜观察，筛选出效果最好的肌肉特异性启动子PEMS003，所述转染按照Lipofectamine3000试剂的标准步骤进行。
进一步，步骤四中，所述基于报告基因表达的启动子活性研究-体外实验，包括：
(1)分别用小鼠成肌细胞C2C12、大鼠成肌细胞L6，非肌肉细胞系HEK293、NIH/3T3、HeLa和HepG2细胞进行瞬时转染，转染按照Lipofectamine3000标准程序进行；(A)荧光素酶报告基因质粒(pGL3-CMV-Luc、pGL3-SP301-Luc、pGL3-EMS003-Luc、pGL3-MCK-Luc)；(B)绿色荧光蛋白报告基因质粒(pCMV-EGFP、pSP301-EGFP、pEMS003-EGFP、pMCK-EGFP)；(C)红色荧光蛋白报告基因质粒(pGL3-CMV-E2、pGL3-SP301-E2、pGL3-EMS003-E2)；
(2)细胞转染48h后，检测荧光信号强度或荧光素酶活性，分析6种不同细胞株中各启动子的活性；
(3)转染细胞中红色和绿色荧光蛋白表达强度的定性分析：使用倒置荧光显微镜拍照后再进行定性比较；
(4)转染细胞中红色和绿色荧光蛋白表达强度的定量分析：使用流式细胞仪检测转染后的细胞，用其自带软件计算10,000个荧光细胞的平均荧光强度，用于定量比较；
(5)转染细胞中荧光素酶表达强度的定量分析：使用酶标仪读取荧光素酶催化底物反应后所产生的荧光信号，即OD值。
进一步，步骤五中，所述基于报告基因表达的启动子活性研究-体内实验，包括：
(1)荧光素酶报告基因表达的定量检测
选取6-8周的BALB/c小鼠，分空白组、pGL3-CMV-Luc组和pGL3-EMS003-Luc组，每组6只小鼠，在其胫骨前肌处使用L/E/G法分别给予50ug质粒，6天后处死小鼠，取胫骨前肌匀浆，用酶标仪读取荧光素酶催化底物反应后所产生的荧光信号，即OD值；
(2)β-半乳糖苷酶报告基因表达的定性检测
选取6-8周的BALB/c小鼠，分空白组、pGL3-CMV-LacZ组和pGL3-EMS003-LacZ组，每组6只小鼠；在小鼠胫骨前肌处使用L/E/G法分别给予50ug质粒，6天后处死小鼠，用原位染色法显示胫骨前肌中β-半乳糖苷酶表达量。
进一步，步骤六中，所述基于功能基因表达的启动子活性研究-体内实验，包括：
(1)选取3-4周的BALB/c小鼠，分空白组、生理盐水组、pGL3-EMS003组、pGL3-CMV-GHRH组和pGL3-EMS003-GHRH组，每组9只；在小鼠腿部肌肉处使用L/E/G法分别给予50ug质粒；
(2)小鼠血清GHRH浓度检测：在注射后7d、14d、21d和30d用Mouse GHRH ELISA Kit利用双抗夹心酶联免疫吸附法ELISA检测血清中GHRH的浓度，操作流程按照检测试剂盒操作步骤进行；
(3)GHRH的生物学效应检测：肌注质粒后表达的GHRH可促进小鼠生长，因此每三天称一次小鼠体重，用以分析不同启动子的活性。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子PEMS，在体内、体外实验中的表达效率显著高于CMV启动子，在骨骼肌中启动基因表达的强度、特异性及持续时间方面表现优秀，在后续的基因治疗领域具有很大的潜能。
同时，本发明筛选了一条比此前构建的高效骨骼肌细胞特异性启动子SP301活性更强的启动子，命名为增强型肌肉特异性启动子EMS003，简写为PEMS，为人工合成启动子，具有核酸序列唯一性。在体外肌肉细胞和体内骨骼肌中，PEMS对多种报告基因的转录活性均显著强于CMV启动子，有很好的肌肉细胞特异性；一次性肌注pEMS-GHRH质粒在小鼠骨骼肌中驱动GHRH表达可产生明显生物学效应，加速小鼠生长，具备治疗效果，展示了PEMS良好的应用前景。
本发明公开了增强型骨骼肌细胞特异性(Enhanced Muscle Specific,EMS)启动子PEMS003(以下简称为PEMS)的核甘酸序列及其应用范围。本发明提供的增强型骨骼肌细胞特异性启动子PEMS在体内、体外实验中的表达效率高于传统强启动子CMV和此前本发明公开的骨骼肌细胞特异性高效合成启动子SP301。PEMS在骨骼肌细胞中启动多种报告基因表达的强度、特异性及持续时间方面表现优秀，并能通过一次性肌肉注射质粒来持续高效表达功能基因，在实验动物体内展示出明显的生物学效应，已具备基因治疗的功能；以PEMS调控功能基因转录所构建的真核表达质粒可通过肌肉注射在实验动物乃至人体实现生物学功能或进行基因治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的不同细胞中转染含不同启动子的绿色荧光蛋白表达质粒示意图。
图2是本发明实施例提供的不同细胞中转染含不同启动子的红色荧光蛋白表达质粒示意图。
图3是本发明实施例提供的不同细胞中转染含不同启动子的荧光素酶表达质粒示意图。
图4是本发明实施例提供的利用β-半乳糖苷酶报告基因半定量分析启动子在小鼠胫骨前肌中的转录效率示意图。
图5是本发明实施例提供的β-半乳糖苷酶报告基因在体内表达的半定量评估示意图。
图6是本发明实施例提供的肌肉中表达GHRH的生物学效应及血清GHRH浓度示意图。
图7是本发明实施例提供的增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子的筛选方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子、筛选方法及应用，下面结合附图和实施例对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子PEMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
如图7所示，本发明实施例提供的增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子的筛选方法包括以下步骤：
S101，构建合成启动子调控报告基因表达的重组质粒；
S102，启动子活性的体外初步筛选；
S103，含报告基因的质粒的构建；
S104，基于报告基因表达的启动子活性研究-体外实验；
S105，基于报告基因表达的启动子活性研究-体内实验；
S106，基于功能基因表达的启动子活性研究-体内实验。
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。
本发明合成启动子体外初步筛选。分别用pGL3-CMV-E2、启动子文库中233个pGL3-SP1-233-E2质粒、pGL3-SP301-E2及5个含合成启动子的质粒pGL3-EMS001-005-E2对小鼠成肌细胞C2C12和大鼠成肌细胞L6进行瞬时转染。48h后，利用倒置荧光显微镜观察红色荧光强度以判断启动子的转录效率，初步筛选出转录活性较高的合成启动子质粒pGL3-EMS003-E2。
图1-图2是基于荧光信号强度分析的启动子活性体外定量分析。分别用pCMV-EGFP、pSP301-EGFP、pEMS003-EGFP、pMCK-EGFP和pGL3-CMV-E2、pGL3-SP301-E2、pGL3-EMS003-E2质粒对小鼠成肌细胞C2C12、大鼠成肌细胞L6和非肌肉细胞系HEK293、NIH/3T3、HeLa和HepG2细胞进行瞬时转染。48h后，利用流式细胞仪检测被转染细胞的平均荧光强度，从而判断、比较各启动子在6种不同细胞株中的转录效率。
图3是基于荧光素酶活性测定的启动子活性体外定量分析。分别用pGL3-CMV-Luc、pGL3-SP301-Luc、pGL3-EMS003-Luc和pGL3-MCK-Luc质粒对小鼠成肌细胞C2C12、大鼠成肌细胞L6和非肌肉细胞系HEK293、NIH/3T3、HeLa和HepG2细胞进行瞬时转染。48h后，通过检测荧光素酶活性来定量判断、比较各启动子在6种不同细胞株中的转录活性。
图4-图5是启动子活性的体内评估。图4：利用β-半乳糖苷酶报告基因半定量分析启动子在小鼠胫骨前肌中的转录效率。图5：利用荧光素酶报告基因定量检测启动子在小鼠胫骨前肌中的转录效率。
(A)在肌注后第7天，β-半乳糖苷酶报告基因在小鼠胫骨前肌中的表达强度。n＝6只/组，CMV:pGL3-CMV-LacZ、EMS003:pGL3-EMS003-LacZ。(B)荧光素酶报告基因在小鼠胫骨前肌中的表达强度。n＝6/组，CMV:pGL3-CMV-Luc、EMS003:pGL3-EMS003-Luc。
图6是单次肌肉注射GHRH表达质粒在小鼠体内GHRH的表达及其对生长的影响。n＝6/组，每只小鼠注射50μg质粒。CMV:pGL3-CMV-GHRH,EMS003:pGL3-EMS003-GHRH,Mock:pGL3-EMS003。(A)小鼠的平均体重。(B)体重的增加值。(C)GHRH在血液中的平均含量。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1
本发明的SP301启动子是一个较强的肌肉特异性合成启动子，是将19种调控元件的双链DNA片段等量混合、连接，构建合成启动子文库，从文库中筛选了1200多个启动子后鉴定出的肌肉特异性高效启动子。
通过对SP301等几十条合成启动子的序列进行分析，结合它们的基因转录水平，本发明推测出一些影响骨骼肌细胞特异性启动子活性和特异性的规律，以此为指导，本发明设计、合成了5条全新的启动子，通过体外、体内多种验证，获得了一条性能优于SP301的增强型肌肉特异性启动子(Enhanced Muscle Specific Promoter)，命名为PEMS。
为了在骨骼肌细胞中更高效、特异地表达目标基因，本发明提供了一种增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子PEMS。
本发明高效启动子PEMS，其特征在于：其独有的人工合成核苷酸序列。
本发明中的重组载体，它含有前述的启动子PEMS。
本发明所述重组载体包括但不限于以下重组质粒：pGL3-EMS-Luc(pEMS-Luc)、pGL3-EMS-E2(pEMS-E2)、pGL3-EMS-LacZ(pEMS-LacZ)、pGL3-EMS-GHRH(pEMS-GHRH)及pCDNA3.1(+)-EMS-EGFP(pEMS-EGFP)。
本发明中所用的骨骼肌原位基因传递方法为发明人前期建立的L/E/G法(详见Regenerative Biomaterials.2019,6(2):1-10.doi:10.1093/rb/rby028.)。
本发明还提供了含启动子PEMS的重组载体通过肌肉注射进行基因治疗的示范。
本发明提供的启动子PEMS在体内、体外实验中的表达效率显著高于CMV启动子，在骨骼肌中启动基因表达的强度、特异性及持续时间方面表现优秀，在后续的基因治疗领域具有很大的潜能。
实施例2
一、从合成启动子文库中筛选骨骼肌细胞高效特异性启动子
1、构建合成启动子调控报告基因表达的重组质粒
将合成启动子混合片段与TOPO Zero Blunt质粒连接后转化感受态大肠杆菌，得到大量含不同长度Topo-SP质粒的单菌落。将所有单菌落用LB液体培养基收集到同一试管中，37℃过夜震荡培养，提取Topo-SP混合质粒。将混合质粒用KpnI/XhoI双酶切，将所有切下的SP片段连于pGL3-E2载体的KpnI/XhoI位点间，得到混合质粒pGL3-SP-E2。用pGL3-SP-E2混合质粒转化感受态大肠杆菌得到了大量pGL3-SP-E2单菌落，从中挑取233个单菌落分别培养后，提取233个pGL3-SP-E2质粒，命名为pGL3-SP1-233-E2。
2、启动子活性的体外初步筛选
用233个质粒pGL3-SP1-233-E2与pGL3-SP301-E2、pGL3-CMV-E2和pGL3-EMS001-005-E2质粒分别转染小鼠成肌细胞C2C12和大鼠成肌细胞L6，利用倒置显微镜观察，筛选出效果最好的肌肉特异性启动子PEMS003。转染按照Lipofectamine3000试剂的标准步骤进行。
3、含报告基因的质粒的构建
为进一步对比启动子PEMS003的功能，构建了多种含报告基因和功能基因的质粒，如表1所示。
表1多种含报告基因和功能基因的质粒
Figure BDA0003010534450000111
重组质粒的构建按照分子克隆常规程序操作。
4、基于报告基因表达的启动子活性研究-体外实验。
分别用小鼠成肌细胞C2C12、大鼠成肌细胞L6，非肌肉细胞系HEK293、NIH/3T3、HeLa和HepG2细胞进行瞬时转染，转染按照Lipofectamine3000标准程序进行。(A)荧光素酶报告基因质粒(pGL3-CMV-Luc、pGL3-SP301-Luc、pGL3-EMS003-Luc、pGL3-MCK-Luc)；(B)绿色荧光蛋白报告基因质粒(pCMV-EGFP、pSP301-EGFP、pEMS003-EGFP、pMCK-EGFP)；(C)红色荧光蛋白报告基因质粒(pGL3-CMV-E2、pGL3-SP301-E2、pGL3-EMS003-E2)。细胞转染48h后，检测荧光信号强度或荧光素酶活性，分析6种不同细胞株中各启动子的活性。
转染细胞中红色和绿色荧光蛋白表达强度的定性分析：使用倒置荧光显微镜拍照后再进行定性比较；
转染细胞中红色和绿色荧光蛋白表达强度的定量分析：使用流式细胞仪检测转染后的细胞，用其自带软件计算10,000个荧光细胞的平均荧光强度，用于定量比较；
转染细胞中荧光素酶表达强度的定量分析：使用酶标仪读取荧光素酶催化底物反应后所产生的荧光信号(OD值)。
上述实验均按相应开放性标准实验流程进行操作。
5、基于报告基因表达的启动子活性研究-体内实验
5.1)荧光素酶报告基因表达的定量检测
选取6-8周的BALB/c小鼠，分空白组、pGL3-CMV-Luc组和pGL3-EMS003-Luc组，每组6只小鼠，在其胫骨前肌处使用L/E/G法分别给予50ug质粒，6天后处死小鼠，取胫骨前肌匀浆，用酶标仪读取荧光素酶催化底物反应后所产生的荧光信号(OD值)。
5.2)β-半乳糖苷酶报告基因表达的定性检测
选取6-8周的BALB/c小鼠，分空白组、pGL3-CMV-LacZ组和pGL3-EMS003-LacZ组，每组6只小鼠。在其胫骨前肌处使用L/E/G法分别给予50ug质粒，6天后处死小鼠，用原位染色法显示胫骨前肌中β-半乳糖苷酶表达量。
上述实验均按相应开放性标准实验流程进行操作。
6、基于功能基因表达的启动子活性研究-体内实验
选取3-4周的BALB/c小鼠，分空白组、生理盐水组、pGL3-EMS003组、pGL3-CMV-GHRH组和pGL3-EMS003-GHRH组，每组9只。在小鼠腿部肌肉处使用L/E/G法分别给予50ug质粒。
6.1)小鼠血清GHRH浓度检测。在注射后7d、14d、21d和30d用Mouse GHRH ELISAKit利用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中GHRH的浓度。操作流程按照检测试剂盒操作步骤进行。
6.2)GHRH的生物学效应检测。肌注质粒后表达的GHRH可促进小鼠生长，因此每三天称一次小鼠体重，用以分析不同启动子的活性。
二、实验结果
1、流式细胞术检测绿色荧光蛋白荧光强度
6种不同来源的细胞：L6，C2C12，293T，NIH/3T3，HeLa，HepG2；四种启动子质粒：pCMV-EGFP、pSP301-EGFP、pMCK-EGFP和pEMS003-EGFP。
图1：不同细胞中转染含不同启动子的绿色荧光蛋白表达质粒。6种不同来源的细胞：大鼠成肌细胞L6和小鼠成肌细胞C2C12；非肌肉来源细胞293T、NIH/3T3、HeLa和HepG2。四种启动子质粒：CMV:pCMV-EGFP；SP301:pSP301-EGFP；MCK:pMCK-EGFP；EMS003:pEMS003-EGFP。48h后利用流式细胞仪进行平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)测定。*p<0.05；**p<0.01，每组N＝3。
48h后利用流式细胞仪进行平均荧光值测定，每组N＝3。EMS003启动子组在大鼠成肌细胞L6和小鼠成肌细胞C2C12中具有比MCK、CMV和SP301启动子组显著升高的荧光值；在非肌肉细胞293T、NIH/3T3、HeLa、HepG2细胞中，肌肉特异性启动子EMS003、SP301和MCK启动子组的荧光强度显著低于CMV启动子组。表明EMS003启动子在肌肉细胞中的活性比此前所得的SP301更强，而在非肌肉细胞中活性很低，具有增强型肌肉细胞特异性启动子的特性。
2、流式细胞术检测红色荧光蛋白荧光强度
6种不同来源的细胞：L6，C2C12，293T，NIH/3T3，HeLa，HepG2；三种启动子质粒：pGL3-CMV-E2、pGL3-SP301-E2和pGL3-EMS003-E2。
图2：不同细胞中转染含不同启动子的红色荧光蛋白表达质粒。6种不同来源的细胞：大鼠成肌细胞L6和小鼠成肌细胞C2C12；非肌肉来源细胞293T、NIH/3T3、HeLa和HepG2。三种启动子质粒：CMV:pGL3-CMV-E2；MCK:pGL3-MCK-E2；EMS003:pGL3-EMS003-E2。48h后利用流式细胞仪进行平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)测定。*p<0.05；**p<0.01。每组N＝3。
48h后利用流式细胞仪进行平均荧光值测定，每组N＝3。EMS003启动子组在大鼠成肌细胞L6和小鼠成肌细胞C2C12中具有比CMV和SP301启动子组显著升高的荧光值；在非肌肉细胞293T、NIH/3T3、HeLa、HepG2细胞中，肌肉特异性启动子EMS003和SP301启动子组的荧光强度显著低于CMV启动子组。表明EMS003启动子在肌肉细胞中的活性比此前所构建的SP301更强，而在非肌肉细胞中活性很低，具有增强型肌肉细胞特异性启动子的特性。
3、利用荧光素酶报告基因体外定量检测启动子活性
6种不同来源的细胞：L6，C2C12，293T，NIH/3T3，HeLa，HepG2；三种启动子质粒：pGL3-CMV-Luc、pGL3-MCK-Luc和pGL3-EMS003-Luc。
图3：不同细胞中转染含不同启动子的荧光素酶表达质粒。6种不同来源的细胞：大鼠成肌细胞L6和小鼠成肌细胞C2C12；非肌肉来源细胞293T、NIH/3T3、HeLa和HepG2。三种启动子质粒：CMV:pGL3-CMV-E2；MCK:pGL3-MCK-E2；EMS003:pGL3-EMS003-E2。48h后进行荧光素酶活性测定。*p<0.05；**p<0.01。每组N＝3。
48h后进行荧光素酶活性测定，每组N＝3。EMS003启动子组在大鼠成肌细胞L6和小鼠成肌细胞C2C12中具有比MCK和CMV启动子组极显著升高的荧光素酶活性；在四株非肌肉细胞中，肌肉特异性启动子EMS003和MCK启动子组的荧光素酶活性显著低于CMV启动子组。表明EMS003为肌肉细胞特异性强启动子。
4、利用荧光素酶报告基因体内定量检测启动子活性
图4：体内荧光素酶活性测定。于小鼠胫骨前肌用L/E/G法分别给予pGL3-CMV-Luc和pGL3-EMSP003-Luc质粒，7d后对荧光素酶活性进行测定，*p<0.05；**p<0.01。每组N＝6。pGL3-EMSP003-Luc组荧光素酶活性显著高于pGL3-CMV-Luc组。
5、利用β-半乳糖苷酶报告基因体内半定量检测启动子活性
图5：体内β-半乳糖苷酶表达水平分析。CMV：pCMV-LacZ，EMS003：pEMS003-LacZ，每组N＝6。EMS003组表达水平高于CMV组。
6、生长激素释放激素的生物学效应及血清浓度分析
图6：EMS003驱动GHRH肌内表达的生物学效应及血清GHRH浓度。每只小鼠用L/E/G法单次注射50μg质粒到骨骼肌，在不同时间点测量小鼠体重(A)和体重平均增加值(B)。与正常生长组比，*p<0.05；**p<0.01。(C)小鼠血液中GHRH的平均浓度。*p<0.05；**p<0.01。每组N＝9。
综上，本发明筛选了一条比此前构建的高效骨骼肌细胞特异性启动子SP301活性更强的启动子，命名为增强型肌肉特异性启动子EMS003，简写为PEMS，为人工合成启动子，具有核酸序列唯一性。在体外肌肉细胞和体内骨骼肌中，PEMS对多种报告基因的转录活性均显著强于CMV启动子，有很好的肌肉细胞特异性；一次性肌注pEMS-GHRH质粒在小鼠骨骼肌中驱动GHRH表达可产生明显生物学效应，加速小鼠生长，具备治疗效果，展示了PEMS良好的应用前景。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川大学 中国科学院成都生物研究所
<120> 增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子、筛选方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 689
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgatgtact gccaagttgg aaagtcccgt tagtgcccat tgacgtcaat aatatatggc 60
gacggccggg cccctccctg gggacagccc cggtgtggaa agtccccagg ctccccagca 120
ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggactat ataaaaaacc 180
tgacccgata tgcctggcca gccaatagcg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg 240
cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc agacacccaa atatggcgac 300
gggtgaggaa tggtgaccaa gtcagcaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 360
gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccac caacacctgc tgcctgcccg 420
ctctaaaaat aactcccggc ttcaggtttc cctagggccc ctccctgggg acagccccat 480
atggcgacgg ccccccattg acgtcaatgg gacggtaaat ggcccgcctg gcgcccattg 540
acgtcaataa tccagccaat agcacccgat atgcctgggg actatataaa aaacctggga 600
cacccgagat gcctggttac aaggcctggg gacacgctct aaaaataact cccccaacac 660
ctgctgcctg ccggcttcag gtttcccta 689

Claims (4)

1.一种增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子，其特征在于，所述增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子PEMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种表达权利要求1所述的增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子的重组载体。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述含有增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子PEMS的重组载体包括pGL3-EMS-Luc、pGL3-EMS-E2、pGL3-EMS-LacZ、pGL3-EMS-GHRH以及pCDNA3.1(+)-EMS-EGFP。
4.一种如权利要求2所述的重组载体在制备基因治疗用药物中的应用，其特征在于，所述基因治疗通过肌肉注射进行实现。
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