CN1159445C - 能在心脏中组织特异性表达的重组腺病毒 - Google Patents

能在心脏中组织特异性表达的重组腺病毒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于实现心脏限制性转录的人5型重组腺病毒载体，包括用心肌细胞限制性心锚蛋白重复蛋白(CARP)启动子与含有人腺病毒相关病毒(AAV)的反向末端重复序列。用绿荧光蛋白(GFP)作为标记基因，该重组腺病毒载体(Ad/CG/ITR)显示出在体外和体内小鼠模型中能指导转基因表达于心肌组织。

Description

能在心脏中组织特异性表达的重组腺病毒
本申请申明享有于1998年9月11日登记的美国专利临时申请No.60/098,960的优先权，本文将其全部引入作为参考。
发明背景
发明领域
本发明主要涉及一种重组腺病毒载体构建物，和研究心脏病基因治疗和基因功能的方法，更具体地说通过采用人腺病毒相关病毒的反向末端重复序列，在心脏组织中靶向特异性表达某给定的转基因的方法。
背景信息
心血管基因治疗代表一种治疗遗传性和后天性心脏病的新型方法。将基因转移给心脏，能替代有缺陷的或缺失的担负适当心脏功能的细胞蛋白。体内心脏功能的控制表现为多个基因、各种类型细胞和环境刺激之间的复杂相互作用，但这种相互作用的阐明仍然取决于对分子和细胞水平变化的更全面了解。通常，大多数人基因治疗方案是通过将逆转录病毒载体引入患部细胞或组织，而依靠治疗基因的活体内(ex vivo)应用。因为基因治疗的活体内方法有赖于将靶细胞移出体内并再引入，对不能接近的或敏感的器官或组织这构成了主要困难。故直接体内将治疗基因送递给靶细胞的其他方法可能将是一种基因治疗的优选方法。
在体细胞组织中靶向表达基因是基因治疗和基因功能体内分析所必须的，主要通过采用安全有效的治疗基因送递系统，来替代损伤的基因。至今，已用重组腺病毒来替代逆转录病毒，作为各种细胞类型和组织的有效基因送递载体(Yeh等人，FASEB J 11，615-23，1997)。腺病毒载体在非分裂性人细胞的遗传修饰中高度有效，而且具有携带长遗传信息片段的能力。将腺病毒用作基因“送递系统”的障碍是，当将腺病毒给予患者以帮助将基因送递给特定的细胞时，患者的免疫系统可能对该病毒作出反应。为了克服这种障碍，已作了修饰使腺病毒对细胞更安全、毒性更小，且刺激免疫应答的可能性更小。这包括除去腺病毒的E1区域，从而防止腺病毒表达制造病毒颗粒所需的自身蛋白质。在原E1区域插入治疗性转基因。这种外源基因的送递和随后的表达效率可以很高，因为它通常不会整合到宿主基因组中，且对固有的宿主细胞功能作用极小(Baldwin等人，Gene Ther.4，1142-49，1997)。然而，虽然腺病毒载体能够产生高水平的转基因表达，但它们在大量细胞和组织(包括肝和肺)中感染和推进转基因表达的能力有限。作为高水平瞬时感染的结果，已采用一些方法来指导在特定组织或身体部位的转基因表达。对于心脏组织而言，已报道作了许多尝试，通过心肌内或冠状动脉内注射，用重组腺病毒实现在心脏中表达转基因(Brody等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.716，90-101，1994；Barr等人，Gene Ther.1，51-8，1994；Kypson等人，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.115，623-30，1998)。直接将病毒颗粒注射入心肌或心腔，已显示能更有效地将基因送递到心肌，但在非心肌细胞中也有感染和转基因表达，引起了这样的一种思考，即已实现的任何特异性转基因的表达是由靶向送递实现的，而不是由限制性转录实现的(Kass等人，Gene Ther.1，395-402，1994；Kass等人，Methods Cell Bio.52，423-37，1997)。结果，异位表达(尤其是在肝和其它组织的异位表达)，对于普遍采用重组腺病毒将基因转移到在心血管系统和其它器官系统中的特定细胞类型来说，依然有明显限制。
在大部分重组腺病毒载体中，缺失了编码具有转录调节性能的蛋白质的基因组E1区域，而用小基因“弹夹”替代，它通常包括一选择的启动子、转基因编码区域和聚腺苷酸化信号(Yeh等人，FASEB J11，615-23，1997)。用腺病毒实现组织特异性转基因表达的一个可能方法，是采用在转录水平具有细胞类型特异性的细胞基因启动子，而不是通常所用的表达水平高但缺少组织特异性的病毒基因启动子。过去，大量的研究使用不同的细胞启动子来实现在以下各种组织中的靶向转基因的表达：平滑肌(Kim等人，J.Clin.Invest.100，1006-14，1997)、胰腺(Dusetti等人，J.Biol.Chem.272，5800-4，1997)、内皮(Morishita等人，J.Biol.Chem.270，27948-53，1995)、肺(Strayer等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Bio.18，1-11，1998)和若干类型的肿瘤(Su等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94，13891-6，1997；Sider等人，Cancer Res.56，5638-46，1996)。在腺病毒的前后序列用心脏特异性启动子，如肌球蛋白轻链-2(MLC-2v)和α-肌球蛋白重链(α-MHA)启动子所作的类似尝试，没能完全成功地在体内提供组织限制性基因表达(Kim等人，J.Clin.Invest.100，1006-14，1997)。这些结果表明在缺失的Ela区域周围的腺病毒基因组序列可能对相邻的细胞启动子至少有部分特异性作用。也有人提出Ela区域周围的序列可能含有负调节元件，它对细胞启动子的特异性和活性有影响(Shi等人，Hum.Ther.8，403-10，1997)。腺病毒载体这种不理想的特性使它们的应用受限，尤其是在需要转基因的组织特异性表达的体内研究中。
因此，仍然需要一种采用重组腺病毒载体的转基因表达系统，此系统对用于体外和体内基因治疗和成人和新生儿的基因功能分析具有组织特异性。本发明满足了这种需要并且还提供了相关的优点。
发明概述
本发明提供一种人5型重组腺病毒载体，利用心肌细胞限制性心锚蛋白重复蛋白(CARP)启动子与人腺病毒相关病毒〔AAV〕的反向末端序列(ITR)的协同，在成人和新生儿中实现心脏限制性转录。这种联合能有效地在体外和体内实现转基因的心脏组织特异性转录。
本发明还提供在新生儿和成人的心脏组织中，实现对给定的转基因的组织靶向表达的方法。这种方法在遗传和后天性心脏病的基因研究和基因治疗中可能有明显的应用。
附图简述
图1显示了重组腺病毒载体的构建。所有重组腺病毒载体都是通过在293细胞中pJM17质粒DNA和特异性穿梭质粒DNA之间的同源重组产生的。
图2显示了腺病毒感染后，培育的细胞中GFP的相关细胞类型特异性转录的Northern印迹分析。用GFP编码序列为探针，并以GAPDH mRNA杂交信号为标准，用Northern印迹分析了未感染的、对照的和感染的心肌细胞的RNA。
图3显示了腺病毒感染后，培育的细胞中GFP的相关细胞类型特异性转录的Northern印迹分析。用NotI和XhoI限制性内切酶消化对照和感染细胞的DNA，检测到约3.0kb大小的Adv/CMV/GFP，和760碱基的Adv/CG/ITR的GFP表达。
图4显示了心内注射腺病毒载体后，用Northern印迹分析了小鼠心脏和肝中GFP转录的水平。
发明详述
本发明提供一种通过采用重组腺病毒基因送递载体，而实现在新生儿的和成熟的心脏组织中转基因的心脏限制性转录的方法，此载体经基因工程改造而含有心肌细胞-限制性CARP启动子，并连接有人腺病毒相关病毒的反向末端重复序列(该序列本文纳入作为参考)。在构建腺病毒载体中，最常见的是除去血清5型腺病毒基因的Ela和Elb区域，以防止腺病毒DNA的复制。通过将所需的外源遗传信息，包括左侧反向末端重复序列(ITR)、信号增强子、表达所需外源基因的启动子和聚腺苷酸化信号，插入到腺病毒的前体El位置来构建原型载体。Fu等人(Nat.Biotechnol.16，253-7，1998)已报道了该反向末端重复(ITR)序列(腺病毒相关病毒特有)的异常特性，本文将其纳入作为参考。腺病毒相关病毒是从复制缺陷性细小病毒衍生出的卫星病毒，常常发现它与腺病毒和单纯疱疹病毒相伴。野生型AAV是不致病的，但可特异性整合入宿主的基因组、可转导非分裂性细胞，不诱导可破坏转导细胞的免疫应答。Fu等人已显示用病毒基因启动子或组织特异性细胞基因启动子，将AAV-ITR序列的左侧和右侧末端片段都包括入非洲爪蟾属(Xenopus)发育的胚胎中，可赋予提高转基因表达水平和组织特异性的能力。另外，Philip等人(Mol.Cell Bio.14，2411-8，1994)已证明将右侧和左侧末端AAV-ITR序列包含到哺乳动物质粒构建物中，将提高转基因表达的效率和稳定性。当用心脏限制性启动子时，将腺病毒相关病毒左侧和右侧末端ITR序列包含入一重组腺病毒载体，能提高外源转基因表达的组织特异性。
为了在心脏组织中实现靶向基因的表达，选择CARP基因的213碱基对5’侧翼启动子片段来指导转基因的表达。产生了三种转基因小鼠品系，它们包含各种CARP启动子/β-半乳糖苷酶报告基因，用于研究这种5’侧翼CARP启动子。CARP(心锚蛋白重复蛋白)是同源框基因NKx2-5途径中推定的下游调节基因，它调节心室肌球蛋白轻链-2(MLC-2)基因的表达(Zou等人，Development 124，793-804，1997)。该研究鉴定了邻近CARP基因上游调节区域中一个基本的GATA-4结合位点，和Nkx2.5与GATA-4介导的协同转录调控。这种协同调控依赖于GATA-4结合于启动子中它的相应DNA序列，这提示Nkx2.5可能对CARP启动子有控制作用，至少部分通过GATA-4。如本文所用术语“同源框基因Nkx2.5”指果蝇基因tinman的鼠同源物，已证明它是哺乳动物心脏发育中心管成环形成和心室特异性肌球蛋白轻链-2表达所需要的。心室肌球蛋白轻链-2(MLC-2v)，一种哺乳动物心脏发生过程中心室分区的最早标记，已是各种寻求鉴定指导心室分区、发育成熟和形态发生的分子途径的研究对象。这些研究已鉴定了MLC-2v启动子区域中28个碱基对的HF-1a/MEF-2cis-元件，它在心脏发生过程中看来赋予心室特异性基因表达，并且显示普遍存在的转录因子YB-1与辅因子协同结合于HF-1a位点。另外，数据还表明CARP基因的5’侧翼区域中的调节元件能指导心脏中的区域特异性(心房对心室，左对右)转基因表达。CARP基因的5’侧翼区域中的213个碱基对序列元件看来足以赋予锥干(conotruncal)特异性转基因表达。
CARP在心肌细胞中与YB-1形成一种物理复合物，且内源性CARP似乎位于心肌细胞的核中。Zou等人(Development 124，793-804，1997)已证明在心肌细胞中，CARP以HF-1序列依赖性方式负调节HF-1-TK最小启动子活性，而且当与心脏和非心脏细胞中的GAL4 DNA结合区域融合时，表现出转录抑制活性。用标准Northern印迹方法分析表明在心脏组织的肌细胞中CARP mRNA水平丰富，达到骨骼肌中较低的水平，且通过对细胞因子活性的诱导，可在心脏和其它组织中上调内源性CARP的表达(Chu等人，J.Biol.Chem.270，10236-45，1995；Jeyaseelan等人，J.Biol.Chem.272，22800-8，1997)。
细胞因子在控制和维持调节哺乳动物多种器官系统生理机能的信号传导途径中有重要作用。它们普遍的重要性反映于细胞因子网络在组织中的广泛分布，缺少细胞因子信号传导元件将导致多种器官缺陷。在Hirota等人(Cell 97，189-198，1999年4月16日)的研究(本文纳入作为参考)中，研究者研究了IL-6相关细胞因子在心力衰竭发病机制中的作用，它是美国和其它发达国家中发病率和死亡率综合的首要原因。在对血压慢性增高和血容量过载的反应中(这在心肌受损中非常常见)，心脏的反应是增大以维持正常的心脏功能，这是一种称为代偿性增生的过程。CT-1(IL-6细胞因子家族的一个成员)能激发体外心肌细胞发生增生，且已显示其通过阻断心肌细胞发生调亡而成为心肌细胞中强有力的心肌细胞存活因子的重要作用。还有其它证据表明在心肌细胞中存在细胞因子受体gp130的表达，能导致代偿性心脏肥大，从而延缓细胞调亡的发生，和最终的心力衰竭。gp130细胞因子受体信号传导途径中的缺陷常常导致发育胚胎的严重心脏缺陷，可能导致子宫中胚胎早期死亡。用本发明的组织特异性腺病毒载体送递系统，将gp130的转基因编码区域直接引入子宫内胚胎心脏细胞中，这一治疗策略是可行的治疗方法。类似地，通过连接于本发明的心脏特异性CARP启动子，在恒定的生物力学应力下，将gp130基因引入成熟心肌细胞，可以引发gp130细胞因子受体途径的表达，从而增加心脏代偿性增生，抵销心肌细胞调亡，由此避免了心力衰竭。
重组腺病毒载体的产生
用Wang等人，J.Biol.Chem.273，2161-8，1998描述的腺病毒/CMV载体的构建方法，通过含转基因的穿梭质粒DNA和含人5型腺病毒全基因组的pJM17质粒DNA之间的同源重组，构建了本发明的重组腺病毒载体。按专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约及该条约颁布的条款，将含质粒pJM17(它包含复制缺陷性人5型腺病毒的全基因组的DNA)的大肠杆菌宿主在美国典型培养物保藏中心(10801 University Blvd.，Manassas，Virginia20110-2209，U.S.A.)保藏，ATCC登录号为PTA1047。此保藏材料的样品可提供给工业产权部，和接受该条约和条例的条款，承认美国的专利法和条例有法律资格的人，以及所有递交过本申请或要求本申请优先权的其他国家或国际组织。
用2.5千碱基的CARP启动子(从CARP基因的5’侧翼区域切下，插入到pXCJL.2的Bam HI和Xho I位点之间)装配穿梭质粒pAdv/CARP。(含质粒pJM17的大肠杆菌宿主，包含有人5型腺病毒(含有插入的鼠CARP启动子序列)全基因组的DNA，已被保藏为ATCC登录号No.PTA1046)。得到的构建物显示出足以在培养的细胞和转基因小鼠中进行局限于心脏的标记基因的表达。(见Zou等人，(Development 124，793-804，1997)。)
为阐明CARP的功能，用此2.5千碱基的CARP启动子来产生腺病毒/CARP/标记构建物，在体外和体内给予这种腺病毒构建物后，用绿荧光蛋白(GFP)基因作为鉴定腺病毒/CARP启动子活性的可见报告物。为了构建报告基因，通过Bam HI和Afl III消化，从pEGFP-N1(Clontech，CA)切下GFP编码序列，插入到pAdv/CARP的Xho I位点，产生pAdv/CG。将得到的重组腺病毒命名为Adv/CG。
为了测定腺病毒基因组中包含的AAV ITR序列是否具有提高转基因组织特异性表达的能力，通过Bam HI和SaI I消化从pAdv/CG取出含CARP启动子和GFP编码序列的DNA片段，随后插入到pAdv/AAV质粒(其衍生自含两个AAV ITR序列拷贝的pXCJL.2)的Xho I位点。用本领域技术人员已知的转化技术，将得到的质粒pAdv/CG/ITR用于产生重组腺病毒，命名为Adv/CG/ITR。图1提供了该重组腺病毒构建物的图解说明。用标准方法将所有重组腺病毒载体噬斑纯化，用PCR分析在病毒基因组中是否存在转基因。如Wang等人，J.Biol.Chem.273，2161-8，1998所述，在CsCl梯度上一次超速离心(本领域熟知的方法)制备了高滴度的病毒储藏液。
心肌细胞和心脏成纤维母细胞培养和腺病毒感染
为了建立本发明的腺病毒载体的心脏组织特异性，如Iwaki等人，J.Biol.Chem.265，13809-17，1990所述，用Percoll梯度方法从1-2日龄的Sprague-Dawley大鼠制备了原代心室肌细胞和心脏成纤维母细胞。从Percoll梯度的上层区带分离出心脏成纤维母细胞，随后将其置于补充有10％胎牛血清的高葡萄糖Dulbecco改进的Eagle培养液中。从Percoll梯度的下层区带分离出心肌细胞，随后置于4：1Dulbecco改进的Eagle培养液；199培养液，10％马血清和5％胎牛血清中。分离后24小时，以不同感染复数(M.O.I.)用该重组腺病毒感染心脏成纤维母细胞和肌细胞，然后再培养48小时，之后作DNA、RNA和荧光显微照相分析。
RNA和DNA分析
按制造商说明(TELTEST，Texas)，用RNAzol B溶液从培养的细胞和小鼠组织中制备RNA样品。按标准程序(本领域技术人员熟悉的)进行Northern印迹杂交，用GFP编码序列产生P32标记探针。按Purogene DNA分离试剂盒指导的方法制备了培养的细胞和小鼠组织纯化的总DNA，然后用限制性内切酶Xho I/NotI消化作Southern印迹分析，采用与Northern印迹杂交所
用的相同P32标记的GFP编码序列探针。
体内腺病毒注射入新生小鼠心脏
如Brody等人，Ann.N.Y.Acd.Sci.716，90-101，1994所述，用高效程序将通过腺病毒载体的长期表达注射入新生小鼠中，4℃低温麻醉1日龄新生小鼠2分钟。用固定在显微操作器的火焰拉伸毛细管，将含有2×109个病毒颗粒的10μl病毒溶液直接注射到心腔中。毛细管中搏动性血液倒流表明腔内安置正确。重加温到室温，使新生小鼠复苏，然后将它们放回它们的母亲处48小时。48小时后，处死新生小鼠，从它们的尸体中取出心脏和肝，用于DNA、RNA和荧光显微照相分析。
小鼠胚胎培养和显微注射腺病毒载体
用Cockroft等人，《胚胎移植后的解剖和培养1990》(IRL Press，Oxford，England)所述的方法制备大鼠血清。按Sturm和Tam，酶学方法，225，164-90，1993的方法培养全小鼠胚胎。如此方法，通过颈椎脱位处死控时的怀孕雌性小鼠。从尸体中解剖下子宫，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)淋洗除去任何残留的血液，然后再转移到含PB1培养基(137mM NaCl；2.7mMKCl；0.5mM MgCl2；8.04mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4；0.9mM CaCl2；0.33丙酮酸钠；1g/L葡萄糖；0.01g酚红；pH 7.35；100ml/L链霉素；100U/ml青霉素)的无菌容器中；所有试剂都是从Sigma Biochemicals，St.Louis，MO购得。从子宫中解剖取下交配后11天的胚胎，除去蜕膜和Riechert膜。将胚胎与卵巢和羊膜分开，在解剖过程中它们是相连的，以确保连接胚胎和卵巢的脉管或连接胚胎和胎盘的脐血管的完整性。然后将分离的胚胎转移到摇床上培养转瓶中的预平衡好的培养液中(含50％大鼠血清，连续通气95％O2、5％CO2)，37℃培养。培养1小时后，将胚胎置于培养皿上，用6μm直径的玻璃移液管将胚胎显微注射入左心室。用多阶移液管牵拉器(Suter InstrumentCo.，Novato，CA)预先制备显微移液吸管，将1mm玻璃毛细管牵拉成6μm针头构型。用电极钳将每根显微移液吸管连接于MX-110-R4手动显微操作器轴(Newport Instruments，Newport，CA)。低流速0.2-0.5μl/秒(每微升2-5秒)心内注射1μl高滴度病毒溶液(2×108)。
转基因靶向表达于体内心肌细胞中的能力代表了一种新型强效的方法，可用来研究和操纵心脏发育过程中特异性基因的功能和用基因治疗技术治疗心脏病。用心脏限制性细胞启动子与AAV的左右两边ITR序列(分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)组合的策略，以实现在胚胎中和出生后心脏组织中心脏特异性转基因表达，从而使本发明不同于本领域已有的其它重组腺病毒载体。另外，在心脏限制性重组腺病毒载体的前后序列中包含有AAV-ITR序列，可保留体外和体内该细胞启动子活性的组织特异性，且当与靶向送递系统联合时，能使本发明用作基因治疗来治疗心脏病，并提供一种研究胚胎心脏和出生后心脏特异性基因功能的方法。
如Fu等人和Phillip等人先前研究所报道的，在哺乳动物细胞系统以及发育的非洲蟾蜍胚胎中存在AAV-ITR序列具有提高转基因表达的作用。本文将Fu等人和Phillip等人的研究报道纳入作为参考。虽然非洲蟾蜍胚胎实验提示ITR序列促进了复制细胞中的DNA分离，但其它研究表明在转染后AAV-ITR序列提高了基因组整合，至少在体外装配中如此。
不管为何种作用模式，大部分腺病毒DNA在感染细胞时为游离形式。由于出生后心肌细胞本身不呈现强复制，这两种特性不可能对提高心脏组织中的组织特异性(表达)有明显作用。在非洲蟾蜍研究中还表明另一机理：AAV-ITR有绝缘特性，这使得侧翼转基因不受腺病毒基因组中其它调节元件的影响。事实上，腺病毒Ela区域(它可调节相邻细胞启动子的特异性)周围存在负调节元件的发现，支持这种作用方式。已有的两个研究，Franz等人(Cardiovasc.Res.35，560-6，197)和Rothman等人(Gene Ther.3，919-26，1996)报道了用MLC-2启动子产生心肌细胞特异性腺病毒，但用α-MHC启动子则不行，虽然这两种启动子都具有心肌细胞特异性转录活性。本文将Franz等人和Rothman等人的研究报道纳入作为参考。缺少Adv/CG(无AAV ITR的CARP启动子)转基因表达，表明细胞启动子特异性转录活性受到周围腺病毒基因组的显著影响。所以，包含AAV ITR提供了一种用其它细胞启动子实现组织特异性转录的通用策略。
Hammond等人(美国专利No.5,792,453)报道了含编码血管生成蛋白或肽的转基因的复制缺陷型腺病毒载体，可通过冠状动脉内注射将其直接送入冠状动脉，靶向患者的心肌，来治疗心肌缺血。为了送递这些血管生成蛋白(可能包括aFGF、bFGF、FGF-5(成纤维母细胞生长因子)和VEGF(血管内皮生长因子))，Hammond等人依靠心室肌细胞特异性启动子(称为MLC-2和α-MHC的启动子)来实现靶向送递。然而如本发明所建立的方法，心肌细胞中血管生成蛋白转基因的心肌表达更可能是腺病毒载体直接应用于心脏的结果，而不是用MLC-2v或α-MHC启动子的结果。除CARP基因启动子(SEQID NO：3)外，本发明AAV-ITR序列(SEQ ID NO：1和2)可与其它心脏限制性启动子一起使用，这包括以下基因的启动子：
1.α-肌球蛋白重链基因
2.β-肌球蛋白重链基因
3.肌球蛋白轻链2v基因
4.肌球蛋白轻链2a基因
5.CARP基因
6.心α-肌动蛋白基因
7.心m2蝇蕈碱乙酰胆碱基因
8.ANF
9.心肌肌钙蛋白C
10.心肌肌钙蛋白I
11.心肌肌钙蛋白T
12.心肌肌质网Ca-ATP酶基因
13.骨骼肌α-肌动蛋白
14.从MLC-2v基因衍生的人工心肌启动子
也可用AAV-ITR序列产生其它靶载体，用可诱导启动子进行条件性基因表达。在Hammond等人的腺病毒载体中含有本发明的AAV-ITR序列，能确保血管生成转基因的组织特异性表达，从而避免了这些血管生成蛋白对身体其它组织的负效应。
以下实施例用于说明本发明，对本发明无任何限制。
                          实施例1
在培养细胞中Adv/CG/ITR载体介导的细胞类型特异性转录
本实施例提供了对包含心肌细胞富含的CARP启动子(SEQ ID NO：3)(偶联于人腺病毒相关病毒(AAV)的反向末端重复序列(ITR)(SEQ ID NO：1和2))的重组腺病毒的转录特异性的评价。
用纯化的腺病毒载体来感染从新生大鼠心脏制备的原代心脏成纤维母细胞和心肌细胞。用含人巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子(驱动GFP表达)的腺病毒载体(Adv/CMV/GFP)作为病毒感染和GFP检测的阳性对照。如Wang等人，J.Biol.Chem.273，2161-8，1998所报道的，重组腺病毒能有效感染许多类型的细胞，包括心肌细胞，感染复数(M.O.I.)小于100病毒粒子/细胞，而且可在95％以上新生大鼠的培养的心肌细胞中检测到高水平的GFP表达。但心成纤维母细胞需要大于1,000病毒粒子/细胞的M.O.I.来实现约70％感染。用相同水平的病毒感染(100或1,000病毒粒子/细胞)，无论是用Adv/CG载体感染的成纤维母细胞或心肌细胞中都未检测到GFP的表达。相反，当用Adv/CG/ITR载体作为感染剂时，在90％以上的心肌细胞中观察到GFP的表达，但在心成纤维母细胞中未观察到任何可评估的水平。这些结果表明心特异性CARP启动子/AAV-ITR是实现在培养的新生大鼠心脏心室肌细胞中转基因特异性转录所必须的，而即使在高M.O.I也未在成纤维母细胞中观察到转录表达。
用检测mRNA的标准Norhtern印迹方法，在转录水平上进一步评估了Adv/CG/ITR产生的GFP心脏局限性表达。如图2所示，易测得在Adv/CMV/GRP感染的心肌细胞和心成纤维母细胞中GFP mRNA的水平。在Adv/CG感染的细胞中，未测得GFP mRNA，这与用荧光显微照相评估得到的观察结果相一致。相反，受Adv/CG/ITR感染的心肌细胞的RNA样品显示了GFP转录的显著水平，而感染的心成纤维母细胞的RNA样品的GFP水平则明显较低。
为了确保观察到的Adv/CG/ITR载体的心肌细胞局限性表达是在转录水平上而不是感染作用的继发影响，用感染的成纤维母细胞和肌细胞DNA样品作标准Southern印迹分析。如图3所示，在受Adv/CMV/GFP或Adv/CG/ITR载体感染的心肌细胞和成纤维母细胞中存在相等水平的病毒DNA。这些结果证实CARP启动子的转录活性在腺病毒基因组的前后序列中受抑制，其含有AAV的ITR序列使得培养的细胞中保留了CARP启动子的限制于心肌类型细胞的特异性。
                         实施例2
体内新生小鼠心脏中Adv/CG/ITR载体介导的心肌限制性转基因表达
为了使本发明成为治疗遗传性和获得性心脏病的一种基因治疗方法，重要的是要确立，Adv/CG/ITR载体的细胞类型特异性(在体外已得到证明)也可在体内指导组织靶向的转基因表达。为了对其进行测试，将约2×109个腺病毒粒子直接注射到一日龄的小鼠心肌中。将Adv/CMV/ITR载体直接注射入心腔后，测得感染水平约为10％，主要集中分布在心室壁心外膜中。另外，在受感染动物的肝脏中也测得高水平的GFP表达。该观察与许多早期发表的研究相一致，这些早期研究确定通过全身循环送递重组腺病毒，常常导致肝脏和其它非心脏组织中高水平的感染。与已有的观察相似，直接心内注射Adv/CG载体将导致在任何组织(包括心脏)中测不到GFP。如所预计的，本发明的腺病毒载体Adv/CG/ITR能在心脏组织中引发高水平GFP表达，而在肝脏和其它非心脏组织中表达水平低得多。
为了进一步评估转基因的组织特异性表达，对感染小鼠心脏和肝脏制备的RNA样品作了Northern印迹分析。图4显示了该分析结果。在注射Adv/CMV/GFP的动物中，在心脏和肝脏中都检测到高水平GFP mRNA，证明了Northern印迹分析产生的结果。然而在注射Adv/CG/ITR的小鼠中，测得GFPmRNA主要在心脏中，肝脏中的水平明显低许多。如本发明所述，在腺病毒载体中含有AAV ITR，能提高体内转基因表达的组织特异性，使本发明的腺病毒载体适合用于基因治疗制剂的送递。
                         实施例3
培养的小鼠胚胎中受Adv/CG/ITR载体介导的心脏局限性转基因表达
也可将本发明的组织特异性基因转移特性用于胚胎心脏发育过程中的基因功能研究。为了证明靶向基因表达的能力，在发育的心脏组织中，用组织特异性腺病毒载体，约2×108个粒子/重组腺病毒载体，Adv/CMV/GFP、Adv/CG和Adv/CG/ITR，显微注射入交配11天后发育的小鼠胚胎的心腔中。首次注射腺病毒载体后再培养25小时，评估GFP的表达。Adv/CMV/GFP载体注射导致在发育心脏以及许多其它组织中相对高水平的GFP表达。这种大范围表达模式证实先前的证据：Adv/CMV/GFP载体能指导大范围组织中转基因的表达，而且转基因的表达很可能受发育胚胎中病毒粒子分布的指引。注射重组Adv/CG载体后，荧光显微照相分析表明在胚胎的任何部分都无GFP表达，这与体外培养细胞得到的结果以及新生小鼠研究的体内数据相一致。注射Adv/CMV/ITR载体能引发心脏组织中GFP的表达，而在其它组织中无异位表达(用荧光显微照相检测)。尤其是GFP表达在心房中水平最高。
这些结果表明含有AAV的ITR序列(如本发明的Adv/CG/ITR载体构建物)能消除转基因的异位表达，使得在直接将腺病毒载体注射入发育胚胎后，能够心脏组织特异性表达。这种由本发明的Adv/CG/ITR载体指导的组织特异性表达，可用于开发含AAV的ITR序列的其它重组腺病毒载体，并可在治疗心脏损伤和功能失调中赋予治疗性转基因的心脏特异性表达。
虽然本发明已参考上述实例进行描述，但可以理解在不脱离本发明精神时还可有许多改进。另外，本发明仅受限于附带的权利要求书。
                       序列表
<110>    Kenneth Chien
         Yibin Wang
         Sylvia Evans
<120>    能在心脏中组织特异性表达的重组腺病毒
<130>    6627-8045
<140>    未知
<141>    1999年9月10日
<150>    US 60/099,960
<160>    3
<170>    Word Perfect 8.1版本
<210>    1
<211>    174
<212>    ssDNA
<212>    腺病毒相关病毒2；病毒；ssDNA病毒；细小病毒；
         Parvovirineae；依赖病毒
<220>
<221>    增强子；5’反向末端重复序列
<222>    1…174
<400>    1
ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa  50
agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga  100
gcgcgcagag agggagtggc caactccatc actaggggtt cctggagggg  150
tggagtcgtg acgtgaatta cgta                              174
<210>    2
<211>    183
<213>    腺病毒相关病毒2；病毒；ssDNA病毒；细小病毒；
         Parvovirineae；依赖病毒
<220>
<221>    增强子；3’反向末端重复序列
<222>    1…183
<400>    2
catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga    50
acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca    100
ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggcttt gcccgggcg    150
gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag gga                      183
<210>    3
<221>    2247
<222>    小家鼠；真核细胞；多细胞动物；脊索动物；有头类；脊
         椎动物；哺乳动物；真兽亚纲；啮齿目；Sciurognathi；
         鼠科；鼠亚科；鼠属。
<220>
<221>    启动子
<222>    1-2247
<300>
<301>    Zou，Y.，等人
<302>    CARP，心锚蛋白重复蛋白，位于Nkx2-5同源框基因途径
         的下游
<303>    发育
<304>    124
<305>    4
<306>    793-804
<307>    1997
<400>         3
nagctcncat gcctgcaggt cgactctaga ggatcctttc atgtttaaca    50
atatcaaccc taacccaagg ggaacagcct gcctgacagt ggctttgcca    100
cccatgaata cttcctagtc tagtccgttt gtgaaactca gcccatccca    150
acacttctgc aagccccatc ctctacaagg tgctcattgg gaatttcctg    200
gagcttctct ttcaggatca gcctgattct agggcagcag ttctcaacct    250
gggggcctcg acccctttgg gggaatcaaa cgacccttta caggggtcac    300
atatcatcta tcctatatgt caggtattta cattacgatt cgtaacagta    350
gcaaaattac aggtatgaaa tagcaatgaa ataattttat gattgaaggt    400
caccacaaca tgaggccgcc acactgttct agagaaaaat cacctgggtg    450
gggaaaggtt tgggaaagcc tttctgtcca ttcttcattc ttcaaagtga    500
tgtgttcaca gaaagccttt cagctgttct gctggggctc ttagtaagtc    550
tgagtaggaa ctgtatgtac caggtctgct tcttatgggt ggagccaaga    600
cgcatcgtgg gtggagcgaa gacgcaacct caccttctac tctgcatcca    650
tagcaagtag cctaatgttc tgngtctagg gtcatctctg tgaatcgaga    700
tccttggccc ttgtttgaat tagggaggca caaaatctta aaaaattcaa    750
gactgntcaa caanccanaa gtcctttctc aaaaggaaag gncttaactn    800
tnancccccc tttacttttg agtcaaggcc tggaaccaaa ccggccccag    850
gaatgaaaaa agcttgccat nacctggttg gcccctttna anaggncaaa    900
aaaaaattgt ggttaacntt gaaaaaccga agaccaacag ttatcctcta    950
gaaacacaat ttgctggttg aacagctgaa gtggggtggg ggttcttacc    1000
ccatgttcat ggaagggtga gtgaggagag acagatatat gaggccagca    1050
taacaaacat acacaacacc ctaattaaca cttccctctt ctactgacac    1100
ccccttcact ctcctctttc ataaaaaata aaaaaagtat tttagtggct    1150
cttacgatag aatctttcct cgaactataa aaagatctaa atatttatat    1200
ttttcacatt ttaatatctt agcgatgaca agccagaaac aagatttttt    1250
gcctctctca acagcaaagc ttggggcctt tttgtttccg tgttaggaat    1300
agaacacgag agccccgtgt atctaggcag atgctctatc attagcccat    1350
gagtctccag cctcagacgc acatttttct cgggctctct taagcttttc    1400
ccacagcatt gggaaacttt actgacagca tccaagttgt gcttctgcta    1450
agaactggac tcacatctct ctggcatcac ttcggcccgt tttggggtag    1500
atcctctgat tagccttcag atttagaaca cggtgagcct gtggtcacta    1550
attatggcca gtgacaccat agagtcaaag tgcattactg aatgctttca    1600
atttctccta atgctggtac gatggcatgt cacagggcca ttttagctgc    1650
agacatcatc cagagaattc caaacagata ggacaagtgg cacccagacc    1700
catctccttc ccctcgggct gattatcccc aaaataggat gtcccaaagc    1750
aacacttccc agccaactgg agtgctgata agtccagtta tcagaaagat    1800
atggctgtaa gtgtgatgca cagtgcttgc attttcttga tacgttagtc    1850
atatgagagc tgacaaagaa ggaaaaagag cagcgatgtg tgcaatatta    1900
acaggcagct gtcccctggc ttcccgatac gtgggatgac tcgcattgct    1950
gagcggtgtg gtcactgcca aaggaatgac cctctcacat ttcttcctga    2000
ttcgcatacg ccgcggccag cttgtcatct ccctcttggg cttcccagac    2050
actaagtctg gaatgaaaat tcacctgcct ctgaattggc cactggtggg    2100
agcaggggtg tgacttggct tcccaggctg gaagattatc tcacccagcc    2150
ctactatata acgggctggt gtggaggggc tccacagggc cagttccagg    2200
ggttcatcca caagagagaa aaacatagac tcacggctgc caacatg       2247

Claims (8)

1.一种人5型重组腺病毒载体，其具有组织特异性转录转基因，其特征在于，所述的腺病毒载体含有：
心肌细胞限制性锚蛋白重复蛋白启动子；和
人腺病毒相关病毒的反向末端重复序列，其中转基因、启动子和反向末端重复序列可操纵性连接。
2.如权利要求1所述的人5型重组腺病毒载体，其特征在于，所述人腺病毒相关病毒的反向末端重复序列含有两个反向末端重复序列的拷贝。
3.如权利要求2所述的人5型重组腺病毒载体，其特征在于，所述的人腺病毒相关病毒的两个反向末端重复序列拷贝包含左端和右端反向末端重复序列。
4.如权利要求3所述的人5型重组腺病毒载体，其特征在于，所述的人腺病毒相关病毒的左端和右端反向末端重复序列分别包含5’端和3’端反向末端重复序列。
5.权利要求1所述的人5型重组腺病毒载体的用途，其特征在于，该腺病毒载体用于制备靶向基因治疗心脏病的药物。
6.如权利要求5所述的重组腺病毒载体的用途，所述的人腺病毒相关病毒的反向末端重复序列含有两个反向末端重复序列的拷贝。
7.如权利要求5所述的重组腺病毒载体的用途，其特征在于，所述的人腺病毒相关病毒的两个反向末端重复序列拷贝包含左端和右端反向末端重复序列。
8.如权利要求5所述的重组腺病毒载体的用途，其特征在于，所述的人腺病毒相关病毒的左端和右端反向末端重复序列分别包含5’端和3’端反向末端重复序列。
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