CN109627330A - 一种猪伪狂犬病毒高效价阳性血清制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种猪伪狂犬病毒高效价阳性血清的制备方法。该方法使用兔作为免疫对象，使用含有合适用量的PolyI∶C、胞壁酰二肽、西咪替丁的灭活疫苗对其免疫，生产高免血清，可在T25方瓶等体积比中和1头份疫苗试验中达到继代至少2代未出现细胞病变，满足《中国兽药典》(2015年版)中关于外源病毒检测标准为细胞法的规定。本发明具有良好的应用前景。

Description

一种猪伪狂犬病毒高效价阳性血清制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品领域，尤其涉及一种猪伪狂犬病毒高效价阳性血清制备方法。
背景技术
高免血清，是利用某种疫(菌)苗按一定程序反复免疫某种动物，并经抗体检测其滴度达到一定水平后，屠宰被免疫动物并收集全血后，经特殊处理而制成的一种生物制品。本高免血清主要用于生物制品的外源病毒检验。
猪伪狂犬病毒高免血清主要用于兽用生物制品的外源病毒检验。目前制备猪伪狂犬病毒高免血清的动物源主要是猪和兔子，猪作为本体动物，能提供大量血清，但外源病毒风险高且近缘动物的蛋白质免疫原性弱；兔作为异源动物，外源病毒风险低，且免疫原性强，但是血清提供量较低。
目前行业内有些公司因没有高效价血清，仅通过PCR检测方法对疫苗进行外源病毒检验，但《中国兽药典》(2015年版)中明确规定外源病毒检测标准为细胞法，所以现行快速检测结果可信度低。相反如采用细胞检测外源病毒方法中和市售伪狂犬病疫苗1头份(≥106.0TCID50/头)就需要用效价高的猪伪狂犬病高免血清或增加猪伪狂犬病高免血清使用量。
目前尚无商品化猪伪狂犬病毒高免血清；已发文章和专利上发表的猪伪狂犬病毒阳性血清仅仅是通过96孔细胞板培养3～5天测算细胞中和抗体为1∶512～1∶2048。目前市售猪伪狂犬病疫苗1头份(≥106.0TCID50/头)效价已完全高于《中国兽药典》(2015年版)中标准1头份(≥5×103TCID50)，仅测定猪伪狂犬病毒阳性血清的细胞中和抗体高不能代表该猪伪狂犬病毒阳性血清能够完全中和1头份猪伪狂犬病疫苗(≥106.0TCID50/头)。
发明人通过实验，发现一头份的市售猪伪狂犬病毒活疫苗中和现有的猪伪狂犬病毒阳性血清等体积37℃作用1h后接种于T25方瓶中的细胞，仍然能引发细胞继代后的病变反应。表明现有的猪伪狂犬病毒阳性血清的效价实际上还较低。(确认)
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种猪伪狂犬病毒高效价阳性血清的制备方法，包含以下步骤：
(1)水相制备：猪伪狂犬病病毒抗原原液经二乙烯亚胺处理，即得；
(2)免疫增强剂制备：使用氯化钠溶液配制含0.1～1mg/L PolyI：C、0.05～1mg/L胞壁酰二肽、0.5～1mg/L西咪替丁的溶液，为混合液A；在1份混合液A中加入1～10份吐温-80、0.5～10份匹多莫德、1～10份司盘-80、1～10份白油，前述的“份”均以体积计算；
(3)灭活疫苗制备：将前述水相和免疫增强剂按1∶(40～160)体积比混合成为混合液B，将混合液B与弗氏完全佐剂按1∶(0.5～2)的体积比混合，乳化得灭活疫苗。
(4)免疫：取兔子对其皮下多点注射上述灭活疫苗，经过4次或5次免疫，琼脂免疫扩散试验中测定血清中和滴度大于等于1∶16时采血、制备血清。
进一步地，步骤(1)所述抗原原液的效价≥108.0TCID50/ml。
进一步地，步骤(1)所述抗原原液与二乙烯亚胺的比例是100∶1。
进一步地，步骤(1)所述处理的具体方式是：将抗原原液与二乙烯亚胺混合物置于37℃下转速在3000转/min摇的床内摇48h。
如前所述的制备方法中，步骤(2)所述混合液A含有PolyI：C 0.4mg/L、胞壁酰二肽0.05mg/L、西咪替丁0.5mg/L。
进一步地，步骤(2)所述吐温-80为10份；所述匹多莫德为10份；所述司盘-80为5份；所述白油为10份。
如前所述的制备方法中，步骤(3)所述免疫增强剂与水相的混合比例是100∶1。
如前所述的制备方法中，步骤(4)所述多点注射灭活疫苗的方式为：在第1次免疫时共注射2ml，第2、3次免疫时每次共注射4ml，第4、5次免疫时每次共注射6～8ml。
进一步地，步骤(4)所述采血为心脏无菌采血。
进一步地，步骤(4)所述制备血清的方法是：将血液置于37℃热激1h，再在4℃静置2h，低温离心、吸取血清，分装后56℃灭活，-70℃下保存。
本发明还提供了一种如前述步骤(3)所述的灭活疫苗。
本发明的猪伪狂犬病毒高效价阳性血清，可以等体积比地中和市面1头份疫苗(≥106.0TCID50/头份)，效价较高。
本发明的猪伪狂犬病毒高效价阳性血清，可在T25方瓶等体积比中和1头份疫苗试验中达到继代至少2代未出现细胞病变，满足《中国兽药典》(2015年版)中关于外源病毒检测标准为细胞法的规定。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是兔抗PRV特异性血清的琼脂免疫扩散图：0.BEI灭活PRV；1.阴性血清；2-6.兔抗PRV血清分别按1∶2，1∶4，1∶8，1∶16和1∶32稀释。
图2是兔抗PRV特异性血清T25方瓶血清中和试验细胞状态观察图。
具体实施方式
实施例 猪伪狂犬病毒高效价阳性血清制备
(一)灭活疫苗的制备
1)水相的制备
悬浮培养的猪伪狂犬病毒病毒液经钛棒和3μm滤芯去除载体和细胞碎片获得高效价且相对单一的猪伪狂犬抗原液(效价≥108.0TCID50/ml)，原液和BEI(二乙烯亚胺)按照100∶1体积比加入新鲜配制的BEI得到水相，然后将水相放置于37℃转速在3000转/min摇的床内48h，灭活后将水相放置于4℃保存，待无菌及灭活检测合格后备用。
2)免疫增强剂制备
在氯化钠缓冲液中加入0.4mg/L PolyI：C、0.05mg/L胞壁酰二肽和0.5mg/L西咪替丁，然后加入吐温-80，配制成水相溶液；在白油中加入10份的匹多莫特，然后加入5份司盘-80配制成油相溶液，将含免疫增强剂的水相溶液与10份油相混合，制备成油乳剂的免疫增强剂。
3)抗原乳化
将上述新鲜配置的免疫增强剂与水相按照体积比100∶1混合，然后再按照1∶1体积比加入弗氏完全佐剂，组织匀浆机以600-1000HZ频率处理10min乳化得到灭活疫苗。
(二)免疫程序
1)试验动物筛选
选取体重1.5～3.0kg雌性新西兰大耳白兔5只。
2)免疫接种
分别对每只兔子进行4～5次免疫接种。
一免：将上述制备的灭活疫苗背部及足下多点注射免疫兔子，共注射2ml；
二免和三免：第一次免疫接种后每隔14天对每只兔子皮下多点注射上述制备灭活疫苗，共注射4ml；
四免和五免：第四次免疫接种量为每只6～8ml，免疫后隔7天采血进行琼脂免疫扩散试验，血清中和滴度大于等于1∶16直接采血。中和滴度小于1∶16进行第无次免疫，接种量为每只8ml，免疫后隔7天采血。
3)血清采集制备
最后一次免疫后7天心脏无菌采取全部血液，采集血液全部置于37℃条件下热激1h，再置4℃条件下静置2h，5000r/min、4℃离心10min后吸取血清。同只兔血清混匀后分装于15ml离心管，10ml/只，标记后56℃水浴灭活30min，置于-70℃保存。
(三)血清分析
1.方法
1.1琼脂免疫扩散试验检测：
(1)将平板用双蒸水洗净后，再用75％乙醇冲洗，晾干备用；
(2)将100ml 0.9％的生理盐水加入到1g琼脂糖中，煮沸，待温度降到56℃左右时，倒入平板，约1.5mm厚，凝固后打孔(直径3mm)，孔间距1～1.2cm；将10μl灭活的PRV抗原加入中心孔，周围每孔加10μl抗血清(PRV多克隆抗体作倍比稀释，即1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32)，同时将阴性血清作为对照；
(3)将加好样的凝胶板置水平湿盒内，放进37℃恒温培养箱，12h后取出置观察结果。
1.2猪伪狂犬病毒抗原及抗体检测
(1)用IDEXX ELISA检测PRVgB和gE抗体，方法参IDEXX试剂盒说明书。
(2)用应用下列引物进行PCR检测，PRV gE抗原阳性条带为270bp，
PRV gB抗原阳性条带为368bp。
PCR引物序列为：
gE up(SEQ ID NO.1)：5’-TGGCATCGGCGACTACCTG-3’；
gE down(SEQ ID NO.2)：5’-GCAGAAGAGGCTTGCGAGTGGAA-3’；
gB up(SEQ ID NO.3)：5’-GCGGCATCGCCAACTTCTTCC-3’；
gB down(SEQ ID NO.4)：5’-CGCCTTGTCGTCCTGCTGCTGCTC-3’。
1.3细胞中和效价测定试验
(1)将兔抗PRV特异性阳性血清经56℃水浴中灭活30min后备用；
(2)将猪伪狂犬病毒(≥106.0TCID50/头份)用无血清DMEM细胞培养液稀释成100TCID50/0.1ml，将已灭活的兔抗PRV特异性阳性血清按2倍稀释倍数进行倍比稀释至1∶128，每个稀释度的病毒特异性阳性血清取0.1ml与0.1ml已稀释后的疫苗病毒液等量混合，置37℃水浴中作用1h，同时设病毒对照和正常细胞对照；
(3)取长成单层Vero细胞的96孔细胞培养板，弃去培养液，用无血清的DMEM润洗细胞1次，再接种病毒中和样品和对照样品，每孔0.05ml，每个稀释度重复接种4孔。先加正常细胞对照孔、再加不同血清稀释病毒中和孔、最后加病毒对照孔。置37℃、5％CO2培养箱中吸附1h后，以DMEM细胞培养液洗涤细胞1次，每孔补加含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液0.2ml；
(4)将接种后的细胞培养板置37℃、含5％CO2培养箱中培养，连续观察5日，第5日判定结果。先观察正常细胞对照孔和病毒对照孔，再观察病毒中和孔；
(5)细胞接种样品后第5日判定结果，记录每个稀释度有无CPE的孔数，按Reed-Muench法计算该血清的中和效价。
1.4 T25方瓶中和试验
(1)样品处理取样品2～3瓶伪狂犬病活疫苗，用无血清DMEM溶解，混合，稀释成1头份/ml，以8000r/min离心10分钟，取上清与猪伪狂犬病特异性阳性血清等体积混合，37℃作用1小时，作为待检样品。
(2)样品的接种和培养
a.样品的接种按常规方法对长成良好单层的Vero细胞进行传代，按样品数量准备适量细胞瓶(25cm2)，取处理好的样品接种Vero细胞(长成80％左右单层)每瓶2.0ml(含1头份疫苗)，置37℃温箱吸附1小时，弃去吸附液，用DMEM营养液洗细胞面2-3次，补加含1％新生牛血清(BVDV抗体和抗原检测均为阴性)的DMEM维持液。同时设Vero正常细胞对照各1瓶(25cm2)。细胞置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养观察5天，每日观察细胞是否出现CPE(细胞病变效应)。如5天后未出现细胞病变，取细胞培养物置-70℃冰箱中反复冻融3次，3000g离心10min，取上清液标记为F1代-70℃保存，备用。
b.细胞培养物的继代将上述细胞培养物冻融3次后接种于新的细胞单层用于继代。每次继代均设立正常细胞对照。待检样品在细胞上的总培养时间应不少于14日。培养期间细胞培养物应至少继代2次。
c.培养期观察培养期内对细胞培养物进行常规检查，如培养物出现非疫苗病毒引起的细胞病变时，则判为不符合规定；如无细胞病变，培养结束时，F3代培养物无细胞病变，判为合格。
2.结果
2.1琼脂免疫扩散试验检测
血清中和滴度大于等于1∶16。
2.2猪伪狂犬病毒抗原及抗体检测
兔抗猪伪狂犬病高免血清经IDEXX ELISA试剂盒检测猪伪狂犬gB抗体阳性，猪伪狂犬gE抗体阴性；PCR检测本制品猪伪狂犬gB抗原阳性，猪伪狂犬gE抗原阴性。
2.3细胞中和效价测定试验
细胞中和效价为1∶158(如表1所示)。
表1兔抗PRV特异性血清中和效价的测定结果
2.4 T25方瓶中和试验
兔高免血清与市售疫苗1头份(效价≥106.0TCID50/头)疫苗等体积中和后于T25方瓶上继代至少2代持续时间不少于15日，三代均未出现细胞病变(表2-表4)。
表2 T25方瓶血清中和检验F1代细胞观察结果
备注：“+”表示出现细胞病变，“-”表示细胞正常。
表4 T25方瓶血清中和检验F3代细胞观察结果
以上实验表明，本发明的猪伪狂犬病毒高效价阳性血清具有很高的效价的同时，还能直接保护体外培养的细胞。
SEQUENCE LISTING
<110> 马鞍山史记动物健康管理有限公司
成都天邦生物制品有限公司
<120> 一种猪伪狂犬病毒高效价阳性血清制备方法
<130> GY854-18P1701
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> gE up
<400> 1
tggcatcggc gactacctg 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> gE down
<400> 2
gcagaagagg cttgcgagtg gaa 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> gB up
<400> 3
gcggcatcgc caacttcttc c 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> gB down
<400> 4
cgccttgtcg tcctgctgct gctc 24

Claims (10)

1.一种猪伪狂犬病毒高效价阳性血清的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：
(1)水相制备：猪伪狂犬病病毒抗原原液经二乙烯亚胺处理，即得；
(2)免疫增强剂制备：使用氯化钠溶液配制含0.1～1mg/L PolyI∶C、0.05～1mg/L胞壁酰二肽、0.5～1mg/L西咪替丁的溶液，为混合液A；在1份混合液A中加入1～10份吐温-80、0.5～10份匹多莫德、1～10份司盘-80、1～10份白油，前述的“份”均以体积计算；
(3)灭活疫苗制备：将前述水相和免疫增强剂按1:(40～160)体积比混合成为混合液B，将混合液B与弗氏完全佐剂按1:(0.5～2)的体积比混合，乳化得灭活疫苗；
(4)免疫：使用上述疫苗对兔子进行免疫，琼脂免疫扩散试验中测定血清中和滴度大于等于1:16时采血、制备血清。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述抗原原液的效价≥108.0TCID50/ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述抗原原液与二乙烯亚胺的比例是100:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述处理的具体方式是：将抗原原液与二乙烯亚胺混合物置于37℃下转速在3000转/min摇的床内摇48h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述混合液A含有PolyI∶C0.4mg/L、胞壁酰二肽0.05mg/L、西咪替丁0.5mg/L。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述吐温-80为10份；所述匹多莫德为10份；所述司盘-80为5份；所述白油为10份。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述免疫增强剂与水相的混合比例是100:1。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述多点注射灭活疫苗的方式为：在第1次免疫时共注射2ml，第2、3次免疫时每次共注射4ml，第4、5次免疫时每次共注射6～8ml。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述采血为心脏无菌采血。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述制备血清的方法是：将血液置于37℃热激1h，再在4℃静置2h，低温离心、吸取血清，分装后56℃灭活，-70℃下保存。
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