CN106190970A - 诱导脐带间充质干细胞直接转分化为红母细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的一种诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，公开了一种快速诱导间充质干细胞(MSCs)直接转分化为红母细胞(EBCs)的方法，包括下列步骤：S1，分离和纯化均质的脐带间充质干细胞；S2，选取可用于干细胞表观遗传调控的小RNA分子；S3，小核酸多肽纳米粒的制备和细胞转染；S4，转染后的红母细胞扩增培养。本发明使用容易获取、来源充足、无道德伦理问题和安全有效的新生儿脐带间充质干细胞作为诱导对象，通过转染6个小RNAs分子，在一种特制的无血清培养基的作用下大规模并快速直接转分化成红母细胞，解决了现有人工造血技术中红母细胞的来源、数量限制和定向分化的技术瓶径问题。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种诱导脐带间充质干细胞直接转分化为红母细胞的方法。
背景技术
脐带间充质干细胞(UC-MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。流式细胞仪检测结果显示，贴壁的UC-MSCs均表达CD166、CD44、CD29，CD105,CD90，CD73,低表达CD106，不表达造血细胞表型CD38、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，也不表达HLA-DR：有报道从人脐带中分离出UC-MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs和脂肪MSCs，免疫原性比骨髓MSCs和脂肪MSCs低，并且具有取材方便，无伦理问题等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。
这种脐带组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且还具备如下优点：①脐带中的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。②这些干细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发免疫反应或引起移植物抗宿主反应。③干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染。④扩增时培养体系能统一，便于质控。⑤可制成种子细胞冷冻，多次使用，冷冻后细胞损失小。⑥潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低。⑦采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤。⑧采集方便，易于保存和运输，且无伦理问题。这种脐带来源的间充质干细胞有可能成为胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPS)的理想替代物，并具有更大的应用潜能。
鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。但至今尚不清楚这些间充质干细胞是否能直接转分化为造血干细胞(HSCs)、红母细胞(Erythroblast,EBCs)，继而发育成成熟的红细胞(Redblood cells,RBCs)。
红细胞是血液的重要成分，是人的生命之源，然而，血液很难储存，而且经常供应短缺，有时还会给人们带来致命的传染病。据“中新网”消息，至2015年，我国每天需要约12万人献血才能满足用血量。巨大的用血与献血缺口使得有专家建议，或应将我国《献血法》规定的献血年龄由18～55岁放宽至17～60岁。因此，在实验室中研制出和在公司中生产出人造血变得比以前更为迫切和需要。
2008年美国“先进细胞科技”公司首席科学家罗伯特·兰扎说：“血液供应不足对大量失血的患者将产生致命的后果，而胚胎干细胞可能成为一个可以无限繁衍细胞的新源头，使人类的医疗得到源源不绝的红血球供应。”他们诱导胚胎干细胞在10天后发育分化为造血干细胞，接着用15天到20天变为下游的红母细胞与红细胞，大多数胚胎干细胞能够发育成造血细胞，其中只有65％的能分化为红细胞，最重要的是大多数红细胞只能合成胚胎样的血红蛋白(Chang et al,2008；Chang et al,2011)，只有大约60％的细胞能够脱核成熟(Ltet al，2008)。
2011年爱丁堡大学和布里斯托大学的教授马克·特纳表示利用胚胎干细胞制造出阴性O型血，这样的人造血液不容易感染，可以给98％的人口进行输血。安全人造血液的产生意义重大，将会给战场伤员和需要接受心脏移植等大手术的病人以及产后大出血的产妇带来生命保障。马克教授指出，在大约两年的时间内，他就将把人造血液注射进健康的人体内，完成英国首例人工血液试验。随后，人造血液就投入工业化的大批量生产，预计10年内可能即将普及到日常应用中。20年内，每年的人造血液产量可达到200万品脱(合约95万升)，足够满足英国全部的医用需求。
最近世界上几个研究小组采用成年人皮肤的成纤维细胞或者血细胞经过导入能表达OCT4,NANOG,LIN28,and SOX的慢病毒诱导成干细胞，叫做“诱导性多功能干细胞(iPS)”。之后这些iPS细胞在模拟人体生物条件下进行培育，最终分化发育成血红细胞，但大多数红细胞只能合成胚胎样的血红蛋白(Chang et al,2010；Papapetrot et al,2011)。目前该技术增大了转变过程的有效性，但并不是所有细胞都能成为血红细胞。最大的问题是只有10-40％的红细胞能排核成熟(Lapillonne et al,2010)。爱丁堡大学一支研究小组需用一个多月的时间，使iPS细胞来源的人造血液成功率达到五成。血红细胞在离心器中可与其它剩余细胞相分离，下一步将于2016年对临床患者测试人造血液。这项实验最有可能先用地中海贫血症患者进行测试，因为这些患者需要定期输血。近年来，世界上多个发达国家都在寻找新的血源，最为看好的是使用人干细胞来体外造血。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种诱导脐带间充质干细胞直接转分化为红母细胞的方法。该方法解决了现有人工造血技术中能合成成体血红蛋白和能脱核的红母细胞产生困难(如胚胎干细胞和诱导的多能干细胞)、数量限制(不能获得临床级的成熟红细胞)、定向分化(分化成较高比例的其它类型的血细胞)效率低的技术瓶径问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其包括下列步骤：
S1，分离和纯化均质的脐带间充质干细胞；
S2，选取可用于干细胞表观遗传调控的小RNA分子；
S3，小核酸多肽纳米粒的制备和细胞转染；
S4，转染后的红母细胞扩增培养。
其中，步骤S1中加入趋化液，所述的趋化液是指在无血清的DMEM/F12培养基中添加的间充质干细胞从脐带组织内向脐带组织外的培养环境迁移的趋化分子，优选SDF-1/CXCL12、HGF、EGF、bFGF、PDGF-BB和IGF-1六种细胞趋化因子。
步骤S2中所述的小RNA分子为多种，所述的多种小RNA分子包括ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221和siR-EID3分子的序列。
所述的多种小RNA分子组合的比例为：ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221和siR-EID3干粉重量比为0.5:0.5:0.5:1:1:1.5。
步骤S3中小核酸多肽纳米粒的制备方法为：将步骤S2中1份干粉量的多种小RNA分子的组合混合物与50份干粉量的多肽转染试剂分别溶于医用级去离子水中，然后在搅拌状态下将多肽转染试剂溶液缓慢滴加至多种小RNA混合物溶液中，继续搅拌使小RNA活性成分与多肽转染试剂充分混合，静置20分钟，让其充分自组装成纳米颗粒。
所述的细胞转染，即小核酸多肽纳米粒转染脐带间充质干细胞的方式为第一天消化转染一次，第二天非消化转染一次。
步骤4包括步骤S41和S42，其中，
S41，制备诱导间充质干细胞转分化扩增培养基；
S42，激活多种指导红母细胞发育和分化的相关基因。
所述的转染后的红母细胞扩增培养是指在红母细胞诱导扩增培养基中以5×105/ml的细胞密度进行培养至少5-7天来实现的。
所述的扩增培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添加bFGF,shh，SCF，TPO，VEGF,Flt3L，Delta1，IGFBP，EPO，IGF-1,IL-3,GM-CSF，IL-6,LIF，TGF-β,dmPGE2,dexamethasone,和lenalidomide十八种分子制成的。
所述的扩增培养基配方包括0-1μg/ml bFGF，0-1μg/ml Sonic hedgehog，0-1μg/mlDelta1，0-1μg/ml IGF-1，0-1μg/ml IGFBP，0-1μg/ml SCF，0-1μg/ml IL-3，0-1μg/ml IL-6,0-1μg/ml GM-CSF,0-1μg/ml Flt3L,0-1μg/ml EPO，0-1μg/ml TPO，0-1μg/ml VEGF，0-1μg/ml LIF，0-1μg/ml TGF-β，0-100μM dmPGE2，0-100μM dexamethasone和0-100μM lenalidomide。
所述的激活多种红母细胞发育和分化的相关的基因包括Runx1,Tal1,Gata1,NFE2,PU.1,Gfi1B,State5,Fog1,DNMT3b，BMI1，CHD8，EKLF,BCL11A,Fop,Sox1,Klf1,FOXO,NFkB,JAK2,GAB1/2,ERB1/2,LYN,EPO-R,IGF1-R,IL3-R,c-kit-R,AKT和Mill。
一种间充质干细胞转分化为红母细胞的诱导扩增培养基试剂盒，所述的试剂盒包括红母细胞诱导扩增培养基，所述红母细胞诱导扩增培养基包括红母细胞增殖所需要的细胞增殖因子和其他血细胞分化抑制剂；所述红母细胞诱导扩增培养基的配方为：80-100％(v/v)的DMEM/F12基础培养基，0-1μg/ml bFGF、0-1μg/ml Sonic hedgehog、0-1μg/ml Delta1、0-1μg/ml IGF-1、0-1μg/ml IGFBP、0-1μg/ml SCF、0-1μg/ml IL-3、0-1μg/mlIL-6、0-1μg/ml GM-CSF、0-1μg/ml Flt3L、0-1μg/ml TPO、0-5μg/ml EPO、0-1μg/mlVEGF、0-1μg/ml LIF、0-1μg/ml TGF-β、0-100μM dmPGE2、0-100μM dexamethasone和0-100μM lenalidomide以及miR-146、miR-181a和miR-10以及anti-221和anti-23。
通过上述本发明的技术方案，本发明使用容易获取、来源充足、无道德伦理问题和安全有效的新生儿脐带间充质干细胞作为诱导对象，通过转染6个小RNAs分子，在一种特制的无血清培养基的作用下大规模并快速直接转分化成红母细胞，解决了现有人工造血技术中红母细胞的来源、数量限制和定向分化的技术瓶径问题。
附图说明
图1为本发明的诱导脐带间充质干细胞直接转分化为红母细胞的方法的流程框图；
图2是人脐带间充质干细胞的培养(A和B)和表面特征性抗原，(C)流式细胞仪分析显示人脐带间充质干细胞是CD29,CD44,CD90,CD105,CD73和CD166阳性的,CD33,CD38,CD31和CD45阴性的；
图3是ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221，和siR-EID3的分子结构以及与相应靶基因序列的排比配对；
图4是不同的小RNA分子能够有效地沉默它们的靶基因，从而导致相应下游关键基因的高表达；
图5是人脐带间充质干细胞转分化成原红细胞的集落形成和细胞形态的照片；
图6是脐带间充质干细胞转分化成红母细胞的各种表面特征标志和这些标志物各自所占的百分比；
图7是转分化后的红母细胞的爆发性集落和一般集落的形态；
图8是qPCR电泳分析比较人脐带间充质干细胞，和转染不同小RNA分子后的脐带间充质干细胞中的红细胞相关基因的表达差异；
图9红母细胞在小鼠体内能够进一步分化成表达CD235分子标志物的成熟红细胞。UC-MSC，是人体脐带间充质干细胞组；CB-EPC,是人体脐血红母细胞组；UC-EPC,是人体脐带间充质干细胞来源的红母细胞组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明：
如图1所示，一种诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其包括下列步骤：
S1，分离和纯化均质的脐带间充质干细胞；
S2，选取可用于干细胞表观遗传调控的小RNA分子；
S3，小核酸多肽纳米粒的制备和细胞转染；
S4，转染后的红母细胞扩增培养。
其中，步骤S1中加入趋化液，所述的趋化液是指在无血清的DMEM/F12培养基中添加的间充质干细胞从脐带组织内向脐带组织外的培养环境迁移的趋化SDF-1/CXCL12、HGF、EGF、bFGF、PDGF-BB和IGF-1六种细胞趋化因子。
步骤S2中所述的小RNA分子为多种，所述的多种小RNA分子包括ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221和siR-EID3分子的序列。
所述的多种小RNA分子组合的比例为：ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221和siR-EID3干粉重量比为0.5:0.5:0.5:1:1:1.5。
步骤S3中小核酸多肽纳米粒的制备方法为：将步骤S2中1份干粉量的多种小RNA分子的组合混合物与50份干粉量的多肽转染试剂分别溶于医用级去离子水中，然后在搅拌状态下将多肽转染试剂溶液缓慢滴加至多种小RNA混合物溶液中，继续搅拌使小RNA活性成分与多肽转染试剂充分混合，静置20分钟，让其充分自组装成纳米颗粒。
所述的细胞转染，即小核酸多肽纳米粒转染脐带间充质干细胞的方式为第一天消化转染一次，第一天非消化转染一次。
多肽纳米粒的制备(即组装)是指不同的小RNA分子与多肽转染试剂按有关配比、程序和时间的配制过程，通过第一天的消化转染和第二天的非消化转染以达到最佳的诱导转化效率。
步骤4包括步骤S41和S42，其中，
S41，制备诱导间充质干细胞转分化扩增培养基；
S42，激活多种指导红母细胞发育和分化的相关基因。
所述的转染后的红母细胞扩增培养是指在红母细胞诱导扩增培养基中以5×105/ml的细胞密度进行培养至少5-7天来实现的。作为优选的技术方案，所述的转染后(即转分化后)的红母细胞培养是指在红母细胞诱导扩增培养基中以5×105/ml的细胞密度进行培养至少4-6天。
所述的扩增培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添加bFGF,shh，SCF，TPO，VEGF,Flt3L，Delta1，IGFBP，EPO，IGF-1,IL-3,GM-CSF，IL-6,LIF，TGF-β,dmPGE2,dexamethasone,和lenalidomide十八种分子制成的。
所述的扩增培养基配方包括0-1μg/ml bFGF，0-1μg/ml Sonic hedgehog，0-1μg/mlDelta1，0-1μg/ml IGF-1，0-1μg/ml IGFBP，0-1μg/ml SCF，0-1μg/ml IL-3，0-1μg/ml IL-6,0-1μg/ml GM-CSF,0-1μg/ml Flt3L,0-1μg/ml EPO，0-1μg/ml TPO，0-1μg/ml VEGF，0-1μg/ml LIF，0-1μg/ml TGF-β，0-100μM dmPGE2，0-100μM dexamethasone和0-100μM lenalidomide。
所述的激活多种红母细胞发育和分化的相关的基因包括Runx1,Tal1,Gata1,NFE2,PU.1,Gfi1B,State5,Fog1,DNMT3b，BMI1，CHD8，EKLF,BCL11A,Fop,Sox1,Klf1,FOXO,NFkB,JAK2,GAB1/2,ERB1/2,LYN,EPO-R,IGF1-R,IL3-R,c-kit-R,AKT和Mill。
一种间充质干细胞转分化为红母细胞的诱导扩增培养基试剂盒，所述的试剂盒包括红母细胞诱导扩增培养基，所述红母细胞诱导扩增培养基包括红母细胞增殖所需要的细胞增殖因子和其他血细胞分化抑制剂；所述红母细胞诱导扩增培养基的配方为：80-100％(v/v)的DMEM/F12基础培养基，0-1μg/ml bFGF、0-1μg/ml Sonic hedgehog、0-1μg/ml Delta1、0-1μg/ml IGF-1、0-1μg/ml IGFBP、0-1μg/ml SCF、0-1μg/ml IL-3、0-1μg/mlIL-6、0-1μg/ml GM-CSF、0-1μg/ml Flt3L、0-1μg/ml TPO、0-5μg/ml EPO、0-1μg/mlVEGF、0-1μg/ml LIF、0-1μg/ml TGF-β、0-100μM dmPGE2、0-100μM dexamethasone和0-100μM lenalidomide以及miR-146、miR-181a和miR-10以及anti-221和anti-23
间充干细胞培养基配方可制造成不同的培养试剂盒，其中包括不同间充质干细胞(如骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞)增殖所需要的细胞增殖因子、细胞分化抑制剂。
红母细胞诱导扩增培养基配方可制造成不同的培养试剂盒，其中包括红母细胞增殖所需要的细胞增殖因子、细胞分化抑制剂。具体配方成分见表1。
使用本发明的方法获得的诱导红母细胞，可用于血液病如地中海贫血和红细胞缺少症等的治疗以及人工血液制品的生产。
具体详尽的技术方案描述如下：
步骤1.间充质干细胞分离、纯化和扩增
脐带的获取在捐献者同意的前提下进行的。由于脐带间充质干细胞能高表达6种细胞因子的受体基因如CXCR4、IGF1R、HGFR、bFGFR、EGFR和PDGFR,并在细胞膜上呈现相关的受体蛋白，为了获得最大量的活力优质的人脐带来源的间充质干细胞(UC-MSCs)，同时尽可能避免其它细胞的混入以及酶消化对细胞的损伤(尤其在胶原酶和透明质酸酶联合应用时，有可能造成细胞外膜的破坏，使分离的MSC不能贴壁。酶消化法获得的细胞，除MSC外还含有其他类型的细胞)，本发明公开了一种新的人脐带来源的间充质干细胞的采集、分离纯化和扩增培养的方法，具体方案如下：1)无菌条件下用消毒的镊子从脐带运输瓶中将脐带取出置于无菌的培养皿中，在含有双抗的PBS溶液中清洗2-3遍，用剪刀将脐带等分成3cm长，再将脐带管切开，取出大血管，剥出里面的华氏胶组织，用利剪将大块的脐带分成1-3mm见方的脐带组织块；2)，以低强度脉冲式超声波处理脐带组织块10-20min，使脐带间质变得更为松散；3)用0.5％多聚赖氨酸预处理的100mm培养皿底表面，待其干后再让其吸附多种间充质干细胞的趋化因子的混合物，如用100ul的DMEM/F12培养基将20ng/ml SDF-1,10ng/ml HGF，10ng/ml bFGF,10ng/mlPDGF-BB，10ng/ml IGF-1和10ng/ml EGF混合均匀，滴加到多聚赖氨酸培养皿中形成诱导间充质干细胞从脐带中向培养基质迁移的趋化层，再培养箱中放置30分钟固型；4)按每个用多聚赖氨酸和趋化因子预处理的100mm培养皿中放置20-50个1-3mm见方的脐带组织块，再加入5mL无血清的高糖DMEM/F12培养基含100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。置于37℃、5％的CO2及饱和湿度培养箱内培养，脐带组织培养5-7天后，可见有许多间充质干细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，细胞开始迅速增殖。10天后弃残存的组织，换细胞培养液含有5-10％FBS和0.1-0.5ng/ml TGF-beta的高糖DMEM/F12培养基。培养期间可用相差显微镜观察UC-MSCs逐渐从脐带组织块中迁移出来，在培养瓶中形成一层贴壁的均质细胞群(图2A)。从1cm长的脐带中大约能获得5-6万个纯净的间充质干细胞，而没有其它种类的杂细胞如血管内皮细胞，成纤维细胞，平滑肌细胞等污染。相差显微镜观察细胞形态特征及增殖情况，以后每48h按30-50％换液1次。待细胞融合超过培养瓶底80-90％时，用0.25％胰蛋白酶消化传代和检测。总之，贴壁法操作简单，且传代后的细胞形态及增殖活性更为稳定。
人脐带来源间充质干细胞的鉴定：取第3或4代细胞以0.25％胰酶(含0.02％乙二胺四乙酸)消化细胞，制成单细胞悬液，1000r/min离心5min，去上清，用PBS洗涤后重复再次离心、重悬。然后用体积分数95％乙醇固定，分别加入FITC标记的单抗如CD29、CD166、CD73、CD44、CD45、CD90、CD105和HLA-ABC等，流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达。流式细胞术分析研究发现UC-MSCs主要表达CD44、CD73、CD90、CD166、CD29、CD49e和HLA-ABC，而不表达CD34、CD45、CD14、CD33、和CD38(图2B)。分析结果表明本发明提供的方法能够分离纯化出高质量和高纯度的间充质干细胞，上述特征性标志物的阳性率高达99.5％。这个结果和其他的MSCs几乎一致。
步骤2.miRNAs序列、结构和合成
通过生物信息学技术和相关的预测软件以及大量的生物学筛选试验，最终我们筛选和鉴定了6个与红母细胞的发生有关sRNAs，它们的核苷酸序列和相应靶基因的核苷酸序列排比如图3所示。根据它们的核苷酸序列，分别设计了相应的反义核酸小RNA分子，这些小核酸分子是诱导干细胞转分化的关键活性分子。
第一个sRNA是miR-10b,它的反义核酸小RNA分子是ANTI-10b，其序列如下：
ANTI-10b:5’-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3’
第二个是miRNA-155,它的反义核酸小RNA分子是ANTI-155，其序列如下：
ANTI-155:5’-ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA-3’
第三个是miRNA-181B,它的反义核酸小RNA分子是ANTI-181B,其序列如下：
ANTI-181B:5’-ACCCACCGACAGCAAUGAAUGUU-3’
第四个是miRNA-24,它的反义核酸小RNA分子是ANTI-24,其序列如下：
ANTI-24：5’-CUGUUCCUGCUGAACUGAGCCA-3’
第五个是miRNA-221,它的反义核酸小RNA分子是ANTI-221,其序列如下：
ANTI-221:5'-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3'
第六个是siRNA-EID3,其序列如下：
5'-UCAGACAUUGUUUUACUGUGCTT-3'
3'-TTAGUCUGUGGCAAAGUGACACG-5'
这些miRNAs和反义核苷酸都可以通过化学合成的方法获得，为了加强稳定性这些小RNA的组成单体可进行全部或部分不同的化学修饰，如甲氧或乙氧修饰。本发明中的miRNAs活性成分的制备方法如下：
将上述6种不同的核苷酸单体经RNA/DNA合成仪按特定的设计序列合成6种不同的小RNA单链，这些小RNA单链序列如上所示。合成好的小RNA单链再经过分离纯化除去其它成分，第六种小RNA单链进行退火形成1个特征的sRNAs双体，前5种均为单链。将这6种sRNA分子冷冻浓缩成干粉作为配方中的小核酸活性成分，在低温下保存，干粉包括ANTI-10b,ANTI-181b，ANTI-155,ANTI-221,ANTI-24和siR-EID3,这些ANTI sRNAs均能与相应的靶子miRNAs(如miR-10b，miR-181b，miR-155，miR-221和miR-24)的核苷酸序列相识别和结合。同样siR-EID3亦能与其靶基因EID3的核苷酸序列相识别和结合。所以，将它们转染进脐带间充质干细胞，48小时后用qPCR分析，结果显示这些小RNA分子(包括siR-EID3)均能有效的下调它们的靶序列(图4A)。利用荧光素酶报告基因检测实验验证了不同小RNA分子(miR-136,miR-128,miR-218,siR-EID3)对靶基因EID3的抑制作用(图4B)。这些小RNA的作用分别导致了相应下游基因，如HOXA1,BCL2,SPI 1，Kit，ACVR1B，CBP/P300表达增加(图4C),最终诱导间充质干细胞直接转分化为红母细胞。为了加强小RNA的诱导转化效应，我们采用了这6种小RNA(sRNA)的结合战略，最终的小核酸活性成分是在ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221，和siR-EID3合成后根据干粉重量的0.5：0.5：0.5：1：1:1.5比例要求加以混合配制。
步骤3.小核酸多肽纳米粒的制备和细胞转染
分别将上述小核酸活性成分的混合物和转染试剂如透皮穿膜肽/脂质体Lipofectamine2000(从北京吉利奥生物技术发展有限公司或Life technologies公司购买)分别溶解在医用级去离子水中，混合均匀10min,根据核酸与多肽的重量百分比：即1：10到1：100，在搅拌状态下再将小核酸活性成分的溶液缓慢滴加透皮穿膜肽的溶液中,继续搅拌使小核酸活性成分和透皮穿膜肽能充分混合，静止20分钟，让其充分自组装成纳米颗粒。同时，可用胰酶将2X106贴壁的脐带间充干细胞消化离散，用旧培养基终止消化，PBS清洗2-3遍，用5ml的无血清的DMEM/F12培养基悬浮，继而加入上述的转染纳米颗粒，充分混匀后植入培养板中继续培养，6到8小时后加入含有多种细胞因子的无血清DMEM/F12培养液(表1)，第二天再次在培养板中加入上述转染剂，混匀后继续培养5-6天，用于FACS检测。
表1. 红母细胞诱导扩增用培养基配方
| 成分 | 含量 |
| DMEM/F12基础培养基 | 80-100％(v/v) |
| Sonic hedgehog(shh) | 0-1μg/ml |
| Delta1 | 0-1μg/ml |
| bFGF | 0-1μg/ml |
| IGFBP | 0-1μg/ml |
| SCF | 0-1μg/ml |
| EPO | 0-1μg/ml |
| TPO | 0-1μg/ml |
| IGF-1 | 0-1μg/ml |
| LIF | 0-1μg/ml |
| TGF-β | 0-1μg/ml |
| dmPGE2 | 0-100μM |
| IL-3 | 0-1μg/ml |
| Flt3L | 0-1μg/ml |
| VEGF | 0-1μg/ml |
| dexamethasone, | 0-100μM |
| lenalidomide | 0-100μM |
| Anti-24 | 0-100nM |
| Anti-10b | 0-100nM |
| Anti-221 | 0-100nM |
| Anti-181b | 0-100nM |
| Anti-155 | 0-100nM |
| siR-EID3 | 0-100nM |
为了大大提高小RNA诱导人间质干细胞向红母细胞转分化的效率，本发明进一步优化了具体的诱导方案，这里公开的8种诱导配方见表2。从中可见方案4中的第二种诱导配方的效率最高，即通过每天一次共二次转染，能使90％以上的人间质干细胞在6天中转分化成红母细胞。比我们原来的诱导方法大为改进，使通过此技术能快速获得临床级的红母细胞成为可能。进一步将可用于各种贫血的治疗和工业化制造血液。
表2. 3X106人脐带间质干细胞向红母细胞转分化的诱导方案
步骤4.小核酸-多肽纳米粒诱导间质干细胞转分化成红母细胞
用小RNA混合物(包括ANTI-181a,ANTI-24,ANTI-10b,siR-EID3以及ANTI-221和ANTI-155)转染消化离散后的人脐带间质干细胞1天后，第二天再继续贴壁转染1次，转然后绝大部分(》90％)细胞变成圆形的悬浮的细胞，再培养3天这些悬浮的细胞就显示出原红细胞的形态特征，如在1％甲基纤维素上培养5-7天可形成原红细胞的集落(图5)。在红母细胞诱导扩增培养基中(配方见表1)以2X106/ml细胞密度于3-5L的生物反应器中,在3％氧，5％二氧化碳，和92％氮，pH为7.1-7.3,搅拌器转速为30-60转/分的条件下培养3天，这些悬浮的细胞丢失了间充质干细胞的特征性抗原(如CD44、CD73、CD105、CD166、CD29、CD90、Flk-1)和同时获得了红母细胞的表面抗原(如CD34、CD235、CD71、CD38、CD45和CD36)(图6)。并得到快速的扩增。
对这些转化后的红母细胞进行FACS双抗标记分析，结果显示这些红母细胞中，80％的细胞表达CMP祖细胞和CEMP红母细胞的表面标志性抗原如CD36、CD38、CD71、CD235、CD45、和CD34，只有大约20％的细胞表达长期造血干细胞的表面标志性抗原如CD105和CD90(图6)。
步骤5.转分化的红母细胞在体外能形成B-CFU和E-CFU。
为了明确证实这些转化的单一细胞通过培养能够自我更新，将转染过的单一干细胞分离出来再接种到涂有1％甲基纤维素的24孔培养板(购于Corning公司)的中，并向培养基中加入诱导红母细胞细胞扩增的细胞因子和其它必需成分(配方见表1)，培养条件为37℃和5％CO2，这是本发明首次公开的红母细胞诱导扩增培养基的配方。第15日在显微镜下观察，可以看到有B-CFU和E-CFU细胞集落的形成(图7)。该方法较目前广泛使用的红母细胞集落培养方法更有效更快速。目前通常使用的培养方法容易导致向其他造血细胞的分化，如粒细胞、淋巴细胞、血小板、NK细胞，树突细胞等，和较低的扩增倍数。
步骤6.转分化的红母细胞能高表达一些红细胞的特征基因
用RT-PCR方法对这些转化的红母细胞进行检测，发现它们能高表达许多与红细胞发育有关的重要基因如Runx1,Tal 1,Gata1,NFE2,Gfi 1B,State5,Fog1,DNMT3b，BMI 1，CHD8，EKLF,FOXO,NFkB,JAK2,GAB1/2,LYN,EPO-R,AKT,和Mill。从而使它们在基因表达方面更加相似于自然发生的红母细胞，而不同于它们来自的间充质干细胞(图8)。这些调控红母细胞发育的关键基因的激活使间充质干细胞转分化成红母细胞成为现实。
步骤7.移植实验表明这些转化的红母细胞能够在小鼠体内发育成成熟的红细胞
将转染有小RNA分子的脐带间质干细胞体外培养5天后，分别移植到经临界致死剂量的放射处理的免疫缺陷的小鼠体内。4周后能够检测到由脐带间质干细胞分化成的红细胞。利用抗人源性单克隆抗体对鼠的有关组织进行FACS分析，发现在经临界致死辐射剂量的放射处理的小鼠的骨髓、肝脏和脾脏中能够检测到人红细胞基因标志分子的表达，这些红母细胞能够进一步分化成以特征表达CD235分子标志物的红细胞(图9)。
由于采用了上述技术方案，一种能够大规模并快速高纯度地诱导脐带间充质干细胞转分化成红母细胞的方法，包括下列步骤：1)分离和纯化了均质的间充质干细胞的趋化液；2)精选了多种可用于干细胞表观遗传调控的小RNA分子；3)采用了核酸多肽纳米粒的高效传递系统和优化了干细胞的转染和转化效率；4)创制了高效的诱导间充质干细胞转分化扩增培养基；5)激活了多种指导红母细胞发育和分化的相关基因，解决了现有人工造血技术中红母细胞的来源、数量限制和定向分化的技术瓶径问题。
本发明的方法提供了一些内源性miRNAs及其它们的衍生物，他们分别针对不同的靶mRNAs和miRNAs，从而调节它们的表达水平，最终改变原先细胞内的基因表达类型和细胞形态及标志物的类型，使这些间充质干细胞获得了向红母细胞转分化的潜能，在一组优化的诱导因子的作用下，产生了一种全新的红母细胞群。这种方法具有高的多的转化效率，比我们原先专利中介绍的方法提高了8-10倍(如从间充质来源的造血干细胞进一步分化成红母细胞的方法)，使临床应用成为可能。消化转染方法有效解决了高效将小RNA转染进脐带间充质干细胞的瓶颈问题，有效防止了造血干细胞扩增中极易分化为下游其它血细胞(粒细胞，淋巴细胞，血小板等)的事态发生，高效地激活了与红母细胞发生有关的多种基因。
与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：
1、能够大规模(1-3X109-12细胞)并快速(5-7天)地诱导期待间充质干细胞转分化成红母细胞。解决了现有诱导干细胞转分化技术中转化率不高、需要时间长和转化后红母细胞数量少和纯度低的技术瓶径问题。
2、转分化后的红母细胞与人体中天然产生的红母细胞一样，具有增殖和分化为成熟红细胞的潜能，可用于人体红系再障或其它原因的红细胞发育障碍如地中海贫血治疗。使用本发明的方法获得的红母细胞还可进一步的大规模分化为成熟的红细胞作为人造血液，用于输血手术方面，从而弥补长期以来血库的血液存量不足的问题。
本发明通过体外多次试验研究和反复的检测论证，证明了本发明在诱导脐带间充质干细胞向红母细胞转分化方面有着比目前在研的同类技术更好的效果。
进一步的，对附图做更详尽的说明如下：
图2是人脐带间充质干细胞分离、培养和鉴定。流式细胞仪分析显示人脐带间充质干细胞的表面特征性抗原是CD29,CD44,CD90,CD105,CD73和CD166阳性的,CD33,CD38,CD31和CD45阴性的。
图3是不同小RNA分子的核苷酸序列和它们相应靶基因的核苷酸序列的结构和排比配对。
图4是不同的ANTI-RNA分子能够有效地沉默它们的靶子miRNA基因,从而导致下游的关键基因的高表达。
图5是人脐带间充质干细胞转分化成原红细胞的集落和细胞形态；
图6是脐带间充质干细胞转分化成红母细胞的表面特征性标志和它们各自所占的百分比；
图7是转分化后的红母细胞的爆发性集落和一般集落的形态；
图8是qPCR电泳分析比较人脐带间充质干细胞，和转染不同小RNA分子后的脐带间充质干细胞中的红细胞相关基因的表达差异；
图9红母细胞在小鼠体内能够进一步分化成表达CD235分子标志物的成熟红细胞。UC-MSC，是人体脐带间充质干细胞组；CB-EPC,是人体脐血红母细胞组；UC-EPC,是人体脐带间充质干细胞来源的红母细胞组。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (13)
1.一种诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其特征在于，包括下列步骤：
S1，分离和纯化均质的脐带间充质干细胞；
S2，选取可用于干细胞表观遗传调控的小RNA分子；
S3，小核酸多肽纳米粒的制备和细胞转染；
S4，转染后的红母细胞扩增培养。
2.如权利要求1所述的诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其特征在于，步骤S1中加入趋化液，所述的趋化液是指在无血清的DMEM/F12培养基中添加的间充质干细胞从脐带组织内向脐带组织外的培养环境迁移的趋化分子。
3.如权利要求2所述的诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其特征在于，所述的趋化分子包括SDF-1/CXCL12、HGF、EGF、bFGF、PDGF-BB和IGF-1六种细胞趋化因子。
4.如权利要求1所述的诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其特征在于，步骤S2中所述的小RNA分子为多种，所述的多种小RNA分子包括ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221和siR-EID3分子的序列。
5.如权利要求4所述的诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其特征在于，所述的多种小RNA分子组合的比例为：ANTI-181b，ANTI-155，ANTI-10b，ANTI-24,ANTI-221和siR-EID3干粉重量比为0.5:0.5:0.5:1:1:1.5。
6.如权利要求1所述的诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其特征在于：步骤S3中小核酸多肽纳米粒的制备方法为：将步骤S2中1份干粉量的多种小RNA分子的组合混合物与50份干粉量的多肽转染试剂分别溶于医用级去离子水中，然后在搅拌状态下将多肽转染试剂溶液缓慢滴加至多种小RNA混合物溶液中，继续搅拌使小RNA活性成分与多肽转染试剂充分混合，静置20分钟，让其充分自组装成纳米颗粒。
7.如权利要求6所述的诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其特征在于：所述的细胞转染，即小核酸多肽纳米粒转染脐带间充质干细胞的方式为第一天消化转染一次，第二天非消化转染一次。
8.如权利要求1所述的诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其特征在于：步骤4包括步骤S41和S42，其中，
S41，制备诱导间充质干细胞转分化扩增培养基；
S42，激活多种指导红母细胞发育和分化的相关基因。
9.如权利要求8所述的诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其特征在于：所述的转染后的红母细胞扩增培养是指在红母细胞诱导扩增培养基中以5×105/ml的细胞密度进行培养至少5-7天来实现的。
10.如权利要求9所述的诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其特征在于：所述的扩增培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添加bFGF,shh，SCF，TPO，VEGF,Flt3L，Delta1，IGFBP，EPO，IGF-1,IL-3,GM-CSF，IL-6,LIF，TGF-β,dmPGE2,dexamethasone,和lenalidomide十八种分子制成的。
11.如权利要求10所述的诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其特征在于：所述的扩增培养基配方包括0-1μg/ml bFGF，0-1μg/ml Sonic hedgehog，0-1μg/ml Delta1，0-1μg/ml IGF-1，0-1μg/ml IGFBP，0-1μg/ml SCF，0-1μg/ml IL-3，0-1μg/mlIL-6,0-1μg/ml GM-CSF,0-1μg/ml Flt3L,0-1μg/ml EPO，0-1μg/ml TPO，0-1μg/mlVEGF，0-1μg/ml LIF，0-1μg/ml TGF-β，0-100μM dmPGE2，0-100μM dexamethasone和0-100μM lenalidomide。
12.如权利要求9所述的诱导间充质干细胞转分化为红母细胞的方法，其特征在于：所述的激活多种红母细胞发育和分化的相关的基因包括Runx1,Tal1,Gata1,NFE2,PU.1,Gfi1B,State5,Fog1,DNMT3b，BMI1，CHD8，EKLF,BCL11A,Fop,Sox1,Klf1,FOXO,NFkB,JAK2,GAB1/2,ERB1/2,LYN,EPO-R,IGF1-R,IL3-R,c-kit-R,AKT和Mill。
13.一种间充质干细胞转分化为红母细胞的诱导扩增培养基试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括红母细胞诱导扩增培养基，所述红母细胞诱导扩增培养基包括红母细胞增殖所需要的细胞增殖因子和其他血细胞分化抑制剂；所述红母细胞诱导扩增培养基的配方为：80-100％(v/v)的DMEM/F12基础培养基，0-1μg/ml bFGF、0-1μg/ml Sonic hedgehog、0-1μg/mlDelta1、0-1μg/ml IGF-1、0-1μg/ml IGFBP、0-1μg/ml SCF、0-1μg/ml IL-3、0-1μg/ml IL-6,0-1μg/ml GM-CSF,0-1μg/ml Flt3L,0-1μg/ml TPO，0-5μg/ml EPO、0-1μg/ml VEGF、0-1μg/ml LIF、0-1μg/ml TGF-β、0-100μM dmPGE2、0-100μMdexamethasone和0-100μM lenalidomide以及miR-146、miR-181a和miR-10以及anti-221和anti-23。
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