CN102031244A - 重组间充质干细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组间充质干细胞及其制备方法与应用。本发明提供的培育重组间充质干细胞的方法是将趋化因子受体CCR7的编码基因导入间充质干细胞中，得到重组间充质干细胞。本发明提供的重组间充质干细胞具有靶向迁移至淋巴结和脾的能力。

Description

重组间充质干细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及重组间充质干细胞及其制备方法与应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是最先从骨髓中分离出来的一群具有一定自我更新和多向分化潜能的干细胞。特定的诱导条件下能向骨、软骨、脂肪、肌肉等多种间质系统细胞分化。由于这些细胞最终可分化为间质系统细胞，因此被命名为间充质干细胞。骨髓被认为是MSC的主要居住场所。近年来许多学者在骨髓以外的组织器官中也分离出MSC，包括肌肉、脂肪、骨实质、胰腺、肺脏、胸腺、脐带和胎盘等几乎机体所有的组织和器官。体外和体内实验均证明了MSC及其分化细胞可给予造血细胞结构和功能上的支持，具有造血调节作用。MSC具有易于外源基因转染和转染后外源基因可以稳定表达的优点，亦可作为良好的基因治疗载体，进行疾病治疗。MSC成为了组织工程和骨髓移植细胞治疗的研究热点。

近年来，MSC的免疫调节功能逐渐受到人们的重视。MSC细胞表面只表达中等量MHC-I类分子，但不表达MHC-II类分子及共刺激分子，如：CD80、CD86、CD40和CD40L等，MSC具有低免疫原性，提示着体外培养和体内输注MSC，不会引起T细胞的活化和增殖。间充质干细胞的低免疫原性在体内的研究中也得到证实。越来越多的资料表明，MSC在体外实验的混合淋巴细胞反应(MLR)、丝裂原刺激的淋巴母细胞转化实验(LTT)以及CD3或CD28抗体刺激的淋巴细胞反应体系中均能抑制淋巴细胞的增殖。体内实验证明了MSC输注能延长狒狒和小鼠异体皮肤移植存活时间。以上说明MSC可以作为免疫调节剂。

我们的前期实验中应用转入eGFP的MSC示踪其输注后在GvHD小鼠的体内分布，与已有报导相一致，发现MSC在小鼠二级淋巴器官(SLO)，如脾脏和淋巴结分布极少，而在外周靶器官如肺、肝、肠、骨髓等器官分布较多。

机体接受免疫信息，发生细胞和体液免疫应答的场所主要是在SLO，包括脾脏和淋巴结。脾脏主要应答血液来源的抗原，淋巴结主要应答淋巴液中的循环抗原。当DC在外周组织器官摄取抗原，经加工处理后，逐渐成熟，迁移至SLO，定位于T细胞区，刺激T细胞活化和效应T细胞的形成。细胞进入SLO有着特定的信号。细胞表达CD62L，又称L-选择素，其与高内皮静脉上(HEV)的地址素非共价结合，使细胞能够与血管表面相接触，并在血管表面滚动；如细胞表达趋化因子受体7(chemokine receptor 7，CCR7)，就能使细胞与SLO组成性表达的二级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoidtissue chemokine，SLC)相共价结合，活化细胞的Gαi信号通路，进一步介导LFA-1与ICAM-1或ICAM-2相结合，接着是细胞变形和穿越HEV，进入SLO。

趋化因子是一组具有趋化作用的细胞因子，能吸引免疫细胞到免疫应答局部，参与免疫调节和免疫病理反应。它们多为小于100个氨基酸的小分子多肽，根据结构可主要分为4个趋化因子亚家族：Cys-X-Cys(CXC)、Cys-Cys(CC)、Cys(C)、Cys-X₃-Cys(CX₃C)亚家族。从1999年开始，国际命名委员会在趋化因子的结构基础上，对趋化因子及其受体进行了统一命名，即用CXCLn、CCLn、CX3CLn、XCLn分别代表CXC、CC、CX3C和C家族的不同成员，其中L为配体即Ligand，n为不同的数字。迄今发现的CC趋化因子为CCL1-CCL28，CXC趋化因子为CXCL1-CXCL16，CX3C趋化因子目前只有CX3CL1一个成员，C趋化因子有XCL1和XCL2两个成员。目前发现的CC趋化因子受体为CCR1-CCR11，CXC趋化因子受体为CXCR1-CXCR6，CX3C和C趋化因子受体目前各只有一个成员，分别为CX3CR1和XCR1。趋化受体CCR7是CC族趋化因子受体7。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培育重组间充质干细胞的方法。

本发明提供的培育重组间充质干细胞的方法是将趋化因子受体CCR7的编码基因导入间充质干细胞中，得到重组间充质干细胞。

具体地讲，上述趋化因子受体CCR7的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

进一步讲，上述趋化因子受体CCR7的编码基因是如下1)或2)或3)：

1)其编码序列如序列表中序列1所示；

2)在严格条件下与1)的基因杂交且能编码所述趋化因子受体CCR7的基因；

3)与1)的基因具有90％以上同源性且能编码所述趋化因子受体CCR7的基因。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

上述趋化因子受体CCR7的编码基因可以是通过重组病毒感染所述间充质干细胞而导入所述间充质干细胞中的；所述重组病毒是用如下的重组逆转录病毒载体构建的：将所述趋化因子受体CCR7的编码基因插入pMSCVneo的多克隆位点得到的重组载体。

上述的方法制备得到的重组间充质干细胞也属于本发明的保护范围之内。

上述重组间充质干细胞在制备免疫调节剂中的应用也属于本发明的保护范围之内。

实验证明：体外实验中，在5小时时，MSC、MSC/pMSCV组仅有少量细胞迁移到transwell培养皿的下表面，而MSC/pMSCV-CCR7组有大量细胞迁出；10小时的结果与其相似，说明MSC/CCR7能够有接受其配体SCL趋化的功能。体内试验中，MSC/pMSCV-CCR7组小鼠脾脏中有较多的CFSE⁺细胞(894.25±363.95)，与MSC(123.25±81.36)、MSC/pMSCV(179.75±90.79)两组相比有显著的统计学差异；MSC/pMSCV-CCR7组小鼠淋巴结中(1109.25±670.21)有较多的CFSE⁺细胞，与MSC/pMSCV(138.75±43.61)和MSC(107.50±63.54)相比有显著统计学差异。说明MSC/pMSCV-CCR7在体内具有靶向迁移至淋巴结和脾的能力。

附图说明

图1为成功构建pMSCVneo-CCR7载体，A是菌落PCR图，上排从左往右依次是Marker，1-7个菌落PCR，下派从左往右依次是Marker，8-14个菌落PCR；B是2个克隆质粒的PCR和酶切鉴定图，上排克隆1的验证，下派是克隆2的验证图，其中泳道1和6是Marker，2是PCR，3、4分别是XhoI、EcoRI单酶切，5是XhoI和EcoRI双酶切；C是pMSCVneo图谱。

图2成功将CCR7基因转入MSC，并流式分选出细胞膜表达CCR7的阳性细胞。A：RT-PCR检测CCR7的表达。以HPRT为内参。B：CCR7抗体标记细胞，流式细胞仪检测结果(MSC：间充质干细胞、MSC/pMSCV：转入pMSCVneo空载体的MSC、MSC/pMSCV-CCR7：转入pMSCVneo-CCR7的MSC)。

图3为MSC/pMSCV-CCR7能够有接受其配体SCL趋化的功能验证，A是体外趋化实验的示意图，B是MSC、MSC/pMSCV、MSC/pMSCV-CCR7三组细胞分别迁移5小时和10小时后通过棉签蘸去上表面细胞，DAPI染色后荧光显微镜下计数迁到Transwell下表面的细胞数量，C为B的代表性照片结果(放大倍数：200×)。

图4为MSC/pMSCV-CCR7在体内具有靶向迁移至淋巴结和脾的能力验证，A是脾脏中CFSE⁺的细胞数，B是淋巴结中CFSE⁺的细胞数。

图5为预备试验中Balb/C小鼠和C57BL/6小鼠的骨实质MSC均不表达CCR7的图片。第1泳道为marker DL2000(TaKaRa)，第2泳道为Balb/C小鼠的骨片分离法得到的MSC，第3泳道为Balb/C小鼠的脾脏单个核细胞，第4泳道为C57BL/6小鼠的骨片分离法得到的MSC，第5泳道为C57BL/6小鼠的脾脏单个核细胞；上排是内参HPRT的RT-PCR结果，下排是CCR7的RT-PCR结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

预备试验：用RT-PCR方法对Balb/C小鼠和C57BL/6小鼠的骨实质MSC的mRNA进行检测，HPRT的引物为：上游5’-GTTCTTTGCTGACCTGCTGG-3’下游：5’-TGGGGCTGTACTGCTTAACC-3’；CCR7引物为上游：5’-CAGCCTTCCTGTGTGATTTC-3’，下游：5’-TGGGAGAGGTCCTTGTAGTC-3’，结果如图5所示，其均不表达CCR7。

实施例1、

一、重组间充质干细胞

1、扩出趋化因子受体CCR7的编码基因

-CCR7-上游：

CAGCCTTCCTGTGT GATTTC；

-CCR7-下游： TGGGAGAGGTCCTTGTAGTC。

(上游引物前添加CCG保护性碱基，XhoI识别的酶切序列

以及Kozak序列

下游引物前加CCG保护性碱基，EcoRI识别的酶切序列

用上述引物对，以离体的小鼠脾脏单个核细胞提取的mRNA为模板，RT-PCR扩出序列。测序表明扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列1的ORF为49-1185位，可编码序列表中序列2所示的蛋白。

2、构建重组表达载体(pMSCVneo-CCR7)

将上述扩增产物经双酶切后插入亦经双酶切的pMSCVneo(购自Clontech公司，图谱如如图1C所示)的XhoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组表达载体，命名为pMSCVneo-CCR7。结构验证：将构成的重组表达载体pMSCVneo-CCR7转入DH5α感受态菌株中，用氨苄青霉素筛选，得到14个克隆，进行PCR检测(引物为上游：5’-CAGCCTTCCTGTGTGATTTC-3’，下游：5’-TGGGAGAGGTCCTTGTAGTC-3’)发现有13个能够扩增出阳性条带(图1A)。

挑取2个克隆进行摇菌，提取质粒，进一步进行PCR(引物为上游：5’-CAGCCTTCCTGTGTGATTTC-3’，下游：5’-TGGGAGAGGTCCTTGTAGTC-3’)、单酶切(XhoI或EcoRI酶)和双酶切鉴定(XhoI酶和EcoRI酶)，结果如图1B所示。

将上述2个克隆测序，结果显示，pMSCVneo-CCR7是在pMSCVneo的框架中插入了序列表中序列1所示的CCR7基因。

3、将空质粒(pMSCVneo)和步骤2得到的正确结构的重组表达载体(pMSCVneo-CCR7)转入包装细胞PT67(购自Clontech公司)中，并收取病毒上清

用QIAGEN质粒提取试剂盒提取pMSCVneo和pMSCVneo-CCR7质粒；分别用Lipofectin2000(Invitrogen)转染PT67细胞，6小时后换成普通培养体系HG-DMEM(Gibco)+10％FCS(Hyclone)，24小时后1∶5传代，48小时后用G418筛选3周，细胞在80％融合时更换新的普通培养基培养再24小时后的病毒上清，0.45um的醋酸纤维素膜过滤，备用。

4、小鼠骨实质MSC的分离和培养

将2-3周龄C57BL/6小鼠(购自军事医学科学院动物中心)，断颈处死小鼠，75％酒精浸泡消毒小鼠→无菌条件下分离小鼠胫骨和股骨，置于平皿中→用无菌纱布搓去附着肌肉，去除干骺端→用PBS+10％FCS(Hyclone)反复冲洗骨髓腔，冲出骨髓细胞→将骨组织剪成约1mm×1mm大小→用0.2％胶原酶(Invitrogen)，37℃消化2小时→消化后吸出消化液，用α-MEM(Gibco)洗骨片3遍→接种于培养瓶中，使骨片均匀分布瓶底，培养体系含α-MEM(Gibco)+10％FCS(Hyclone)+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素，37℃、5％CO2的饱和湿度条件下培养→每3天换液1次→细胞接近70-80％汇合时，0.25％胰酶(Hyclone)消化传代，传代细胞接种密度为4000个细胞/cm²。

5、收集PT67病毒上清，感染MSC

将小鼠MSC提前1天铺24孔板，5×10⁵/孔；将分别收取步骤3得到的两种病毒上清加入polybrene 8ug/ml感染小鼠MSC，6小时后加入G418筛选，3周后收取重组间充质干细胞。将导入pMSCVneo载体的MSC；命名为MSC/pMSCV；将导入pMSCVneo-CCR7载体的MSC命名为MSC/pMSCV-CCR7。

MSC、MSC/pMSCV、MSC/pMSCV-CCR7三组细胞分别用小鼠CD16/32抗体(ebioscience公司)封闭，然后CCR7-PE抗体(ebioscience公司)标记细胞，流式细胞仪检测表达膜分子CCR7的细胞比例，结果显示MSC、MSC/pMSCV不表达膜分子CCR7，而MSC/pMSCV-CCR7有8.8％表达膜分子CCR7。用流式细胞仪将阳性细胞分选出来，得到全部表达膜分子CCR7的MSC(图2)。

二、体外检测迁移能力

体外迁移实验应用transwell培养皿(8.0μm孔径，Coring)，将5×10⁵的MSC、MSC/pMSCV、MSC/pMSCV-CCR7分别放置在上腔，下腔加入600μl培养体系为：α-MEM(Gibco)+1％BSA(Stemcells)和100ng/ml SLC配体(Propertech)，每组细胞设6个复孔。37℃，5％CO₂孵箱中培养10小时，在第5、10小时分别将上腔上表面的细胞用湿润棉棒轻轻蘸掉，并用冰甲醇固定，DAPI染色，在显微镜下计数迁移至下表面的细胞数量，每个实验孔取20个视野。

结果如图3所示，在5小时时，MSC、MSC/pMSCV组仅有少量细胞迁移到transwell培养皿的下表面，而MSC/pMSCV-CCR7组有大量细胞迁出；10小时的结果与其相似，说明MSC/CCR7能够有接受其配体SCL趋化的功能。

三、体内检测迁移能力

将C57BL/6小鼠(购自军事医学科学院动物中心)分为三组，每组3只小鼠；将三组MSC用CFSE(Invitrogen)标记，以2×10⁶尾静脉分别输入a)MSC、b)MSC/pMSCV、c)MSC/pMSCV-CCR7；在输注后24小时取淋巴结、脾的单个核细胞，用流式细胞仪定量分析发出绿色荧光的细胞数量；各组间进行统计学比较。

结果如图4所示，c组小鼠脾脏中有较多的CFSE⁺细胞(894.25±363.95)，与a(123.25±81.36)、b(179.75±90.79)两组相比有显著的统计学差异；c组小鼠淋巴结中(1109.25±670.21)有较多的CFSE⁺细胞，与b(138.75±43.61)和c(107.50±63.54)相比有显著统计学差异。说明MSC/pMSCV-CCR7在体内具有靶向迁移至淋巴结和脾的能力。

实施例2

本实施例与实施例的区别在于将分离得到的MSC换成商业化的MSC(C3H10T1/2，上海复医生科科研服务中心)，其余实验完全相同。结果发现：体外检测迁移能力和体内检测迁移能力的结果与实施例1的结果无显著差异。

Claims (6)

1.一种培育重组间充质干细胞的方法，是将趋化因子受体CCR7的编码基因导入间充质干细胞中，得到重组间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述趋化因子受体CCR7的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述趋化因子受体CCR7的编码基因是如下1)或2)或3)：

1)其编码序列如序列表中序列1所示；

2)在严格条件下与1)的基因杂交且能编码所述趋化因子受体CCR7的基因；

3)与1)的基因具有90％以上同源性且能编码所述趋化因子受体CCR7的基因。

4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述趋化因子受体CCR7的编码基因是通过重组病毒感染所述间充质干细胞而导入所述间充质干细胞中的；所述重组病毒是用如下的重组逆转录病毒载体构建的：将所述趋化因子受体CCR7的编码基因插入pMSCVneo的多克隆位点得到的重组载体。

5.权利要求1-4中任一所述的方法制备得到的重组间充质干细胞。

6.权利要求5所述的重组间充质干细胞在制备免疫调节剂中的应用。

Images