CN1326999C - 使用含有病毒和细胞结合区域的分子增强病毒介导的dna转移的方法 - Google Patents

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Abstract

一种提高逆转录病毒转导造血细胞和其它细胞的效率的方法，该方法包括在存在纤连蛋白或纤连蛋白片段时感染细胞。纤连蛋白和纤连蛋白片段明显增强逆转录病毒介导的基因转移进细胞，特别是造血细胞包括定向祖细胞和初级造血干细胞。本发明还提供利用增强的基因转移、造血细胞群体和用于增强逆转录病毒介导的DNA转移进细胞的新型构建体进行体细胞基因治疗的改进方法及其应用。

Description

使用含有病毒和细胞结合区域的分子 增强病毒介导的DNA转移的方法
发明领域
本发明一般地说是涉及提高病毒转导细胞效率的方法，更具体地说是涉及利用含有一个病毒结合区域和一个细胞结合区域的分子如多肽来增强病毒介导的基因转移进细胞的方法。
发明背景
对于许多人类疾病分子基础理解的进展和基因转移技术的进步，导致了最近发展针对严重遗传疾病的体细胞基因治疗方案的努力。目前，有希望用于人基因治疗的候选疾病包括那些有一种酶或其它蛋白损伤或缺失而酶或蛋白的水平又不需要精确调节的疾病，特别是那些是组成调节的疾病以及损伤见于病人骨髓中的疾病。
例如，基因治疗的一个候选疾病是腺苷脱氨酶(ADA)缺陷，它会导致恶性复合免疫缺陷症(SCID)。在ADA缺陷病人的骨髓细胞中酶很少或检测不到。但是，ADA缺陷已用匹配骨髓移植得到了治愈。ADA正常细胞对ADA缺陷细胞有选择优势，一般能使病人的骨髓种群恢复。
骨髓细胞是体细胞基因治疗的很好目标，因为骨髓组织易于在体外操作并含有种群恢复细胞。另外，人脐带血也已被证明含有大量的初级祖细胞。基因成功地转移进造血干细胞(长期种群恢复细胞)可导致在这些细胞的后代中所显示的多种疾病的终身治愈。
基因转移进种群恢复干细胞和在其中的基因长期表达已由许多研究者在鼠模型中获得了成功。但是，在大型动物如狗和灵长动物的体内实验中，只获得有限的成功，这很大程度上是因为初级造血干细胞感染的低效率。目前的基因转移技术在用于人体方案时由于几个因素其局限性被进一步复杂化，这些因素包括存在于成人骨髓(ABM)中的干细胞的低数目、缺乏纯化这些细胞的合适方法和这种初级细胞在细胞循环中的低份额。
在使用骨髓细胞的鼠和大动物实验两组中，人们已经注意到最成功的方案使用靶细胞和逆转录病毒生产细胞系的协同培养。而且，多数FDA批准的人体基因转移实验依靠重组逆转录病毒载体进行基因转导。重组逆转录病毒载体对基因治疗是理想的，因为它们能将外源DNA有效地转移进并精确而稳定地整合到细胞DNA中。这类载体含有用于基因转移的外源DNA，并被进一步修饰以去除病毒的病原性。由于这些修饰，病毒生产一般使用逆转录病毒包装细胞来完成。但是，对于临床基因治疗来说，因为考虑到生物安全性和质量控制，更需要的是无细胞转导。不幸的是，基因有效地转移进造血细胞如干细胞在不与病毒生产细胞协同培养时一般是不可能的。
最近，实验显示通过在感染时将靶细胞与基质细胞接触能提高基因转移效率。基质细胞是造血微环境(HM)中的一种主要成分。HM包括巨噬细胞、基质细胞、内皮细胞、脂肪细胞和由多种特定的粘附分子组成的复杂的胞外基质(ECM)所形成的有机网络。ECM分子如层粘连蛋白、胶原蛋白、血小板反应蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和纤连蛋白为造血细胞和生长因子两者提供锚定位点。基质对逆转录病毒感染的促进作用的机制还不清楚，但已知有时当造血细胞与HM的细胞直接接触时，会发生造血细胞的增殖和分化的生理调节。
将基因有效地转移进长期种群恢复造血干细胞和其它细胞仍存在问题，目前这阻碍了基因转移技术在造血性和其它疾病的治愈治疗中的广泛应用。这就迫切需要一种能有效地将遗传物质转移进哺乳动物细胞但却没有过去方法的危险性和局限性的方法，本发明满足了这些需求。
发明简述
简而言之，本发明的一个优选实施方案提供了一种提高逆转录病毒载体转导造血细胞的频率的方法。该方法包括，用复制缺陷型重组逆转录病毒载体在存在基本上纯的纤连蛋白和/或纤连蛋白片段的条件下感染活的造血细胞，所用的纤连蛋白或纤连蛋白片段能有效地提高逆转录病毒细胞转导的频率。纤连蛋白和/或纤连蛋白片段可从自然产生的物质中获得，或合成获得(如通过重组遗传工程技术或化学合成技术)，或从自然产生物质和合成物质的组合中获得。另外，应当理解本发明中使用的纤连蛋白多肽或多肽组可包括自然产生的纤连蛋白氨基酸序列的突变，但按照本发明这种突变应提供具有完成增强转导所需的粘附特性的功能多肽。
本发明的另一个优选实施方案提供生产已被转导的造血细胞的方法，包括用携带外源DNA的复制缺陷型重组逆转录病毒在存在固定的纤连蛋白、固定的纤连蛋白片段或它们的固定的混合物的条件下感染活的造血细胞，其中所用固定物的量足以有效地提高逆转录病毒转导细胞的频率。
本发明的另一个优选实施方案提供改进的细胞移植方法。该方法包括以下步骤：从动物供体获得活的造血细胞；用重组逆转录病毒载体感染造血细胞来产生被转导的活的造血细胞，感染在存在固定形式的并且能有效提高转导效率的纤连蛋白和/或其片段时进行；将转导的活造血细胞移植物引入动物受体。在一种优选模式中感染细胞可被导入供体自身。
本发明的另一个优选实施方案提供适用于细胞移植方案的已被转导的脐带血细胞的获得方法。该方法包括用复制缺陷型重组逆转录病毒载体在存在有效量的固定的纤连蛋白和/或纤连蛋白片段的条件下感染来自脐带血的造血细胞，纤连蛋白和纤连蛋白片段用来提高逆转录病毒载体转导造血细胞的频率。本发明还包括用此方法可获得的来自脐带血的活的已被转导的细胞群体，以及细胞移植方法，该方法包括将被转导的细胞群体用作细胞移植物导入动物。
根据本发明的上述实施方案更具体的方面，所用的纤连蛋白或纤连蛋白片段应含有提供纤连蛋白肝素II结合区域的逆转录病毒结合活性的第一氨基酸序列，和提供纤连蛋白CS-1区域的细胞结合活性的第二氨基酸序列。同时使用这两个纤连蛋白的结合区域已被证明能够非常明显地提高逆转录病毒转导靶细胞的效率。
本发明的另一个优选实施方案提供生产一种构建体的方法，该构建体用于提高逆转录病毒载体转导预先确定的靶细胞的效率。该方法包括将一个能与所说靶细胞结合的配体同含有提供纤连蛋白肝素II结合区域的逆转录病毒结合活性的氨基酸序列的多肽共价偶联的步骤。本发明还包括涉及使用这些构建体来提高逆转录病毒载体转导预先确定的靶细胞的频率和将其用于利用被转导细胞的移植方案的方法。
本发明的另一个优选实施方案提供使一定量的病毒定位的方法，包括在存在有效量的固定纤连蛋白或含有纤连蛋白肝素II结合区域的病毒结合活性的纤连蛋白片段时，将含有病毒培养基温育来使一定量的病毒定位。
本发明的另外的优选实施方案一般提供含有基本上纯的和/或固定的纤连蛋白或其片段的已被转导的活造血细胞和其它细胞培养物，以及用于逆转录病毒介导的DNH转移进细胞的试剂盒，见下文的进一步介绍.
本发明的更优选的实施方案提供获得已被逆转录病毒转导的活细胞群体的方法，包括在存在有效量的固定物质如多肽时用逆转录病毒感染细胞，其中固定物质包括与细胞结合的配体和与逆转录病毒结合的配体，以此将逆转录病毒和细胞协同定位并提高细胞的转导效率。我们更奇怪地发现这种过程在缺少或至少基本上缺少溴化己二甲铵(也称为1，5-二甲基-二氨杂十一亚甲基多N-甲溴化物)时可以更好地进行，溴化己二甲铵在此以前是为了提高转导效率而用于基因转移程序。但是，奇怪的是，在本发明的协同定位介导的基因转移过程中溴化己二甲铵的存在被发现降低而不是提高转导效率。因此，本发明更优选的方法是在缺少溴化己二甲铵或其它能在不含协同定位物质的相似过程如相应协同培养过程中提高转导效率的试剂时进行。所产生的改良的细胞群体和细胞移植方法也是本发明的一个部分。
本发明的另一个实施方案提供获得逆转录病毒转导的活细胞群体的方法，包括在存在包含与细胞结合的氨基酸序列和来自胶原蛋白V或成纤维细胞生长因子的与逆转录病毒结合的氨基酸序列的多肽时用逆转录病毒感染细胞的步骤。
本发明的另一个优选实施方案提供用逆转录病毒转导T细胞的方法，包括在存在一种含有与T细胞结合的配体和与逆转录病毒结合的配体的物质时，用逆转录病毒感染细胞，以此来使逆转录病毒和细胞协同定位并提高细胞的转导效率。用于此方法的物质的优选形式是含有与T细胞结合的第一氨基酸序列和与逆转录病毒结合的第二氨基酸序列的多肽。
本发明的另一个优选实施方案提供使一种逆转录病毒定位的方法，包括将逆转录病毒与有效量的含有来自胶原蛋白V或成纤维细胞生长因子的与逆转录病毒结合的分离多肽接触。
本发明的一个目的是提供哺乳动物细胞的有效逆转录病毒感染的方法。
本发明的另一个目的是提供无需协同培养的使用逆转录病毒载体的基因转移方法。
本发明的再一个目的是提供用于自体和/或异体细胞移植的改进方法和细胞培养物。
本发明的这些和其它目的、优点和特征对于熟练的技术人员可以很容易地从下面的介绍中看出。
附图简述
图1提供了纤连蛋白分子包括胰凝乳蛋白酶样片段的图形描述。
图2显示了在存在纤连蛋白片段的情况下使用TKNEO载体感染人定向祖细胞的效率，见下文实施例1中的进一步介绍。
图3比较了不同的人定向造血祖细胞在存在纤连蛋白或其片段的情况下使用TKNEO载体的感染效率，见下文实施例1中的进一步介绍。
图4比较了使用按(i)协同培养方法(条带2-4)、(ii)存在固定的纤连蛋白片段时的上清液感染(条带5-7)，和在BSA上的上清液感染(条带8-10)转导的骨髓细胞移植的小鼠中hADA的存在，见下文实施例7中的进一步介绍。hADA的对照显示于条带1和12，鼠hADA的对照显示于条带11。
图5证明了逆转录病毒与纤连蛋白片段结合，见下文实施例8中的进一步介绍。
图6证明了逆转录病毒与纤连蛋白片段的结合是剂量依赖的，见下文实施例8中的进一步介绍。
图7提供了描述下文实施例9-11中所用的不同重组纤连蛋白片段的图解。
图8显示了逆转录病毒与不同的纤连蛋白片段包括几种重组片段结合，见下文实施例9的介绍。
图9证明肝素阻断逆转录病毒与纤连蛋白片段结合，见下文实施例9中的介绍。
图10显示逆转录病毒在存在不同纤连蛋白片段时感染鼠造血细胞的效率，见下文实施例10中的进一步介绍。
图11和12比较了使用按(i)协同培养方法、(ii)在不同的纤连蛋白片段上的上清液感染、(iii)在BSA上的上清液感染转导的骨髓细胞移植的小鼠中hADA的存在，见下文实施例11中的进一步介绍。
图13显示了纤连蛋白α链的结构及其与实施例中所用的重组片段的关系。标明了纤连蛋白的I、II和III型重复，III型重复的编号从1到14。三个细胞结合位点标记为，CELL为细胞结合区域(CBD)，HEPARIN为肝素结合区域(HBD)，CS1为VLA-4结合位点CS1，CS1结合位点由可变剪接IIICS区域的前25个氨基酸形成。
图14显示逆转录病毒在存在不同纤连蛋白片段时感染NIH/3T3细胞的效率，见下文实施例12中的进一步介绍。
图15显示逆转录病毒在存在不同纤连蛋白片段时感染非粘附性的HL60细胞的效率，见下文实施例12中的进一步介绍。
图16显示了高和低分子量肝素对逆转录病毒与纤连蛋白结合的影响。
图17显示了逆转录病毒在存在重组纤连蛋白片段时感染CD34+细胞群体中不同类型祖细胞的效率，见下文实施例13中的介绍。
图18显示了逆转录病毒在存在重组纤连蛋白片段时感染c-KIT+细胞群体中HPP-CFC细胞的效率，见下文实施例14中的介绍。
图19证明逆转录病毒感染NIH/3T3细胞的效率随着溴化己二甲铵浓度的增加而降低，见下文实施例15中的讨论。
图20证明逆转录病毒感染克隆形成骨髓细胞的效率随着溴化己二甲铵浓度的增加而降低，见下文实施例15的讨论。
图21显示了证明T细胞表达纤连蛋白受体的流式细胞试验结果。
图22显示了证明人T细胞预刺激的流式细胞试验结果。
图23显示了用ADA同工酶试验分析基因转移进人T细胞效率的结果。
图24提供了描述用于感染方案的多肽的图解，进一步介绍见实施例16。
图25是一个显示在存在图24中介绍的肽C-FGF、C-COL和bFGF时NIH/3T3细胞的转导效率的统计图。
图26显示在存在图24中介绍的肽时逆转录病毒基因转移进HEL细胞的效率，它是通过流式细胞分析进行分析的。
图27是一个显示在存在图24中介绍的多肽时CD34+骨髓细胞的转导效率的统计图。
优选实施方案的说明
为了促进对本发明原则的理解，现对本发明的某些实施方案进行介绍，特定的用语所指均相同。但是应当理解，这并不意味着对本发明的范围进行限制，本文所述的这些改变、进一步调整和本发明原则的这些应用被认为对本发明所涉及领域的技术人员来说是常规的。
如上所述，本发明提供提高病毒如逆转录病毒转导活细胞效率的方法。本发明还提供利用重组逆转录病毒载体将基因有效转移进活细胞的方法、获得转导细胞的方法、以及获得自体和其它细胞移植的方法和材料。
本发明的一个特征是发现纤连蛋白(FN)和含有FN的CS-1细胞粘附区域的纤连蛋白片段能明显提高逆转录病毒介导的基因转移进带有纤连蛋白受体并因此表现出纤连蛋白或其片段结合能力的细胞，例如定向祖细胞、初级造血干细胞等造血细胞或长期培养的原始细胞(LTC-IC)。其优点在于，这种效率的提高使与病毒生产细胞的协同培养变得没有必要。本发明的其它特征基于以下发现，纤连蛋白的病毒结合区域位于肝素II结合区域内。这个病毒结合区域在许多应用中可用来使病毒颗粒定位，包括如在多种用来将病毒传递进靶细胞的构建体中。
根据本发明的特定优选方面的重组病毒载体含有外源DNA，并且是非病原性的，即复制缺陷型。这些载体能有效地将外源DNA转移进并精确而稳定地整合于宿主细胞如动物细胞特别是哺乳动物细胞的细胞DNA中。例如，在本发明中，含有来自目的基因编码序列的连续碱基的核苷酸序列可以整合到一个重组逆转录病毒载体中，并置于一个适于驱动该基因的启动子控制之下，典型的启动子为外源启动子。在这点上，外源DNA可以含有自然或人工生产的DNA，并可来自由不同来源衍生的部分，这些部分可以是自然产生的或人工合成的分子，并且这些部分已经通过连接或其它本领域熟知的方法结合在一起。
整合在病毒中的外源DNA可以是任何想用来导入细胞的DNA。例如，外源DNA可以编码一种蛋白质，如ADA，它与一种众所周知的失调有关；或编码一种反义RNA、核酶或假引物(见例如1990年11月15日公开的WO90/13641)；编码一种胞内抗体(见例如1994年2月3日公开的WO94/02610)；编码一种生长因子等等。
如上所述，导入的核酸序列被置于一个启动子的控制之下，因此一般在启动子的下游。换句话说，启动子序列一般在编码序列的上游(即在5’端)。同样，众所周知可以有或没有与启动子和转录起始密码子共同起作用的用来成功转录外源编码序列的其它调节元件(例如增强子序列)。短语“置于…的控制之下”是指这种其它元件的存在是成功转录导入基因所必需的。重组DNA还优选在所导入的编码序列下游包含一个终止序列。
可以使用含有能提供选择性标记或其它选择优势的外源DNA的逆转录病毒载体。例如，载体可以含有一个或多个能提供对不同的选择试剂包括抗生素如新霉素具有抗性的外源基因。可以在本发明中使用的代表性的载体包括如N2/ZipTKNEO载体(TKNEO)(滴度：在NIH/3T3细胞上为1×105 G418r cfu/ml)、ZipPGK-hADA载体和ZipPGK-mADA载体，均如Moritz等以前的报道(1993)《实验医学杂志》178卷，529页。在TKNEO载体中，新霉素磷酸转移酶序列通过单纯疤疹胸苷激酶启动子以有义方向表达(相对于5’长末端重复-LTR)。此载体含有一个提供新霉素抗性的选择性标记基因以便于转导细胞的鉴定。在ZipPGK-hADA载体中，人ADA(“hADA”)c DNA通过人磷酸甘油激酶(PGK)启动子以相对于5’LTR的有义方向表达。它仅含有一个可表达的基因序列并缺少显性选择标记。ZipPGK-mADA(PGK-mADA)载体除用鼠ADA(“mADA”)DNA代替人ADAcDNA外与ZipPGK-hADA相同。这些载体及其它病毒载体以及它们的生产技术是众所周知的，本领域的熟练技术人员可以根据在此公开的内容很好地在本发明中提供和使用它们。
本发明中所使用的病毒载体显示能够与纤连蛋白包括人纤连蛋白的肝素II结合区城的氨基酸序列结合。如下文所讨论的，虽然本发明不为任何理论所限制，但据信通过病毒与细胞与各自的功能区域结合的病毒与靶细胞的协同定位有利于增强病毒对细胞的转导。在这点上，一种病毒与肝素II结合区城的氨基酸序列结合的能力以及因此在本发明中的有效作用的能力可以用传统的方案如下文实施例8和9中所介绍的方案方便地进行确定。一般说来，这些实验确定病毒颗粒与含有肝素II结合区域的固定多肽结合(以此抵抗固定多肽基质洗涤)的程度。简而言之，例如，可以将含有病毒的上清液在含有固定的包含纤连蛋白肝素II结合区城的多肽的小孔中温育。然后用生理盐水缓冲液充分洗涤小孔，然后将病毒的靶细胞在小孔中温育来确定孔中保留的感染活性的水平。评价相对于原来病毒上清液的感染活性或滴度的降低，并与相同操作的对照(例如使用BSA包被的小孔)进行比较。与对照孔相比含有肝素II区域的孔中保留的明显较高的滴度表明试验病毒适用于本发明的范围。为了使这种筛选方案更方便，病毒载体可以如上文所讨论的，含有一个选择性标记基因。
本发明中所用的纤连蛋白片段可以是自然来源的或人工合成的，并可以由自然来源的物质中以基本的纯度制备，例如按照以前Ruoslahti等(1981)《生物与化学杂志》256卷，7277页；Patel和Lodish(1986)《细胞生物学杂志》102卷，449页；和Bernardi等(1987)《细胞生物学杂志》105卷，489页的介绍。在这点上，在这里所说的基本上纯净的纤连蛋白或纤连蛋白片段的意思是它们基本上不含在自然条件下与纤连蛋白共存的其它蛋白。本发明所使用的基本上纯净的纤连蛋白或纤连蛋白片段也可以是重组生产的，例如按照1993年3月30日授权的、转让给日本，Kyoto，Takara Shuzo Co.，Ltd.，的美国专利号5,198,423的一般介绍进行生产。具体而言，在此‘423专利中详细介绍了在下面实施例中称为H-271、H-296、CH-271、CH-296和C-CS1的重组片段和获得它们的方法。在下面实施例中所用的C274片段按照美国专利号5,102,988的介绍获得。这些片段或能够用来按常规方法获得它们的片段也可以按照美国专利号5,198,423中的介绍通过培养保藏在Fermentation Research Institute of the Agency of IndustrialScience and Technology，Japan的大肠杆菌来获得，这些大肠杆菌为FERM P-10721(H-296)、FERM BP-2799(C-277经甲硫氨酸与H-271结合)、FERM BP-2800(C-277经甲硫氨酸与H-296结合)和FERM BP-2264(H-271)。另外，在这里可用的纤连蛋白片段或获得这些片段的起始物质的有用信息可以在下列文献中找到：Kimizuka等，《生物化学杂志》110卷，284-291页(1991)，它进一步报道了上面提到的重组片段；《EMBO杂志》4卷，1755-1759页(1985)，它报道了人纤连蛋白基因的结构；以及《生物化学》25卷，4936-4941页(1986)，它报道了人纤连蛋白的肝素II结合区域。含有CS-1粘附区域和肝素II结合区域两者的纤连蛋白片段，诸如在约30或35kd(30/35FN)中和下面实施例报道的多种重组片段中包含的片段，在迄今为止的工作中被发现能明显提高基因转移进造血细胞的效率，并且在本发明中优选使用。因而应当理解，广义地说，本发明中使用的纤连蛋白相关的多肽或多个多肽能提供具有纤连蛋白CS-1细胞粘附区域的细胞结合活性的氨基酸序列和与病毒结合的纤连蛋白肝素II结合区域的氨基酸序列。熟练技术人员应知道所需的细胞和病毒结合活性可同时由这些功能性纤连蛋白区域的天然氨基酸序列和与天然序列不同但足够相似到显示细胞结合和病毒结合活性的氨基酸序列提供。这些相似氨基酸序列应显示与它们相应的天然序列基本的序列同源性，并可包含那些氨基酸被删除、取代和/或修饰但能提供具有所需细胞结合或病毒结合特征的氨基酸序列。
在这点上，相关的生物技术领域已经发展到所说的功能区域可以按常规方法进行氨基酸的删除、取代、添加或其它修饰的地步。然后所获得的氨基酸序列可按常规方法筛选所需的细胞结合或病毒结合活性。例如，纤连蛋白肝素II结合区域的突变或修饰形式的病毒结合活性可按上文的一般性讨论和下文实施例8和9更具体的讨论进行筛选，使用病毒温育、洗涤和病毒滴度试验来确定与对照相比感染能力的保留。根据在此提供的指导，这些结合试验对于本领域的工作人员应是代表性的但却是常规的试验。
细胞与纤连蛋白CS-1细胞粘附区域的修饰或突变形式的结合，或细胞与其它细胞结合性多肽的结合，也可以用传统方案进行分析。例如，这样的方案包括《自然》352卷，438-441(1991)介绍的方案。简而言之，将细胞结合性多肽包被于塑料皿中，将待测细胞群体覆盖在基质上30分钟至2小时。温育后，回收不与蛋白粘附的细胞，计数并分析存活性。用胰蛋白酶或细胞解离缓冲液(如Gibco)也回收与多肽粘附的细胞，计数并检测存活性。在某些情况下，例如使用造血细胞集落形成细胞时，将细胞再另外继续培养12-14天以确定细胞的集落形成特征。然后计算粘附细胞的百分比，并与一个标准对照如牛血清白蛋白(BSA)包被的塑料皿进行比较。靶细胞与待测多肽的大量结合提示多肽/细胞组合适用于本发明，并且多肽可与来自纤连蛋白的逆转录病毒结合片段偶联来生产本发明的一种用来增强病毒载体感染靶细胞的构建体。
根据本发明更具体的方面，用来增强逆转录病毒载体转导的病毒结合多肽应包含(i)对应于人纤连蛋白肝素II结合区域的Ala1690-Thr1960的第一氨基酸序列，其代表为通式(Seq.I.D.#1)：
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly
Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val
Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln
Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr
Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala
Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Sys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile
Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg
Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala
Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile
Lys Tyr Glu Sys Pro Gly Sev Pro Pro Arg Glu Val ValPro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr
Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn
Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr；
或能显示与逆转录病毒结合能力的足够相似的氨基酸序列；
和(ii)对应于人纤连蛋白IIICS结合区域的一个部分(CS-1细胞结合区域)的第二氨基酸序列；其代表为通式(Seq.I.D.#2)：
AsD Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His
Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr；
或能显示与造血细胞如初级祖细胞和/或长期种群恢复(干)细胞结合能力的足够相似的氨基酸序列；
正如前面提到的，应当理解在本发明的实践中这些天然序列的某些修饰和/或突变是可能的，只要所产生的氨基酸序列与天然序列足够相似，可以显示与病毒结合的能力(在肝素II结合区域时)和与靶细胞结合的能力(在CS-1区域时)。
例如，含有与肝素结合并显示与纤连蛋白肝素II结合区域具有基本的序列同源性的序列的已知多肽包括，例如胶原蛋白V和成纤维细胞生长因子。如下面实施例16具体证明的，含有这些序列与细胞结合序列如VLA-4和/或VLA-5结合位点相连接的多肽，可以用来增强逆转录病毒介导的DNA转移进与这些细胞结合序列结合的细胞。
本发明的一个方面提供了一种体细胞基因治疗的方法，它包括体外的细胞治疗和随后将靶细胞移植进宿主，后者也称为用转导的靶细胞对宿主进行移植。造血细胞或其它细胞，例如分离自骨髓或外周血的干细胞、脐带干细胞、或其它特征为CD34+和/或C-kit+的细胞，可以使用标准方案从人或其它哺乳动物来源收集。例如，造血细胞可以从人供者的骨髓或外周血或人胎儿脐带血中收集。收集以后，造血细胞可用标准方法选择性地进行处理以从它们中富集干细胞和/或初级祖细胞。然后将造血细胞适当温育，例如在组织培养板上。可任选在此阶段，在逆转录病毒感染前对粘附阴性的低密度单核细胞进行预刺激。本领域所熟知的并在此使用的预刺激指将细胞在接触逆转录病毒前与生长刺激因子接触的过程。这种预刺激已被证明能提高逆转录病毒对造血细胞的转导。
预刺激之后，收集细胞，并按照这里的介绍将其与能提高逆转录病毒细胞转导频率的纤连蛋白或其片段一起温育。优选细胞与纯化的和/或非溶解的如固定的纤连蛋白或纤连蛋白片段一起温育。然后用重组病毒例如含有一个用于在细胞中纠正一个酶或其它蛋白缺失或异常的基因的逆转录病毒，在存在有效量的能提高病毒转导细胞频率的纤连蛋白或纤连蛋白片段的情况下，感染细胞。然后将所获得的转导的造血细胞用传统方法如经静脉导入一个动物细胞移植受体，优选导入一个自身供体，但同时也包括异源移植者，如下面所讨论的，后者特别是在移植使用脐带血细胞的情况下。
本发明的方法可用于包括骨髓紊乱等多种疾病的基因标记或基因治疗方案，骨髓紊乱的疾病包括例如癌症、白血病、涉及蛋白缺失或异常的紊乱，本发明的方法还可用于修饰造血细胞以提高其对其它治疗方案如化疗的抵抗能力的治疗。因而可以利用本发明的代表性的紊乱包括ADA缺失，如ADA缺失性SCID，儿科急性骨髓性白血病(AML)，成神经细胞瘤，和成人AML以及急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，用于细胞移植的细胞获自人脐带血。因此，可以收集人脐带血，富集活的初级造血祖细胞和/或干细胞，例如通过获得一种粘附阴性、低密度、单核的细胞群体的方法来富集。然后可以将这一细胞群体预刺激，并在存在逆转录病毒载体以及固定的和/或纯化的纤连蛋白或纤连蛋白片段的条件下温育，来提高载体对细胞的转导效率。在这点上，我们发现虽然纤连蛋白并不是脐带血中ECM的组成成分，并且虽然来自脐带血的初级祖细胞和干细胞的特征不同于来自骨髓的细胞，但来自脐带血的初级造血细胞和/或干细胞的转导在存在纤连蛋白或纤连蛋白的情况下有很大提高。具体而言，脐带血干细胞的特征是CD34+、HLA-DR+，而来自骨髓的干细胞的特征是CD34+、HLA-DR-。来自脐带血的初级祖细胞在存在纤连蛋白或纤连蛋白片段时能以提高的方式被转导，这个发现使我们能够使用造血细胞的方便和高度干细胞富集的来源。而且，采用初级祖细胞和干细胞富集的同种异体脐血移植物已对大量病人进行了成功的移植，这些证据使脐带血成为造血细胞的非常优选的来源。见Kohli-Kummer等，《BritHeaematol.》85卷，419-422页(1993)；Broxmeyer等，《血细胞》17卷，313-329页(1991)；Gluckman等，《Br.J.Heaematol.》45卷557页(1980)；Heidelberg：Springer-Verlag，60-68页(1989)；Wagner等，《血液》79卷1874-1881(1992)；以及Wagner等，《血液》82-86a(摘要)。
如果需要，可以对收集的转导造血细胞或其它细胞进行转导效率和基因表达的检测。例如，在下面的具体实施例中，本发明提供的逆转录病毒介导的基因转移的明显提高得到了证明，这些实施例介绍了几个实验，这些实验证明在存在纤连蛋白或纤连蛋白的有效片段的条件下逆转录病毒的高感染和基因转移效率。具体而言，用PGK-hADA逆转录病毒感染的鼠造血细胞能表达高水平的转移ADA cDNA。相似地，个别PGK-mADA病毒感染的人祖细胞集落表达的鼠ADA的水平高出内源人ADA蛋白10倍以上。因此，为了严格地分析基因转移效率，祖细胞集落仅在转移mADA的表达等于或大于内源人ADA水平时，才被认为是已被转导。来自TKNEO载体的neo的高水平表达用G418抗性来检测，如同检测新霉素磷酸转移酶(neo基因产物)活性的试验。
如上所述，使用本发明的方法的优点在于没有在存在逆转录病毒生产细胞下协同培养的必要。因此，根据本发明的一个方面，逆转录病毒介导的基因转移可以在除了靶造血细胞或其它细胞以外基本上没有细胞的情况下进行。例如，可以培养含有逆转录病毒载体质粒的生产细胞并收集上清液。然后用含有逆转录病毒的上清液在存在纤连蛋白和/或纤连蛋白片段的情况下感染造血细胞，纤连蛋白和其片段优选为固定形式，例如包被于进行感染的基质或其它与感染基质接触的基质。在这点上，任何能产生高滴度的不含辅助物的逆转录病毒的生产细胞都可以认为适用于本发明。这些细胞包括例如包装细胞如Psi-2、C2、PA12、PA317和GP+envAM12以及其它本领域熟知的其它包装细胞系。
根据本发明的其它特征，可以使用与纤连蛋白肝素II结合区域中的氨基酸结合强的病毒来构建用于在大范围的细胞类型中进行病毒治疗的传递系统。为此，可将含有来自纤连蛋白的逆转录病毒结合区域的多肽共价偶联到任何能使构建体与靶细胞特异性结合的配体上。这种方法将不再需要像以前一样为每一种靶细胞构建特殊的逆转录病毒细胞系(Kasahara，N.，A.M.Dozy，和Y.w.Kan，《科学》266卷，1373-1376页(1994)和Valsesia-Wittmann，S.，A.Drynda，G.Deleage，M.Aumailley，J.M.Heard，O.Danos，G.Verdier，和F.L.Cosset，《病毒学杂志》68卷，4609-4619页(1994))。靶向构建物的特异性可以用配体来提供，这样的配体包括例如1)细胞粘附蛋白，2)激素或细胞因子，3)针对靶细胞的单克隆抗体，4)与靶细胞结合的碳水化合物(G.Ashwell等，《生物化学年评》51卷，531-554页(1982))，5)靶细胞的代谢产物，或6)与靶细胞结合的功能肽。构建体基因传递的效率可以用包含几个肝素II病毒结合区域从而增加病毒颗粒传递入靶细胞的量来提高。例如，如美国专利号5,198,423的介绍，对应于Pro1239-Ser1515的人纤连蛋白的细胞结合区域已显示与细胞包括BHK和B16-F10细胞(Kimizuka等，《生物化学杂志》110卷，285-291页(1991))结合。此外，肝素II区域自身已显示与成纤维细胞、内皮细胞和肿瘤细胞结合。这些多肽序列可与来自纤连蛋白的逆转录病毒结合区域偶联，从而靶向预先确定的逆转录病毒感染的细胞。
造血系统中的应用举例还包括红细胞生成素或G-CSF与纤连蛋白的逆转录病毒结合区域偶联的构建体，这两种构建体分别用来高度特异地靶向红细胞和粒细胞前体细胞。根据本发明的另一个普通应用是将一个或多个逆转录病毒结合区域与一个特异性或优先与恶性细胞结合的配体组合。例如，已经发现体外甚至体内的乳腺癌细胞的生长可用与靶细胞上的受体结合的物质如促黄体生成激素释放因子衍生物进行影响，Emons，G.等，《Hum.Reprod》9卷1364-1379(1994)，雌激素，Tolcher，A.W.，《肿瘤学》8卷，39-43页(1994)，或抗雌激素抗体，Howell，A.等，《柳页刀》345卷，29-30页(1995)，孕激素或抗孕激素抗体，Klijn.F.G.等，《Hum.Reprod》9卷增刊1，181-189页(1994)：Griffiths，K.等《Semin.Oncol.》21卷，672-681页(1994)，这些物质在本发明的含有一个或多个来自纤连蛋白的病毒结合区域的构建体中作为配体。进一步的例子是，使用含有Jodid的构建体可以高特异性地靶向甲状腺(癌)细胞，而使用含有HDL或其部分的构建体可以靶向肝(癌)细胞。最后，含有单克隆抗体和纤连蛋白的逆转录病毒结合区域的构建体可以用来靶向抗体针对的任何细胞和器官。因此大范围的哺乳动物细胞种类可以通过利用纤连蛋白的逆转录病毒结合区域的病毒载体结合和定位能力而被靶向作用。
相应地，本发明的另一个优选实施方案涉及能用于增强病毒转导靶细胞的构建体的制备。纤连蛋白肝素II结合区域的病毒结合氨基酸序列与靶细胞结合的配体偶联。如上文所讨论的，配体可以是，例如，来自纤连蛋白或其它蛋白(包括细胞粘附蛋白，如层粘连蛋白、胶原蛋白、玻连蛋白、骨桥蛋白或血小板反应蛋白)的一个多肽、一种激素、一种代谢产物、一种抗体(包括单克隆抗体)、或其它任何显示与靶细胞结合能力优选是特异性的结合能力的配体。所获得的完整构建体可以固定的形式以与下面实施例中具体列出的纤连蛋白多肽的类似方式进行使用。
这种构建体和细胞靶向方法可以按上面的讨论用于体外，也可以在考虑多种因素如构建体的稳定性与特异性和在生理条件下逆转录病毒构建体的相互作用的情况下，用于体内逆转录病毒定向。特异性也可以通过修饰传递系统来使构建体的传递定位于靶细胞来予以提高，例如用门静脉插入导管来定向肝细胞。
本发明的另一个方面涉及这样一个发现，本发明的转导过程涉及病毒与细胞的协同定位，它在没有或基本上没有溴化己二甲铵的情况下进行时更有优势。溴化己二甲铵(商业名为Polybrene)是聚阳离子物质，广泛用于逆转录病毒介导的基因转移方案，其使用目的是提高逆转录病毒的转导效率。但是，已经发现在协同定位增强基因转移的方案如这里介绍的方案中，溴化己二甲铵的存在明显降低转导效率。因此，本发明的改进方法在至少基本上没有溴化己二甲铵(即含有不超过1ug/ml的溴化己二甲铵)的基质中进行，并更优选在没有溴化己二甲铵的基质中进行。这样的方法提供本发明的优选细胞组合物，此组合物基本上包含逆转录病毒转导的活细胞群体，在此细胞群体中基本上没有逆转录病毒生产细胞和溴化己二甲铵。在这点上，这里所用的基本上转导的活细胞群体的意思是群体中至少约20％的细胞已被逆转录病毒转导。更优选的细胞群体含有至少约50％的转导细胞，最优选至少75％的转导细胞。根据本发明的这个方面的优选细胞组合物将包括造血细胞，并更优选包括对初级祖细胞和干细胞进行了富集的造血细胞群体。一般说来，本发明的优越方法因此可以在没有聚阳离子或其它试剂的情况下进行，这些试剂在相应的逆转录病毒感染方案(如协同培养)中没有用来协同定位的纤连蛋白片段或其它物质时可导致转导效率的提高，但在存在用来协同定位的物质时却降低转导效率。
据信使用特别设计来应用本发明的方法的试剂盒将能很方便地进行逆转录病毒介导的DNA转移。相应地，本发明的另一个方面提供试剂盒，这种试剂盒包括一定量的基本上纯净的上文所讨论的能增强逆转录病毒转导靶细胞的多肽或构建体，以及一种逆转录病毒在其上进行感染的人工基质。多肽或其它构建体可以单独提供或包被于人工基质上提供。在用于人造血细胞的感染方案时，试剂盒还包括用于细胞预刺激的造血细胞生长因子。此外，试剂盒可包含如上文讨论的用于转导的重组逆转录病毒载体。一般说来，试剂盒将包含无菌的包装，在包装中这些不同的试剂盒成分相互之间有足够的空间以防止在试剂盒操作中打破组分。例如，普通的方法是使用含有多个使试剂盒组分相互分开的小室或空间的塑料铸型物。
为了进一步了解和理解本发明，我们提供了下面的具体实施例。应当理解这些实施例在本质上是说明性的而不是限制性的。
实施例1
使用TKNEO将基因转移进骨髓细胞
1.1.病毒上清液的制备
含逆转录病毒质粒TKNEO载体的GP+EnvAM 12生产细胞(见Markowitz等(1988)《病毒学》167卷，400页)培养于Iscove’s改良Dulbeccos培养基(IMDM，Gibco，Gaithersburg，MD)中，培养基含有10％胎牛血清(FCS，Hyclone，Logan，UT)和100单位/ml青霉素以及100微克/ml链霉素(P/S，均来自Cibco)。加入10ml含20％FCS的IMDM至汇合的培养板中过夜，收集含有病毒的上清液。收集的培养液过0.45微米滤器(Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)，贮存于-80℃备用。
1.2.纤连蛋白片段的制备
FN由人血浆(Lifesource，Glenview，IL)中纯化，方法如Ruoslahti等，《酶学方法》82卷，803-831页(1982)所述，但在以4M尿素洗脱FN前用1M尿素洗明胶-琼脂糖柱。纯化的FN于4℃对10mM 3-(环己氨基)-1-丙烷-磺酸(CAPS)、150mM NaCl、2mM CaCl2、pH11.0充分透析，分成小份贮存于-80℃。FN的胰凝乳蛋白酶样细胞(Chymotrypticcell)结合区(CBD)(CS-1)和肝素-II结合片段如前所述进行纯化(Ruoslahti等(1982)，上文，Patel和Lodish，《细胞生物学杂志》，102卷，449-456页(1986)及Bernardi等，《细胞生物学杂志》，105卷489-498页(1987)。三个主要的肝素结合片段(30KD、35KD及42KD)由肝素-琼脂糖柱的1M NaCl洗脱物中获得。为了进一步纯化这些肝素-结合片段，将1M NaCl洗脱物于4℃对10 mM Tris-HCl，pH7.0透析过夜，并过已用10 mM Tris-HCl pH7.0平衡的阴离子交换柱(2ml DEAEsepharose fast flow (Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)/mg蛋白质)。30/35 KD片段由未结合级份收集，而42KD片段以100mM NaCl由柱中洗脱。由500mg FN获得了大约26mg的30/35KD片段和4mg的42KD片段。通过蛋白质印迹法确定，42KD片段而非30/35KD片段被抗血纤蛋白结合区的抗体识别。并且，42KD片段结合血纤蛋白-琼脂糖亲和柱。
为用于感染方案，如Patel和Lodish(1986)上文所述，将纤连蛋白片段以75pmol/cm2的浓度固定于35或100mm培养皿(Falcon，Lincoln Park，NJ)。对照培养板采用类似方式以2％(无FN)牛血清白蛋白(BSA，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)包被。
1.3.逆转录病毒感染方案
根据Indiana大学医学院Institutional Review Board证实的方案，将来自健康成年供者的骨髓样品收集于含有无菌、无防腐剂的硫酸钠肝素的试管中。25℃下在Ficoll-Hypaque(密度1.077g/ml，Pharmacia，Piscataway，NJ)中离心45分钟制备低密度单核细胞。37℃、5％ CO2下在组织培养板上于含2％ FCS的IMDM中进一步温育4-16小时，由低密度骨髓细胞中除去塑料粘附细胞。
如Luskey等(1992)《血液》80卷，396页所述进行逆转录病毒感染之前，将粘附阴性低密度单核细胞在37℃和5％CO2下于含下列成分的IMDM中预刺激48小时：20％FCS、100U/ml rhIL-6、100ng/mlrhSCF(均购自Amgen，Thousand Oaks，CA)和P/S，预刺激在培养皿中进行，细胞密度为1×106细胞/ml。用移液器剧烈冲击培养皿除去与塑料粘附较松的细胞，收集预刺激细胞。
预刺激细胞(5×105细胞/ml)于BSA(对照)或纤连蛋白或纤连蛋白片段(以UV辐射处理以提高蛋白对塑料板的粘附)包被的板上温育6小时，随后在生长因子(同上)和7.5微克/ml polybrene(Aldrich Chemical，Milwaukee，WI)存在下以病毒上清液感染。2小时后置换病毒上清液(包括生长因子和5.0微克/ml Polybrene)，细胞再温育12到24小时。每次更换培养基时均再加入非粘附细胞。
感染方案后，倒去非粘附细胞，粘附造血细胞使用细胞分离缓冲液(CDB)(不含酶/基于PBS，Gibco)按照厂商说明由培养液中收集。将粘附细胞加入至非粘附级份，洗两次并计数。收集的细胞在克隆形成甲基纤维素祖细胞试验或长期骨髓培养物中铺板。
1.4.长期骨髓培养物
对以前介绍的方法稍作调整进行LTC-IC(人干细胞)试验。Sutherland等，《血液》74卷，1563页(1989)。简而言之，0.5-1×106感染细胞接种于长期骨髓培养物(LTMC)，骨髓培养物之下为汇合、预先辐射处理(同上)的异源人骨髓成纤维细胞(BMF)，该培养物生长于5ml含有下列成分的IMDM：10％FCS、10％马血清(Sigma)和P/S、1×10-5M氢化可的松(Upjohn，Kalamazoo，MI)和320mosmol氯化钠，用6孔组织培养板(Costar，Cambridge，MA)培养。LTMC于33℃、5％CO2下温育，每周移去50％培养基和非粘附细胞进行饲喂。五周后，使用CDB由BMF中除去粘附造血细胞使LTC-IC培养物死亡。合并非粘附和粘附造血细胞，并铺于甲基纤维素中以得到LTC-IC来源的集落。
1.5.克隆形成甲基纤维素试验
对Toksoz等《美国国家科学院院刊》89卷，7350页(1992)所述方法稍作调整进行甲基纤维素试验。简而言之，2-5×104感染的成人骨髓细胞与1ml 2.4％IMDM甲基纤维素(Fluka，Ronkonkoma，NY)中的5单位/ml红细胞生成素(Epo，Amgen)、100ng/ml rhSCF、10ng/mlrhIL-3(Genzyme，Cambridge，MA)铺板，IMDM纤维素中含有25％FCS、10％人血浆、10-5M β-巯基乙醇(Sigma)和P/S。培养物于37℃、5％CO2/95％空气下温育，第13天在倒置显微镜下观察来对集落(＞50细胞)按照CFU-GM(含粒细胞和巨噬细胞)、CFU-Mix(含骨髓和红细胞成分)或BFU-E(只含红细胞成分)进行记录。
1.6.逆转录病毒感染的分析
TKNEO病毒的感染效率通过在第13天确定抗1.5mg/ml(干粉，Gibco)G418的甲基纤维素集落的百分比进行分析。在每一试验中将骨髓温育于不产生重组病毒的GP+Env AM 12包装细胞系进行模拟感染。将这些模拟感染细胞与1.5mg/ml G418一起培养始终证明，背景集落＜1％。
1.7.基因转移进定向祖细胞的效率
通过对铺于30/35 FN或BSA包被的培养皿上的骨髓细胞进行感染比较了感染效率。在这些条件下没有选择的感染之后得到的集落数目未见差异。图2示出感染后G418r集落的百分比。在30/35 FN上各种类型的祖细胞，包括来自谱系限制(BFU-E和CFU-GM)以及宽谱系(CFU-Mix)祖细胞的祖细胞均可见到较高百分比的G418r集落。在30/35 FN上感染所有定向祖细胞均较在BSA上高出9倍。
1.8.基因转移进长期培养起始细胞的效率
用TKNEO载体对基因转移进LTC-IC进行了评价，基因转移进LTC-IC衍生集落只在于30/35 FN上进行感染后检测到(30/35FN，16％G418r集落；BSA，0％G418r集落)。
1.9.30/35 FN对造血细胞感染效率影响的特异性
为确定30/35 FN上见到的提高的基因转移效率的特异性，在以BSA、30/35 FN、完整纤连蛋白、含有包括RGDS四肽序列的中央细胞结合区(CBD)的115 kd FN片段和特征性具有肝素-II结合区但缺少CS-1序列(图1)的42 KD C-末端FN片段(42 KD)包被的培养板上进行TKNEO感染。BSA感染产生3±1％的G418r BFU-E、1±1％的G418rCFU-GM和0±0％的G418r CFU-Mix。CBD上的G418r集落比例未见明显增加，而42 FN上可见BFU-E感染略有升高(6.0±-1％)(图3)。但是，完整FN促进基因转移进所有定向祖细胞的升高。在完整FN上进行感染后G418r集落百分比少于在30/35 FN上进行感染后的百分比，这见于所有谱系，包括BFU-E(16±-2％对24±4％)、CFU-GM(5±2％对20±4％)和CFU-Mix(6±1对9±1)，(分别为完整FN对30/35FN)。
实施例2
使用PGK-mADA将基因转移进骨髓细胞
2.1.通用方案
PGK-mADA病毒上清液的制备如实施例1制备TKNEO所述。纤连蛋白的胰凝乳蛋白酶样(chymotryptic)片段(图1)如实施例1所述制备，逆转录病毒感染方案亦如实施例1。LTC-IC(人干细胞)试验和甲基纤维素实验根据实施例1进行。
2.2.逆转录病毒感染的分析
PGK-mADA载体感染的效率通过使用ADA同工酶电泳进行蛋白分析确定。单个祖细胞集落的分析如Moritz(1993)和Lim等(1989)《美国国家科学院院刊》86卷，8892页所述进行。为严格分析转移效率，只有mADA表达水平等于或高于内源人ADA的集落被认为是已转导的。为分析合并的集落，由甲基纤维素培养物挑出的集落在1.5ml微量离心管(Rainin，Woburn，MA)中合并，用温热的培养基和磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，离心并贮存于-20°。进行ADA分析时，细胞在5ul裂解缓冲液中反复冻融进行裂解，并如前所述进行同工酶电泳。
2.3.基因转移进定向祖细胞的效率
通过对铺于30/35FN或BSA包被的平皿上的骨髓细胞进行感染比较转导效率。在这些条件下进行无选择感染之后得到的集落数目未见差异。如表l所示，相对于BSA，在30/35 FN上感染所有定向祖细胞的效率基本上均有提高。如以高滴度(~1×107病毒颗粒/ml)感染时预期的那样，定向祖细胞的转导效率极高。参看表I，在30/35 FN上以PGK-mADA感染骨髓的两个独立试验均获得了将近100％的定向祖细胞转导。
表1
在纤连蛋白30/35片段上使用PGK-mADA载体感染人定向祖细胞的效率
    试验     BSA     30/35FN
    试验1     1/18*     13/14
    试验2     2/13     12/13
*表达mADA的集落数目/分析的集落总数
2.4.基因转移进长期培养起始细胞的效率
在以PGK-mADA进行的4个独立试验中，相当部分的来自5周龄LTMC(即LTC-IC衍生集落)的祖细胞集落表达转移的鼠ADA基因。在分析的集落中表达从2/12(17％)到6/6(100％)(表2)。在所有被认为是阳性的集落中，导入的mADA基因的表达超过或至少等于内源人ADA活性量。PGK-mADA的感染效率高于TKNEO。如表2所示，在30/35FN上的PGK-mADA感染骨髓的两个独立试验均获得了将近100％的定向祖细胞转导。
表2
使用PGK-mADA载体感染人长期培养起始细胞(LTC-IC)的效率
    试验     BSA     30/35FN
    试验1     0/14*     10/19
    试验2     N/A     2/12
    试验3     0/4     3/5
    试验4     1/4     6/6
    总计     0/22     21/42
*mADA阳性集落的数目/分析的集落数目
N/A：未分析
2.5.30/35 FN对造血细胞感染效率影响的特异性
在30/35 FN上基因转移进LTC-IC的效率增加。由于这些次级LTC-IC衍生集落的大小相对较小，在单个集落上进行蛋白质分析的能力有限。在BSA、完整纤连蛋白和42 FN上以PGK-mADA感染之后，分别有0/6、0/4和0/3 LTC-IC衍生集落表达鼠ADA，而在30/35FN上有3/5的LTC-IC衍生集落表达mADA。另外，在另两个试验中，分析前合并多个LTC-IC衍生集落，鼠ADA表达仅在30/35 FN上进行感染后检测到，在完整FN上感染后表达较低，但在42 FN或BSA上感染后未见表达。
实施例3
使用PGK-hADA将基因转移进骨髓细胞
3.1.通用方案
PGK-hADA病毒上清液制备如实施例1制备TKNEO所述。纤连蛋白的胰凝乳蛋白酶样片段(图1)如实施例1所述制备，逆转录病毒感染方案亦如实施例1。LTC-IC和甲基纤维素试验如实施例1所述进行。
3.2.逆转录病毒感染的分析
为分析合并的集落，由甲基纤维素培养物挑出的集落在1.5ml微量离心管(Rainin，Woburn，MA)中合并，用温热的培养基和PBS洗涤，离心并贮存于-20℃。进行ADA分析时，将细胞在5ul裂解缓冲液中反复冻融以使其裂解，并如前所述进行同工酶电泳。
实施例4
使用TKNEO将基因转移进脐带血细胞
4.1.通用方案
TKNEO病毒上清液和纤连蛋白胰凝乳蛋白酶样片段(图1)的制备如前面实施例1所述。逆转录病毒感染方案如实施例1，不同之处是根据Indiana大学医学院Institutional Review Board证实的方案将来自正常、足月的新生儿的脐带血收集于含有肝素的试管中，并用之代替骨髓细胞。LTC-IC(人干细胞)和甲基纤维素试验根据实施例1进行。
4.2.基因转移进定向祖细胞的效率
在三个独立试验中，在FN30/35上的感染较BSA提高了四倍(表3)
表3
使用30/35 FN片段和TKNEO载体感染脐带血祖细胞的效率
    BSA     12±17
    30/35     55±16
实施例5
使用PGK-mADA将基因转移进脐带血细胞
5.1.通用方案
PGK-mADA病毒上清液和纤连蛋白的胰凝乳蛋白酶样片段(图1)的制备如前面实施例1所述。逆转录病毒感染方案如实施例1，不同之处是根据Indiana大学医学院Institutional Review Board证实的方案将来自正常、足月的新生儿的脐带血收集于含有肝素的试管中。LTC-IC和甲基纤维素试验根据实施例1进行。
5.2.基因转移进长期培养起始细胞的效率
使用高滴度PGK-mADA载体，对LTC-IC衍生集落的分析表明，引入的mADA cDNA的高水平表达仅见于在FN 30/35上使用上清液感染的脐带血建立的培养物。在BSA对照板上感染的LTC-IC衍生集落仅检测到极低的mADA表达。
实施例4和实施例5列出的结果证实使用FN 30/35时提高的感染效率在使用脐带血祖细胞和干细胞时也可得到。
实施例6
使用PGK-hADA将基因转移进脐带血细胞
PGK-hADA病毒上清液和纤连蛋白的胰凝乳蛋白酶样片段(图1)的制备如实施例1 TKNEO的制备所述。逆转录病毒感染方案如实施例1，不同之处是根据Indiana大学医学院Institutional Review Board证实的方案将来自正常、足月的新生儿的脐带血收集于含有肝素的试管中，并用之代替骨髓细胞。LTC-IC和甲基纤维素试验根据实施例1进行。
实施例7-11
实施例7-11中的逆转录病毒载体和生产细胞系
实施例7-11中使用两种逆转录病毒-生产包装细胞系：分别为亲嗜性GP+E86(Markowitz，D，S.Goff和A.Bank，《病毒学杂志》62卷，1120-1124页(1988)和兼嗜性GP+envAM12细胞系(Markowitz，D，S.Goff和A.Bank，《病毒学》167卷，400-406页(1988)。此处所述的研究中所用的逆转录病毒载体和生产克隆列于表4。
表4
    载体     生产者/克隆 表达的cDNA
    PGK-hADA     GP+E86/EPHA-5 人ADA
    PM5neo     GP+E86/EAL2a 新霉素磷酸转移酶，LAC-Z
    TKneo     GP+E86/TKNeo 新霉素磷酸转移酶
    PGK-mADA   GP+EnvAM12/55/6     鼠ADA
所有细胞系均培养于Dulbecco’s改良Eagles培养基(DME，Gibco，Grand Island，NY)，其中含有10％胎牛血清(FCS，Hyclone，Logan，UT)、100单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素(P/S，均来自Gibco)，但EAL2a细胞生长于含有10％FCS加上P/S的DME-F12(Gibco)。对鼠细胞，加入10ml含有10％FCS加上P/S的α-基本必需培养基(α-MEM Gibco)至汇合的10cm培养板中过夜，人细胞则加入10ml含有10％FCS加上P/S的Iscove’s Dulbecco培养基(IMDM，Gibco)至汇合的10cm培养板中过夜，从而收集含有病毒的上清液。获得的培养基通过0.45微米滤器(Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)过滤，并贮存于-80℃备用。
实施例7
鼠初级造血细胞的转导
7.1.试验
使用鼠细胞研究时，使用150mg/kg 5-氟尿嘧啶(SoloPackLaboratories，Franklin Park，IC)之后两天由6到8周龄C3H/HeJ小鼠股骨和胫骨取骨髓(Lim，B.，J.F.Apperl ey，S.H.Orkin，及D.A.Williams《美国国家科学院院刊》86卷，8892-8896页(1989))。细胞在IMDM/20％FCS加上P/S中以5×105细胞/ml的浓度采用100ng/ml大鼠重组干细胞因子(rrSCF；Amgen，Thousands Oaks，CA)和100单位/ml重组人白介素-6(rhIL-6；Pepro Tech Inc.，Rock Hill，NJ)预刺激48小时(Luskey，B.D.，M.Rosenblatt，K.Zsebo和D.A.Williams，《血液》80卷，396-402页(1992))。随后，由EPHA-5生产细胞产生的PGK-hADA载体的基因转移效率使用三种不同的感染方案进行比较：1)上清液感染；2)在FN30/35上进行上清液感染；3)在EPHA-5生产细胞中协同培养。因此，100mm细菌培养皿以溶解于5ml磷酸缓冲盐水(PBS；Gibco)中的FN30/35按2.5ug/cm2(等于75pmol/em2)进行包被，在紫外光下打开培养皿盖室温放置1小时，盖上培养皿盖再放置1小时。以2％牛血清白蛋白(BSA，Fraction V；Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)在室温下封闭30分钟后，培养皿用补加有2.5％(v/v)1M Hepes的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)(均来自Gibco)洗一次。上清液感染时，培养皿仅以BSA包被。5×106预刺激的供者细胞与补加有100U/mlrhIL-6、100ng/ml hrSCF和7.5ug/ml Polybrene的如上所述获自EPHA-5细胞的病毒上清液10ml一起温育。收集非粘附细胞，并再加入新鲜的病毒上清液。协同培养时，4ml培养基中的EPHA-5细胞与10ug/ml丝裂霉素C于37℃温育2小时，洗涤，胰酶消化，并以3×106细胞的浓度接种于装有10mlαMEM/20％FCS加P/S的100mm组织培养皿中。第二天，加入用100U/ml rhIL-6、100ng/ml hrSCF和4ug/ml Polybrene预刺激的5×106骨髓细胞，培养48小时。感染后，弃去非粘附细胞，粘附造血细胞使用细胞分离缓冲液(CBD)(不含酶/基于PBS，Gibco)按照厂商说明由培养物中收集，将粘附细胞加入至非粘附级份中，洗涤两次，悬浮于大约1ml HBSS/Hepes。由5×106预刺激细胞得到的全部细胞注射入三只受体小鼠的尾静脉，这些小鼠已经接受了致死量的全身辐射处理(700加400cGy，137Cs源)(Lusky，B.D.，M.Rosenblatt，K.Zsebo及D.A.Williams《血液》80卷，396-402页(1992))。造血干细胞的转导通过检查重建小鼠中引入的人ADA cDNA的表达进行分析。在移植小鼠中进行这种ADA同工酶分析的方法如下：通过乙酸纤维素原位酶分析检查外周血细胞中是否存在hADA蛋白(Lim，B.，D.A.Williams和S.H.Orkin《分子细胞生物学》7卷3459-3465页(1987))。移植后4个月开始进行检查，以后每月重复。
7.2.结果
用经遗传操作的造血干细胞进行的小鼠长期骨髓重建通常被认为足以在移植后4个月确定干细胞转导的效率。7个月后通过同工酶分析进行的转导骨髓的受体分析提示：1)人ADA cDNA表达见于使用协同培养或在FN30/35上的上清液感染的组别中，但在无FN30/35的上清液感染后的移植组别中不存在；和2)协同培养组和FN30/35组的表达水平相当。如图4泳道2-4所示，移植了通过在EPHA-5细胞上的协同培养而转导的骨髓的三只小鼠可见容易检测到的人ADA。类似水平的人ADA在三只移植了通过FN30/35上清液感染转导的造血细胞的小鼠中也可以检测到(图4，泳道5-7)。相形之下，在三只移植了通过在BSA上的上清液感染转导的造血细胞的小鼠中检测不到人ADA(图4，泳道8-10)。确定人ADA位置的对照示于图4的泳道1和12，泳道11为小鼠ADA。泳道2-10中小鼠的条带表明上样的蛋白量相同。这些数据表明通过FN30/35上的上清液感染的长期重建造血干细胞的转导与协同培养等效，而远胜于无FN30/35的上清液感染。
实施例8
通过逆转录病毒载体结合FN30/35提高转导的机制
8.1.试验
为测试提高的转导是否为病毒和造血细胞的协同定位的结果，我们对重组病毒颗粒是否结合FN30/35进行了分析。因此，FN30/35包被的培养板与含TKNeo病毒的上清液预温育30分钟，然后充分洗涤。上清液的病毒滴度使用NIH3/3T3细胞根据标准方案测定(Markowitz，D.，S.Goff和A.Bank《病毒学杂志》62卷1120-1124页(1988))。简而言之，3T3细胞以1000细胞/孔的浓度铺于6孔组织培养板上并生长过夜。病毒上清液的系列稀释液和7.5u/ml polybrene加至各孔，并于37℃温育2.5小时，随后加入2ml培养基。24小时后，将培养基换成含G418(0.75mg/ml，干粉，Gibco)的培养基，培养板温育10-12天。10-12天后将G418抗性集落(G418r)染色并计数。集落数/孔乘以病毒上清液稀释度作为上清液的感染性颗粒(cfu)/ml。我们评价/“滴定”了如下处理后FN30/35或BSA包被的35mm培养板上残余的病毒颗粒数量：培养板与病毒上清液预温育。随后每个35mm细菌学培养皿中加入1000NIH/3T3细胞和Polybrene充分洗涤。24小时后，加入含有0.75mg/mlG418(干粉)的培养基，将细胞再温育10-12天。温育之后，即可通过计数G418抗性NIH/3T3集落而对存在的粘附病毒进行定量。
为评价病毒结合FN30/35是否以剂量依赖方式发生，以浓度增加的FN30/35包被培养皿重复上述试验。因此，35mm细菌学培养皿如上所述以1、4、10和20ug/cm2 FN30/35包被。预先滴定为1×104感染性病毒颗粒/ml的TKNeo病毒原液的1∶50稀释液在FN30/35包被的板上温育30分钟。充分洗涤后，2000 NIH/3T3细胞加入至各孔中。如上所述进行选择，选择后10天对G418抗性NIH/3T3集落进行计数。
8.2.结果
图5列出了三个代表性试验中一个的结果，使用TKNeo上清液，在BSA包被的平板上，通过NIH/3T3细胞中的G418r集落测定的逆转录病毒效价降低了3个Log(4×103到0)以上，而在30/35 FN包被的平板上仅降低了1Log。这些数据表明逆转录病毒定量结合FN 30/35，但不结合BSA包被的培养皿(对照培养皿)。图6显示，当含病毒的上清液在用浓度提高的FN30/35包被的平板上温育时，检测到了数目增加的G418抗性集落。因此，病毒结合FN30/35是以剂量依赖方式进行的。
实施例9
病毒结合重组纤连蛋白片段
9.1.试验
Kimizuka等已经报道了克隆的FN DNA序列在大肠杆菌中的表达(Kimizuka，F.，Y.Taguchi，Y.Ohdate，Y.Kawase，T.Shimojo，D.Hashino，I.Kato，K.Sekiguchi和K.Titani《生物化学杂志》110卷，284-291页(1991))。克隆肽和嵌合肽包括纤连蛋白中已知参与细胞粘附的一个或几个重要序列的组合(包括RGDS、CS-1和肝素结合位点)，见图7。为分析逆转录病毒是否能结合这些重组FN片段，在以重组片段C-274、H-271、H-296、CH-271、CH-296和C-CS1包被的平板上重复3T3细胞集落形成试验，FN30/35作为阳性对照，采用具有1×104感染性病毒颗粒/ml的逆转录病毒TKNeo冷冻原液的两个不同稀释度(1∶10和1∶100)。FN片段的使用浓度为120-130pmol/cm2(等于4ug/cm2C-274、H-271、H-296、C-CS1、FN30/35和8ug/cm2 CH-271和CH-296)。简而言之，包被平板，加入病毒，充分洗涤平板，加入NIH/3T3细胞24小时，随后于选择培养基中生长10天，接着将集落染色并计数。
9.2.结果
图8表明使用片段H-271、H-296、CH-291和CH296时G418抗性集落的数量(并因此病毒粘附)增加。并且，尽管在该试验中CH-271片段表现出最高水平的病毒粘附，但在这些重组片段和FN30/35之间病毒粘附的数量大体相当。所有这5个FN片段中共同的是III型重复12-14，其中含有可能位于重复13(Kimizuka，F.，Y.Taguchi，Y.Ohdate，Y.Kawase，T.Shimojo，K.Hashino，I.Kato，K.Sekiguchi和K.Titani《生物化学杂志》110卷，284-291页(1991))的高亲和力肝素结合位点(Ruoslahti，E.，《生物化学年评》57卷，375-413页(1988)和Kimizuka，F.，Y.Taguchi，Y.Ohdate，Y.Kawase，T.Shimojo，K.Hashino，I.Kato，K.Seki guchi和K.Titani《生物化学杂志》110卷，284-291页(1991))。这表明病毒结合是通过该已知的粘附位点进行的。这可通过将4ug/cm2 CH-271包被的培养皿与浓度增加(10-1000ug/ml)的硫酸肝素一起温育证实，硫酸肝素为带大量电荷的分子，已知其抑制细胞结合肝素结合位点。由图9可见，CH-271与浓度增加的硫酸肝素预温育之后G418抗性集落的数目减少。这些数据表明病毒结合FN是通过位于FN羧基末端区域中紧靠CS-1位点的高亲和力肝素结合位点介导的。
实施例10
造血细胞在重组纤连蛋白片段上的转导
10.1试验
为分析前文所述的在FN30/35上造血细胞的转导增加是否见于重组FN片段，我们使用高增殖潜能-集落形成细胞(HPP-CFC)试验评价了体外上清液感染的转导效率。通过使用EAL2a载体，我们比较了各种重组FN片段与FN30/35在BSA上的上清液感染对造血细胞转导的影响，使用G418抗性集落的生长作为基因转移的指标。并且，我们比较了已粘附于FN片段的病毒颗粒(对上清液中的病毒)转导造血细胞的能力。0.5-1×106预刺激的骨髓细胞在1-2ml含EAL2a病毒的上清液中于35mmFN包被的培养皿中如上所述与生长因子和5ug/ml Polybrene温育。为评价结合于FN片段上的病毒对造血细胞的转导，与含有病毒的上清液温育过的35mmFN包被的培养皿以PBS洗涤三次，每次2ml随后，加入补加有生长因子和Polybrene的2ml培养基中的0.5-1×106预刺激过的骨髓细胞。22小时后，收获细胞并按介绍在有或无1.5mg/ml G418时在HPP-CFC试验中铺板，(Bradley，T.R.和D.Metcalf，Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.，44：287-293(1966))。培养物在7％CO2、33℃下温育14天，根据G418抗性集落百分比计算基因转移效率。
10.2.结果
对所有包括肝素结合位点(HBS)和至少另一个活性细胞粘附位点的片段(实心长方体)来说，初级造血细胞通过上清液感染的转导(图10)显著高于BSA上的上清液感染。重组片段CH-271、H-296、CH-296和C-CS1的转导效率类似于FN30/35的效果，所有包括肝素结合位点和CS-1位点两者的三个片段。在所有其它情况下，转导大幅度减低。这些数据表明原来在FN30/35上所见的初级造血细胞的转导增加在重组FN片段上可重现。这进一步证实直接结合于纤连蛋白的病毒能够遗传转导造血细胞。最后它还证实存在CS-1和肝素结合两个位点对转导初级造血前体(干)细胞的用途。
实施例11
使用重组纤连蛋白片段上的鼠供体细胞转导的小鼠长期骨髓重建
11.1试验
我们重复了上述初级造血祖细胞体外试验(自实施例10)，比较了在下列物质上的上清液感染：BSA对FN 30/35对重组FN片段对协同培养，使用骨髓移植来分析它们对重建造血干细胞的影响。简而言之，给经过致死辐射的小鼠注射已经用含有人ADA cDNA的EPHA-5载体转导的供体细胞。1个月后和大约6个月后，取外周血进行ADA同工酶试验来分析基因转移效率。
11.2结果
图11显示了1个月后的结果，并清楚地显示，含有肝素结合位点和CS-1两种位点的纤连蛋白片段H-296产生与FN30/35和协同培养相似的结果。不同时含有这两个位点的片段在转导可移植造血细胞时，效率要低一些。这些数据表明，与同时含有CS-1和肝素结合位点的重组FN片段结合的初级造血/干细胞和逆转录病毒的协同定位能有效地转导可移植的造血细胞。
图12显示了移植后4和6个月的结果。在此时间点，在用对照平板上转导的细胞或在仅含有CBD(C-271)或III12-24(H-271)的片段上转导的细胞移植的动物中，没有发现种群恢复的造血干细胞的遗传转导。在C-CS1片段上所见的HSCs遗传转导的频率较低，在此情况下1/3的动物为人蛋白阳性。基因转移进体内种群恢复干细胞在含有HBD与CBD(CH-271)或CS1(H-296)的组合的片段上总能发现。在含有所有三个细胞结合位点的片段(CH-296)上的转导最有效的，比得上靶细胞生产细胞系的协同培养。这些数据显示，含有III12-14以及VLA-4和/或VLA-5的结合位点的纤连蛋白片段能使逆转录病毒介导的基因转移进鼠造血祖细胞和干细胞提高。
实施例12
纤连蛋白通过至少三个位点指导细胞粘附(图13)：细胞结合区域(CBD)，它经整联蛋白VLA-5包含重复10的四肽RGDS；肝素结合区域，它经细胞表面蛋白聚糖分子位于III型重复12-14(III12-14)中；和CS1序列，它经整联蛋白VLA-4位于可变剪接的IIICS区域。在这些研究中，我们使用了图13中所示的六种嵌合重组FN片段，这些片段在肽中单独或组合含有上述细胞粘附位点。
FN包被的细菌培养皿与200cfu在来自兼嗜性包装细胞系TKNeo的2ml上清液(SN)中温育。37℃下30分钟后，培养皿用PBS洗涤三次，然后加入2000 NIH/3T3细胞(成纤维细胞)，该细胞在2ml补加有10％牛血清(CS；Sigma，U.S.A.)和2％P/S的DMEM中。第二天，将细胞置于含有0.75mg/ml G418的选择培养基中。8-10天后，培养皿用StatStain(Volu-Sol，U.S.A.)染色，并对G418r集落计数。在此试验中，逆转录病毒不与没有包被的或BSA包被的板结合。如图14所示，基因转移进NIH/3T3仅发生在含有肝素II结合区域的片段上，该区域在此也被称作“III12-14”(H-271、CH-271、H-296、CH-296)。这些数据表明逆转录病毒颗粒直接与纤连蛋白的III12-14重复中的序列结合。在含有III12-14和CBD两者的FN片段上的NIH/3T3细胞感染明显比只含III12-14的FN片段上高(H-271与CH-271相比)。值得注意的是，由加入量仅为200 NEO cfu/板可产生高达80个G418r NIH/3T3集落/板。相形之下，加入CS1没有显示对NIH/3T3转导有任何效果(H-271对H296，CH271对CH-296)。
为了证明FN促进逆转录病毒介导的基因转移的机制是通过逆转录病毒和靶细胞与片段的同时结合，使用非粘附细胞系(HL60-一种已知的前髓性白血病细胞系)进行试验。HL-60细胞用荧光染料直接接合的抗VLA-4(FITC；Immunotech，U.S.A.)和VLA-5(PE，Antigenix Amercia，U.S.A.)单克隆抗体或IgG1和IgG2a的同种型对照(Becton Dickinson)染色，死亡的细胞用碘化丙锭(propifium iodine)染色来排除。然后用一台FAScan(Becton Dickinson)对细胞进行分析。对于基因转移研究，104HL60细胞用来自兼嗜性包装细胞系DAG(获自St.Jude’s ChildrenResearch Hospital，Memphis，TN，U.S.A.)的、含有神经生长因子受体(NGF-R)的胞外结构域的病毒上清液(滴度为105cfu/ml)悬浮，然后加入至以2ug/cm2的浓度包被了六种FN片段的6孔细菌培养板中。4小时后，加入2ml取自正在生长的HL60培养物的条件培养基。4-5天后，加入4ml新鲜培养基(含有5％FCS和2％P/S的RPMI(Gibco))。细胞共培养8天，然后用抗NGF-R的单克隆抗体8211(Boehringer，U.S.A.)或IgG1同种型对照(Dako，U.S.A.)进行染色，接着与第二抗体FITC接合的羊抗鼠血清(Boehringer)进行反应。样品与碘化丙锭一起温育以排除细胞残渣，并随后在FACScan上测量。基因转移在活细胞进入后通过分析NGF-R的表达来证明。所有的基因转移研究均在没有Polybrene或鱼精蛋白的条件下进行。如图15所示，HL60细胞在流式细胞分析(A+B)中表达VLA-4而不表达VLA-5。与表达数据一致，HL60细胞仅与用含有CS1的片段(H-296、CH-296、C-CS1)包被的板粘附。如图15所示，HL60细胞的遗传转导仅见于含有III12-14及CS1(H-296、CH-296)的片段。虽然HL-60细胞可通过VLA-4整联蛋白粘附于C-CS1片段，但缺乏与逆转录病毒结合的III12-14使HL60细胞的转导大幅度地降低。
在另一组试验中，浓度增加的高分子量(HMW)肝素(Sigma，U.S.A.，MW约7000-25000)溶解在2ml补加有2.5％(v/v)1M Hepes的Hanks平衡盐缓冲液(HBSS/Hepes；均购自Gibco)中，加入至用不同的FN片段以4ug/cm2的浓度包被的6孔细菌培养板中。30分钟后，板用PBS洗涤三次，然后加入400cfu/2ml的兼嗜性TKNeo载体。37℃下30分钟后，板用PBS再次洗涤，接着加入2000个含有10％CS和2％P/S的DMEM中的NIH/3T3细胞。按前述方法进行选择，基因转移效率用培养8-10天后的G418r集落数进行计算。在一组相似的试验中，分级的低分子量(LMW)肝素(Sigma，U.S.A.，MW约3000)以浓度增加的方式溶解在2ml HBSS/Hepes中，随后的试验设计如上面用于HMW肝素的试验设计。基因转移效率用培养8-10天后G418r集落的数目读出。所有这些基因转移研究都在没有Polybrene或鱼精蛋白的条件下进行。这些试验的结果示于图16。如图所示，病毒与FN结合能以剂量依赖方式被高分子量肝素竞争(16A)，而不能被低分子量肝素竞争(16B)。这些结果证明病毒颗粒与III12-14内的序列结合。
实施例13
CD34+细胞群体中BFU-E细胞的选择性转导
本实施例证明，通过使用带有一个病毒结合区域和一个靶细胞特异的细胞结合区域的多肽，混合的细胞群体中的所选细胞可以用作转导的靶细胞。重复实施例1的通用TKNEO感染和试验方案，不同之处是使用含有BFU-E、CFU-GM和CFU-Mix细胞的基本上同源的CD34+细胞群体(用亲和层析法从脐带血(CB)细胞中获得)，并且使用1、2、4、8、16和20ug/cm2的不同浓度的重组FN片段CH-271。结果示于图17。如图所示，能与VLA-5结合位点结合的BFU-E细胞被高效转导(大于25％G418抗性集落)而不能显示明显VLA-5结合的CFU-GM和CFU-Mix群体的转导基本很低效(小于5％G418抗性集落)。
实施例14
c-KIT+细胞的转导
在本实施例中，一个基本上为c-KIT+同源的细胞群体按照本发明进行了转导。这样，采用流式细胞分类技术从小鼠骨髓中分离c-KIT+细胞。基本上按照实施例1中的介绍使用TKNEO载体将细胞用于感染方案，不同之处在于FN片段如图18所示不同，并且感染细胞进行HPP-CFC分析。如图18所示，含有III12-14和VLA-4结合位点的FN片段(FN30/35、H296和CH-296)导致高转化效率(大于80％G418抗性集落)，而缺乏这两个区域的FN片段不能产生明显的转导(C274和C-CS1)或基本上效率较低(H271、CH271，小于20％G418抗性集落)。
实施例15
采用不同浓度的Polybrene进行的NIH/3T3和克隆形成BM细胞转导
本组试验证明本发明的有利转导方法在没有溴化己二甲铵的情况下进行。分别基本上按照实施例12和1的介绍将NIH/3T3(成纤维细胞)和克隆形成骨髓细胞用于TKNEO感染方案，不同之处在于载体、细胞和不同浓度的Polybrene首先一起悬浮，然后加于用FN片段CH-296(8ug/ml)包被的基质。按前面介绍的方法对这些细胞类型进行试验。结果示于图19和20。如图19所示，G418抗性的NIH/3T3集落数目随Polybrene浓度的增加而急剧下降，其范围从不用Polybrene时的14降至使用12.5ug/ml Polybrene时的约4。同样，图20显示，当感染在没有Polybrene时进行，观察到近40个集落，而当使用10ug/mlPolybrene时，相应的值少于15。
实施例16
T细胞转导和含有胶原蛋白V和FGF病毒结合序列的多肽的使用
本实施例介绍了DNA转移进人T细胞的提高和本发明的来自胶原蛋白V和成纤维细胞生长因子(FGF)的逆转录病毒结合序列的使用，这两种序列基本上与纤连蛋白的肝素II结合位点同源。这样，全血用抗CD3(perCP；Becton Dickinson)、CD49e(PE；Anitenix America)、CD49d(分别为FITC，PE：Becton Dickinson)的单克隆抗体(MoAbs)在室温下染色15分钟，然后按照厂商推荐用FACS裂解液(BECTINDICKINSON)制备用于在FACScan(BECTIN DICKINSON)上进行分析。外周血来源的单核细胞(PB-MNCs)以1×106细胞/ml的浓度用1ug/ml OKT-3(Ortho)和50U/ml IL-2(Cetus)进行预刺激。2-3天后，收集细胞，洗涤，并在用8ug/cm2 CH296或2％牛血清白蛋白(BSA，Boehringer)包被的非组织培养处理板上，在连续存在7.5ug/ml Polybrene(Aldrich)下，用含有PGK启动子控制下的鼠腺苷脱氨酶的兼嗜性逆转录病毒55/6转导1或2天，在其它的每一天，用含有50U/ml IL-2的新鲜培养基置换50％的培养基。在感染后4-6天，收集细胞，用抗CD3、CD56、TCR-αβ和HLA-DR的MoAbs(均来自Bectin Dickinson)进行表型分析。基因转移效率的分析在非选择群体中通过测量在ADA同工酶试验中与内源的人ADA蛋白相比转导的鼠ADA酶活性来进行(Bodine，D.M.等，《血液》82卷，1975-80页(1993)；Moritz，T.等，《实验医学杂志》178卷，529-36页(1993))。
结果
A.T细胞
首先，分析了人T细胞的FN受体VLA-4和VLA-5的表达。为此，外周血(PB)来源的单核细胞(MNCs)用抗CD3、CD49d和CD49e的单克隆抗体(MoAbs)染色，并用流式细胞技术分析。如图21所示，记入代表全部外周血T细胞的CD3阳性淋巴细胞(R1和R4)。94％的PBT细胞为CD49d阳性，96％为CD49e阳性。90％的T细胞表达VLA-4和VLA-5两者。
其次，PB来源的PB-MNCs用CD3 MoAbs OKT-3和重组IL-2预刺激2-3天，然后在用重组IL-2包被的非组织培养处理板上转导1-2天，然后用来自兼嗜性生产细胞系AMmA55/6(Bodine，D.M.等，《血液》82卷，1975-80(1993)；Moritz，T.等，《实验医学杂志》178卷，529-36页(1993))的逆转录病毒上清液在用重组FN片段CH-296或对照BSA包被的非组织培养处理板上转导1-2天。该病毒含有PGK启动子控制下的鼠腺苷脱氨酶(ADA)cDNA。
感染4-6天后的流式分析显示，细胞培养物含有＞90％的T细胞，其HLA-DR和CD56表达显示其中大部分被强烈活化(图22)。
用ADA同工酶试验(图23)进行的基因转移效率分析证明，当转导方案包括重组肽CH-296时，导入的鼠ADA蛋白的活性与内源的人蛋白活性相同。BSA上感染产生的基因转移水平超出了试验的敏感范围。
这些数据证明，在没有聚阳离子如polybrene时，初级人T细胞能有效地用不含细胞含有逆转录病毒的上清液在重组FN片段CH-296上进行转导。基因传递的效率与使用上清再加polybrene的标准方案相比要高得多。
B.新型重组肽
由于胶原蛋白V(COL)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)两者都显示序列与纤连蛋白的HBD同源，并也能结合肝素，对图24中显示的7种重组蛋白都进行了逆转录病毒结合活性分析。
首先，分析COL和FGF以确定它们是否含有有功能的逆转录病毒结合序列。为此，用重组肽包被细菌学板，然后加入含有一种兼嗜性NEO逆转录病毒的上清液。30分钟后，充分洗涤板以除去所有未结合的逆转录病毒颗粒，然后在每个板中加入2000 NIH/3T3细胞。8-10天后，以G418抗性的(G418r)NIH/3T3细胞集落的数目来评价基因转移效率。
如图25所示，用G418r集落的生长所估测的成功的基因传递进NIH/3T3细胞发生在含有FN的细胞结合区域(CBD)与HBD(CH-271片段)或与胶原蛋白V(C-COL)或FGF(C-FGF)的序列组合的重组肽上。这些结果证明，逆转录病毒颗粒也直接与胶原蛋白V或bFGF中的序列结合，这也证明含有这些序列的重组肽能用于靶造血祖细胞。
表达VLA-4和VLA-5的HEL细胞用含有经过剪切的神经生长因子受体P75链(NGF-R)cDNA的兼嗜性逆转录病毒在重组片段C-274(CBD)、H-271(HBD)、CH-271(CBD HBD)、COL、C-COL(CBD+COL’)、C-FGF、C-FGF-CS1以及对照BSA上进行转导。8天后用流式细胞技术分析NGF-R的表达来分析基因转移效率。
如图26所示，低水平的基因转移见于用C-274包被的板或BSA上。H-271(CBD)和COL上的转导产生了33-36％的NGR-R阳性细胞。在此试验中CBD加入至HBD(CH-271)中使转导细胞的百分比增至最高水平。有趣的是，CBD(＝VLA-5结合位点)加入至C-COL片段中的COL或CS-1(＝VLA-4结合位点)加入片段C-FGF-CS1都不能明显地增加HEL细胞的遗传转导。
最后，IL-6和SCF预刺激1天的人CD34+骨髓(BM)细胞在嵌合肽上用兼嗜性NEO逆转录病毒转导1天，然后在存在或缺乏1.5 mg/ml G418的情况下铺板于祖细胞试验。
经过14天培养后以G418r集落的百分比进行评价，有效的基因转移见于含有H-271或FGF中逆转录病毒结合序列与细胞结合受体的组合的片段。值得注意的是，与用NGF-R逆转录病毒遗传改造的HEL细胞所得的结果相反(图27)，在C-FGF中加入CS1位点大大地提高了基因转移进克隆形成CD34+BM细胞的效率，接近在片段CH-296(CBD+HBD+CS1)上获得的水平。
这样证明了应用T细胞与纤连蛋白经其VLA-4或VLA-5整联蛋白结合的能力，初级T细胞能用逆转录病毒载体在纤连蛋白的特殊粘附区域上获得有效转导。还显示了逆转录病毒颗粒与胶原蛋白V或bFGF中的序列粘附，这两个序列显示与纤连蛋白的肝素II区域同源。并且还显示了造血细胞和细胞系能在含有胶原蛋白V或bFGF的逆转录病毒结合序列与靶细胞结合位点的组合的重组肽上进行有效的遗传改造。
尽管本发明已在前面的叙述中进行了详细阐述和介绍，这在本质上应看作是说明性的而不是限制性的，应当理解，只有优选的实施方案进行了介绍，所有根据本发明的精神所做的改变和修饰都是需要保护的。
所有在此引用的出版物都特此全文引入作为参考，如同其单独引入作为参考和全文列出。另外，1994年3月25日提交的共同未决的美国专利中请系列号No.08/218,355以及1995年3月27日提交并指定美国的共同未决的国际专利申请系列号PCT/US95/03817，特此全文引入作为参考。

Claims (15)

1.一种获得逆转录病毒转导的活细胞群体的方法，包括：
在存在有效量的固定物质时，用逆转录病毒感染细胞，其中所说的物质包含纤连蛋白的CS-1结合区域和纤连蛋白的肝素II结合区域；并且该方法不使用在所述包含纤连蛋白的CS-1结合区域和纤连蛋白的肝素II结合区域的物质缺失时促进所述细胞转导的阳离子试剂。
2.权利要求1的方法，其中细胞是造血干细胞。
3.按权利要求1的方法制备的活细胞组合物，该组合物中基本上没有所说的聚阳离子试剂并含有所说的物质。
4.权利要求3的活细胞组合物，其包含造血干细胞。
5.一种细胞组合物，包括：
由权利要求1的方法制备的基本上被逆转录病毒体外转导的活细胞群体，所说的组合物基本上没有逆转录病毒生产细胞和在协同培养中能提高逆转录病毒转导细胞的效率的聚阳离子试剂，所说的组合物进一步包含一种物质，这种物质包含含有纤连蛋白的CS-1结合区域的配体和含有纤连蛋白的肝素II结合区域的配体。
6.权利要求5的细胞组合物，其中所说的活细胞包括造血干细胞。
7.权利要求1的方法，其中所说的感染形成一种活细胞群体，其被转导的效率大于在存在所说的聚阳离子试剂时所获得的转导效率。
8.权利要求1的方法，其中所说的细胞是哺乳动物细胞。
9.权利要求8的方法，其中所说的细胞是人细胞。
10.权利要求2的方法，其中细胞是人造血干细胞。
11.权利要求4的活细胞组合物，其中所说的细胞是哺乳动物细胞。
12.权利要求11的活细胞组合物，其中细胞群体是含有造血干细胞的人造血细胞群体。
13.权利要求7的方法，其中与逆转录病毒结合的配体是具有显示结合逆转录病毒能力的氨基酸序列的多肽：
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly
Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val
Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln
Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr
Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala
Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile
Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg
Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala
Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile
Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr
Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn
Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr；
14.权利要求13的方法，其中细胞是人造血细胞，所述物质是含有以下两种氨基酸序列的多肽，第一种氨基酸序列为显示结合逆转录病毒能力的氨基酸序列：
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly
Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val
Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln
Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr
Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala
Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile
Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg
Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala
Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile
Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr
Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn
Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr；
第二种氨基酸序列为显示结合造血细胞能力的氨基酸序列：
Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His
Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr。
15.权利要求7的方法，其中细胞是哺乳动物细胞，且所说的感染在没有逆转录病毒辅助生产细胞的基质中进行。
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