JP2004267214A - ウイルス及び細胞結合部位を持つ分子を用いたウイルス媒介性dna導入を増強する方法 - Google Patents
ウイルス及び細胞結合部位を持つ分子を用いたウイルス媒介性dna導入を増強する方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】レトロウイルスによる造血細胞およびその他の細胞の形質転換効率を増加させる方法は、フィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントの存在下で、細胞を感染させることを含む。フィブロネクチンおよびフィブロネクチンフラグメントは、細胞、特に、前駆細胞および初期造血幹細胞を含む造血細胞、へのレトロウイスル仲介遺伝子トランスファーを強化する。また、本発明は、遺伝子トランスファーの強化、造血細胞集団、および細胞内へのレトロウイスル仲介DNAトランスファーを強化する新規の構築物、を利用する体細胞遺伝子療法の改良された方法ならびにそれらの使用を提供する。
【選択図】 なし
Description
本発明は、一般的にはウイルスによる細胞の形質導入の効率を増加させること、より具体的には、ウイルスに結合する領域と、細胞に結合する領域を含むポリペプチド類のような分子を用いて、細胞へのウイルス媒介性遺伝子導入を増強させる方法に関連する。
遺伝子導入技術の進歩と同様に、多くのヒト疾患の分子的基礎の理解の進歩により、重度の遺伝病に対する体細胞遺伝子治療のプロトコールを開発するための最近の試みがもたらされた。最近、ヒト遺伝子治療に対する、見込みのある疾患候補は、酵素、もしくは他のタンパク質が不完全または見られないものであって、酵素もしくはタンパク質のレベルが厳密に調節される必要がないもの、特に本質的には調節されており、そしてその欠陥が骨髄で発見されたものを含む。
簡単に、本発明の一つの好ましい様態は、レトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入の効率を増加させる方法を提供する。この方法は、レトロウイルスによる細胞の形質導入の効率を増加させるのに効果的な、十分に純粋なフィブロネクチンおよび/またはフィブロネクチン断片の存在下で、複製欠損組換えレトロウイルスベクターを、生存している造血細胞に感染することを含む。フィブロネクチンおよび/またはフィブロネクチン断片は、天然に生じる物質から由来しうるか、また合成的に由来することができ(例えば、遺伝的に組換え、もしくは化学的合成技術によって設計される)、もしくは、天然に生じるもの及び合成物質の組み合わせにより由来しうる。加えて、本発明で用いたフィブロネクチンポリペプチド、もしくはペプチド類は、本発明に従って、形質導入を高めることができるのに必要な接着特性を持っている、機能的ポリペプチドをそれでもなお提供する、自然に生ずるフィブロネクチンのアミノ酸配列の変異を含む可能性があることが理解されるであろう。
共培養の必要性を取りのぞいた、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入の方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。
本発明のこれらのそして他の目的、利点、及び特徴は、すぐに以下の記載によって、当業者に対しては容易に明らかになるであろう。
本発明の原理の理解を促進する目的のために、参考文献は現在、それらの特定の態様をなし、固有言語は同様に記載するために使用しうる。それにも関わらず、本発明の範囲を制限しないことがそれによって、このような変化、さらには改良、そして本発明が関係する技術分野での当業者が想到したであろう様に企画され、本明細書に示されたように、このような本発明の原理の応用を意図していると理解されるであろう。
及び(ii)式により示される、ヒトフィブロネクチンのIIICS結合部位(CS-1細胞結合部位)の一つの部分に対応する、第二のアミノ酸配列(配列番号2)、
Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr ;
もしくは、原始前駆細胞および/または長期にわたり再配置する(幹)細胞などの造血細胞結合能を示すための、それに対して十分に類似のアミノ酸配列を含みうる。
1.1.ウイルス上清の調整
レトロウイルスプラスミドTKNEOベクターを含むGP+EnvAM12産生細胞(Markowitz et al. (1988) Virology 167:400 参照)を、10%胎児子牛血清(FCS、Hyclone, Logan UT)、及び100 units/ml ペニシリン、及び100 microgram/ml ストレプトマイシン(P/S、双方 Gibco)を含むIscove's Modified Dulbeccos Medium (IMDM、Gibco, Gaithersburg,MD)中で培養した。ウイルスを含む上清を、20%FCSを含むIMDM10 ml を加えて一晩プレートをコンフルエンスにすることによって回収する。回収した培養液を、0.45ミクロンフィルター(Gelman Science, Ann Arbor, MI)を通して濾過し、使用まで−80℃にて保存した。
FNを、FNを4M尿素で溶出する前に、ゼラチン−アガロースカラムを1M尿素で洗浄した以外は、すでに、 Ruoslahti et al., Methods. Enzymol. 82:803-831 (1982) で記載されているように、ヒト血漿(Lifesource, Glenview,IL)から精製した。精製したFNは、4℃にて,10mM 3-(シクロヘキシルアミノ)-1-プロパン−スルホン酸(CAPS)、150mM NaCl、2mM CaCl2 pH 11.0に対して透析し、−80℃にて等分して保存した。FNのキモトリプシン様細胞結合部位(CBD)(CS-1)、及び、ヘパリン−II結合断片は、すでに記載されているように(Ruoslahti et al. (1982), supra, Patel and Lodish, J. Cell. Biol. 102, pp. 449-456 (1986), and Bernardi et al., J. Cell. Biol. 105, pp. 489-498 (1987))精製した。三つの主なヘパリン断片(30kD、35kD、42kD)が、ヘパリン−アガロースカラムからの1M NaCl中の溶出で得られた。これらのヘパリン結合断片を、さらに精製するために、1M NaCl溶出物を4℃にて1晩、10mM Tris-HCl pH7.0に対して透析し、10mM Tris-HCl pH7.0で平衡化された陽イオン交換カラム(2ml DEAE セファロース fast flow, (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) /mg タンパク質)に通した。30/35kD断片を、非結合フラクションで回収し、一方42kD断片はカラムより100mM NaClにて溶出した。FN 500mg から、おおよそ26mgの30/35kD断片、及び4mgの42kD断片を得た。30/35kD断片でなく、42kD断片は、ウエスタンブロッティング手法によって決定したように、フィブリン結合部位に対する抗体によって認識された。また、42kD断片は、フィブリン−セルロースアフィニティーカラムへ結合する。
健康な大人提供者からの、骨髄サンプルを、the Institutional Review Board of Indiana University School of Medicine によって立証されたプロトコールに従った、無菌保存剤なしの培養液硫酸ヘパリンを含むチューブに集めた。低密度単核細胞を、フィコール−ハイパック(密度 1.077 g/ml, Pharmacia, Piscataway, NJ)において、25℃にて45分間遠心することで用意した。プラスチック接着細胞を、低密度骨髄細胞から2%FCS入りIMDM中、5%CO2中で37℃にて4〜16時間さらに組織培養プレートをインキュベートすることで取り除いた。
LTC-IC(ヒト幹細胞)分析を、すでに記載された方法に従って、若干の改良をして行った。Sutherland et al. Blood 74:1563 (1989)。簡単には10%FCS、10%ウマ血清(Sigma)及びP/S、1×10−5Mヒドロコルチゾン(Upjohn, Kalamazoo,MI)、及び、6ウェル組織培養プレート上に、320モスモル塩化ナトリウム(Costar, Cambridge,MA)を含む5 ml IMDM中でのコンフレントな(上記のような)前照射を受けた同種ヒト骨髄繊維芽細胞(BMF)において、0.5−1×106の感染細胞を播種した。LTMCは、33℃で5%CO2、及び毎週培養液及び非接着細胞の50%を取り去ることで栄養を与えてインキュベートした。5週間後、LTC-IC培養は、BMFから、接着造血細胞を取り除くために、CDBを用いて回収した。非接着、及び接着造血細胞双方を一緒にし、LTC-ICから由来するコロニーを得るために、メチルセルロースにプレートした。
メチルセルロース分析は、すでに Toksoz et al., Prc. Natl.Acad. Sci., USA, Vol. 89, p7350 (1992) で記載されたものに、若干の改良を加えて行った。2.5×104感染大人骨髄細胞を、25%FCS、10%ヒト血漿、10−5Mベータ−メルカプトエタノール(Sigma)、及びP/Sを含む1 mlの2.4%IMDMメチルセルロース(Fluka, Ronkonkoma, NY)中で、5 units/ml エリスロポエチン(Epo, Amgen)、100 ng/ml rhSCF、10 ng/ml rhIL-3(Genzyme, Cambridge, MA)とともにプレートした。培養は、37℃にて、5%CO2/95%空気でインキュベートし、コロニー(>50細胞数)を13日目に反転顕微鏡で見ることで、CFU-GM(顆粒球及びマクロファージを含む)、CFU-混合(骨髄及び赤血球成分を含む)、BFU-E(赤血球成分のみを含む)として計数した。
TKNEOウイルスによる感染効率は13日目の1.5 mg/ml(乾燥粉、Gibco)G418抵抗性メチルセルロ−スコロニ−の割合を決めることで解析した。擬感染は、骨髄を組換えウイルスをつくらないGP+EnvAM12パッケージング株上でインキュベートすることでそれぞれの実験で行った。1.5 mg/ml G418とのこれらの擬感染細胞の培養は一貫して、<1%バックグラウンドコロニーを示す。
形質導入効率は、30/35 FN−、もしくはBSAコートディッシュにまき、骨髄細胞に感染することで比較した。これらの状態間では、選択なしの感染の後に得られたコロニー数においては、違いが観察されなかった。図2は感染後のG418rコロニーの割合を示す。多系統(CFU-混合)前駆細胞と同様に、系統制限(BFU-E、及びCFU-GM)から由来するものを含む、すべての前駆体型からの、30/35 FN上で高い割合のG418rコロニーが確認された。すべての前駆体への感染はBSAに比べ、30/35 FNで9倍増加した。
LTC-ICへの遺伝子導入はTKNEOベクターを用いて行った。コロニー由来LTC-ICへの遺伝子導入は、30/35 FN上での感染後、検出されたのみである。(30/35 FN対BSA 16%G418r対0%G418rコロニー)。
30/35 FNにおいて見られた遺伝子導入効率の増加の特異性を決めるためにTKNEOによる感染を、BSA、30/35 FN、無傷の(intact)フィブロネクチン、RGDSテトラペプチド配列を含む中心細胞結合部位(CBD)を含む115kD FN断片、CS-1配列は欠損しているが、ヘパリン−II結合部位を持つことによって特徴づけられる42kD C-末端FN断片(42FN)上で行った(図1)。BSA上での感染は3±1%G418r BFU-E、1±1% G418r CFU-GM、及び0±0% G418r CFU-混合を示した。CBD上で観察されたG418rコロニー群は明らかな増加が見られず、一方42 FN上ではBFU-Eのわずかに高い感染(6.0±−1%)が見られた(図3)。しかしながら、無傷のFNはすべての前駆体への遺伝子導入の増加を促進した。無傷のFN上での感染後のG418rコロニーの割合は30/35FN上のものより少なかったが、それぞれBFU-E(16±−2対24±4%)、CFU-GM(5±2対20±4%)、及びCFU-混合(6±1対9±1%)(無傷FN対30/35FN)であった。
2.1.全体的な手順
PGK-mADAウイルス上清は実施例1のTKNEOのための記載と同様に準備した。フィブロネクチンのキモトリプシン様断片は(図1)、すでに実施例1で記載のように準備し、実施例1のレトロウイルス感染プロトコールに従った。LTC-IC(ヒト幹細胞)分析、及びメチルセルロース分析は実施例1に従って行った。
ADAイソ酵素電気泳動によるタンパク質分析によって、PGK−mADAベクターの感染効率を定量した。個々の前駆(progenitor)細胞コロニーの分析は、Moritz(1993)およびLimら(1989)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86巻、8892頁に前記した方法に従って、行なわれた。トランスファー効率を厳密に分析するために、内在性ヒトADAと同じか、またはより高レベルのmADAを発現するコロニーのみを形質転換されたと考えた。プールしたコロニーを分析するために、メチルセルロース培地より選択(pick out)したコロニーを、1.5mlのミクロチューブ(Rainin,Woburn,MA)内に集め、暖めた培地およびリン酸緩衝塩類溶液(PBS)で洗浄し、遠心分離し、そして−20℃に保存した。ADA分析のため、凍結−融解サイクルを繰り返すことによって、5μlの溶解バッファーに細胞を溶解し、そしてイソ酵素電気泳動を、前記の方法に従って行った。
30/35FN−またはBSA−コート皿上にプレートした間、骨髄細胞に感染させることによって、形質転換効率を比較した。選別しなかった場合、感染後得られたコロニー数の差は、これらの条件間では認められなかった。表1に示したように、すべての前駆細胞内への感染効率は、実質上、BSAに対して30/35FN上で増加した。高力価(〜1x107ビリオン(virons)/ml)ベクターで予想されるように、前駆細胞の形質転換効率は、非常に高かった。表1に示すように、30/35FN上での骨髄へのPGK−mADAの感染は、2回の別々に行った実験で、前駆細胞の100%近い形質転換が得られた。
PGK−mADAで行った4回の独立した実験では、週齢5週のLTMCから誘導された前駆細胞コロニー(即ち、LTC−IC誘導コロニー)の有意な割合が、トランスファーされたマウスADA遺伝子を発現していた。発現は、分析したコロニーの2/12(17%)から6/6(100%)までの範囲であった(表2)。導入されたmADA遺伝子の発現は、陽性と考えられるすべてのコロニー内で、内在性ヒトADA活性量を越えるか、または少なくとも等しかった。PGK−mADAの感染効率は、TKNEOより高かった。表2に示すように、30/35FN上の骨髄へのPGK−mADAの感染では、2回の別々の実験で、前駆細胞の100%近い形質転換が得られた。
LTC−IC内への遺伝子トランスファー効率は、30/35FN上で増加した。これらの二次のLTC−IC誘導コロニーは比較的小サイズであるため、単一コロニーでタンパク質分析を成し遂げる能力には限界がある。BSA上でのPGK−mADAでの感染後、完全な(intact)フィブロネクチンならびに42FN 0/6、0/4および0/3 LTC−IC誘導コロニーは、それぞれ、マウスADAの発現を示したが、30/35FN上で感染させた3/5LTC−IC−誘導コロニーは、mADAを発現した。さらに、複数のLTC−IC−誘導コロニーを2回の追加実験で分析する前にプールしたところ、mADA発現は、30/35FN上で感染後のみに検出され、完全なFN上ではより少ない程度であり、42FNまたはBSA上では検出されなかった。
3.1. 一般的方法
実施例1のTKNEOで記載した方法に従って、PGK−hADAウイルス上清を調製した。実施例1に前述した方法に従って、フィブロネクチンのキモトリプシンフラグメント(図1)を調製し、次に実施例1のレトロウイルス感染プロトコールを行った。LTC−ICおよびメチルセルロースアッセイを、実施例1記載の方法に従って行った。
プールしたコロニーを分析するために、メチルセルロース培地より選択したコロニーを1.5mlのミクロチューブ(Rainin,Woburn,MA)に集め、暖めた培地およびPBSで洗浄し、遠心分離し、そして−20℃で保存した。ADA分析のために、細胞を、凍結−解凍サイクルを繰り返すことによって5mlの溶解バッファーに溶解し、そして前述の方法に従って、イソ酵素を電気泳動した。
4.1. 一般的方法
TKNEOウイルス上清およびフィブロネクチンのキモトリプシンフラグメント(図1)は、実施例1に前述した方法に従って、調製された。次いで、実施例1に記載のレトロウイルス感染プロトコールを行ったが、骨髄細胞の代わりに、正常な満期産新生児からの臍帯血を、the Institutional Review Board of Indiana University School of Medicineで是認されたプロトコールに従って、ヘパリン含有チューブに集めて用いた。LTC−IC(ヒト幹細胞)およびメチルセルロースアッセイは、実施例1に記載の方法に従って、行われた。
FN30/35上での感染は、3回の別々の実験において、BSAと比較して4倍以上増加していた(表3)
5.1. 一般的方法
PGK−mADAウイルス上清およびフィブロネクチンのキモトリプシンフラグメント(図1)は、実施例1に前記された方法に従って、調製された。次いで、実施例1記載のレトロウイルス感染プロトコールを行ったが、正常な満期産新生児からの臍帯血を、the Institutional Review Board of Indiana University School of Medicineに是認されたプロトコールに従って、ヘパリン含有チューブに集めて用いた。LTC−ICおよびメチルセルロースアッセイは、実施例1に記載の方法に従って、行われた。
より力価の高いPGK−mADAを用いると、LTC−IC−誘導コロニーの分析は、FN30/35上で上清を用いて感染させた臍帯血から確立された培地からのみ、導入したmADA cDNAの高レベル発現を示した。BSA対照プレート内で感染させたLTC−IC誘導コロニー内では、mADAの発現はほとんど検出されなかった。
実施例6 PGK−hADAを用いての臍帯血細胞内への遺伝子トランスファー
PGK−hADAウイルス上清およびフィブロネクチンのキモトリプシンフラグメント(表1)は、実施例1のTKNEOに記載の方法に従って、調製された。次に、実施例1のレトロウイルス感染プロトコールを行ったが、骨髄細胞の代わりに、正常な満期産新生児からの臍帯血を、the Institutional Review Board of Indiana University School of Medicineに是認されたプロトコールに従って、ヘパリン含有チューブに集めて用いた。LTC−ICおよびメチルセルロースアッセイは、実施例1に記載の方法に従って、行われた。
実施例7−11に関して、2つのレトロウイルス産生パッケージング細胞系(retrovirus−producing packaging cell line)を用いた:それぞれ、エコトロピック(ecotropic)GP+E86(Markowitz,D.,S.GoffおよびA.Bank,J.Virol.,62,1120−1124、1988)ならびにアンホトロピック(amphotropic)GP+envAM12細胞系(Markowitz,D.,S.GoffおよびA.Bank,Virology,167,400−406,1988):ここに記載された研究に用いられたレトロウイルスベクターおよび産生細胞クローンを、表4に列挙した。
7.1. 実験方法
マウスの細胞で研究するために、150mg/kgの5−フルオロウラシルの投与後、2日の週齢6から8週のC3H/HeJマウスの大腿骨および頸骨から、骨髄を収集した(SoloPack Laboratories,Franklin Park,IL)(Lim,B.,J.F.Apperley,S.H.OrkinおよびD.A.Williams,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86、8892−8896、1989)。細胞は、IMDM/20%FCS+P/S中の濃度5x106細胞/ml、並びに100ng/mlのラット組換え幹細胞因子(rrSCF;Amgen.Thousands Oaks,CA)および100ユニット/mlのヒト組換えインターロイキン−6(rhIL−6;Pepro Tech Inc.,Rock Hill,NJ)で、48時間、前刺激(prestimulate)した(Luskey,B.D.,M.Rosenblatt,K.ZseboおよびD.A.Williams,Blood,Vol.80,pp.396−402、1992)。次に、EPHA−5産生細胞によって作り出されたPGK−hADAベクターでの遺伝子トランスファー効率を、3種類の異なる感染プロトコールを用いて比較した:1)上清感染;2)FN30/35上での上清感染;3)EPHA−5産生細胞上での同時培養。そのために、100mmの細菌皿を、5mlのリン酸緩衝溶液(PBS;Gibco)中に溶解した2.5μg/cm2のFN30/35(75pmol/cm2に等しい)で、室温、UV光下で、1時間、皿のフタを開けたままで、さらに1時間、皿のふたを閉めてコートした。2%のウシ血清アルブミン(BSA,Fraction V:Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)で、室温で30分間、ブロックした後、皿を、2.5%(v/v) 1M Hepesを添加したハンクス液(Hank’s Balanced Salt Solution)(HBSS)(両方共Gibco)で、一度洗浄した。上清感染では、皿をBSAのみでコートした。5x106の前刺激したドナー細胞を、EPHA−5細胞より上記の方法に従って得られた10mlのウイルス上清に、100U/mlのrhIL−6、100ng/mlのhrSCFおよび7.5μg/mlのポリブレン(polybrene)を添加したものと共に、インキュベートした。非粘着性細胞を集め、新たにウイルス上清を再付加した。共培養のために、4ml培地中のEPHA−5細胞を、10μg/mlのマイトマイシンCと共に、2時間、37℃でインキュベートし、洗浄し、トリプシン処理し、そして10mlのαMEM/20%FCS+P/S中、3x106の細胞濃度で、100mmの組織培養皿上に接種した。翌日、5x106の前刺激した骨髄細胞を、100U/mlのrhIL−6、100ng/mlのrrSCFおよび4μg/mlのポリブレンと共に、48時間加えた。感染プロトコールに次いで、非粘着性細胞をデカントし、そして、粘着性造血細胞を、製造者の指示書に従って、Cell Dissociation Buffer(CDB)(酵素非含有/PBSをベースとする、Gibco)を用いて、培養液から収集した。粘着性細胞を非粘着性画分に加え、二度洗浄し、そして、おおよそ1mlのHBSS/Hepes中に懸濁した。5x106の前刺激した細胞から得られた全細胞を、致死量の全身照射(700+400cGy、137Cs−源)(Luskey,B.D.,M.Rosenblatt,K.ZseboおよびD.A.Williams,Blood,Vol.80,396−402、1992)を受けた3匹のレシピエントマウスの尾静脈内に注射した。造血幹細胞の形質転換は、導入されたヒトADA cDNAの発現用に再構築されたマウスを試験することによって、分析された。このADAイソ酵素分析は、原位置での酢酸セルロースのin vivo酵素分析によって、hADAタンパク質の存在について、末梢血液細胞を試験することによって、移植されたマウス内で成し遂げられた(Lim,B.,D.A.WilliamsおよびS.H.Orkin,Mol.Cell.Biol.,7,3459−3465、1987)。試験は、最初4ヶ月間、追加移植を行い、月に一度繰り返した。
遺伝子操作された造血幹細胞でのマウスの骨髄再構築が長期に及ぶことは、一般的に、4ヶ月の追加移植期間後の幹細胞の形質転換効率を定量するために、適当であるとして受け入れられる。形質転換骨髄の7ヶ月後のレシピエントのイソ酵素分析による分析は、1)ヒトADA cDNA発現は、同時培養またはFN30/35上での上清感染のいずれかを用いると存在するが、FN30/35なしでの上清感染後移植したグループでは、存在せず、そして2)発現のレベルは、共培養とFN30/35グループで同等である:ことを示した。図4、列2−4に示したように、EPHA−5細胞上での同時培養によって形質転換された骨髄を移植した3匹のマウスでは、ヒトADAが容易に検出できることを証明した。同様のレベルのヒトADAは、FN20/35の上清感染によって形質転換された造血細胞を移植した3匹のマウスでも検出された(図4、列5−7)。これに対して、BSA上での上清感染によって形質転換された造血細胞を移植した3匹のマウスでは、ヒトADAは検出されなかった(図4、列8−10)。ヒトADAの位置コントロールを図4の列1および12に、ならびにマウスのADAを列11に示す。列2−10のマウスのバンドは、同量のタンパク質が負荷されたことを示す。これらのデータは、FN30/35上での上清感染によって長期にわたって再構築される造血幹細胞の形質転換が 同時培養と等価であり、FN30/35なしでの上清感染より遥かに優れていることを証明している。
8.1. 実験方法
形質転換の増加が、ウイルスと造血細胞を共に配置する(co−localization)結果であるか否かを試験するため、我々は、組換えレトロウイルス粒子がFN30/35との結合を示すか否かについて分析した。そのため、FN30/35−コートプレートを、TKNeoウイルスを含む上清と共に、30分間プレインキュベートし、その後、広範囲にわたって洗浄した。上清のウイルス力価をNIH/3T3を用いて、標準的方法に従って、定量した(Markowitz,D.,S.GoffおよびA.Bank,J.Virol.,62,1120−1124、1988)。簡単に言えば、3T3細胞を、6穴の組織培養プレートに、濃度1000細胞/穴でプレートし、一晩増殖させた。ウイルス上清の一連の希釈物を、7.5μg/mlのポリブレンと共に、それぞれの穴に加え、そして2mlの培地を加えた後、37℃で2.5時間インキュベートした。24時間後、培地は、G418(0.75mg/ml、乾燥粉末、Gibco)を含む培地と置き換え、そしてプレートを10−12日間インキュベートした。G418−耐性コロニー(G418r)を10−12日後に染色し、そして数を記入した。ウイルス上清の希釈倍率を掛けたコロニー/穴の数を、上清の感染粒子(cfu)/mlとして用いた。我々は、ウイルス上清とプレインキュベーションし、そして1000NIH/3T3/35mm細菌皿細胞+ポリブレンを加えることによって集中的に洗浄した後、FN30/35−コートしたまたはBSA−コートした35mmプレート上に残っているレトロウイルス粒子の量を、評価/”滴定”した。24時間後、培養液に、0.75mg/mlのG418(乾燥粉末)を含む培地を供給し、そしてさらに細胞を10−12日間インキュベートした。このインキュベーションの後、G418−耐性NIH/3T3コロニーを数えることによって、粘着性ウイルスの存在を定量した。
図5は、3回の実験の内の典型的な一つの結果を示す。TKNeo上清を用いて、NIH/3T3細胞内のG418rコロニーによって測定されたレトロウイルスの力価は、BSA−コートプレート上では、3logより多く(4x103から0)減少したが、これに対して、30/35FNでコートしたプレート上では、力価の減少は、1logのみであった。これらのデータは、レトロウイルスは、FN30/35と定量的に結合するが、しかしBSAでコートした皿(対照皿)とは結合しないことを、証明している。図6は、ウイルス−含有上清を、FN30/35の濃度を増加させてコートしたプレート上でインキュベートした場合、G418−耐性コロニーの数の増加が検出されたことを示している。このように、FN30/35へのウイルスの結合は、服用量依存様式で起こっている。
9.1. 実験方法
Kimizukaらは、以前、大腸菌内にクローン化したFN DNA配列の発現について報告している(Kimizuka,F.,Y.Tatuchi,Y.Ohdate,Y.Kawase,T.Shimojo,D.Hashino,I.Kato,K.SekiguchiおよびK.Titani,J.Biochem.,110,284−291、1991)。クローン化したキメラペプチドは、細胞粘着性に関係することが知られているフィブロネクチン内の様々な重要配列(RGDS、CS−1およびヘパリン結合部位)の内の一つまたはその組み合わせを含む(図7参照のこと)。レトロウイルスがこれらの組み換えFNフラグメントと結合することができるか否かを分析するために、3T3細胞コロニー形成アッセイを、1x104感染粒子/mlの凍結レトロウイルスTKNeoストックの2つの異なる希釈物(1:10および1:100)を用いて、組換えフラグメントC−274、H−271、H−296、CH−271、CH−296およびC−CS1ならびに陽性対照としてFN30/35でコートしたプレート上で繰り返した。FNフラグメントは、120−130pmol/cm2の濃度(C−274、H−271、H−296、C−CS1、FN30/35では4μg/cm2に等しく、CH−271およびCH296では8μg/cm2に等しい)で用いられた。簡単に言えば、プレートをコートし、ウイスルを加え、プレートを広範囲に洗浄し、NIH/3T3細胞を24時間加え、そして10日間選択培地内で増殖させ、その後、コロニーを染色し、数を数えた。
図8は、G418−耐性コロニーの数(およびそのウイルス粘着性)が、フラグメントH−271、H−296、CH−271およびCH−296で増加したことを示している。さらに、図8は、ウイルス結合量が、これら組み換えフラグメントとFN30/35の間では概略的に比較できるが、この仕事中では、CH−271フラグメントが最も高いレベルのウイルス結合を示したことを、示している。これらの5FNフラグメントのすべてに共通なのは、高アフィニティーのヘパリン結合部位を含むタイプIIIリピート12−14であり(Ruoslahti,E.,Ann.Rev.Biochem.,57,375−413、1988、およびKimizuka,F.,Y.Taguchi,Y.Ohdate,Y.Kawase,T.Shimojo.K.Hashino,I.Kato,K.SekiguchiおよびK.Titani,J.Biochem.,110,284−291、1991)、多分、リピート13に位置する(Kimizuka,F.,Y.Taguchi,Y.Ohdate,Y.Kawase,T.Shimoko,K.Hashino,I.Kato,K.SekiguchiおよびK.Titani,J.Biochem.,110,284−291、1991)。このことは、ウイルス結合が、この既知の粘着部位を通して起こることを示唆している。このことは、4μg/cm2のCH−271でコートした皿を、ヘパリン結合部位との細胞結合を阻害することが知られている高荷電分子である、硫酸ヘパリンの濃度を上昇(10−1000μg/ml)させて、プレインキュベーションすることによって、証明された。図9に示したように、G418−耐性コロニーの数は、高濃度の硫酸ヘパリンと共にCH−271をプレインキュベーションした後には、減少している。これらのデータは、FNへのウイルス結合が、FNのカルボキシ末端ドメイン内のCS−1部位のすぐ隣りに位置する高アフィニティーのヘパリン結合部位を通して仲介されることを、示唆している。
10.1. 実験方法
前記したように、FN30/35上での造血細胞の形質転換の上昇が、組換えFNフラグメントでもまた認めることができるか否かを分析するために、我々は、高増殖潜在性−コロニー形成細胞(high proliferative potential− colony forming cell)(HPP−CFC)アッセイを用いて、インビトロでの上清感染の形質転換効率を評価した。EAL2aベクターを用いることによって、我々は、BSA上での様々な組換えFNフラグメント対FN30/35の上清感染の、造血細胞の形質転換への影響を、遺伝子トランスファーのインジケーターとしてG418−耐性コロニーの増殖を利用して、比較した。さらに、我々は、すでにFNフラグメントに粘着したウイルス粒子(対上清ウイルス)が造血細胞を形質転換する能力を比較した。上記の方法に従って、0.5から1x106の前刺激した骨髄細胞を、35mmのFN−コートペトリ皿上、1−2mlのEAL2aウイルス含有上清中、増殖因子および5μg/mlのポリブレンと共に、インキュベートした。FNフラグメントに結合したウイルスによる造血細胞の形質転換を評価するために、ウイルス含有上清と共にインキュベートした35mmのFN−コート皿を各2mlのPBSで3回洗浄した。次に、0.5から1x106の前刺激した骨髄細胞を、増殖因子およびポリブレンを添加した2mlの培地内に加えた。22時間後、細胞を収集し、そして、Bradley,T.R.およびD.Metcalf,Aust,J.Exp.Biol.Med.Sci.、44、287ー293,1966に記載の方法に従って、1.5mg/mlのG418を加えておよび加えずに、HPP−CFCアッセイに塗布した。培養液を、14日間、7%CO2中、33℃でインキュベートし、遺伝子トランスファー効率を、G418耐性コロニーの%として計算した。
上清感染を通しての初期造血細胞(primitive hematopoietic cells)の形質転換(図10)は、ヘパリン−結合部位(heparin−binding site)(HBS)および少なくとも一つより多くの活性細胞粘着部位(立体棒)を含むすべてのフラグメントで、BSA上での上清感染より有意に高い。組み換えフラグメントCH−271、H−296、CH−296およびC−CS1(3つのフラグメントはすべて、ヘパリン−結合部位およびCS−1部位の両方を含む)の形質転換効率は、FN30/35の効果と同等であった。その他のすべての場合において、形質転換は、劇的に減少した。これらのデータは、以前にFN30/35上で示された初期造血細胞の形質転換の増加を、組み換えFNフラグメント上でも複製できることを、証明している。さらに、フィブロネクチンに直接結合したウイルスは、造血細胞を遺伝的に形質転換する能力を持つことを、証明している。最終的に、初期造血前駆体(幹)細胞を形質転換するために、CS−1およびヘパリン結合部位の両方の存在が有用であることが、確認された。
11.1. 実験方法
造血幹細胞の再構築への効果を分析するために、初期造血前駆細胞について、BS対FN30/35対組み換えFNフラグメント上での上清感染、対同時培養を、骨髄移植を用いて比較する、上記のインビトロでの研究(実施例10から)を繰り返した。簡単に言えば、致死照射マウスに、ヒトADA cDNAを含むEPHA−5ベクターで形質転換したドナー細胞を注射した。1ヶ月後およびおおよそ6ヶ月後、遺伝子トランスファー効果を、ADAイソ酵素アッセイで末梢血液から分析した。
図11は、1ヶ月後の結果を示し、ヘパリン結合部位およびCS−1の両方を含むフィブロネクチンフラグメントH−296では、FN30/35および共培養と同様の結果が得られることを、はっきりと示している。これら部位を両方共含まないフラグメントは、移植可能な造血細胞の形質転換に、あまり有効ではない。これらのデータは、初期造血/幹細胞ならびにCS−1およびヘパリン結合部位を両方共含む組換えFNフラグメントに結合したレトロウイルスが共に配置されることが、移植可能な造血細胞を効果的に形質転換することを証明している。
フィブロネクチンは、少なくとも3つの部位(図13):インテグリンVLA−5を通してリピート10内にテトラペプチドRGDSを含む細胞結合ドメイン(cell binding domain)(CBD);細胞表面のプロテオグリカン分子を通してタイプIIIリピート12−14(III12−14)内に含まれるヘパリン結合ドメイン;および、インテグリンVLA−4を通して変化するスプライス領域IIICS内のCS1配列:を通して細胞粘着性を支配する。これらの研究では、これらの単一の細胞粘着部位を単独で含むか、あるいはペプチド内に組み合わせて含む、図13に示す6つのキメラ組換えFNフラグメントを用いた。
この実施例では、混合した細胞集団内で選別された細胞を、ウイルス結合ドメインおよび細胞結合ドメインを持ち、標的細胞に特異的であるポリペプチドを用いることによって、形質転換の標的とすることができることを証明した。一般的TKNEO感染および実施例1のアッセイプロトコールを繰り返したが、BFU−E、CFU−GMおよびCFU−Mix細胞[臍帯血(CB)細胞よりアフィニティクロマトグラフィーによって得られた]を含むCD34+細胞は、実質的に均一な集団を用い、組換えFNフラグメントCH−271の濃度は1、2、4、8、16および20μg/cm2 に変化させて用いた。結果を図17に示す。示した通り、BFU−E細胞は、VLA−5結合部位に結合し、高い効率で形質転換された(G418耐性コロニーの25%より多い)が、これに対してCFU−GMおよびCFU−Mix集団は、有意なVLA−5への結合を示さず、実質的により低い効率で形質転換された(G418耐性コロニーの約5%より少ない)。
本実施例では、c−KIT+として実質的に均一な細胞集団を、本発明の方法に従って、形質転換した。このため、c−KIT+細胞は、フローサイトメトリー選択技術を用いて、マウスの骨髄から単離された。細胞は、一般的には実施例1記載の方法に従って、TKNEOベクターを用いた感染プロトコールに委ねたが、FNフラグメントは、図18に示すように変化させ、感染した細胞は、HPP−CFCでアッセイした。図18に示すように、III12−14およびVLA−4結合部位を含むFNフラグメント(FN30/35、H296およびCH−296)は、高い形質転換効率を示した(G418耐性コロニーの80%より高い)が、これらの2つのドメインを欠くFNフラグメントは、結果として有意な形質転換を生じない(C274およびC−CS1)か、または実質的に低い効率を示す(H271、CH271、G418耐性コロニーの20%より少ない)。
この実験セットでは、本発明の有用な形質転換法が、ヘキサジメチリンブロミド非存在下で行われることを証明した。NIH/3T3(繊維芽細胞)細胞およびクロ−ン原性骨髄細胞は、一般的には、それぞれ実施例12および1に記載した通りのTKNEO感染プロトコールに委ねたが、ベクター、細胞および様々な濃度のポリブレンを最初に一緒に懸濁し、次いで、FNフラグメントCH−296(8μg/ml)でコートした基質に適用した。アッセイは、これらの細胞型に関して前記したとおりである。結果を図19および20に示す。図19に示すように、G418耐性NIH/3T3コロニーの数は、ポリブレン濃度を増加させると、劇的に減少する(その範囲は、ポリブレンを使わなかった場合約14から、12.5μg/mlのポリブレンを用いた場合約4に低下する)。同様に、図20は、プロトコールがポリブレンの非存在下に委ねられた場合に40近いコロニーが得られたことを、表しているが、これに対して10μg/mlのポリブレンを用いた場合の関連値は、15より少なかった。
この実施例では、ヒトT細胞内へのDNAトランスファーの強化、およびコラーゲンVおよび繊維芽細胞増殖因子(FGF)からのレトロウイルス結合配列(フィブロネクチンのヘパリンII結合部位と実質的に相同である)の発明への使用について、説明している。このために、全血を、モノクローナル抗体(CD3 perCPに対するMoAbs;Becton Dickinson)、CD49e(PE;Anitenix America)、CD49d(FITC,PE,それぞれ:Becton Dickinson)で、15分間、室温で染色し、次いで、製造者らの勧告に従って、FACS溶解溶液(BECTIN DICKINSON)と共にFACScan(BECTIN DICKINSON)での分析用に、調製した。末梢血液−誘導単核細胞(peripheral blood−derived mononuclear cells)(PB−MNCs)は、1x106細胞/mlの濃度で、1μg/mlのOKT−3(Ortho)および50U/mlのIL−2(Cetus)で、前刺激した。2−3日後、細胞を収集し、洗浄し、次いで、7.5μg/mlのポリブレン(Aldrich)の連続存在下、8μg/cm2 のCH296で又は2%のウシ血清アルブミン(BSA,Boehringer)でコートした組織培養処理しなかったプレート上、PGKプロモーターの調節下で、マウスのアデノシンデアミナーゼ(ADA)cDNAを含むアンホトロピックレトロウイスル55/6で、1または2日間形質転換した。一日おきに、50%の培地を、50U/mlのIL−2を含む培地に新しく置き換える。感染から4−6日後、細胞を収集し、CD3、CD56、TCR−αβおよびHLA−DRに対するMoAbs(すべてBectin Dickinson)を用いて、形態学的に分析した。遺伝子トランスファー効率の分析は、ADAイソ酵素アッセイ(Bodine,D.M.ら、Blood,82,1975−80,1993;Moritz,T.ら、J.Exp.Med.178,529−36、1993)でヒトの内在性のADAタンパク質と比較して、形質転換されたマウスのADA酵素の活性を測定することによって、非選択集団上で、行われた。
A. T細胞
最初に、ヒトT細胞を、FNレセプターVLA−4およびVLA−5の発現について分析した。このために、末梢血液(PB)−誘導単核細胞(MNCs)を、CD3、CD49dおよびCD49eに対するモノクローナル抗体(MoAbs)で染色し、フローサイトメトリーで分析した。図21に示すように、細胞を、すべての末梢血液T細胞を表すCD3陽性リンパ球(R1およびR4)について通門した。PB T細胞の94%は、CD49d陽性であり、96%はCD49e陽性である。T細胞の90%は、VLA−4およびVLA−5の両方を発現している。
コラーゲンV(COL)および塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)の両方が、フィブロネクチンのHBDと配列相同性を示し、ヘパリン結合能力もまた有するため、図24に示す7つの組み換えタンパク質を、レトロウイルス結合活性について分析した。
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