CN1190496C - 基因导入的方法 - Google Patents

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Abstract

利用逆转录病毒将基因导入靶细胞的改良方法，其中通过将逆转录病毒结合到固定在载体上并具有结合逆转录病毒活性的功能性物质上并经随后的洗涤；应用能特异性识别细胞的抗体、作为具有结合靶细胞活性的物质的层粘连蛋白或富含甘露糖型的糖链；预处理靶细胞使转铁蛋白受体活化；或将新的功能性基团导入功能性物质，使基因导入效率得到改善，并有效地转化靶细胞。

Description

基因导入的方法
技术领域
本项发明与一种方法学有关，该方法能增加基因导入靶细胞的效率并能使靶细胞有效地转导，并涉及一系列与医学、细胞技术、遗传工程、发育技术等领域相关的技术。
技术背景
很多人类疾病的发病机理已经阐明。重组DNA技术及将基因导入细胞的技术进展很快。在这种情况下，治疗严重的遗传性疾病的体细胞基因治疗方法最近已经建立。新近，人们试图将基因治疗的方法不但用于治疗遗传性疾病，而且用于治疗病毒性感染(如AIDS)和癌症。
至今，大多数已通过审查的对人的临床应用的基因治疗法，是通过用重组逆转录病毒载体将基因导入细胞的。逆转录病毒载体能有效地将目的外源基因导入细胞并稳定地将基因整合入它们的染色体DNA中。因此，这是一种优先选用的基因导入方法，特别是希望有长期基因表达的基因治疗。为了消除被导入的基因对机体的有害的影响，这种载体已经过不同的改进。例如，消除所述载体的复制功能，这样在重复无限制感染(基因导入)的同时，用于基因导入的载体在细胞内不复制。
由于这种载体(复制-缺陷性逆转录病毒载体)不能自主复制，因此通常通过应用逆转录病毒生成细胞(包装细胞)制备包壳在病毒病毒颗粒内的载体。最简单的能将基因有效地导入靶细胞的方法包括将靶细胞与逆转录病毒生成细胞共同培养。然而在此方法中，逆转录病毒生成细胞可能污染将被移植入活体的已导入基因的靶细胞。
最近，有报道当有纤连蛋白(细胞外基质成分)或其片段存在时，能够增加用逆转录病毒将基因导入细胞的效率(J.Clin.Invest.，93：1451-1457(1994)；Blood，88：855-862(1996))。并且已证明，用遗传工程技术生产的纤连蛋白片段有相似的性质并能够用以有效地将外源基因导入造血干细胞中(WO 95/26200)。因此提示由于纤连蛋白而增加的基因导入效率是与纤连蛋白的肝素-结合区域与逆转录病毒的结合有关。
此外，在WO 97/18318中公开的功能性物质(而不是纤连蛋白，如成纤维细胞生长因子)能增加基因导入的效率。公告中还公开，当应用一种具有与逆转录病毒结合活性的功能性物质和另一种具有与细胞结合活性的功能性物质的混合物时也观察到相似的基因导入效率的增加。
在没有逆转录病毒生成细胞和靶细胞共同培养的情况下，应用功能性物质的基因导入方法能有效地进行基因导入。因此认为该方法中基因导入效率的增加是由于在功能性物质的帮助下增加了紧密地共定位在一起的逆转录病毒和靶细胞之间相互作用的机率。
在用逆转录病毒进行的基因导入中，用逆转录病毒感染靶细胞，导致基因按以上所述导入。然而用逆转录病毒进行基因导入的效率仍不能满足实际的临床应用。因此期望进一步增加感染效率。
增加感染效率或基因导入效率也可以通过增加所用的病毒悬液(上清液)中逆转录病毒的浓度(滴度)来实现。然而，构建和建立一种能生成高滴度病毒的病毒生成细胞通常需要大量的劳动。利用来自水泡性口炎病毒的包膜蛋白形成的假型病毒载体[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：8033-8037(1993)]可经离心而浓缩。但由于该浓缩方法只能用于这种载体，因此该法不能被广泛应用。
另外，即使靶细胞纯度较低时，在基因导入时用逆转录病毒特异性感染靶细胞也能达到高的基因导入效率。然而本领域现阶段还没有一个方便、高效的方法。
发明目的
综上所述，本发明的主要目的是提供一种改良的方法用于利用逆转录病毒将基因导入靶细胞，该方法提高了基因导入效率，并有效地转导靶细胞。
在下文中，参照附图将详细解释本发明的其它的目的及优势。
附图简述
图1显示分子中含有九个甘露糖残基的高甘露糖型糖链的结构。
图2图示在实施例3中应用化学修饰的CH-296所达到的基因导入效率(％)。
图3图示实施例13中在去除病毒感染抑制物质的影响的研究中，相对基因导入效率(％)与接触/结合时间之间的关系。
图4图示实施例15中，利用离心的方法将逆转录病毒结合到功能性物质上的影响的研究中，相对基因导入效率(％)和各自病毒结合步骤之间的关系。
图5图示实施例15中，用离心法或离心感染法达到的基因导入效率(％)。
发明概述
本发明者发现，通过将具有结合逆转录病毒活性并被固定在支持物上的功能性物质与逆转录病毒接触，然后在感染靶细胞之前洗涤支持物，能够增加基因导入效率。
本发明者也发现，当诸如能特异性结合到靶细胞的抗体、层粘连蛋白、来源于层粘连蛋白的糖链或高甘露糖型糖链等的功能性物质存在时，通过用逆转录病毒感染靶细胞能特异并有效地将基因导入目的靶细胞。
本发明者进一步发现进行基因导入前适当地预处理靶细胞能增加基因导入效率。
此外，本发明者还发现用化学方法修饰功能性物质以增加其硷性可改善具有结合病毒活性的功能性物质对基因导入的作用。
该项发明是本发明者基于这些新发现而完成的。
因此，本发明的第一个方面是用逆转录病毒将基因导入靶细胞的方法，该方法特征包括：
(1)将含有逆转录病毒的溶液与具有结合逆转录病毒活性并被固定于支持物的功能性物质接触；
(2)洗涤该结合有逆转录病毒的支持物；和
(3)将该结合有逆转录病毒的支持物与靶细胞接触并一起孵育；
进行上述第一步时没有什么限制，如持续1小时或更长时间，最好是3小时或更长时间。另外，可经物理的方法增加逆转录病毒与具有结合逆转录病毒活性的功能性物质之间的接触频率。
能用于本发明的具有结合逆转录病毒活性的功能性物质的例子包括但不限于纤连蛋白、成纤维细胞生长因子、V型胶原蛋白、聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖和它们的片段以及其它具有相同的结合逆转录病毒活性的物质。所述功能性物质可具有结合靶细胞的活性。做为选择，该功能性物质也可以与另一具有结合靶细胞活性的功能性物质结合使用。可使用的具有结合靶细胞活性的功能性物质的实例包括但不限于细胞-粘附蛋白、激素、细胞因子、抗体、糖链、碳水化合物和代谢物。
例如，本发明中可将逆转录病毒生成细胞的培养上清作为逆转录病毒用于基因导入。可在有促进逆转录病毒生成的物质如丁酸钠存在下获得所述培养上清。
本发明的第二个方面是一种利用逆转录病毒将基因导入靶细胞的方法，该方法的特征包括在有以下两个功能性物质存在下用逆转录病毒感染靶细胞：
(1)具有结合逆转录病毒活性的功能性物质；和
(2)能特异性结合靶细胞的抗体。
用于本发明的能特异性结合靶细胞的抗体的例子包括但不限于能识别靶细胞表面的生物性物质的抗体。
本发明的第三个方面是一种利用逆转录病毒将基因导入靶细胞的方法，该方法的特征包括在以下两个功能性物质存在下用逆转录病毒感染靶细胞：
(1)具有结合逆转录病毒活性的功能性物质；和
(2)层粘连蛋白、层粘连蛋白片段、来源于层粘连蛋白的糖链或高甘露糖型糖链。
能用于本发明第二和第三方面的具有结合逆转录病毒活性的功能性物质的例子包括，但不限于，纤连蛋白、成纤维细胞生长因子、V型胶原蛋白、多聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖及其片段，以及其它具有相同的结合逆转录病毒活性的物质。该功能性物质可具有结合靶细胞的活性。此外，也可将该功能性物质固定在适当的支持物上使用。
本发明的第四个方面是一种利用逆转录病毒将基因导入靶细胞的方法，该方法的特征包括在靶细胞接触逆转录病毒前，先在含低浓度铁的培养基内培养靶细胞。可用于本发明的培养基的例子包括，但不限于，含去铁胺的培养基。最好在有功能性物质存在下进行本方法。
本发明的第五个方面涉及增加肽链或蛋白质与逆转录病毒结合的活性的方法，该方法的特征包括用化学法修饰肽链或蛋白质。化学修饰的例子包括，但不限于，激活肽链或蛋白质的氨基酸残基和硷性残基的引入。例如，最好用水溶性的碳化二亚胺或用水溶性的碳化二亚胺和二氨基化合物处理肽链或蛋白质进行所述氨基酸残基的激活，没有什么限制。可优选将用这种方法获得的经化学修饰的肽链或蛋白质用于用逆转录病毒将基因导入靶细胞中。
发明详述
在本发明的基因导入方法中通常使用重组的逆转录病毒载体。具体地说，优选应用复制缺陷性重组逆转录病毒载体。将这种载体的复制能力去除以使其不能在被感染的细胞内自主复制，因此这种载体没有致病性。所述载体可以进入如脊椎动物细胞的宿主细胞(特别是哺乳动物细胞)中，并稳定地将插入载体内的外源基因整合入所述染色体DNA中。
本发明中，通过将外源基因插入重组逆转录病毒载体并在适当的启动子如逆转录病毒载体的LTR启动子或一外源启动子的控制下，将外源基因导入靶细胞。此外，为了使该外源基因有效地转录，载体中还可有与该启动子和转录启始位点协同作用的另一调节成分(如增强子序列或终止子序列)。该导入的外源基因可以是一天然的基因或者是一人工制备的基因。另外，外源基因也可以是不同来源的DNA分子经连接或用本领域已知的其它方法结合在一起的一个基因。
人们可以选择任何想要导入细胞的基因作为所述外源基因插入该逆转录病毒载体。例如，与所治疗疾病相关的酶或蛋白质、细胞内抗体(例如参见，WO 94/02610)、生长因子、反义核酸、核酶、假引物(例如参见，WO 90/13641)等的编码基因可被用来作为所述外源基因。
本发明中应用的逆转录病毒载体还含有适当的标志基因，它能够选择已导入基因的细胞。例如，将赋予细胞抗生素抗性的药物抗性基因或可将通过酶活性的检测区别已导入基因的细胞的报道基因作为标志基因。
能用于本发明的载体包括，例如，逆转录病毒载体如MFG载体(ATCC第68754号)、α-SGC载体(ATCC第68755号)和LXSN载体[BioTechniques，7：980-990(1989)]。在下文实施例中使用的逆转录病毒载体(包括PM5neo载体)包括含有新霉素磷酸转移酶基因作为标志基因[Exp.Hematol.，23：630-638(1995)]，因此根据细胞对G418的抗性作为一种指标能够证明，利用该载体已将基因导入细胞内。
可用已知的包装细胞系如PG13(ATCC CRL-10686)、PG13/LNc8(ATCC CRL-10685)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86(ATCCCRL-9642)、GP+envAm12(ATCC CRL-9641)和CRIP[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：6460-6464(1988)]包装所述载体制备成的病毒颗粒。
可将已知的培养基如DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)和Iscoves改良的Dulbecco培养基用于培养将逆转录病毒载体导入包装细胞而产生的逆转录病毒生成细胞或用于培养靶细胞。这些培养基均已商品化，如可从Gibco公司买到。根据基因导入的靶细胞的类型或其它目的，可向这些培养基内加入不同的组分。如为促进或抑制所述靶细胞的生长或分化，可加入血清或不同的细胞因子。例如，可将小牛血清(CS)或胎牛血清(FCS)作为血清使用。所述细胞因子包括白细胞介素(IL-3、IL-6等)、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF等)、干细胞因子(SCF)、促红细胞生成素和各种细胞生长因子。许多人源性的细胞因子已经商品化。从所述细胞因子中按所需目的选择有适当活性的细胞因子。此外，可联合应用所述细胞因子。
将含有逆转录病毒的样品如病毒生成细胞的培养上清应用于本发明的基因导入方法中。制备该上清的方法并不限于某种特殊类型。例如，已知在培养病毒生成细胞时加入丁酸钠可增加培养上清内病毒颗粒产生的量[Human Gene Therapy 6：1195-1202(1995)]。毫无问题，可将这样制备的高滴度的病毒上清用于本发明的基因导入方法。
本发明的方法的特征在于，在具有逆转录病毒结合位点的功能性物质存在下，用逆转录病毒感染靶细胞。在有效量的这种功能性物质存在下，通过逆转录病毒感染细胞可以有效地获得基因导入的细胞。此外，使用功能性物质还能容易地去除病毒上清内的病毒感染抑制物质。此外，具有结合靶细胞活性的功能性物质的共同存在，会使基因导入特异性和/或效率更高。
本文所用的有效量是指通过用逆转录病毒将基因导入靶细胞而有效地使靶细胞转导的量。根据应用的所述功能性物质和靶细胞的类型选择适当的量。例如，可通过用此处所描述的方法测定基因导入效率来确定该有效量。本文所指的结合到靶细胞的活性不但包括与靶细胞充分地结合的活性，而且还包括在溶液中保持与靶细胞接触的活性。可基于如上所述的对基因导入效率的作用测定所述活性。此外，基因导入效率意味着转导效率。
可将上述提到的功能性物质溶解于溶液中或固定于适当的支持物上后使用。用于固定功能性物质的支持物也不限于某一特殊类型。通常使用细胞培养容器(vessel)或珠状支持物。
当使用具有结合病毒的活性并被固定于支持物上的功能性物质时，使用以下例举的步骤会进一步增加基因导入效率。
首先，使含有逆转录病毒的液体样品(如病毒上清)与固定有具有结合逆转录病毒活性的功能性物质的支持物接触。洗涤该支持物。然后使该支持物直接与靶细胞接触。做为选择，可将用适当的方法从支持物上洗脱下来的病毒颗粒加入靶细胞。因此，可有效地导入基因。所述应用的具有结合逆转录病毒活性的功能性物质可具有结合靶细胞的活性。做为选择，还可将具有结合逆转录病毒活性的和结合靶细胞活性的功能性物质结合起来应用。
例如，进行含有逆转录病毒的液体样品与固定有具有结合逆转录病毒活性的功能性物质的支持物相互接触这一步骤时，可持续1小时或更长，最好3小时或更长，没有什么限制。同样，其它条件包括温度也没有特别限制。例如，可在室温或37℃下进行该步骤。根据所述病毒的稳定性或其它性质，也可以用4℃左右的低温。根据所述目的，可适当地选择固定功能性物质的支持物。如果使用细胞培养的容器，只要加入了靶细胞，就可开始基因导入的步骤。例如，可将磷酸盐缓冲溶液或Hanks’盐溶液、用于培养靶细胞的液体培养基等用于洗涤支持物。
通过物理的方法增加所述逆转录病毒和所述功能性物质之间的接触频率，可以使逆转录病毒更有效地与具有结合逆转录病毒活性的功能性物质相结合。这种物理方法实例包括，但不限于，振荡、过滤和离心力的应用。以下方法是一种使用离心力的具体实例：将有逆转录病毒的液体样品放入一个管底固定了具有结合逆转录病毒活性的功能性物质的离心管内，然后离心。该离心管在离心过程中由于离心力的作用，使所述逆转录病毒沉淀到该离心管底部。相应地，所述逆转录病毒与具有结合逆转录病毒活性的功能性物质的接触频率增加，导致所述结合的频率增加。上述提及的方法不是将细胞置于物理应力下不象通过离心力将病毒沉淀到细胞上进行感染的方法(WO 95/10619)，因此，本发明的方法导致较高的基因导入效率。
可以用上述提及的方法去除含逆转录病毒的样品内的不利于基因导入的物质以后再进行基因导入。例如，用本发明的方法去除的物质包括包含于病毒上清内的来自包装细胞的逆转录病毒的感染抑制物质[Human Gene Therapy 8：1459-1467(1997)；J Virol.，70：6468-6473(1996)]，为促进病毒产生而在培养逆转录病毒生成细胞时加入的物质，如12-肉豆蔻酸13-醋酸佛波醇酯(TPA)(phorbol 12-myristate13-acetate)和地塞米松[Gene therapy，2：547-551(1995)]以及上述的丁酸钠。
能用于本发明的具有结合逆转录病毒活性的功能性物质的例子包括，但并不限于，纤连蛋白的肝素-II的域、成纤维细胞生长因子、V型胶原蛋白、多聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖以及与这些功能性物质有相同功能的物质(如具有肝素结合位点的功能性物质)。此外，可应用所述功能性物质的混合物、含有该功能性物质的多肽、该功能性物质的聚合物和该功能性物质的衍生物等。
用化学方法修饰功能性物质可以增强其结合病毒的活性。化学修饰的例子包括：激活所应用的功能性物质的氨基酸残基，或向功能性物质内导入硷性残基。例如，用水溶性的碳化二亚胺如1-乙基-3-二甲氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐激活羧基基团来修饰肽或蛋白质组成的功能性物质的游离羧基基团以增加对逆转录病毒的结合活性。此外，通过应用这类激活的羧基将硷性残基如氨基导入到所述功能性物质中可增加所述结合逆转录病毒的活性。
本发明中使用的具有结合靶细胞活性的功能性物质的例子包括，但不限于，具有结合靶细胞的配体的物质。所述配体包括：细胞粘附蛋白、激素或细胞因子、抗细胞表面抗原的抗体、多糖、糖蛋白、糖脂、来源于糖蛋白或糖脂的糖链以及靶细胞的代谢物。此外，还可以用含有所述功能性物质的多肽、所述功能性物质的聚合物、所述功能性物质的衍生物、所述功能性物质的功能相同的物质等。
能特异性结合到靶细胞的抗体特别有助于将基因特异而有效地导入特异性细胞。能用于本发明的抗体并不限于某一特异类型。可适当地选用抗导入基因的靶细胞上表达的抗原的抗体。可用已知的方法产生这样的抗体。此外，也可以用目前已商品化的许多的抗体。所述抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，只要其具有所需的诸如细胞特异性的特性。另外也可应用经已知的技术修饰的抗体或抗体的衍生物如人源化抗体、Fab片段或单链抗体。
不同细胞各自的白细胞抗原(也被称为CD抗原)的表达已有详细的研究。因此，在本发明的基因导入方法中，通过选择并应用能识别目的靶细胞表达的CD抗原的抗体可高度特异地将基因导入靶细胞。例如，用抗CD4抗体将基因直接导入辅助性T细胞，或用抗CD34抗体将基因导入造血干细胞。
此外，可以使用糖蛋白、层粘连蛋白作为具有结合靶细胞活性的功能性物质将基因有效地导入不同的靶细胞，例如，造血干细胞。可用于本发明的层粘连蛋白可来源于小鼠或人，或者是其片段，只要其具有结合靶细胞的活性。在下面所述的实施例中，层粘连蛋白的糖链在用层粘连蛋白进行基因导入时起重要作用。因此，本发明的方法中也使用了根据已知的方法从层粘连蛋白释放出的糖链。此外，本发明中还可使用象层粘连蛋白一样的高甘露糖型N-联糖链的糖蛋白或从糖蛋白释放的或化学合成的糖链。另外，可以应用连接有上述糖链和蛋白质或相似物。例如可优先选用具有结合逆转录病毒活性以及与其连接的所述糖链的功能性物质进行基因导入。
上面提到的高甘露糖型糖链并不限于某一特殊类型，只要分子内有1到20个甘露糖残基即可。在本发明方法中优先选用在其非还原末端有甘露糖残基的糖链。可以应用连接于另一适当的分子如生物分子(例如，单糖、寡糖、多糖、氨基酸、肽、蛋白质或脂质)或人工合成物质如合成的大分子的所述糖链。
以具有(甘露糖)n-(GlucNAc)2为代表的结构举例说明来源于有机体的典型的高甘露糖型糖链[Protein，Nucleic Acid and Enzyme，43：2631-2639(1998)]。例如，在本发明基因导入方法中优先选用(但不限于)的具有上述结构的糖链(甘露糖)9-(GlucNAc)2，其分子中含有9个甘露糖残基(该糖链的结构示于图1)。
以上所述的功能性物质可获自天然形成的、人工制备的(如通过重组DNA技术或化学合成技术)、或者将天然形成的和人工制备的物质的结合起来制备的物质。另外，可将具有逆转录病毒结合位点的功能性物质和另一具有靶细胞结合位点的功能性物质的混合物用于基因导入，可应用WO 97/18318所述的功能性物质。作为选择，还可应用在单一分子中既有逆转录病毒结合位点又有靶细胞结合位点的功能性物质。可应用基本不含与其天然相关的其它蛋白质的功能性物质。另外，可将所述功能性物质或所述功能性物质的组合物与用于培养靶细胞的培养基、细胞生长因子等一起组合制备成基因导入试剂盒。
根据已在如J Biol Chem.，256：7277(1981)；J Cell Biol.，102：449(1986)或J Cell Biol.，105：489(1987)中所述的方法，可从天然材料中制备大致纯的用于本发明的方法中的纤连蛋白或其片段。还可按照美国专利第5,198,423号所述的用重组DNA技术制备所述纤连蛋白或其片段。具体地说，在上述专利的公告中详细地描述了，含肝素-II域即逆转录病毒结合位点的纤连蛋白片段，如包括在下述实施例中应用的CH-296，H-271，H-296和CH-271的重组多肽，以及获得这些片段的方法。这些片段可经培养以下大肠杆菌株获得，如在公告中描述的以如下保藏号保藏在国立生命科学与人体技术研究所、工业科学和技术局、国际贸易与工业部，1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken的大肠杆菌株：FERM P-10721(H-296)(原保藏日期：1989年5月12日)；FERM BP-2799(CH-271)(原保藏日期：1989年5月12日)；FERM BP-2800(CH-296)(原保藏日期：1989年5月12日)和FERM BP-2264(H-271)(原保藏日期：1989年1月30日)。另外，还可用已知的重组DNA技术修饰大肠杆菌株内的质粒制备有代表性的来源于这些片段的片段。在以上描述的纤连蛋白片段中，H-296具有VLA-4结合区多肽、CH-271具有VLA-5结合区肽、而CH-296具有所述两个结合区[Nature Medicine，2：876-882(1996)]。
在所述功能性物质存在下，用逆转录病毒感染靶细胞可有效地获得基因导入细胞。可根据传统的方法进行所述逆转录病毒的感染，如在37℃，5％CO2中培养。根据所述靶细胞或实验对象可适当改变这些条件和培养时间。
在G0期时，靶细胞不会被逆转录病毒感染。因此，最好经预刺激靶细胞诱导所述细胞进入细胞周期。为此，在用逆转录病毒感染所述靶细胞前，先将靶细胞培养于有适于靶细胞的生长因子存在的培养基中。例如，将不同的细胞因子如白细胞介素-3、白细胞介素-6和干细胞因子用于预刺激骨髓细胞或造血干细胞以进行基因导入。
已知在逆转录病毒感染中涉及细胞表面的受体。已知硷性氨基酸转运蛋白和磷酸转运蛋白分别作为亲嗜性病毒和双嗜性病毒的受体而起作用[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：11407-11413(1996)]。通过在硷性氨基酸或磷酸盐、或盐或其前体浓度降低的培养基中预处理所述靶细胞来激活所述转运蛋白的表达或代谢，使靶细胞对病毒感染敏感是可能的。
使人惊奇的是，本发明者发现激活铁传递蛋白受体(目前还不知其是否与病毒感染相关)也能增加逆转录病毒感染或基因导入效率。可通过但不限于在含浓度限制的铁的培养基中处理靶细胞来激活铁传递蛋白受体。例如可应用加入去铁胺螯合了铁的培养基。
应用铁传递蛋白激活的基因导入最好也在上述功能性物质存在下进行。
本发明的方法中用作基因导入的靶细胞的细胞实例包括但不限于干细胞、造血细胞、非粘附的低密度的单核细胞、粘附细胞、骨髓细胞、造血干细胞、外周血干细胞、脐带血细胞、胎儿造血干细胞、胚原性干细胞、胚胎细胞、原生殖细胞、卵母细胞、卵原细胞、卵细胞、精母细胞、精子，CD34阳性细胞、c-kit阳性细胞、多能造血祖细胞、单潜能造血祖细胞、红细胞样的前体细胞、淋巴样母细胞、成熟血细胞、淋巴细胞、B细胞、T细胞、成纤维细胞、成神经细胞、神经细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝细胞、成肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、癌细胞、骨髓瘤细胞、白血病细胞等。对于可从血液或骨髓获得的造血细胞优先使用本发明的方法，因为这些细胞相对较易得到，并且培养和维持这些细胞的技术也已建立。特别是，如果想要导入的基因长期表达，血液祖细胞如造血干细胞、CD34阳性细胞、c-kit-阳性细胞和多能造血祖细胞是合适的靶细胞。
例如，通过以下的步骤可进行用造血干细胞作为靶细胞的基因治疗。
首先，从供体处收集含有造血干细胞的原料，如骨髓组织、外周血和脐带血。可将这些组织直接用于基因导入过程。然而，通常用密度梯度离心法等制备含有造血干细胞的单核细胞部分，或用细胞表面的标志分子如CD34和/或c-kit进一步纯化造血干细胞。用重组逆转录病毒载体感染所述含有造血干细胞的原料，可按本发明的方法将目的基因插入所述载体中，如果需要，可用适当的细胞生长因子进行预刺激后进行。可将这样获得的已导入基因的细胞通过如静脉内给予而移植入接受者体内。虽然所述受者优选为供体自身，但也可以进行同种异体移植。例如，如果将脐带血用作原材料进行的即是所述同种异体移植。
一些用造血干细胞作为靶细胞的基因治疗是补充患者的缺陷或异常的基因(如ADA缺陷或Gaucher’s病的基因治疗)。此外，将抗药基因导入造血干细胞以减轻例如由于用于治疗癌症或白血病的化疗药物而对造血细胞的损伤。
肿瘤疫苗接种治疗已开始作为肿瘤基因治疗的方法而被研究。在这种疗法中，将细胞因子的基因导入癌细胞，使该肿瘤细胞的增殖能力消失，然后将该细胞再输回病人体内以促进肿瘤免疫[HumanGene Therapy，5：153-164(1994)]。此外，还试图用基因治疗法治疗艾滋病。即使这样，仍需考虑以下步骤。在此过程中，将编码能干扰HIV(人类免疫缺陷性病毒)复制或基因表达的核酸分子的基因(例如反义核酸或核酶)导入感染了HIV的T细胞(艾滋病的病因)中[如J.Virol.，69：4045-4052(1995)]。
如上述详细说明，应用本发明可将基因高效率和高特异性地导入靶细胞。此外，本发明的所述方法不需要特殊的设备或仪器且对不同的逆转录病毒载体和靶细胞均有效。
实施例
以下实施例更详细地阐明了本发明，但是不能解释为限制本发明的范围。
实施例1
从纤连蛋白制备多肽
根据美国专利第5,198,423号所述方法，从含有重组质粒pHD101的大肠杆菌HB101/pHD101(FERM BP-2264)中制备来源于人的纤连蛋白的一种多肽H-271，所述重组质粒含有编码所述多肽的DNA。
根据以上提及的公开专利描述的方法，从含有pHD102重组质粒的大肠杆菌HB101/pHD102(FERM P-10721)中制备来源于人的纤连蛋白的一种多肽H-296，所述重组质粒含有编码所述多肽的DNA。
按以下方法制备多肽CH-271。
简而言之，根据以上提及的公开专利描述的方法培养大肠杆菌HB101/pCH101(FERM BP-2799)，从该培养物中获得CH-271。
按以下方法制备多肽CH-296。
简而言之，根据以上提及的公开专利描述的方法培养大肠杆菌HB101/pCH102(FERM BP-2800)。从该培养物中获得CH-296。
按以下方法制备多肽C-274。
简单地说，根据美国专利号5,102,988所述方法培养大肠杆菌JM109/pTF7221(FERM BP-1915)，从该培养物中获得C-274。
按照WO 97/18318描述的方法制备自V型胶原蛋白、ColV衍化的具有结合逆转录病毒活性的多肽。
实施例2
逆转录病毒载体的构建和逆转录病毒上清的制备
将逆转录病毒质粒，即含有新霉素磷酸转移酶基因的PM5neo载体[Exp.Hematol.，23：630-638(1995)]，导入GP+E-86细胞(ATCCCRL-9642)。将细胞培养于含10％胎牛血清(FCS；Gibco)、50 IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素(两者均得自Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；Bio Whittaker)中。所有在以下过程中使用的DMEM均含有上述提到的抗菌素。含PM5neo病毒的上清按下述过程制备：当上述病毒生成细胞在10-cm的包被有明胶的培养皿(IwackiGlass)中长到半融合时，加4ml含10％FCS的DMEM培养基，培养过夜，收集上清。将这样收集的培养上清用0.45微米的滤膜(Millipore)过滤以制备病毒上清的贮存液，将其于-80℃保存备用。
根据上述步骤，从以下细胞中制备病毒上清。将含有新霉素磷酸转移酶基因和增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因的逆转录病毒质粒pLEIN (Clontech)导入其中的亲嗜性包装细胞BOSC23[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：8392-8396(1993)]和双嗜性包装细胞CRIP[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：6460-6464(1988)]。在下文中，分别将从BOSC23细胞中制备的病毒称为Eco-EGFP，从CRIP 细胞中制备的病毒称为Ampho-EGFP。
此外，根据上述步骤，从含有逆转录病毒质粒TKNeo载体[J.Exp.Med.，178：529-536(1993)](该载体含有新霉素磷酸转移酶基因)的GP+Env Am12(ATCC CRL-9641)细胞制备病毒上清。应用含10％的小牛血清(CS，购自Gibco)替代10％FCS的DMEM培养基。
根据标准的方法测定病毒上清的滴度[J.Virol.，62：1120-1124(1988)]，该方法应用新霉素磷酸转移酶基因导入MH/3T3细胞(ATCCCRL-1658)的效率作为指标。计算每毫升上清中含有的感染病毒颗粒的数目(cfu/ml)。在该计算值即所述上清滴度的基础上，决定下文实验中需加的病毒上清的量。
实施例3
具有结合逆转录病毒活性的功能性物质的制备及其活性测定
在未经任何处理的96孔微量细胞培养板(Falcon)的每个孔内加入50μl含有80μg/ml H-271、H-296、C-274、CH-271、CH-296、CoIV、人硷性成纤维细胞生长因子(bFGF；Progen)、肌腱蛋白(Gibco)或表皮生长因子(EGF；Takara Shuzo)的溶液或50μl的2％小牛血清白蛋白(BSA，Sigma)。将所述培养板置于4℃过夜，然后用磷酸盐缓冲液(PBS，Roman Kogyo)洗涤两次。作为选择，将所述板按上述方法处理后，每孔加入0.1 ml用无菌纯水配制的4 mg/ml的1-乙基-3-二甲氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐(Sigma)溶液。使其在37℃反应2小时。将所述板用纯水彻底洗涤以制备成经碳化二亚胺处理的板。将这些板置于4℃，直到进行病毒感染实验。
将生长于含10％FCS、50 IU/ml青霉素，50μg/ml链霉素的RPMI1640培养基(Bio Whittaker)中的104的小鼠白血病L1210细胞(ATCCCCL-219)和50μl PM5neo病毒上清(104cfu/ml)加入所述微量培养板的孔中。培养24小时后，将培养基换成含有终浓度为0.75mg/ml的G418(Gibco)的相同培养基，然后将该板再培养48小时。按照部分修改的S.Kim等[Gene Therapy，3：1018-1020(1996)]描述的方法测定G418抗性细胞，所述方法中用Premix WST-1试剂(Takara Shuzo)显色后测定450nm的吸光度。培养后，将按10ul/100μl培养液将WST-1试剂加入到孔内，将该板在37℃继续培养4小时。用微量板阅读仪测定450nm和650nm的吸光度，并计算所述吸光度间(450nm-650nm)的差值。将获自用2％BSA包被但未经碳化二亚胺处理的板的值作为本底。表1是三次实验结果的总结。
表1
功能性物质   未经处理 用碳化二亚胺处理
实验1 BSA   0.000±0.011 未做
CH-271   2.099±0.010 2.814±0.079
实验2 BSA   0.000±0.007 0.224±0.031
H-271   0.777±0.016 0.994±0.029
H-296   0.474±0.014 0.666±0.021
C-274   -0.068±0.017 0.100±0.033
CH-271   0.382±0.017 0.425±0.019
CH-296   0.363±0.023 0.460±0.007
CoIV   0.644±0.006 0.847±0.033
bFGF   0.425±0.014 0.580±0.046
肌腱蛋白   0.060±0.021 0.323±0.037
EGF   0.030±0.021 0.077±0.038
(均数±标准差)
如表1所示，观察到已知的具有结合病毒活性的功能性物质能增加基因导入效率，例如H-271、H-296、CH-271、CH-296、ColV和bFGF。此外，当应用无结合病毒活性的物质，如C-274、肌腱蛋白、EGF和BSA，以及用碳化二亚胺处理时，G418抗性细胞的出现增加。
下一步，将CH-296作为功能性物质按下述方法进行实验：
将0.5ml的40μg/ml CH-296加入到未经处理的用于细胞培养的24孔板(Falcon)的每个孔内。将所述板置于4℃过夜，然后用PBS(pH 5.8)洗涤。在每孔中加入用PBS(pH 5.8)配制并含有不同浓度的1，2-乙二胺[(NH2(CH2)2NH2；Nacalai Tesque]、1，3-丙二胺[(NH2(CH2)3NH2；Nacalai Tesque]、腐胺[(NH2(CH2)4NH2；NacalaiTesque]的10mg/ml的1-乙基-3-二甲氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐(Sigma)625μl。将所述板于37℃孵育2小时。在此过程中，经碳化二亚胺的介导，将氨基导入CH-296分子的羧基中。用PBS洗涤该板3遍，然后用2％的甘氨酸/PBS、再用2％BSA/PBS进行封闭。
将导入有逆转录病毒载体质粒pLEIN的GP+E86细胞培养于含有10％CS的DMEM培养基中。然后从培养物中收集上清。将该上清稀释制备成1×105cfu/ml的浓度的上清，取0.5ml该病毒上清加入到所述板的各孔中。将该板孵育4小时。然后向孔中加入1×104NIH/3T3细胞。将该板再培养2天。培养后，用细胞分离(detachment)缓冲液(Bio Whittaker)收集细胞并洗涤。用FACSVantage(BectonDickinson)流式细胞仪在激发光波长为488nm，发射光波长为515-545nm时测定EGFP-表达细胞。用基因导入效率表示病毒结合到培养板上的能力。结果示于图2。
如图2所示，随着用于导入氨基的二氨基化合物的浓度增加，结合病毒的能力也增加。与用未经处理的CH-296观察到的结合力比较，当腐胺、1，3-丙二胺或1，2-乙二胺在反应中的应用浓度为2mM时，可观察到所述病毒结合力增加了2倍。
实施例4
层粘连蛋白对促进基因导入效率的影响
将小鼠的层粘连蛋白(Gibco)或人层粘连蛋白(Takara Shuzo)与具有结合病毒活性的功能性物质联合应用以进行基因导入实验。用于实验的未经处理的24孔细胞培养板(Falcon)按以下两种方法包被这些功能性物质。
鸡尾酒法：将两种功能性物质的混合物加入所述板中。将该板置于4℃过夜。用2％BSA在37℃孵育20分钟封闭该板，然后用PBS洗涤。
预先包被法：在所述板内加入具有结合病毒活性的功能性物质的溶液，将该板置于4℃过夜。去除溶液。在该板中再加入层粘连蛋白溶液。将该板在37℃孵育2小时，用2％BSA封闭，然后用PBS洗涤。
用0.5ml所述功能性物质溶液包被各孔。
向各孔中加入105 L1210细胞和0.5ml的Eco-EGFP病毒上清(105cfu/ml)。将该板孵育24小时。孵育后，用细胞分离缓冲液(BioWhittaker)收集并洗涤细胞。用FACSVantage(Becton Dickinson)流式细胞仪在激发光波长为488nm，发射光波长为515-545nm时分析EGFP-表达细胞。计算基因导入效率(EGFP-表达细胞与总细胞的比例)。实验结果示于表2-5。
表2
功能性物质(80μg/ml) 加入的层粘连蛋白的浓度及包被方法
未加 5μg/ml 20μg/ml 20μg/ml
- 预包被 预包被 鸡尾酒法
BSA(2％) 1.12 5.20 6.55 6.22
H-271 5.41 11.19 17.52 9.67
H-296 4.83 5.96 5.51 6.95
CH-271 4.00 6.72 13.73 17.34
CH-296 6.48 7.08 6.02 16.77
基因导入效率以％表示。
表3
功能性物质(80μg/ml) 加入的层粘连蛋白的浓度
未加 20μg/ml 40μg/ml 60μg/ml
BSA(2％) 1.36 5.14 4.74 3.82
CH-271 16.89 32.05 24.45 23.46
CH-296 17.80 18.79 20.44 19.31
根据鸡尾酒法包被培养板。基因导入效率以％表示。
表4
加入CH-296的浓度 加入的层粘连蛋白的浓度
未加 5μg/ml 10μg/ml 20μg/ml
未加 0.69 4.09 6.76 6.89
10μg/ml 4.67 11.81 9.36 7.01
20μg/ml 5.16 11.64 10.57 8.49
40μg/ml 4.41 10.49 11.52 9.11
80μg/ml 5.11 10.87 11.48 11.10
160μg/ml 5.19 9.04 11.84 10.88
320μg/ml 未做 未做 10.27 10.54
根据鸡尾酒法包被培养板。基因导入效率以％表示。
表5
加入CH-271的浓度 加入的层粘连蛋白的浓度
未加 5μg/ml 10μg/ml 20μg/ml
未加 0.69 4.09 6.76 6.89
10μg/ml 4.61 7.16 6.28 6.34
20μg/ml 4.71 12.98 8.98 5.99
40μg/ml 3.64 17.32 14.50 8.78
80μg/ml 3.60 18.30 14.76 9.15
160μg/ml 3.52 16.34 17.08 12.67
根据鸡尾酒法包被培养板。基因导入效率以％表示。
如表2和表3所示，本实验证明，将人或小鼠的层粘连蛋白与具有结合病毒活性的功能性物质联合应用于用逆转录病毒进行的基因导入时，不管是否用固定法，均能非常有效地将基因导入靶细胞。已测定了用CH-296或CH-271和层粘连蛋白按鸡尾酒法包被的培养板的基因导入效率。表4和表5显示，当CH-296/小鼠层粘连蛋白或CH-271/小鼠层粘连蛋白联合应用时，其最佳比例分别是8∶1(例如80μg/ml∶10μg/ml)和16∶1(例如80μg/ml∶5μg/ml)。与未加层粘连蛋白的基因导入效率相比，CH-296和CH-271的基因导入效率分别增加了2.6倍和5.1倍。
实施例5
应用层粘连蛋白将基因导入小鼠c-kit阳性的骨髓细胞中
小鼠c-kit阳性的骨髓细胞按下述方法制备。取6-8周龄C3H/He雌性小鼠(Japan SLC)，将从股骨收集的骨髓细胞用Ficoll-Hypaque(1.0875g/ml，Pharmacia)进行密度梯度离心以制备含有低密度的单核细胞的部分。用PBS洗涤该细胞，用红细胞裂解缓冲液(155mMNH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM EDTA，pH 7.4)溶解红细胞，再用PBS洗涤该细胞。按1μg/107细胞将抗鼠CD117抗体(Pharmingen)加入获得的骨髓细胞内。将该混合物在冰上反应30分钟。用含5mM EDTA和0.5％BSA的PBS洗涤所述细胞，然后悬浮在相同的缓冲液中。按20μl/107细胞将结合在微珠上的第二抗体(Miltenyi Biotec)加入该细胞内。将所述混合物于4℃反应30分钟。用上述提到的缓冲液进行洗涤并悬浮所述细胞。用MACS系统(Miltenyi Biotec)收集结合到所述微珠上的细胞以获取c-kit-阳性细胞。
在病毒感染前，按照Luskey等所述方法[Blood，80：396-402(1992)]预刺激所述小鼠c-kit-阳性骨髓细胞。简要地说，将细胞培养于含有20％FCS、20ng/ml重组小鼠白介素-3(Genzyme)、50ng/ml重组人白介素-6(Genzyme)、100ng/ml重组小鼠干细胞因子(Genzyme)、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的α-MEM(BioWhittaker)中，在5％CO2存在下，于37℃培养2天。
将不同浓度的小鼠层粘连蛋白和80μg/ml的CH-271的混合物按鸡尾酒法包被未经处理的24孔微量细胞培养板。将该板用2％BSA封闭30分钟，然后用PBS洗涤。用2％BSA代替CH-271制备对照板。在该微量板的各孔中加入105的c-kit阳性的骨髓细胞和0.5ml的Eco-EGFP病毒上清(105cfu/ml)进行病毒感染。孵育48小时后，在各孔中加入0.5ml新鲜培养基，将该板再孵育24小时。培养后，用细胞分离缓冲液收集并洗涤该细胞。按实施例4所述方法计算基因导入效率。两次实验结果示于表6和表7。
表6
加入的层粘连蛋白的浓度
未加 10μg/ml  20μg/ml
  BSA 0.18 0.25  0.16
  CH-271 0.69 3.93  2.64
基因导入效率以％显示。
表7
  加入的层粘连蛋白的浓度
  未加   2.5μg/ml   5μg/ml   10μg/ml
  BSA   1.37   1.80   2.63   5.38
  CH-271   9.95   16.12   15.28   17.00
基因导入效率以％显示。
如表6和表7所示，本实验证明根据鸡尾酒法在用小鼠层粘连蛋白和具将有结合病毒活性的功能性物质CH-271包被的培养板上，用逆转录病毒感染c-kit-阳性的骨髓细胞时，也观察到非常强的促进基因导入效率的作用。与单独使用CH-271比较，CH-271与层粘连蛋白联合应用可增加基因导入效率最多达5.7倍。
此外，按上述方法用滴度为107cfu/ml的Eco-EGFP病毒上清进行相同的步骤。三次实验的基因导入效率的均值示于表8。结果也证明，当将具有结合逆转录病毒活性的功能性物质与层粘连蛋白联合应用时，也增加所述基因导入效率。
表8
 加入的层粘连蛋白的浓度
 未加   2.5μg/ml  4μg/ml  6μg/ml
  BSA  5.88   11.77  19.33  27.09
  H-271  25.12   53.39  55.65  56.45
  CH-271  43.06   66.87  73.67  77.76
  CH-296  76.84   81.57  83.30  85.48
基因导入效率以％显示。
实施例6
用层粘连蛋白将基因导入获自小鼠脾细胞的CD-3阳性T细胞
按下述方法制备获自小鼠脾细胞的CD-3阳性T细胞。从6-8周龄的C3H/He雌性小鼠的脾收集细胞。将该细胞通过100-μm的筛目(Falcon)去除残渣。用含10％FCS的Hanks’平衡盐溶液(HBSS，BioWhittaker)洗涤所得的细胞，并用红细胞溶解缓冲液溶解红细胞，用HBSS再次洗涤所述细胞。将获得的细胞通过30-μm的筛目(MiltenyiBiotec)去除残渣，再用柱子纯化浓缩CD3-阳性T细胞(R&D系统)。按下述方法预刺激用于病毒感染实验的小鼠CD3-阳性T细胞。将用于预刺激的细胞培养于固定有抗鼠CD3抗体和抗鼠CD28抗体(两种均为1μg/ml，Pharmingen)的Petri培养皿中。该Petri培养皿中含添加有10％FCS、50单位/ml的青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI1640培养基(Bio Whittaker)。将所述细胞于37℃、5％CO2下培养2天。
如实施例5所述，用含有20μG/ml的小鼠层粘连蛋白和80μg/ml的CH-296的混合物包被24孔培养板。在该微量培养板的各孔中加入105CD3-阳性T细胞和0.5ml的Eco-EGFP病毒上清(105cfu/ml)进行病毒感染3小时。另外再加入含10％FCS、500单位/ml的重组小鼠的白细胞介素-1α(Genzyme)、10ng/ml的重组小鼠白细胞介素-2(Genzyme)、50单位/ml的青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基。继续培养48小时。培养后，用细胞分离缓冲液收集并洗涤细胞。按实施例4所述方法计算基因导入效率。结果示于表9。
表9
功能性物质 导入效率(％)
BSA(对照) 0.83
CH-296 8.78
CH-296/小鼠层粘连蛋白 13.20
基因导入效率以％显示。
如表9所示，本实验证明由于层粘连蛋白的共同存在，基因导入到小鼠CD3-阳性T细胞的效率增加。
实施例7
基因导入中层粘连蛋白分子的糖链的参与
如实施例5所述，按50μl/孔用含有5μg/ml的小鼠层粘连蛋白和80μg/ml的CH-271的混合物包被96孔微量细胞培养板。用不同的具有切割糖链的活性酶处理培养板，观察对基因导入效率的影响。
用以下的酶处理培养板：配制在50mM的柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)中含有500mU/ml O-聚糖酶(内切-α-N-乙酰半乳糖胺酶，Seikagaku Corp.)、500mU/ml的内切糖苷酶H(内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶H，Seikagaku Corp.)、250mU/ml内切-β-半乳糖苷酶(Seikagaku Corp.)和2mU/ml的α-甘露糖苷酶(Seikagaku Corp.)的酶溶液。配制在100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)中含有250mU/ml糖肽酶F(肽：N-糖苷酶F，Takara Shuzo)的酶溶液。在各孔中加入酶溶液各50μl，于37℃反应20小时。然后用PBS洗涤所述培养板三次并将其用于病毒感染实验。
在所述微量板的各孔中加入104生长于含10％FCS、50单位/ml的青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中的小鼠白血病细胞L1210以及50μl PM5neo病毒上清(104cfu/ml)。将该板培养24小时。将培养基换成含终浓度为0.75mg/ml G418(Gibco)的相同的培养基。将该板再培养48小时。按实施例3所述方法评价G418抗性细胞。结果示于表10。表10是3组实验结果的总结。
表10
功能性物质 酶处理 吸光度
BSA(2％，对照) 无 0.000±0.030
CH-271(80μg/ml) 无 1.376±0.012
CH-271/层粘连蛋白(80μg/ml∶5μg/ml) 无 1.781±0.062
CH-271/层粘连蛋白 O-聚糖酶 1.886±0.071
(80μg/ml∶5μg/ml)
CH-271/层粘连蛋白(80μg/ml∶5μg/ml) 内切糖苷酶H  1.214±0.017
CH-271/层粘连蛋白(80μg/ml∶5μg/ml) E-β-半乳糖苷酶  1.939±0.083
CH-271/层粘连蛋白(80μg/ml∶5μg/ml) α-甘露糖苷酶  1.657±0.033
CH-271/层粘连蛋白(80μg/ml∶5μg/ml) 糖肽酶F  1.610±0.036
如表10所示，与单独使用CH-271比较，当联合使用CH-271与层粘连蛋白时，G418抗性细胞的出现增多。用内切糖苷酶H处理用层粘连蛋白包被的培养板，可完全去除层粘连蛋白的促进基因导入的作用。此外，用α-甘露糖苷酶或糖肽酶F处理所述培养板，也一定程度地减低基因导入效率。根据关于层粘连蛋白分子的糖链的报道[Biochim.Biophysi.Acta，883：112-126(1986)]，大多数的层粘连蛋白分子的糖链是与天冬酰胺结合的N-联糖链。有43个分子的N-联糖链与层粘连蛋白分子结合。在这些糖链中，用内切糖苷酶H处理可释放高甘露糖型的天冬酰胺-N-联糖链。用α-甘露糖苷酶处理也观察到基因导入效率减低的事实提示层粘连蛋白分子的糖链起着重要作用。这种糖链具有可被α甘露糖苷酶裂解的含有α1-2-和/或α1-6-键合甘露糖的结构，以(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn和/或(甘露糖)6-(GlucNAc)2-Asn表示。如上所述，本实验证明层粘连蛋白促进基因导入的作用是由于层粘连蛋白分子的糖链的作用，特别是高甘露糖型的糖链。
下面实验证实了(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn参与基因导入的过程。
将从去脂的大豆粉(Sigma)中用固定有乳糖的Sepharose CL-2B(Pharmacia)制备的大豆凝集素1克热变性，然后用溶于20ml含10mMCaCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中的肌动蛋白酶E(ActinaseE，Kaken Pharmaceutical)20 mg于37℃消化2天。用热将酶灭活后，将所述混合物上样到Sephadex G-15(50 ml)柱和Sephadex G-25(150ml)的层析柱上层析纯化(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn。图1所示为去除了天冬酰胺残基的(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn的结构。
制备经共价键结合固定有CH-271和(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn的微量培养板。简要地说，用4mg/ml水溶性的碳化二亚胺溶液于37℃激活96孔的碳类培养板(ELISA Carbo-type plate)(SumitomoBakelite)2小时，然后用无菌水洗涤3次。在经激活处理的96孔碳类培养板的各孔中加入50μl的2％BSA或80μg/ml的CH-271和不同浓度的(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn的各溶液。将该板于37℃固相化反应2小时。用0.2％的甘氨酸溶液于4℃封闭该板15小时，然后用于以下的基因导入实验。
在所述微量板的各孔中加入103L1210细胞和0.1ml Eco-EGFP病毒上清(106cfu/ml)。将该板培养48小时后，在各孔中加入0.1ml含FCS、青霉素和链霉素的新鲜RPMI 1640培养基。将该板继续培养24小时。收集并洗涤所述细胞。按实施例4所述方法计算基因导入效率。两次独立实验的平均结果示于表11。
表11
功能性物质(80μg/ml)                                 加入的糖链浓度
  未加   2.8μg/ml   5.5μg/ml   11.1μg/ml   22.1μg/ml   44.2μg/ml  88.5μg/ml
BSA(2％)   1.68   未做   未做   未做   1.24   1.65  未做
CH-271   26.9   27.1   29.9   34.7   39.2   52.0  58.7
基因导入效率以％显示。
如表11所示，在固定有(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn和CH-271的所述板的孔中，基因导入效率的增加依赖于所用糖链的浓度。因此，证实增加的基因导入效率归因于具有与层粘连蛋白分子相同结构的糖链。
实施例8
将抗CD4单克隆抗体用于CD4-阳性细胞的特异性基因导入
如实施例4所述将1μg/ml的抗小鼠CD4单克隆抗体或抗小鼠CD44单克隆抗体(两者均得自Pharmingen)和80μg/ml的H-271、CH-271或CH-296一起包被未经处理的24孔微量细胞培养板。根据预包被方法进行H-271的包被，而根据鸡尾酒法进行CH-271和CH-296的包被。
在该微量板的各孔中加入0.5ml Eco-EGFP病毒上清(107cfu/ml)。将该板于32℃孵育3小时，然后用含10％FCS、50单位/ml的青霉素、50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基洗涤。按实施例6所述方法制备从小鼠脾细胞衍生的CD3-阳性T细胞并经预刺激，将105该细胞加入到所述孔内进行病毒感染3小时。然后，在该孔中加入含10％FCS、500单位的重组小鼠白介素-1α、10ng/ml重组小鼠白介素-2、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基。将该板继续培养48小时。培养后，用细胞分离缓冲液收集并洗涤所述细胞，然后用标记有藻红蛋白(PE，Pharmingen)和propiniumiodide(PI，Sigma)的抗小鼠CD4单克隆抗体(Pharmingen)染色。将这些细胞上样到流式细胞仪，用FACSVantage在激发光波长为488nm和发射光波长为515-545nm或562-588nm双相分析活细胞中CD4抗原和EGFP的表达。计算CD4-阳性和CD-4阴性细胞的基因导入效率。结果示于表12。表12是四次实验的总结。
表12
功能性物质 导入CD4-阳性细胞的效率(％) 导入CD4-阴性细胞的效率(％)
BSA(对照) 0.16±0.07 0.11±0.07
抗CD4抗体 0.24±0.19 0.12±0.04
抗CD44抗体 1.92±0.82 1.95±1.00
H-271 31.02±7.34 16.54±4.30
抗CD4抗体/H-271 58.91±8.11 20.32±4.46
抗CD44抗体/H-271 56.08±7.53 40.96±7.04
CH-271 44.63±6.40 26.21±5.73
抗CD4抗体/CH-271 64.81±9.74 25.97±1.25
抗CD44抗体/CH-271 60.29±8.71 44.10±3.56
CH-296 48.81±8.77 29.45±4.70
抗CD4抗体/CH-296 62.93±6.45 30.84±3.27
抗CD44抗体/CH-296 56.79±9.87 41.37±1.14
(均数±标准差)
如表12所示，用包被有单克隆抗体和纤连蛋白片段的培养板进行逆转录病毒的感染时，观察到来源于小鼠脾细胞的CD3-阳性T细胞的基因导入效率增加的作用。
特别应该注意到当抗CD4单克隆抗体与具有结合逆转录病毒活性的功能性物质联合使用进行病毒感染时，基因导入CD4阳性细胞的效率远远高于导入CD4阴性细胞的效率。例如，抗CD4单克隆抗体与H-271联合应用时，基因导入CD4阳性细胞的效率非常高(大约为60％)，而所述基因导入CD4阴性细胞的效率仅约20％。当将CH-271或CH-296作为纤连蛋白片段应用时，观察到相似的结果。
另一方面，98％以上的CD4阳性和CD4阴性细胞均表达CD44抗原。因此，预测当将抗CD44单克隆抗体如上所述用于逆转录病毒感染时，不管所述细胞是否表达CD4抗原，基因导入效率均将增加。
表12的结果证实了这一预测。
实施例9
将抗CD8a单克隆抗体用于CD8阳性细胞的特异性基因导入
除了将H-271用作具有结合逆转录病毒活性的功能性物质，以及将抗小鼠CD8a单克隆抗体(Pharmingen)和抗小鼠CD44单克隆抗体用作抗体外，按实施例8所述方法进行实验。将标记有藻红蛋白(PE；Pharmingen)的抗小鼠CD8a单克隆抗体(Pharmingen)用于检测CD8阳性和CD8阴性细胞。结果示于表13。表13是两次实验结果的总结。
表13
功能性物质 基因导入CD8阳性细胞的效率(％) 基因导入CD8阴性细胞的效率(％)
BSA(对照) 0.22±0.08 0.28±0.00
抗CD8a抗体 0.36±0.20 0.28±0.02
抗CD44抗体 0.98±0.34 0.92±0.20
H-271 20.08±4.71 26.43±6.07
抗CD8a抗体/H-271 36.07±1.57 24.42±0.55
抗CD44抗体/H-271 46.93±0.88 47.16±0.75
(均数±标准差)
如表13所示，当抗CD8a单克隆抗体与纤连蛋白片段联合应用时，观察到来源于小鼠脾细胞的CD3-阳性T细胞的基因导入效率增加的作用。
如实施例8中观察到的，当使用抗CD8a单克隆抗体时，观察到表达被该抗体识别的CD8抗原表达细胞的高基因导入效率。另一方面，当用抗CD44单克隆抗体时(98％以上的CD8阳性和CD8阴性细胞均表达CD44)，在这两种细胞之间未发现基因导入效率的差异。
实施例8和9的实验结果很有意义，这些结果证实如果将可特异性结合所述靶细胞的抗体和具有结合病毒活性的功能性物质的混合物(鸡尾酒样)包被培养容器，用含有目的基因的逆转录病毒感染培养容器中含有靶细胞的细胞群体时，可将目的基因特异地导入该靶细胞中。
实施例10
利用抗体的细胞特异性基因导入
如实施例4所述，根据鸡尾酒方法用80μg/ml的CH-271和1μg/ml一种抗不同细胞表面抗原的单克隆抗体(抗CD4、抗CD8、抗CD44、抗CD49c、抗CD49d和抗CD49e的抗体，均来自Pharmingen)包被未经处理的24孔微量细胞培养板。
将K562(人慢性髓性白血病细胞，ATCC CCL-243)、HSB-2(人急性淋巴母细胞性白血病细胞，CCRF-HSB-2，ATCC CCL-120.1)、MOLT-3(人急性淋巴母细胞性白血病细胞，ATCC CRL-1552)和TF-1(人红白血病细胞，ATCC CRL-2003)作为靶细胞，用标记的各自的单克隆抗体对这些细胞进行流式细胞仪分析以测定相应抗体的抗原表达。
在所述微量板的各孔中加入0.5ml的Ampho-EGFP病毒上清(1×106cfu/ml)。将该板于32℃培养3小时，然后用含10％FCS、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基洗涤。在各孔中加入悬浮在1ml培养基中的1×105各不相同细胞进行病毒感染。继续培养3天后，用细胞分离缓冲液收集并洗涤该细胞，按实施例4所述方法用流式细胞法计算EGFP基因导入效率。
结果示于表14，显示的结果是三次独立实验的平均值。
表14
                                      所用细胞
     HSB-2       MOLT-3        TF-1          K562
所用抗体 基因导入效率(％) CD抗原表达比 基因导入效率(％) CD抗原表达比 基因导入效率(％) CD抗原表达比 基因导入效率(％) CD抗原表达比
无 100 100 100 100
CD4 106.7 - 100.7 +/- 108.8 +/- 104.9 -
CD8 130.4 ++ 130.4 ++ 107.0 - 116.9 -
CD44 173.7 ++ 172.5 ++ 188.9 +++ 135.1 -
CD49c 153.9 +++ 102.7 - 115.6 - 106.3 -
CD49d 159.2 ++ 165.3 +++ 150.3 +++ 97.5 -
CD49e 185.5 +++ 127.5 + 128.9 ++ 172.6 +++
假设未加抗体的相应细胞的基因导入效率为100％，加入抗体的基因导入效率以相对值％表示。
CD抗原表达比(CD ag exp.Ratio)代表FACS测量时阳性细胞的比例(％)，如下所示：
-：10％或更少；+/-：10-30％；+：30-60％；++：60-90％；
+++：90％或更高。
如表14所示，当用鸡尾酒的方法将CH-271作为病毒结合物质并将抗细胞上的抗原的抗体作为细胞结合物质时，抗原表达效率与基因导入效率相关。
此外，以80μg/ml的聚赖氨酸替代CH-271作为具有结合逆转录病毒活性的功能性物质进行基因导入实验。所用的单克隆抗体、细胞和其它实验条件如以上所述。结果示于表15，显示的是三次独立实验的平均结果。
表15
                                  所用细胞
         HSB-2       MOLT-3       TF-1       K562
  所用抗体   基因导入效率(％) CD抗原表达比 基因导入效率(％) CD抗原表达比 基因导入效率(％) CD抗原表达比 基因导入效率(％) CD抗原表达比
  无   100 100 100 100
  CD4   103.3 - 104.1 +/- 98.6 +/- 99.4 -
  CD8   116.3 ++ 136.7 ++ 100.8 - 92.4 -
  CD44   155.5 ++ 144.9 ++ 253.1 +++ 102.6 -
  CD49c   160.1 +++ 104.7 - 116.1 - 100.6 -
  CD49d   138.2 ++ 156.3 +++ 187.7 +++ 103.1 -
  CD49e   142.5 +++ 140.0 + 166.1 ++ 129.2 +++
假设未加抗体的相应细胞基因导入效率为100％，加入抗体的基因导入效率以相对值(％)表示。
CD抗原表达比(CD ag exp.Ratio)代表FACS测量时阳性细胞的比例(％)，如下所示：
-：10％或更少；+/-：10-30％；+：30-60％；++：60-90％；+++：90％或更高。
如表15所示，当用鸡尾酒的方法将聚赖氨酸作为病毒结合物质并将抗细胞上的抗原的抗体作为细胞结合物质时，抗原表达率与基因导入效率相关。
上述两组实验结果证明，根据鸡尾酒方法，将可特异性识别靶细胞表达的抗原的抗体作为细胞结合物质，可以通过基因导入将基因特异性地导入目的靶细胞。
实施例11
将基因导入在含去铁胺的培养基中预培养的靶细胞
将用含10％FCS、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI1640培养基培养的人髓细胞性白血病HL-60细胞(ATCC CCL-240)在感染实验前一天转换到含不同浓度去铁胺(Sigma)的相同培养基中。将所述细胞于37℃、5％CO2存在下培养20小时。使用时用不含去铁胺的新鲜培养基洗涤该细胞，然后按2×105细胞/ml的浓度悬浮细胞并用于下列感染实验。
在未经处理的24孔微量细胞培养板的各孔中加入0.5ml的80μg/ml的CH-271。将该板置于4℃过夜，用2％BSA封闭30分钟并用PBS洗涤。在该微量板的各孔中加入0.5ml的Ampho-EGFP病毒上清(106cfu/ml)。将该板于32℃培养3小时并用含10％FCS、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基洗涤。在各孔中加入105个预培养的HL-60细胞。将该板培养48小时。在各孔中加入0.5ml含10％FCS、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基。继续培养该板24小时。然后按实施例4所述方法测定基因导入效率。结果示于表16和17。
表16
  去铁胺的浓度(μg)   功能性物质   基因导入效率(％)
  未加   BSA(对照)   0.01
  未加   CH-271   0.14
  6.25   CH-271   0.22
  12.5   CH-271   0.27
  25   CH-271   0.35
  50   CH-271   0.71
表17
去铁胺的浓度(μg)   功能性物质 基因导入效率(％)
未加   BSA(对照) 0.02
未加   CH-271 0.25
40   CH-271 11.14
如表16和表17所示，用去铁胺预处理HL-60细胞20小时，就可观察到基因导入效率的增加。已知单独用CH-271时基因导入到HL-60细胞的效率非常低。
实施例12
培养上清中病毒感染抑制物质的存在的检测
将实施例2中制备的TKNeo病毒上清用DMEM、NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)的培养上清或CRIP细胞的培养上清稀释至312.5cfu/ml的浓度用于下列步骤。
在未经处理的24孔微量细胞培养板的各孔中加入0.5ml的32μg/ml的CH-296。将该板置于室温2小时，用2％BSA封闭30分钟并用PBS洗涤。在该板的各孔中加入1ml上述提及的病毒上清和2×104NIH/3T3细胞。将该板于37℃培养过夜。然后将所述细胞培养于含0.75mg/ml的G418的选择性培养基中培养10天。计数形成的集落隆数。将G418抗性克隆数和不含G418的培养基内形成的克隆数之比定义为基因导入效率。结果示于表18。
表18
  稀释液   基因导入效率(％)
  DMEM(对照)   100
  NIH/3T3细胞培养上清   20.6
  CRIP细胞培养上清   15.7
如表18所示，与用DMEM稀释时的基因导入效率比较，当用NIH/3T3细胞培养上清或CRIP细胞培养上清稀释病毒时，所述基因导入效率降至1/5或更低。NIH/3T3细胞是许多包装细胞系，如CRIP细胞和GP+EmvAm12细胞的亲代细胞，可将这些细胞用于生产本实验使用的TKNeo病毒载体的生成细胞。观察到这些细胞的培养上清的抑制逆转录病毒感染的活性的现象提示，用相似包装细胞制备的病毒上清也含有抑制性物质。
实施例13
病毒上清中的病毒感染抑制物质的去除
以下步骤用于去除实施例12中发现的病毒感染抑制物质。将实施例2中制备的TKNeo病毒上清用CRIP细胞的培养上清稀释到5000cfu/ml浓度。将已稀释的上清进一步用DMEM二倍稀释以用作含逆转录病毒的样品。
如实施例11所述，在用CH-296包被的培养板的各孔中加入1ml所述病毒上清。将该板孵育1到5个小时，使病毒颗粒与CH-296接触并结合。然后用PBS洗涤该板3次。在各孔中加入1ml含2×104NIH/3T3细胞的DMEM。对照组将2×104NIH/3T3细胞悬浮于1ml上述提及的病毒上清中并立即转移到用CH-296包被的培养板中。将这些培养板于37℃培养过夜，使所述病毒感染细胞。感染后，将该细胞用含0.75mg/mlG418的选择培养基培养10天，并计数形成的集落数。将G418抗性集落数和不含G418的培养基内形成的集落数之比定义为基因导入效率。结果示于图3。
如图3所示，与对照组的导入效率比较，当病毒颗粒与包被在培养板上的CH-296接触并结合3小时时，观察到较高的基因导入效率。因此证明用上述方法可去除病毒上清中抑制病毒感染的活性。
实施例14
病毒上清中的丁酸钠的去除
通过将逆转录病毒载体质粒pLEIN导入CRIP细胞获得重组逆转录病毒生成细胞，将该细胞培养于含10％CS的DMEM中。当细胞在10厘米的培养皿中生长达半融合时，将培养基换成7ml含10％FCS的RPMI 1640或7ml含5mM丁酸钠(Nacalai Tesque)和10％FCS的RPMI 1640。将细胞培养24小时后，用0.45μm的滤膜过滤上清以获得病毒上清。按实施例2所述方法测定该病毒上清的滴度。不含丁酸钠的病毒上清的滴度为3.3×104 cfu/ml，而含5mM丁酸钠的病毒上清的滴度为2×106cfu/ml。
丁酸钠具有抑制细胞周期从而抑制细胞生长以及诱导细胞分化的活性。因此可能对感染的细胞有不利的影响。下面是对去除病毒上清中的丁酸钠的评估。
将HL-60细胞作为靶细胞。按实施例12所述方法在用CH-296包被的培养板的各孔中加入0.5ml上述提及的病毒上清。将该板于37℃孵育3小时，使病毒颗粒与CH-296接触并结合。孵育后，用PBS洗涤该板3次。在各孔中加入0.5ml含5×104HL-60细胞的10％FCS的RPMI1640培养基。对照组将5×104 HL-60细胞悬浮于0.5ml上述提及的病毒上清中并立即加入到用CH-296包被的培养板中。将这些培养板于37℃培养过夜，使所述病毒感染细胞。孵育后，在各孔中加入1ml的含10％FCS的RPMI 1640培养基。将该板继续培养48小时。然后计数细胞数。此外，根据实施例4所述用流式细胞仪法检测EGFP表达细胞以分析所述基因导入效率。结果示于表19。
表19
实验组/病毒上清 细胞数(细胞/板) 基因导入效率(％)
CH-296
丁酸钠：- 2.0×105 2.21
丁酸钠：+ 1.8×105 52.98
对照
丁酸钠：- 1.7×105 2.74
丁酸钠：+ 4.0×105 35.46
如表19所示，当对照组应用加入丁酸钠制备的病毒上清时，观察到较高的基因导入效率，证实了病毒制备中丁酸钠的作用。然而观察到用所述含丁酸钠的上清时活细胞的数目只有用不含丁酸钠的上清时的1/4或更少，证实丁酸钠抑制细胞生长。另一方面，预先将病毒颗粒与包被在培养板上的CH-296接触并结合，未观察到细胞生长受抑制，而此现象见于应用含丁酸钠的上清的对照组。观察到基因导入效率的增加，而不是减少。因此证明，通过病毒与CH-296接触后的洗涤，排除了丁酸钠的影响，可实现高基因导入效率。
下面用DEAE-葡聚糖进行相似的实验。
将DEAE-葡聚糖(Sigma)按10mg/ml的浓度溶于PBS中。将该溶液用0.22μm滤膜过滤灭菌并将其用于包被培养板。在未经处理的6孔细胞培养板(Iwaki Glass)的各孔中加入1.1ml的混合物，该混合物通过将10体积的PBS与1体积的DEAE-葡聚糖溶液混合所得。将该板于4℃孵育过夜。去除培养板孔中的DEAE-葡聚糖溶液。在各孔中加入2ml的2％BSA溶液处理30分钟。用2ml/孔的PBS洗涤该板3次。对照组除应用PBS替代DEAE-葡聚糖溶液外，按相同步骤制备培养板。
按上述加入丁酸钠的方法，应用通过将逆转录病毒载体质粒pLEIN导入GP+E86细胞[J.Virol.，62：1120-1124(1988)]而获得的重组逆转录病毒生成细胞制备病毒上清。在各孔中加入1ml的病毒稀释液(1.6×106cfu/ml)，该稀释液通过用20体积的含10％CS的DMEM稀释1体积所述病毒上清而获得。将该板于37℃培养2小时，然后用2ml/孔的PBS洗涤该板3次。在各孔中加入5×104 NIH/3T3细胞。将该板于37℃、5％CO2存在下培养3天。培养后，用胰蛋白酶处理并收集所述细胞。按实施例4所述用流式细胞仪法分析EGFP表达细胞以测定基因导入效率。结果示于表20。
表20
  包被 基因导入效率(％)
  DEAE-葡聚糖 26.7
  对照 0.7
基因导入效率是以EGFP阳性细胞与总细胞数之比(％)来表示。
如表20所示，证明DEAE-葡聚糖同样具有结合逆转录病毒的活性，并可将其用于本发明的基因导入方法。
实施例15
应用离心法使功能性物质与逆转录病毒结合
将导入了含有新霉素抗性基因[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：2150-2154(1987)]的逆转录病毒质粒DOL载体的CRIP细胞培养于含10％CS、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM中。按下述方法制备DOL病毒上清。当所述病毒生成细胞在10厘米的培养皿中生长达半融合时，将培养基换成5ml的含10％CS的DMEM培养基。培养24小时后，收集上清并用0.45μm的滤膜(Millipore)过滤该上清。所述病毒上清的滴度为8.7×105cfu/ml。
用于逆转录病毒感染细胞的离心管(50ml聚丙烯圆锥形管，Falcon)按下述方法用CH-296包被。简要地说，将3ml的含40μg/mlCH-296的PBS慢慢地加入该离心管的底部。将该管垂直放置于4℃培养16个小时。将CH-296溶液换成3.5ml含2％BSA的PBS。将该管置于室温下继续孵育30分钟，然后用5ml的Hanks’平衡盐溶液(HBSS，Gibco)洗涤。
按下述方法使DOL逆转录病毒结合到包被有CH-296的离心管的底部。简要地说，将5ml的未经稀释的DOL病毒上清或其10倍、或其100倍的稀释液加入所述离心管中。于25℃以2900×g离心该管3小时，迫使所述逆转录病毒与CH-296结合。作为对照，将上述提及的病毒上清加入到用含40μg/mlCH-296的PBS进行CH-296包被的未经处理的6孔细胞培养板(Falcon)中，形成8/μg/cm2的密度。将该板置于37℃4小时以便于结合并将其用于下面的步骤。
用包被有CH-296的离心管，并通过离心将逆转录病毒强行结合于CH-296，将基因导入NIH/3T3细胞。简要地说，将1×105NIH/3T3细胞加入到用CH-296包被的离心管中，该离心管内有已经离心过的所述病毒上清的系列稀释液中的一种。将该管于37℃孵育3小时(以下称离心法)。作为选择，将上述提及的微量板在相同条件下孵育(此后称结合法)。对照组在用CH-296包被的微量板中加入所述病毒上清和NIH/3T3细胞的混合物，并将该板于37℃孵育3小时。将应用后一种方法所得的结果定义为用传统感染的方法所得的结果，并将其用作对比(此处以下称上清法)。孵育后，收集细胞。按实施例13所述方法测定收集的细胞的基因导入效率。结果示于图4。图4中，水平轴代表病毒上清的稀释度而垂直轴代表基因导入效率。空心条图、阴影条图和实条图分别代表用上清法、结合法和离心法所得的结果。
如图4所示，应用离心法的基因导入效率高于传统的上清法和结合法(该方法中病毒在感染前自发地被吸附到CH-296)。因此证明通过离心力强行使病毒沉淀，可使更多的病毒颗粒在离心管的底部与CH-296结合。具体地说，当应用稀释的病毒上清时，离心效应非常明显。
此外，测定了经离心法或静置(结合法)结合病毒后收集的病毒上清的滴度。结果示于表21。
表21
样品 病毒滴度(cfu/ml) 结合后的回收率(％)
病毒上清(使用前) 8.7×105 100
收集的病毒上清-结合法 7.8×105 89.4
收集的病毒上清-离心法 7.6×104 8.8
如表21所示，当样品静置时，收集的上清约含有结合前上清滴度的80-90％。另一方面，用离心法强制性结合后的上清的滴度只有结合前上清的1/10或更低，这些结果证明，通过离心力使更多的病毒颗粒与CH-296结合。离心后用于洗涤离心管的PBS含有大约原病毒量的2％。此外，不管有无洗涤这一步骤，都观察到几乎相同的基因导入效率。这些结果提示当应用离心法时，病毒颗粒可紧密地与CH-296结合。
此外，将离心法的基因导入效率与细胞在离心过程中感染病毒的方法的基因导入效率作了比较。
比较了用离心法和离心-感染的方法将基因导入NIH/3T3细胞的效率，后者是用离心力将病毒沉淀到细胞上使其感染(参见WO95/10619)。如实施例14所述，用GP+E86细胞制备病毒上清，并用NIH/3T3细胞的培养上清将浓度稀释到1×105cfu/ml，取5ml该病毒上清用于该比较。简要地说，按下述方法进行基因导入。将上述提及的病毒上清加入到用CH-296包被的离心管中。于30℃以2900×g离心该管4小时，然后用PBS洗涤。然后将细胞加入到该管中，于37℃感染4小时(离心法)。将细胞加入到包被有CH-296的离心管中，并培养2小时。在该管中加入所述病毒上清。于30℃以2900×g离心该管4小时进行感染(离心-感染法)。在这些方法中，离心管均按上述方法用CH-296包被，并将1×105的NIH/3T3细胞用于基因导入。将感染后的细胞重新平板接种到60-mm的培养皿中，并培养2天。然后按实施例4所述方法用流式细胞仪法测定EGFP基因导入效率，结果示于图5。
如图5所示，结果证明，离心法的基因导入效率高于离心-感染法的基因导入效率。认为这是由于通过洗涤去除了病毒上清中的感染抑制性物质。

Claims (6)

1.用逆转录病毒将基因导入靶细胞的方法，该方法包括：
(1)将含有逆转录病毒的溶液与具有结合所述逆转录病毒的活性并固定于支持物上的功能性物质接触，所述接触是通过用离心力使逆转录病毒沉淀到具有结合逆转录病毒活性的功能性物质上进行的；
(2)洗涤结合有所述逆转录病毒的支持物；和
(3)将结合有所述逆转录病毒的支持物与靶细胞接触并孵育，其中所述功能性物质选自纤连蛋白、纤连蛋白片段、成纤维细胞生长因子、V型胶原蛋白、聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖。
2.根据权利要求1的方法，其中所述具有结合逆转录病毒活性的功能性物质具有结合靶细胞的活性。
3.根据权利要求1的方法，其中应用其上同时固定有所述具有结合逆转录病毒活性的功能性物质和具有结合所述靶细胞的活性的另一种功能性物质的支持物，所述具有结合所述靶细胞活性的功能性物质选自细胞粘附蛋白、激素、细胞因子、抗体、糖链、碳水化合物和代谢物。
4.根据权利要求1的方法，其中将细胞培养器皿或微粒支持物用作所述支持物。
5.根据权利要求1的方法，其中所述含有逆转录病毒的溶液是在能促进逆转录病毒产生的物质存在下获得的逆转录病毒生成细胞的培养上清。
6.根据权利要求5的方法，其中所述含有逆转录病毒的溶液是在有丁酸钠存在时获得的培养上清。
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