KR19990063945A - 바이러스- 및 세포-결합 도메인을 갖는 분자를 사용하여바이러스-매개된 dna 전달을 향상시키는 방법 - Google Patents

바이러스- 및 세포-결합 도메인을 갖는 분자를 사용하여바이러스-매개된 dna 전달을 향상시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 레트로바이러스에 의해 조혈세포 및 기타 세포의 형질도입 효율성을 증가시키는 방법에 관한 것으로 이 방법은 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편의 존재하에서 세포를 감염시키는 단계를 포함한다. 피브로넥틴과 피브로넥틴 단편은 세포, 특히 위임된 선조세포 및 원시 조혈 간세포를 포함한 조혈세포중으로의 레트로바이러스-매개된 유전자 전달을 현저하게 증진시킨다. 본 발명은 또한 증진된 유전자 전달을 이용하는 개선된 체세포 유전자 치료 방법, 조혈 세포 집단, 및 세포중으로의 레트로바이러스-매개된 DNA 전달을 증진시키기 위한 신규 작제물 및 이들의 용도를 제공한다.

Description

바이러스- 및 세포-결합 도메인을 갖는 분자를 사용하여 바이러스-매개된 ＤＮＡ 전달을 향상시키는 방법
사람의 여러가지 질병의 분자 기준을 이해하는데 있어서의 발달 뿐만 아니라 유전자 전달 기술에 있어서의 개선으로 최근에는 심각한 유전자 질환의 체세포 유전자 치료용 프로토콜을 개발하고자 시도하게 되었다. 현재, 사람의 유전자 치료용으로 유망한 질병 후보로는 효소 또는 기타 단백질이 결핍되거나 없는것, 효소 또는 단백질의 수준이 정확하게 조절될 필요가 없는 경우, 특히 계속적으로 조절되어야 하는 것, 및 환자의 골수에서 발견되는 결핍증 등이다.
예를 들어, 유전자 치료용 질병 후보 중 하나는 아데노신 데아미나제(ADA) 결핍증으로 이는 심각한 합병성 면역결핍증 질환(SCID)이 된다. ADA 결핍성 환자는 골수 세포중에 효소가 거의 없거나 검출가능한 양으로 존재하지 않는다. 그러나, ADA 결핍증은 매치시킨 골수 이식에 의해 치료된다. ADA 정상 세포는 ADA 결핍 세포 보다 선택적인 잇점을 가지며 통상적으로 환자의 골수를 재집단화한다.
골수 세포 조직은 시험관내에서 용이하게 조작할 수 있고 재집단 세포를 함유하기 때문에 골수 세포는 체세포 유전자 치료에 좋은 표적이 된다. 별법으로, 사람의 대혈액(帶血液; cord blood)은 또한 이전에 수많은 원시 선조 세포를 함유하는 것으로 증명되어 있다. 장기간의 재집단 세포인 조혈 간세포로의 성공적인 유전자 전달은 이들 세포의 자손에서 나타나는 여러가지 질병에 대해 생명을 연장시키는 치료가 될 수 있다.
재집합 간세포로의 유전자 전달, 및 장기간의 유전자 발현은 수많은 실험자에 의해 쥐의 모델에서 성취되었다. 그러나, 개 및 영장동물과 같이 더 큰 동물에서의 생체내 실험은 대개 원시 조혈 간세포의 감염 효율성이 낮기 때문에 제한적으로 성공하였을 뿐이다. 현재 유전자 전달 기술의 제한점은 성인 골수(ABM)중에 존재하는 간세포의 수가 적은점, 이들 세포를 정제하기에 적합한 방법의 결여, 및 세포 주기에 있어서 그러한 원시 세포의 분획이 낮은점을 포함한, 여러가지 인자에 의해 사람의 프로토콜에 적용시 더 복잡하게 된다.
골수 세포가 관여되는 쥐 및 더 큰 동물 실험 둘다에 있어서, 가장 성공적인 프로토콜은 표적 세포와 레트로바이러스성 생산 세포주를 함께 배양하는 방법을 이용하는 것임이 주지되어 있다. 또한, 사람에 있어서 대부분의 FDA-승인 유전자 전달 시도는 유전자 형질도입용 재조합 레트로바이러스성 벡터에 따른다. 재조합 레트로바이러스성 벡터가 외인성 DNA를 세포 DNA 중으로 효율적으로 전달하고 정확하고 안정하게 통합시키기 때문에 유전자 치료용으로 바람직하다. 이들 벡터는 유전자 전달용 외인성 DNA를 함유하며 바이러스성 병원성을 제거하도록 추가로 개량된다. 이들 개량으로 인하여, 바이러스 생산은 일반적으로 레트로바이러스 패키지 세포를 사용하여 수행한다. 그러나, 임상용 유전자 치료의 경우, 생체-안전성 및 품질 조정이란 관점에서 세포-유리 형질도입법(cell-free transduction)이 더욱 바람직하다. 불행하게도, 간세포와 같은 조혈세포로의 효율적인 유전자 전달은 일발적으로 바이러스-생산 세포와 함께 배양하지 않고서는 가능할 수 없었다.
최근에, 감염중에 표적 세포를 간질세포에 노출시킴으로써 유전자 전달 효율성을 증가시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 간질세포는 조혈 미세환경(HM)의 주요 성분이다. HM은 대식세포의 조직화된 네트워크, 간질세포, 내피세포, 아디포사이트 및 여러가지 규정된 접착 분자로 이루어진 세포외 매트릭스(ECM) 복합체로 이루어져 있다. 라미닌, 콜라겐, 트롬보스폰딘, 프로테오글리칸, 글리코스아미노글리칸 및 피브로넥틴과 같은 ECM 분자는 조혈세포 및 성장인자 둘다에 대해 앵커 부위(anchorage sites)를 제공한다. 레트로바이러스 감염에 있어서 간질체의 증진 효과를 기본으로 하는 메카니즘은 불명확하지만, 이들 세포가 HM의 세포과 직접 접촉하게 될때 조혈세포의 증식 및 분화에 있어서 생리학적 조절이 일어난다는 것이 공지되었다.
장기간의 재집합 조혈 간세포 및 기타 세포중으로의 효율적인 유전자 전달에 있어서 현재 조혈 및 기타 질병의 치료를 위한 유전자 전달 프로토콜의 범용을 저해하는 문제점이 남아있다. 선행 기술 방법의 위험과 제한점이 없는 효율적인 포유동물 세포중으로의 유전자 물질의 전달 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 이런 필요성을 대상으로한다.
발명의 요약
간략해서, 본 발명의 바람직한 양태중 하나는 레트로바이러스 벡터에 의해 조혈세포의 형질도입 빈도를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 레트로바이러스에 의한 세포의 형질도입 빈도를 증가시키는데 효율적인 실질적으로 순수한 피브로넥틴 및/또는 피브로넥틴 단편의 존재하에서 복제-결핍성 재조합 레트로바이러스 벡터로 생존성 조혈세포를 감염시키는 것이다. 피브로넥틴 및/또는 피브로넥틴 단편은 천연 물질로부터 유도시킬 수 있거나 합성에 의해 유도(예로서, 재조합 또는 화학 합성 기술에 의해 유전 공학적인 방법에 의해)시킬 수 있거나, 또는 천연 및 합성 물질의 혼합물로부터 유도시킬 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용되는 피브로넥틴 폴리펩티드(또는 폴리펩티드들)는 천연 피브로넥틴 아미노산 서열에 대한 돌연변이를 포함할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 본 발명에 따르는 향상된 형질도입을 성취하는데 있어서 필수적인 접착 특성을 갖는 기능성 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 다른 바람직한 양태는 레트로바이러스에 의한 세포의 형질도입 빈도를 증가시키는데 유효한 양의 고정화 피브로넥틴, 고정화 피브로넥틴 단편, 또는 이들의 고정화 혼합물의 존재하에서 외인성 DNA를 포함하는 복제-결핍성 재조합 레트로바이러스로 생존성 조혈세포를 감염시키는, 형질도입된 조혈세포의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 개선된 세포 이식 방법을 제공하는 것이다. 본 방법은 동물 공여체로부터 생존성 조혈세포를 수득하는 단계; 본 조혈세포를 형질도입 빈도를 증가시키는데 효과적인 고정화된 형태의 피브로넥틴 및/또는 이들의 단편의 존재하에서 재조합 레트로바이러스 벡터로 감염시켜 형질도입된 생존성 조혈세포를 생산하는 단계; 및 형질도입된 생존성 조혈세포를 동물 수용체중으로 세포 이식체로서 형질도입시키는 단계를 포함한다. 바람직한 방식중의 하나로 감염된 세포를 동종성 공여체중으로 형질도입시킬 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 양태는 세포 이식 공정에 적합한 형질도입된 제대 혈액 세포(umbilical cord blood cells)를 수득하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 레트로바이러스 벡터에 의해 조혈세포의 형질도입 빈도를 증가시키기 위하여 유효량의 고정화된 피브로넥틱 및/또는 피브로넥틴 단편의 존재하에서 제대 혈액으로부터의 조혈세포를 복제-결핍성 재조합 레트로바이러스 벡터로 감염시키는 것이다. 본 발명은 또한 상기와 같은 방법으로 수득할 수 있는 제대 혈액으로부터의 형질도입된 세포 재집단, 및 형질도입된 세포 재집단을 세포 이식체로서 동물에 형질도입시키는 세포 이식 방법을 포함한다.
본 발명의 상기 언급한 양태의 더욱 특이적인 양태에 따라서, 이용되는 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편은 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인의 레트로바이러스-결합 활성을 제공하는 제1 아미노산 서열, 및 피브로넥틴의 CS-1 도메인의 세포-결합 활성을 제공하는 제2 아미노산 서열을 함유한다. 이들 피브로넥틴의 2개의 결합 도메인을 함께 사용함으로써 레트로바이러스에 의한 표적 세포의 형질도입 효율성이 매우 현저하게 향상되는 것이 증명되었다.
본 발명의 다른 바람직한 양태는 레트로바이러스 벡터에 의한 예정된 표적 세포의 형질도입 빈도 향상용 작제물의 제조 방법을 제공한다. 본 방법은 표적 세포에 결합하는 리간드를 피브로넥틴의 헤파린-II 결합 도메인의 레트로바이러스-결합 활성을 제공하는 아미노산을 함유하는 폴리펩티드에 공유결합에 의해 커플링시키는 단계를 포함한다. 본 방법은 또한 레트로바이러스에 의한 예정된 표적 세포의 형질도입 빈도를 증가시키기 위하여 이들 작제물을 이용하는 것과, 형질도입된 세포를 이용하는 이식 공정을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 양태는 바이러스를 함유하는 배지를 일정량의 바이러스를 편재시키기에 유효한 양의, 피브로넥틴의 헤파린-II 결합 도메인의 바이러스-결합 활성을 함유하는 고정화된 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편의 존재하에서 배양시킴을 특징으로 하여, 일정량의 바이러스를 편재시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 일반적으로 실질적으로 순수하고(하거나) 고정화된 피브로넥틴 또는 이의 단편을 함유하는 형질도입된 생존성 조혈 및 기타 세포 배양물 뿐만 아니라 이후 기술되는 바와 같은, 세포중으로의 레트로바이러스-매개된 DNA 전달용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 추가의 바람직한 양태는 폴리펩티드와 같은, 유효량의 고정화 물질(고정화 물질의 양은 세포에 결합하는 리간드 및 레트로바이러스에 결합하는 리간드를 포함함)의 존재하에서 세포를 레트로바이러스로 감염시켜 레트로바이러스와 세포를 편재시키고 세포의 형질도입 효율성을 증가시킴을 특징으로하는, 레트로바이러스에 의한 생존성 세포의 형질도입된 집단의 수득 방법을 제공한다. 놀랍게도, 상기와 같은 방법은 이전까지 형질도입 효율성을 증가시키는데 바람직한 유전자 전달 프로토콜에서 사용되었던 헥사디메트린 브로마이드(또한 1,5-디메틸-1,5-디아자운데카메틸렌 폴리메토브로마이드로 확인됨)의 부재 또는 적어도 실질적인 부재하에서 수행하는 것이 더욱 유리하다는 것이 또한 밝혀졌다. 그러나, 놀랍게도, 헥사디메트린 브로마이드가 존재함으로써 본 발명의 동시-편재 매개된 유전자 전달 방법에 있어서 형질도입 효율성을 증가시키기 보다는 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 더욱 바람직한 방법은 헥사디메트린 브로마이드 또는 동시-편재용 물질의 부재하에서 수행되는 유사한 프로토콜, 예를 들면 상응하는 동시-배양 프로토콜에서 형질도입 효율성을 증가시키는 기타 제제의 부재하에서 수행한다.
본 발명의 다른 양태는 세포를 결합시키는 아미노산 서열 및 콜라겐 V로부터의 아미노산 서열 또는 레트로바이러스를 결합시키는 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 폴리펩티드의 존재하에서 세포를 레트로바이러스로 감염시키는 단계를 포함하는, 레트로바이러스에 의한 생존성 세포의 형질도입된 집단의 수득 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 바람직한 양태는 T 세포에 결합하는 리간드 및 레트로바이러스에 결합하는 리간드를 포함하는 물질의 존재하에서 세포를 레트로바이러스로 감염시켜 레트로바이러스와 세포를 함께 편재시키고 세포의 형질도입 효율성을 증가시키는, 레트로바이러스를 사용한 T 세포의 형질도입 방법을 제공한다. 바람직한 형태로 상기 방법에서 사용되는 물질은 T 세포에 결합하는 제1 아미노산 서열과 레트로바이러스에 결합하는 제2 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 바람직한 양태는 콜라겐 V로부터의 아미노산 서열 또는 레트로바이러스에 결합하는 섬유아세포 성장 인자를 갖는, 유효량의 단리된 폴리펩티드와 레트로바이러스를 접촉시킴으로써, 레트로바이러스를 편재시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 포유동물 세포의 효율적인 레트로바이러스 감염 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 함께 배양시킬 필요가 없는 레트로바이러스 벡터를 사용한 유전자 전달 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동종성 및/또는 이종성 세포 이식을 위한 개선된 방법 및 세포 배양물을 제공하는 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 목적, 잇점, 및 양상은 이후 기술 내용으로부터 숙련가에게 용이하게 명백하게 될 것이다.
본 발명은 일반적으로 바이러스에 의해 세포의 형질도입 효율성을 증가시키는 방법, 더욱 상세하게는 바이러스에 결합하는 영역 및 세포에 결합하는 영역을 함유하는, 폴리펩타이드와 같은 분자를 사용하여 세포중으로의 바이러스-매개된 유전자 전달을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
도 1은 키모트립신 분해 단편을 포함한, 피브로넥틴 분자를 나타내는 것이다.
도 2는 이후의 실시예 1에 추가로 기술되는 바와 같이, TKNEO 벡터를 사용하는 피브로넥틴 단편의 존재하에서의 수용된 사람의 선조 세포의 감염 효율성을 나타낸다.
도 3은 이후의 실시예 1에 추가로 기술되는 바와 같이, TKNEO 벡터를 사용하는 피브로넥틴 단편의 존재하에서의 여러가지 수용된 사람의 조혈 선조 세포의 감염 효율성을 나타낸다.
도 4는 (i) 동시 배양법(레인 2-4), (ii) 이후의 실시예 7에 추가로 기술되는 바와 같은, 고정화된 피브로넥틴 단편의 존재하에서의 상등액 감염법(레인 5-7), 및 BSA상에서의 상등액 감염법(레인 8-10)에 의해 형질감염시킨 골수 세포가 이식된 마우스에서 hADA의 존재를 비교한 것이다. hADA용 대조군은 레인 1 및 12에 나타내며 쥐의 ADA용 대조군은 레인 11에 나타낸다.
도 5는 이후 실시예 8에 추가로 기술되는 바와 같은, 피브로넥틴 단편에 대한 레트로바이러스의 결합을 증명하는 것이다.
도 6은 이후 실시예 8에 추가로 기술되는 바와 같이, 피브로넥틴 단편에 대한 레트로바이러스의 결합이 투여량-의존성임을 증명하는 것이다.
도 7은 이후 실시예 9 내지 11에서 사용되는 여러가지 재조합 피브로넥틴 단편을 나타내는 다이아그램을 제공한다.
도 8은 이후 실시예 9에 기술되는 바와 같이, 수개의 재조합 단편을 포함하는 여러가지 피브로넥틴 단편에 대한 레트로바이러스의 결합을 나타낸다.
도 9는 이후 실시예 9에 기술되는 바와 같이, 헤파린이 피브로넥틴 단편에 대한 레트로바이러스의 결합을 차단함을 증명한다.
도 10은 이후 실시예 10에 추가로 보고되는 바와 같이, 여러가지 피브로넥틴 단편의 존재하에서의 쥐의 조혈세포의 레트로바이러스 감염 효율성을 나타낸다.
도 11 및 12는 이후 실시예 11에 기술되는 바와 같이, (i) 동시배양법, (ii) 여러가지 피브로넥틴 단편에 대한 상등액 감염법, 및 (iii) BSA에 대한 상등액 감염법으로 형질도입된 골수 세포가 이식된 마우스에서의 hADA의 존재를 비교한 것이다.
도 13은 피브로넥틴의 α-쇄의 구조와 실시예에서 사용되는 재조합 단편에 대한 이의 관련성을 나타낸다. 피브로넥틴 타입 I, II 및 III 반복 단위를 나타내며 타입 III 반복 단위의 수는 1 내지 14이다. 세포에 대한 3종의 결합 부위를 세포 결합 도메인(CBD)의 경우 CELL, 헤파린 결합 도메인(HBD)의 경우 HEPARIN, 및 별도로 스플라이싱된 IIICS 영역의 첫번째 25개의 아미노산에 의해 형성된 VLA-4 결합 부위 CS1의 경우 CS1으로 표시한다.
도 14는 이후 실시예 12에 추가로 보고되는 바와 같이, 여러가지 피브로넥틴 단편의 존재하에서 NIH/3T3 세포의 레트로바이러스 감염 효율을 나타낸다.
도 15는 이후 실시예 13에 추가로 보고되는 바와 같이, 여러가지 피브로넥틴 단편의 존재하에서 비-접착성 HL60 세포의 레트로바이러스 감염의 효율성을 나타낸다.
도 16은 피브로넥틴에 결합하는 레트로바이러스에 대한 저분자량 및 고분자량 헤파린의 영향을 나타낸다.
도 17은 이후 실시예 13에서 논의되는 바와 같이, 재조합 피브로넥틴 단편의 존재하에서 CD34+ 세포 집단내의 여러가지 타입의 선조 세포의 레트로바이러스 감염 효율성을 나타낸다.
도 18은 이후 실시예 14에서 논의되는 바와 같이, 재조합 피브로넥틴 단편의 존재하에서 c-KIT+ 세포 집단중 HPP-CFC 세포의 레트로바이러스 감염 효율성을 나타낸다.
도 19는 이후 실시예 15에서 논의되는 바와 같이, 헥사디메트린 브로마이드의 농도가 증가함에 따라 NIH/3T3 세포의 레트로바이러스 감염 효율성이 감소됨을 증명하는 것이다.
도 20은 이후 실시예 15에서 논의되는 바와 같이, 헥사디메트린 브로마이드의 농도가 증가함에 따라 클로닝된 골수 세포의 레트로바이러스 감염 효율성이 감소됨을 증명하는 것이다.
도 21은 T 세포가 피브로넥틴 수용체를 발현시킴을 증명하는 유동 세포질 시험 결과를 나타낸다.
도 22는 사람의 T 세포의 예비자극을 증명하는 유동 세포질 시험 결과를 나타낸다.
도 23은 ADA 이소자임 검정법에 의한 사람의 T 세포로의 유전자 전달 효율성의 분석 결과를 나타낸다.
도 24는 실시예 16에 추가로 기술되는, 감염 프로토콜에서 사용되는 폴리펩티드를 설명하는 다이아그램을 제공한다.
도 25는 펩티드 C-FGF, C-COL 및 도 24에서 확인된 bFGF의 존재하에서 NIH/3T3 세포의 형질도입 효율성을 나타내는 챠트이다.
도 26은 유동 세포질 분석법에 의해 검정되는 바와 같이, 도 24에서 확인된 펩티드의 존재하에서 HEL 세포중으로의 레트로바이러스 유전자 전달 효율성을 나타낸다.
도 27은 도 24에서 확인된 폴리펩티드의 존재하에서 CD34+ 골수 세포의 형질도입 효율성을 나타내는 챠트이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 원리를 이해하는 것을 돕기 위하여, 특정 양태를 참고로 할 것이며 이를 기술하기 위하여 특정 언어를 사용할 것이다. 그러나, 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 본 발명 원리의 변형, 추가의 개량 및 적용은 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아님을 인식하여야 하며 본 발명과 관련있는 기술 분야의 숙련가에게 통상적인 것으로 생각된다.
상기 표시한 바와 같이, 본 발명은 레트로바이러스와 같은 바이러스에 의한 생존성 세포의 형질도입 빈도를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용하여 생존성 세포중으로 유전자를 효율적으로 전달하는 방법, 형질도입된 세포의 수득 방법, 및 동종성 및 기타 세포 이식을 성취하기 위한 방법 및 물질을 제공한다.
본 발명의 특징 중 하나는 피브로넥틴(FN), 및 FN의 CS-1 세포-접착 도메인을 함유하는 피브로넥틴의 단편이 조혈세포와 같은 세포, 예를 들면 수용된 선조 및 원시 조혈간세포 또는 피브로넥틴 수용체를 포함하여 피브로넥틴 또는 이의 단편에 대한 결합능을 나타내는, 장기 배양-개시 세포(LTC-IC)중으로의 레트로바이러스-매개된 유전자 전달을 현저하게 향상시킴을 발견한 것이다. 유리하게도, 상기 효율성의 증가는 바이러스-생산 세포와의 동시배양을 비필수적으로 만든다. 본 발명의 다른 특징은 헤파린-II 결합 도메인내에 위치한 피브로넥틴의 바이러스-결합 도메인의 발견을 기본으로 한다는 것이다. 상기 바이러스-결합 도메인을 사용하여 예를 들어 표적 세포로 바이러스를 운반하기 위한 광범위한 작제물에, 여러가지 용도로 바이러스 입자를 편재시킬 수 있다.
본 발명의 특정 바람직한 양태에 따르는 재조합 바이러스 벡터는 외인성 DNA를 함유하며 비-병원성, 즉, 복제-결핍성이다. 이들 벡터는 동물 세포, 특히 포유동물의 세포와 같은 숙주 세포의 세포내 DNA중으로 외인성 DNA를 효율적으로 전달하고 정확하고 안정하게 집결시킨다. 예를 들어, 본 발명에서는 대상이 되는 유전자의 암호화 서열로부터 한 방향의 염기를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 적합한 프로모터의 조절하에서 재조합 레트로바이러스 벡터중에 포함시켜 유전자, 전형적으로 외인성 프로모터를 주입시킬 수 있다. 이 점에 있어서, 외인성 DNA는 천연적으로 또는 인위적으로 생산된 DNA를 함유할 수 있고, 이종성 공급원으로부터 유도된 일부로부터 생산될 수 있으며, 이런 일부는 천연 또는 화학적으로 합성된 분자일 수 있고, 결합 또는 당해 분야에 공지된 다른 수단에 의해 연결되어 있다.
바이러스중에 포함시킨 외인성 DNA는 세포중으로 도입시키기 위한 DNA일 수 있다. 예를 들어, 외인성 DNA는 공지된 질환과 관련있는 ADA와 같은 단백질, 또는 항감작 RNA, 리보자임 또는 펄스 프라이머(참조: 1990년 11월 15일에 공개된 WO 90/13641), 세포내 항체(참조: 1994년 2월 3일에 공개된 WO 94/02610), 성장 인자 등을 암호화할 수 있다.
지적한 바와 같이, 도입된 뉴클레오티드 서열은 프로모터의 조절하에 있으며, 따라서 일반적으로 프로모터로부터 하류이다. 달리 언급한다면, 프로모터 서열은 일반적으로 암호화 서열의 상류(즉, 5' 말단)이다. 이런 점에서, 프로모터와 함께 작동하는 다른 조절 요소(예를 들면, 인헨서 서열) 및 외인성 암호화 서열의 전사를 수행하기 위한 전사 개시 코돈이 존재할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다는 것은 숙지되어 있다. "∼의 조절하"란 문구는 도입된 유전자의 전사를 수행하는데 필수적인 다른 요소의 존재를 고려하는 것이다. 또한, 재조합 DNA가 도입된 암호화 서열로부터 하류 종결 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
선별 마커 또는 기타 선별 잇점을 제공하는 외인성 DNA를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 네오마이신과 같은 항생제를 포함한 여러가지 선별제에 대한 내성을 제공하는 외인성 유전자를 1개 이상 함유할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 대표적인 벡터의 예를 들면, 문헌[참조: Moritz et al (1993) J. Exp. Med. 178:529]에 보고된 바와 같은 N2/ZipTKNEO 벡터(TKNEO)(역가: NIH 3T3 세포에 대해 1×105G418r cfu/㎖), ZipPGK-hADA 벡터, 및 ZipPGK-mADA 벡터 모두를 포함한다. TKNEO 벡터에서는, 네오 포스포트랜스퍼라제 서열이 단순포진 티미딘 키나제 프로모터를 통하여 감작 방향으로 (5' 긴 종결 반복 단위-LTR에 대해) 발현된다. 이 벡터는 네오마이신 내성을 제공하는 선별 마커 유전자를 함유하여 형질도입된 세포의 확인을 용이하게 한다. ZipPGK-hADA 벡터에서, 사람의 ADA("hADA") cDNA는 사람의 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터를 통하여 5'LTR에 대해 감작 방향으로 발현된다. 이는 발현가능한 유전자 서열을 1개만 함유하며 우세한 선택성 마커가 결여되어 있다. ZipPGK-mADA(PGK-mADA) 벡터는 사람의 ADA cDNA가 쥐의 ADA("mADA")로 대체되어 있는 점을 제외하고는 ZipPGK-hADA와 동일하다. 이들 및 기타 바이러스 벡터와 이들의 생산 기술은 숙지되어 있으며, 이들의 이식 및 본 발명에서의 용도는 본 명세서의 기술 내용에서 제시되는 당해 분야의 숙련가의 기술내에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 바이러스 벡터는 사람의 피브로넥틴의 헤파린-II 결합 도메인을 포함하여, 피브로넥틴의 헤파린-II 결합 도메인의 아미노산 서열에 대한 결합능을 나타낸다. 이후 논의되는 바와 같이, 본 발명이 어떠한 이론에도 제한되지 않지만, 각각의 기능성 도메인에 대한 바이러스와 세포의 결합을 통한 바이러스와 표적 세포의 동시-편재는 바이러스에 의한 세포의 형질도입을 향상시키는 것으로 생각된다. 이에 대해서, 바이러스가 헤파린-II 결합 도메인의 아미노산 서열에 결합하여 본 발명에서 효과적으로 제공하는 능력은 이후의 실시예 8 및 9에 기술된 바와 같은 통상적인 공정을 이용하여 용이하게 확인할 수 있다. 일반적으로 말해서, 이들 검정법은 바이러스 입자가 헤파린-II 결합 도메인을 함유하는 고정화된 폴리펩티드에 결합하여 고정화된 폴리펩티드 매트릭스로부터 세척을 견딜수 있는 정도를 측정하는 것이다. 간략하면, 예로서, 바이러스-함유 상등액을 피브로넥틴 헤파린-II 결합 도메인을 포함하는 고정화된 폴리펩티드 함유 웰에서 배양할 수 있다. 이어서 상기 웰을 생리식염수로 강력하게 세척한 후, 바이러스에 대한 표적 세포를 웰중에서 배양하여 웰중에 남아있는 감염 활성 수준을 측정하는 것이다. 초기 바이러스 상등액에 대해, 감염 활성, 또는 역가에서의 감소를 평가하여 유사한 대조군 수행(예를 들면 BSA-피복 웰을 사용)의 결과와 비교한다. 대조군 웰과 비교하여 헤파린-II 결합 도메인 함유 웰에서 현저하게 더 높은 역가가 잔류한다는 것은 대상 바이러스가 본 발명의 양태에 사용하기에 적합하다는 것을 시사하는 것이다. 상기 선별 과정을 용이하게 하기 위하여, 상기 논의한 바와 같이, 바이러스 벡터가 선별 마커 유전자를 함유할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 피브로넥틴의 단편은 천연 또는 합성된 것일 수 있으며, 예를 들어 문헌[참조: Ruoslahti et al (1981) J. Biol. Chem. 256: 7277; Patel and Lodish (1986) J. Cell. Biol. 102:449; 및 Bernard et al. (1987) J. Cell. Biol. 105:489]에 기술된 바와 같이, 천연 물질로부터 실질적인 순도로 제조할 수 있다. 이에 관하여, 본 명세서에서 실질적으로 순수한 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편에 대한 언급은 피브로넥틴이 천연적으로 갖고 있는 단백질을 제외하고는 이들이 다른 단백질을 필수적으로 함유하지 않음을 의미하고자 함이다. 본 발명에서 사용하기 위한 실질적으로 순수한 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 제5,198,423호(1993년 3월 30일자로 Taguchi et al에 허여되어 Takara Shuzo Co., Ltd, Kyoto, Japan으로 양도됨)에 일반적으로 기술된 바와 같이 재조합 방식으로 생산할 수 있다. 특히, 이후의 실시예에서 H-271, H-296, CH-271, CH-296 및 C-CS1으로 확인된 재조합 단편, 및 이들의 수득 방법은 상기 미국 특허에 상세하게 기술되어 있다. 이후의 실시예에서 이용되는 C274 단편은 미국 특허 제5,102,988호에 기술된 바와 같이 수득한다. 이들 단편 및 이들로부터 통상적으로 유도되는 단편은 국제 기탁 기관[참조: Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, Japan]에 FERM P-10721(H-296), FERM BP-2799(메티오닌을 통하여 H-271에 결합된 C-277), 및 FERM BP-2264(H-271)로 기탁되어 있으며, 또한 미국 특허 제5,198,423호에 기술되어 있는 이. 콜라이를 배양시켜 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에서 이용가능한 피브로넥틴 단편 또는 상기와 같은 단편에 대한 출발 물질에 관한 유용한 정보는 문헌[참조: Kimizuka et al., J. Biochem. 110, 284-291(1991)]에 나타나 있으며, 이 문헌에는 또한 상기 나타낸 재조합 단편에 대해서도 보고되어 있고; 문헌[참조: EMBO J., 4, 1755-1759(1985)]에도 나타나 있으며, 여기에는 또한 사람의 피브로넥틴의 헤파린-II 결합 도메인에 대해서도 보고되어 있다. 예를 들어 이후의 실시예에 보고된 바와 같은 약 30 또는 35 kd 단편(30/35 FN) 및 여러가지 재조합 단편중에 포함되는 것과 같은, CS-1 세포 접착 도메인과 헤파린-II 결합 도메인을 둘다 함유하는 피브로넥틴 단편은 지금까지의 연구에 있어서 조혈세포중으로의 유전자 전달 효율을 현저하게 향상시키는 것으로 밝혀졌으며, 본 발명에서 사용하기에 바람직하다. 따라서, 광범위하게 언급한다면, 본 발명에서 이용되는 피브로넥틴-관련 폴리펩티드는 피브로넥틴의 CS-1 세포 접착 도메인의 세포-결합 활성을 제공하는 아미노산 서열 뿐만 아니란 바이러스에 결합하는 피브로넥틴의 헤파린-II 결합 도메인의 아미노산 서열을 제공한다는 것을 주지하여야 한다. 당해 분야의 숙련가들은 필수적인 세포- 및 바이러스-결합 활성이 이들 기능성 피브로넥틴 도메인의 천연 아미노산 서열 및 천연 서열과는 상이하지만 세포 결합 및 바이러스-결합 활성을 효율적으로 유사하게 나타내는 아미노산 서열에 의해서 제공될 수 있음을 인식할 것이다. 이들 유사한 아미노산 서열은 이들의 상응하는 천연 서열에 대해 실질적인 서열 상동성을 나타내며, 아미노산이 결실, 치환 및/또는 변형되어 있음에도 불구하고 목적하는 세포-결합 또는 바이러스-결합 특성을 갖는 아미노산 서열을 제공하는 것들을 포함할 수 있다.
이에 대하여, 관련있는 생체기술 분야는 대상이 되는 기능성 도메인에서 아미노산의 결실, 치환, 부가 또는 기타 변형을 통상적으로 수행할 수 있을 정도로 발달되어 있다. 이어서 생성된 아미노산 서열을 목적하는 세포-결합 또는 바이러스-결합 활성에 대해 통상적으로 선별할 수 있다. 예를 들면, 피브로넥틴의 돌연변이 또는 개질된 형태의 헤파린-II-결합 도메인의 바이러스-결합 활성은 상기에서 일반적으로 논의된 바와 같이, 더욱 상세하게는 이후의 실시예 8 및 9에서와 같이, 바이러스 배양법, 세척, 및 대조군과 비교한 감염성 보유능을 측정하기 위한 바이러스 역가 검정법을 이용하여 선별할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 기술로는 이들 결합 검정법이 대표적이지만 당해 분야의 숙련가에 있어서는 통상적인 실험이다.
피브로넥틴의 CS-1 세포 접착 도메인의 변형 또는 돌연변이 형태, 또는 기타 세포-결합 폴리펩티드에 대한 세포-결합은 통상적인 방식을 이용하여 유사하게 검정할 수 있다. 예를 들면, 상기와 같은 공정으로는 문헌[참조: Nature 352:438-441(1991)]에 기술되어 있는 것들이 있다. 간략하면, 세포-결합 폴리펩티드를 플라스틱 접시상에 피복시키고 검정하고자 하는 세포 집단을 배지중에 30분 내지 2시간 동안 중층시킨다. 상기 배양 기간이 경과된 후, 단백질에 대한 세포 비-부착체를 회수하여, 계수하고 생존성에 대해 검정한다. 폴리펩티드에 대한 세포 부착체를 또한 트립신 또는 세포 해리 완충액(예, Gibco)을 사용하여 회수하고, 계수하여 생존성을 시험한다. 일부 경우에 있어서, 예를 들어 조혈 콜로니 형성 세포의 경우, 세포를 추가로 12 내지 14일간 배양하여 세포의 콜로니 형성 특성을 평가한다. 이어서 접착 세포의 백분율을 계산하여 소혈청 알부민(BSA) 피복된 플라스틱 접시와 같은 표준 대조군과 표준치를 비교한다. 검정된 폴리펩티드에 대한 표적 세포의 실질적인 결합은 폴리펩티드/세포 조합이 본 발명에서 적합하다는 지표를 제공하며, 폴리펩티드를 피브로넥틴으로부터의 레트로바이러스 결합 단편에 커플링시켜 바이러스 벡터에 의해 표적 세포의 감염을 향상시키기 위한 본 발명의 작제물을 생산할 수 있다.
본 발명의 더욱 특이적인 양태에 따라서, 레트로바이러스 벡터에 의한 형질도입을 향상시키기 위하여 이용되는 바이러스-결합 폴리펩티드는 (i) 서열 1로 표시되는, 사람의 피브로넥틴의 헤파린-II 결합 도메인의 Ala1690-Thr1960에 상응하는 제1 아미노산 서열 또는 레트로바이러스에 대한 결합능을 나타내는 충분하게 유사한 아미노산 서열; 및 (ii) 서열 2로 표시되는, 사람의 피브로넥틴의 IIICS 결합 도메인의 영역 중 하나에 상응하는 제2 아미노산 서열 또는 원시 선조 및/또는 장기간의 재집단 (간) 세포와 같은 조혈세포에 대한 결합능을 나타내는 충분하게 유사한 아미노산 서열을 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 생성된 아미노산 서열이 바이러스에 대한 결합능(헤파린-II-결합 도메인의 경우) 및 표적 세포에 대한 결합능(CS-1 도메인의 경우)을 나타내는데 있어서 천연 서열과 충분하게 유사하다면, 본 발명의 실시내에서 이들 천연 서열의 특정한 개질 및/또는 돌연변이가 가능하다는 점을 알아야 한다.
예를 들어, 헤파린에 결합하며 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인에 대해 실질적인 서열 상동성을 나타내는 서열을 갖는 공지된 폴리펩티드의 예로는 콜라겐 V 및 섬유아세포 성장 인자가 있다. 이후의 특정 실시예 16에서 증명되는 바와 같이, VLA-4 및/또는 VLA-5와 같이 세포-결합 서열에 연결된 이들 서열을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 세포 결합 서열에 결합하는 세포중으로의 레트로바이러스-매개된 DNA 전달을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 양태중 하나는 시험관내 세포 치료 단계 및 후속되는 숙주 세포중의로의 표적 세포의 이식 단계(이는 또한 형질도입된 표적 세포를 갖는 숙주의 "이식"으로도 공지되어 있슴)를 포함하는 체세포 유전자 치료 방법을 제공한다. 조혈세포 또는 기타 세포, 예를 들면 골수 또는 말초 혈액으로부터 단리시킨 간세포, 배 간세포, 또는 CD34+ 및/또는 C-kit+로 달리 특징되는 세포를 표준 프로토콜을 이용하여 사람 또는 기타 포유동물원으로부터 수거할 수 있다. 예를 들면, 조혈세포는 사람 공여체의 골수 또는 말초 혈액으로부터 또는 사람의 제대 혈액으로부터 수거할 수 있다. 일단 수거한 다음, 조혈세포를 임의로 표준 기술로 처리하여 간세포 및/또는 원시 선조 세포중 이들의 함량을 강화시킬 수 있다. 이후 조혈세포를 예를 들어 조직 배양 플레이트상에서 적합하게 배양시킬 수 있다. 임의로 이 기간중에, 접착성-네가티브 저밀도 분자를 레트로바이러스 감염전에 미리 자극시킬 수 있다. 당해 분야에 공지되어 있으며 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 예비 자극법은 레트로바이러스에 노출시키기 전에 세포를 성장 자극 인자에 노출시키는 공정을 언급한다. 상기와 같은 예비 자극은 레트로바이러스에 의한 조혈세포의 형질도입을 향상시키는 것으로 입증되었다.
예비 자극 단계에 이어서, 세포를 수확하여 본 명세서에 기술된 바와 같이 피브로넥틴 또는 이의 단편과 함께 배양시킬 수 있는데 이는 레트로바이러스에 의한 세포의 형질도입 빈도를 향상시킨다. 바람직하게는, 세포를 정제되고(되거나) 불용성인, 예를 들어 고정화된 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편과 함께 배양시킨다. 이어서 세포를 재조합 바이러스, 예를 들어 세포중에 결핍되어 있거나 비정상인 효소 또는 기타 단백질을 수정하기 위한 유전자를 함유하는 레트로바이러스로, 바이러스에 의한 세포의 형질도입 빈도를 증가시키기에 유효한 양의 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편의 존재하에서 감염시킬 수 있다. 이어서 생성된 형질도입 조혈세포를 통상적으로, 예를 들어 정맥내로 동물 세포 이식 수용체, 바람직하게는 동정상 공여체나 이종성 이식물을 포함하는 수용체중에 도입시킬 수 있는데, 여기서 이후 논의되는 바와 같이 제대 혈액 세포의 경우 후자가 특히 이식물로서 사용된다.
본 발명의 방법은 예를 들어 암, 백혈병, 단백질 결핍 또는 비정상과 관련되는 질병을 포함하여, 골수 질환을 포함하는 여러가지 질병에 대한 유전자 표식 또는 유전자 치료 프로토콜, 및 화학요법과 같은 다른 치료 프로토콜에 대한 내성을 향상시키기 위한 조혈세포의 변형 치료법에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명을 이용할 수 있는 대표적인 질병으로는 ADA 결핍증, 예를 들면 ADA-결핍성 SCID, 소아의 급성 골수성 백혈병(AML), 신경아세포종, 및 성인의 AML 및 급성 임파구성 백혈병(ALL)이 있다.
본 발명의 특히 바람직한 양태중 하나로, 세포 이식에 이용되는 세포는 사람의 제대 혈액으로부터 수득한다. 따라서, 사람의 제대 혈액을 수거하여 접착성-네가티브, 저밀도 분자 세포 집단을 수득함으로써 생존성 원시 조혈 선조 및/또는 간세포를 강화시킬 수 있다. 이어서 상기 집단을 임의로 예비 자극하여, 레트로바이러스 벡터의 존재하에서 배양시키고 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편을 고정화시키고(시키거나) 정제하여 벡터에 의한 세포의 형질도입 효율성을 향상시킬 수 있다. 이에 대하여, 피브로넥틴이 대혈액중에서 ECM의 일부를 구성하지 않으며 대혈액으로부터의 원시 선조 및 간세포가 골수로부터의 것과는 상이한 것으로 특징화되어 있음에도 불구하고, 제대 혈액으로부터의 원시 조혈 및/또는 간세포는 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편의 존재하에서 크게 향상되는 것으로 밝혀졌다. 특히, 대혈액 간세포는 CD34+, HLA-DR+로 특징화되는 반면, 골수로부터의 간세포는 CD34+, HLA-DR-로 특징화된다. 제대 혈액으로부터의 원시 선조 세포가 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편의 존재하에서 향상된 방식으로 효과적으로 형질도입된다는 발견으로 조혈세포의 편리하고 고도로 강화된 간세포 공급원을 사용할 수 있도록 한다. 또한, 원시 선조 및 간세포에 대해 강화된 대혈액의 이종성 이식물로 수많은 환자를 성공적으로 이식시킨다는 증거는 대혈액이 조혈세포에 대해 매우 바람직한 공급원이 되도록 한다[참조: Kohli-Kummer et al., Brit. Heamatol. 85:419-422(1993); Broxmeyer et al., Blood Cell 17:313-329(1991); Gluckman et al., Br. J. Heaematol. 45:557(1980); Heidelberg: Springer-Verlag pp. 60-68(1989); Wagner et al., Blood 79:1874-1881(1992); 및 Wagner et al., Blood 82-86a(Abstract)].
경우에 따라, 수확한 형질도입 조혈 또는 기타 세포를 형질도입 효율성 및 유전자 발현에 대해 시험할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 의해 제공되는 레트로바이러스-매개된 유전자 전달에서의 현저한 향상은 이후의 특정 실시예에서 증명되며, 실시예에는 피브로넥틴 또는 효과적인 피브로넥틴 단편의 존재하에서 레트로바이러스에 의한 높은 감염 및 유전자 전달 효율성을 증명하는 수개의 시험이 기술되어 있다. 특히, PGK-hADA 레트로바이러스로 감염시킨 쥐의 조혈세포는 전달된 ADA cDNA를 높은 수준으로 발현시킨다. 유사하게, 사람의 선조 콜로니로 감염시킨 각각의 PGK-mADA 바이러스는 사람의 내인성 ADA 단백질 보다 10배 까지 더 높은 수준으로 쥐의 ADA를 발현시킨다. 그러므로, 전달 효율성을 엄격하게 분석하기 위해서는, 전달된 mADA가 사람의 내인성 ADA 수준과 대등하거나 더 큰 경우에만 선조 콜로니가 형질감염된 것으로 간주한다. TKNEO 벡터로부터 neo의 높은 수준의 발현은 네오포스포트랜스퍼라제(neo 유전자 생성물) 활성에 대한 검정법으로서 G418 약물 내성으로 검출한다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법은 레트로바이러스 생산 세포의 존재하에서 동시배양할 필요없이 유리하게 수행된다. 따라서, 본 발명의 양태에 따라서, 레트로바이러스-매개된 유전자 전달은 표적 조혈 또는 기타 세포를 제외한 세포의 실질적인 부재하에서 수행할 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스 벡터 플라스미드를 함유하는 생산 세포를 배양하여 상등액을 수거할 수 있다. 이어서 레트로바이러스-함유 상등액을 이용하여 피브로넥틴 및/또는 피브로넥틴 단편, 바람직하게는 예를 들어 감염이 수행되거나 달리 감염용 배지와 접촉하는 기질상에 피복된, 고정화된 형태의 피브로넥틴 및/또는 이의 단편의 존재하에서 조혈세포를 감염시킬 수 있다. 이에 대하여, 높은 역가의 헬퍼-유리 레트로바이러스를 생산하는 생산 세포는 본 발명에 사용하기에 적합한 것으로 간주된다. 이들로는 예를 들어, Psi-2, C2, PA12, PA317, 및 GP+envAM12와 같은 패키지 세포 뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 수많은 패키지 세포주가 있다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 피브로넥틴의 헤파린-II 결합 도메인내의 아미노산에 결합하는 강력한 바이러스를 광범위한 세포 타입을 포괄하는 바이러스 치료용 전달 시스템을 작제하는데 사용할 수 있다. 이 목적을 위하여, 피브로넥틴으로부터의 레트로바이러스 결합 도메인을 포함한 폴리펩티드를 리간드에 공유결합에 의해 커플링시켜 상기 작제물에 표적 세포에 대한 특이성을 제공한다. 이 방법은 각각의 표적 세포에 대한 특이적 레트로바이러스 세포주를 작제하여야 하는 선행 기술의 필요성을 피할 수 있도록 한다[참조: Kasahara, N., A. M. Dozy, and Y. W. Kan., Science, Vol. 266, pp. 1373-1376(1994) 및 Valsesia-Wittmann, S., A. Drynda, G. Deleage, M. Aumailley, J. M. Heard, O. Danos, G. Verdier, and F. L. Cosset, J. Virol., Vol. 68, pp 4609-4619(1994)]. 표적화 작제물의 특이성은 예를 들어 1) 세포 접착 단백질, 2) 호르몬 또는 사이토킨, 3) 표적 세포에 대한 모노클로날 항체, 4) 표적 세포를 결합시키는 탄수화물[참조: G. Ashwell, et al., Annu. Rev. Biochem, Vol. 51, pp. 531-554(1982)], 5) 표적 세포에 대한 대사물, 또는 6) 표적 세포를 결합시키는 기능성 폴리펩티드를 포함한 리간드를 사용함으로써 제공될 수 있다. 유전자 전달용 작제물의 효율성은 수개의 헤파린-II 바이러스 결합 도메인을 포함시킴으로써 표적 세포로 전달되는 바이러스 입자의 양을 증가시킴으로써 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,198,423호에 기술된 바와 같이, Pro1239- Ser1515에 상응하는 사람의 피브로넥틴의 세포-결합 도메인은 BHK 및 B16-F10 세포를 포함한 세포에 결합하는 것으로 밝혀졌다(Kimizuka et al., J. Biochem. Vol. 110, pp. 285-291(1991)). 또한, 헤파린-II 도메인 자체가 섬유아세포, 내피세포, 및 종양 세포에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이들 폴리펩티드 서열은 피브로넥틴으로부터의 레트로바이러스 결합 도메인에 커플링시켜 설정된 레트로바이러스에 의한 감염용 세포를 표적화할 수 있다.
조혈 시스템에서의 적용예로는 각각 고도로 특이적인 에리트로이드 또는 과립구성 전구체 세포를 표적시키기 위한 피브로넥틴의 레트로바이러스 결합 도메인에 커플링된 에리트로포이에틴 또는 G-CSF의 작제물이 있다. 본 발명에 따른 다른 통상의 적용예로는 레트로바이러스 결합 도메인 또는 도메인들을 악성 세포에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 리간드와 배합하는 것이다. 예를 들면, 유방암 세포의 시험관내 및 심지어 생체내 성장이 피브로넥틴으로부터의 바이러스 결합 도메인을 1개 이상 함유하는 본 발명의 작제물중에 리간드로서 사용될 수 있는, 황체화 호르몬 방출 유도체(Emons, G. et al., Hum. Reprod. 9:1364-1379(1994)), 외스트로겐(Tolcher, A. W., Oncol. 8:39-43(1994)), 또는 안티-외스트로겐(Howell, A. et al., Lancet 345:29-30(1995)), 프로게스토겐 또는 안티-프로게스토겐(Klijn. F. G. et al, Hum. Reprod. 9 Suppl. 1:181-189(1994); Griffiths, K. et al, Semin. Oncol. 21:672-687(1994))과 같은 표적 세포상의 수용체에 결합하는 물질을 사용함으로써 영향받을 수 있다는 것이 밝혀졌다. 추가의 예로서, Jodid를 갖는 작제물을 사용하여 티로이드(암) 세포를 고도로 특이적으로 표적화할 수 있으며, HDL 또는 이들의 일부를 함유하는 작제물에 의해 간(암) 세포를 표적화할 수 있다. 최종적으로, 모노클로날 항체와 피브로넥틴의 레트로바이러스-결합 도메인의 작제물은 항체를 입수할 수 있는 세포 및 이에 대한 기관을 표적화한다. 따라서 광범위한 포유동물 세포 타입을 피브로넥틴의 레트로바이러스 결합 도메인의 결합 및 바이러스 벡터 편재화 능력에 기초하여 표적화할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 바람직한 양태는 표적 세포의 바이러스 형질도입을 향상시키기 위하여 사용할 수 있는 작제물의 제조와 관련된다. 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인의 바이러스-결합 아미노산 서열을 표적 세포가 결합하는 리간드에 커플링시킨다. 상기에서 논의된 바와 같이, 리간드의 예로는 피브로넥틴 또는 다른 단백질(세포 접착성 단백질, 예를 들면 라미닌, 콜라겐, 비트로넥틴, 오스테오폰틴 또는 트롬보스폰딘을 포함)로부터의 폴리펩티드, 호르몬, 대사물, 항체(모노클로날 항체 포함), 또는 결합능을 나타내며 바람직하게는 특이성을 갖는 기타 리간드일 수 있다. 생성된 대략적인 작제물은 이후의 실시예에서 특별하게 예시되는 피브로넥틴 폴리펩티드에 대해 사용되는 방식과 유사한 방식으로 고정화된 형태로 사용될 수 있다.
상기와 같은 작제물과 세포-표적화 방법은 상기 논의된 바와 같이 시험관내 레트로바이러스 표적화, 및 또한 생체내 레트로바이러스 표적화에서, 작제물의 안정성과 특이성 및 생리학적 조건하에서의 레트로바이러스 작제물의 상호반응과 같은 여러가지 인자를 고려하여 이용될 수 있다. 예를 들어 간세포를 표적시키고자 할 경우 간문 정맥을 카테터화함으로써, 표적 세포로의 작제물의 전달을 편재시키도록 전달 시스템을 변형시킴으로써 특이성을 또한 향상시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 바이러스와 세포의 동시-편재화와 관련된 본 발명의 형질도입 과정이 헥사디메트린 브로마이드의 부재 또는 실질적인 부재하에서 수행할 경우 더욱 유리하다는 발견과 연관된다. 헥사디메트린 브로마이드(통상적으로 Polybrene: 등록상표로 입수가능함)는 레트로바이러스에 의한 형질도입 효율성을 향상시킬 목적의 레트로바이러스-매개된 유전자 전달 프로토콜에서 광범위하게 사용되는 다중양이온성 물질이다. 그럼에도 불구하고, 본 명세서에 기술되는 것과 같은 동시-편재화 향상된 유전자 전달 프로트톨에 있어서 헥사디메트린 브로마이드의 존재는 형질도입 효율성을 현저하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 향상된 방법은 적어도 헥사디메트린 브로마이드가 실질적으로 없는(즉, 헥사디메트린 브로마이드를 약 1㎍/㎖ 이상 함유하지 않는) 배지중에서, 더욱 바람직하게는 헥사디메트린 브로마이드의 부재하에서 수행한다. 상기와 같은 공정은 본 발명의 바람직한 세포 조성을 제공하는데, 이는 레트로바이러스 생산 세포와 헥사디메트린 브로마이드가 실질적으로 없는 실질적으로 레트로바이러스-형질도입된 생존성 세포 집단을 포함한다. 이에 대하여, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 실질적으로 형질도입된 생존성 세포 집단은 형질도입된 집단중 세포의 적어도 약 20%가 레트로바이러스에 의해 형질도입된 것임을 의미하고자 한다. 더욱 바람직한 집단은 형질도입된 세포를 적어도 약 50% 갖는 것이고, 가장 바람직한 것은 형질도입된 세포를 적어도 약 75% 갖는 것이다. 본 발명의 상기 양태에 따르는 바람직한 세포 조성물은 조혈세포를 포함하며, 더욱 바람직하게는 원시 선조 및 간세포가 많은 조혈세포 집단을 포함한다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 유리한 공정은 상응하는 레트로바이러스 감염 프로토콜(예, 동시 배양)에서 피브로넥틴 단편 또는 동시-편재화를 위한 기타 물질을 사용하지 않고 형질도입 효율성을 증가시키지만, 동시-편재화를 위한 물질의 존재하에서 형질도입 효율성을 감소시키는, 다중양이온성 또는 기타 제제를 사용하지 않고 수행할 수 있다.
고도로 편리한 레트로바이러스-매개된 DNA 전달은 본 발명의 방법을 실행하기 위하여 특별하게 고안된 키트를 이용하여 수행한다. 따라서, 본 발명의 다른 양태는 레트로바이러스 감염을 수행할 수 있는 인공 기질과 함께, 레트로바이러스에 의한 표적 세포의 형질도입을 향상시키는, 상기 논의된 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 작제물을 포함하는 키트를 제공한다. 폴리펩티드 또는 기타 작제물은 별개로 제공할 수 있거나 인공 기질상에 피복시킬 수 있다. 사람의 조혈세포에 대한 감염 프로토콜의 경우 상기 키트는 또한 세포의 예비자극을 위하여 조혈세포 성장 인자를 포함한다. 또한, 상기 키트는 형질도입에 대해 상기 논의한 바와 같은 재조합 레트로바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 일반적으로 말해서, 상기 키트는 키트의 조작시 성분의 파괴를 방지하기에 충분하도록 이들 여러가지 성분들이 서로 이격되어 있도록 멸균 패키지를 포함한다. 예를 들면, 키트 성분을 이격된 상태로 보조하기 위하여 다중 구획 또는 영역을 갖는 성형 플라스틱 용기를 이용하는 것이 통상적이다.
본 발명의 이해와 평가를 돕기 위하여, 다음 특정 실시예를 제공한다. 이들 실시예는 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하지는 않는다.
실시예 1
TKNEO를 사용한 골수세포중으로의 유전자 전달
1.1 바이러스-상등액의 제조
레트로바이러스 플라스미드 TKNEO 벡터를 함유하는 GP+EnvAM 12 생산 세포(참조: Markowitz et al. (1988) Virology 167:400)를 10% 소태아 혈청(FCS, Hyclone, Logan, UT) 및 페니실린 100 단위/㎖ 및 스트렙토마이신 100㎍/㎖(P/S, 둘다 Gibco)를 함유하는 이스코브의 개질된 듈베코 배지(Iscove's Modified Dulbeccos Medium: IMDM, Gibco, Gaithersburg, MD) 중에서 배양한다. 밤새 융합성 판에 20% FCS를 함유하는 IMDM 10㎖를 가하여 바이러스 함유 상등액을 수거한다. 수확한 배지를 0.45μ 필터(Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)를 통하여 여과하여 사용할 때까지 -80℃에서 보관한다.
1.2 피브로넥틴 단편의 제조
FN을 4M 우레아로 용출시키기 전에 젤라틴-아가로스 컬럼을 1M 우레아로 세척하는 것을 제외하고는 문헌(Ruoslahti et al., Methods Enzymol. 82:803-831(1982))에 기술된 바와 같이 FN을 사람의 혈장(Lifesource, Glenview, IL)으로부터 정제한다. 정제한 FN을 10mM 3-(시클로헥실아미노)-1-프로판-술폰산(CAPS), 150mM NaCl, 2mM CaCl2pH 11.0에 대해 4℃에서 강력하게 투석시키고 나누어서 -80℃에서 보관한다. FN의 키모트립신분해 세포 결합 도메인(CBD)(CS-1) 및 헤파린-II 결합 단편을 문헌(Rouslahti et al. (1982), 상기, Patel and Lodish, J. Cell. Biol. 102, pp. 449-456(1986), 및 Bernardi et al., J. Cell. Biol. 105, pp. 489-498(1987))에 기술된 바와 같이 정제한다. 헤파린-아가로스 컬럼으로부터 1M NaCl 용출액중에서 3개의 주요한 헤파린-결합 단편(30kD, 35kD, 및 42kD)를 수득한다. 이들 헤파린-결합 단편을 추가로 정제하기위하여, 1M NaCl 용출액을 밤새 4 ℃에서 10mM Tris-HCl, pH 7.0에 대해 투석하여 10mM Tris-HCl pH 7.0으로 평형시킨 음이온 교환 컬럼(2㎖ DEAE 세파로스 신속 유동(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)/단백질 ㎎)상에 통과시킨다. 30/35kD 단편은 비결합 분획중에서 수거되는 반면 42kD 단편은 100mM NaCl을 갖는 컬럼으로부터 용출된다. FN 500㎎으로부터, 대략 26㎎의 30/35kD 단편과 4㎎의 42kD 단편을 수득한다. 42kD 단편은 웨스턴 블롯팅 기술에 의해 측정한 바에 따르면, 피브린-결합 도메인에 대한 항체에 의해 인식되지만 30/35kD 단편은 인식되지 않는다. 또한, 42kD 단편은 피브린-세파로스 친화성 컬럼에 결합한다.
감염 프로토콜에 사용하기 위하여, 피브로넥틴 단편을 35 또는 100㎜ 페트리 접시(Falcon, Lincoln Park, NJ)상에 문헌(Patel and Lodish(1986))에 기술된 바와 같이 75pmol/㎠의 농도로 고정화시킨다. 대조군 판을 유사한 방식으로 2%(FN-유리) 소 혈청 알부민(BSA, Boehringer Mannhein, Mannheim, Germany)으로 피복시킨다.
1.3 레트로바이러스 감염 프로토콜
건강한 성인 공여체로부터의 골수 샘플을 기관(Institutional Review Board of Indiana University School of Medicine)에 의해 승인된 프로토콜에 따라서 멸균, 방부제-유리 황산나트륨 헤파린을 함유하는 관에 수거한다. Ficoll-Hypaque(밀도 1.077g/㎖, Pharmacia, Piscataway) 상에서 45분간 25℃에서 원심분리시켜 저밀도 분자 세포를 제조한다. 저밀도 골수 세포로부터 조직 배양판상에서 4 내지 16시간 동안 37℃ 5% CO2에서 2% FCS를 갖는 IMDM 중에서 추가로 배양시켜 플라스틱 접착성 세포를 제거한다.
접착성-네가티브 저밀도 분자 세포는 문헌(Luskey et al(1992) Blood 80:396)에 기술된 바와 같이 레트로바이러스 감염전에 48시간 동안 37℃ 및 5% CO2에 20% FCS, 100U/㎖ rhIL-6, 100ng/㎖, rhSCF(둘다 Amgen, Thousand Oaks, CA), 및 페트리 접시중 1×106개의 세포/㎖를 함유하는 IMDM 중에서 예비자극한다. 예비자극된 세포를 강력하게 피펫팅하여 수확하여 플라스틱에 느슨하게 접착된 세포는 제거한다.
예비자극시킨 세포(5×105세포/㎖)를 BSA(대조군 판) 또는 피브로넥틴 또는 이의 단편으로 피복시킨 판(UV 조사시켜 플라스틱판에 대한 단백질의 접착성을 더욱 좋게함)상에서 6시간 동안 배양시킨 다음 성장 인자(상기와 같음) 및 7.5 ㎍/폴리브렌 ㎖(Aldrich Chemical, Milwaukee, WI)의 존재하에서 바이러스 상등액으로 감염시킨다. 2시간 후에 바이러스 상등액을 교체시키고(성장 인자 및 5.0㎍/㎖ 폴리브렌을 포함) 세포를 추가로 12 내지 24시간 동안 배양시킨다. 비-접착성 세포를 각각 배지를 교환시키면서 다시 가한다.
감염 프로토콜에 이어서, 비-접착성 세포를 경사시키고 접착성 조혈세포는 세포 해리 완충액(CDB)(효소 유리/PBS 기본, Gibco)을 사용하여 컬쳐로부터 제조업자의 지침에 따라서 수거한다. 접착성 세포를 비-접착성 분획에 가하고 2회 세척하여 계수한다. 수확한 세포는 클론발생성 메틸셀룰로스 선조 검정법 또는 장기간의 골수 배양액에 넣는다.
1.4 장기간의 골수 배양
LTC-IC(사람의 간세포) 검정을 약간 변형시킨 상기한 방법에 따라서 수행한다[Sutherland et al. Blood 74:1563(1989)]. 간략하면, 0.5-1×106개의 감염된 세포를 6개의 웰 조직 배양판(Costar, Cambridge, MA) 중 10% FCS, 10% 말의 혈청(Sigma) 및 P/S, 1×10-5M 히드로코르티손(Upjohn, Kalamazoo, MI), 및 320mosmol 염화나트륨을 함유하는 5㎖중의 IMDM 중용융상의 미리 조사처리한(상기한 바와 같이) 이종성 사람 골수 섬유아세포(BMF) 상에 장기적인 골수 배양(LTMC)으로 씨딩한다. 5주후, CDB를 사용하여 LTC-IC 컬쳐를 희생시켜 BMF로부터 접착성 조혈세포를 제거한다. 비-접착성 및 접착성 조혈세포 둘다를 합하고 메틸셀룰로오스에 플레이팅시켜 LTC-IC로부터 유래되는 콜로니를 수득한다.
1.5 클론발생성 메틸셀룰로오스 검정
문헌(Toksoz et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 89, p 7350(1992))에 기술된 바와 같이 메틸셀룰로오스 검정을 수행한다. 간략하면, 2-5×104개의 감염된 성인의 골수 세포를 25% FCS, 10% 사람의 혈장, 10-5M 베타-머캅토에탄올(Sigma), 및 P/S를 함유하는 2.4% IMDM 메틸셀룰로오스(Fluka, Ronkonkoma, NY) 1㎖ 중에 5단위/㎖ 에리트로포이에틴(Epo, Amgen), 100ng/㎖ rhSCF, 10ng/㎖ rhIL-3(Genzyme, Cambridge, MA)와 함께 플레이팅한다. 컬쳐를 37℃에 5% CO2/95% 공기 중에서 배양시키고 콜로니(>50개 세포)를 13일째 되는 날에 CFU-GM(과립구 및 대식구를 함유), CFU-Mix(골수성 및 적혈구 요소를 함유), 또는 BFU-E(적혈구 요소만을 함유)로서 반전 현미경상에서 육안으로 평가한다.
1.6 레트로바이러스 감염 분석
TKNEO 바이러스에 의한 감염 효율성은 13일째 되는 날 1.5㎎/㎖(무수 분말, Gibco) G418에 대해 내성인 메틸셀룰로오스 콜로니의 %를 측정하여 분석한다. 재조합 바이러스를 갖지 않는 GP+EnvAM 12 패키지 라인상에서 골수를 배양시킴으로써 각각의 실험으로 가짜 감염을 수행한다. 이들 가짜 감염된 세포와 1.5㎎/㎖ G418와의 컬쳐는 <1% 배경 콜로니인 것으로 일정하게 증명된다.
1.7 수용된 선조 세포로의 유전자 전달 효율성
30/35 FN- 또는 BSA-피복된 접시상에 플레이팅시킴으로써 골수 세포를 감염시켜 형질도입 효율성을 비교한다. 선택하지 않고 감염시킨 후 수득한 콜로니의 수에 있어서는 이들 조건간에 차이는 관측되지 않는다. 도 2는 감염후 G418r콜로니의 %를 나타내는 것이다. 혈통-제한된(BFU-E 및 CFU-GM) 뿐만 아니라 다중혈동(CFU-Mix) 선조 세포로부터 유래된 것들을 포함한, 모든 타입의 선조로부터의 30/35 FN 상에서 G418r콜로니의 %가 더 높은 것으로 나타났다. 모든 수용된 선조세포로의 감염은 30/35 FN 대 BSA에 있어서 9배 증가하였다.
1.8 장기간의 배양-개시 세포로의 유전자 전달 효율성
TKNEO 벡터를 사용하여 LTC-IC로의 유전자 전달을 평가한다. LTC-IC로의 유전자 전달 유래된 콜로니만이 감염후 30/35 FN(16% G418r대 0% G418r콜로니, 30/35 FN 대 BSA) 상에서 검출되었다.
1.9 조혈세포의 감염 효율성에 대한 30/35 FN 효과의 특이성
30/35 FN상에서 발견된 증가된 유전자 전달 효율성의 특이성을 측정하기 위하여, BSA, 30/35 FN, 천연 피브로넥틴, RGDS 테트라펩티드 서열을 함유하는 중추 세포-결합 도메인(CBD) 함유 115kd FN 단편, 및 헤파린-II 결합 도메인으로 특징되지만 CS-1 서열이 결여되어 있는 42kd C-말단 FN 단편(42FN)(도 1)으로 피복시킨 판상에서 TKNEO에 의한 감염을 수행한다. BSA 상의 감염은 3±1% G418rBFU-E, 1±1% G418rCFU-GM, 및 0±0% G418rCFU-Mix로 나타났다. G418r콜로니의 비율상의 현저한 증가는 CBD상 에서 밝혀지지 않았으마, 42FN 상에서는 BFU-E의 감염이 약간 더 높은(6.0±-1%) 것으로 밝혀졌다(도 3). 그러나, 천연 FN은 수용된 선조세포 모두의 증가된 유전자 전달을 증진시켰다. 천연 FN상의 감염후 G418r콜로니의 %는 BFU-E(16±-2 대 24±4%), CFU-GM(5±2 대 20±4%) 및 CFU-Mix(6±1 대 9±1; 천연 FN 대 30/35 FN, 각각)을 포함한, 모든 혈통에 있어서 30/35 FN 보다 작다.
실시예 2
PGK-mADA를 사용한 골수 세포로의 유전자 전달
2.1 일반적인 방법
실시예 1의 TKNEO에 대해 기술된 바와 같이 PGK-mADA 바이러스 상등액을 제조하고 실시예 1의 레트로바이러스 감염 프로토콜에 따른다. 실시예 1에 따라서 LTC-IC(사람의 간세포) 검정 및 메틸셀룰로오스 검정을 수행한다.
2.2 레트로바이러스 감염의 분석
PGK-mADA 벡터에 의한 감염 효율성은 ADA 동형 효소 전기영동법을 이용한 단백질 분석으로 측정한다. 각각의 선조세포 콜로니의 분석을 문헌(Moritz(1993) 및 Lim et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 86, p 8892)에 기술된 바와 같이 수행한다. 전달 효율성을 정확하게 분석하기 위하여, 내인성 사람 ADA와 동일하거나 더 높은 수준으로 mADA를 발현시키는 콜로니만을 형질도입된 것으로 간주한다. 푸울된 콜로니 분석의 경우, 메틸셀룰로오스 컬쳐로부터 회수한 콜로니를 1.5㎖ 미세관(Rainin, Woburn, MA)에서 합하여, 따뜻한 배지 및 인산염 완충된 염수(PBS)로 세척하고, 원심분리시켜 -20℃에서 보관한다. ADA 분석의 경우, 반복되는 냉동-해동 사이클에 의해 세포를 분해 완충액(lysis buffer) 5㎕ 중에서 분해하고 상기한 바와 같이 동형효소 전기영동을 수행한다.
2.3 수용된 선조세포로의 유전자 전달 효율성
BSA-피복된 접시의 30/35 FN 상에 플레이팅시키면서 골수 세포를 감염시켜 형질도입 효율성을 비교한다. 선택하지 않고 감염시킨후 수득한 콜로니 수에 있어서 이들 조건 사이의 차이점은 관측되지 않는다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 모든 수용된 선조세포로의 감염 효율성은 30/35 FN 대 BSA에서 실질적으로 증가하였다. 역가가 높은(∼1×107virons/㎖) 벡터에 대해 기대되는 바와 같이, 수용된 선조세포의 형질도입 효율성이 특히 높다. 표 1을 참고로 하여, PGK-mADA를 갖는 30/35 FN에 대한 골수의 감염은 2개의 별개의 실험에서 수용된 선조세포가 거의 100% 형질도입된 것으로 나타났다.
PGK-mADA 벡터를 사용한 피브로넥틴 30/35 단편에 대한 수용된 사람의 선조세포의 감염 효율성
실험 BSA 30/35FN
실험 1 1/18* 13/14
실험 2 2/13 12/13
* mADA 발현 콜로니의 수/분석되는 콜로니의 전체수
2.4 장기간의 배양-개시 세포로의 유전자 전달 효율성
PGK-mADA로 수행한 4개의 독립적인 실험에서 5주령 LTMC로부터 유래되는 선조세포 콜로니(즉, LTC-IC 유래 콜로니) 중 높은 비율이 전달된 쥐의 ADA 유전자를 발현시켰다. 발현 범위는 분석된 콜로니중 2/12(17%) 내지 6/6(100%)였다(표 2). 모든 콜로니에 있어서 내인성 사람 ADA 활성의 양을 초과하거나 적어도 대등한 도입된 mADA 유전자의 발현을 포지티브인 것으로 간주한다. PGK-mADA에 대한 감염 효율은 TKNEO 보다 높았다. 표 2에 나타낸 바와 같이, PGK-mADA를 사용한 30/35 FN에 대한 골수의 감염은 2개의 별개 실험에서 수용된 선조세포가 거의 100% 형질도입되는 것으로 나타났다.
PGK-mADA 벡터를 사용하는 사람의 장기간 배양 개시 세포(LTC-IC)의 감염 효율성
실험 BSA 30/35FN
실험 1 0/14* 10/19
실험 2 N/A 2/12
실험 3 0/4 3/5
실험 4 0/4 6/6
전체 0/22 21/42
* mADA 포지티브 콜로니의 수/분석된 콜로니의 전체수; N/A: 분석되지 않음.
2.5 조혈세포의 감염 효율성에 대한 30/35FN 효과의 특이성
LTC-IC중으로의 유전자 전달 효율성은 30/35FN 상에서 증가하였다. 이들 2차 LTC-IC 유래 콜로니의 크기가 상대적으로 작기 때문에, 단일 콜로니에 대한 단백질 분석 수행능력은 제한된다. BSA에 대해 PGK=mADA를 사용하여 감염시킨 후, 각각 천연 피브로넥틴 및 42 FN 0/6, 0/4, 및 0/3 LTC-IC-유래된 콜로니가 쥐의 ADA를 발현시키는 것으로 증명되었으나, 30;/35 FN에 대해 감염된 3/5 LTC-IC-유래 콜로니가 mADA를 발현시켰다. 또한, 2개의 추가 실험으로 분석전에 다중 LTC-IC-유래 콜로니를 푸울할 경우, 30/35 FN에 대한 감염후에만 mADA 발현이 검출되며 천연 FN에 대해서는 더 적은 정도로, 42FN 또는 BSA에 대해서는 검출되지 않았다.
실시예 3
PGK-hADA를 사용하는 골수 세포로의 유전자 전달
3.1 일반적인 방법
실시예 1의 TKNEO에 대해 기술된 바와 같이 PGK-hADA 바이러스 상등액을 제조한다. 피브로넥틴의 키모트립신 분해 단편을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고 실시예 1의 레트로바이러스 감염 프로토콜에 따른다. LTC-IC 및 메틸셀룰로오스 검정을 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행한다.
3.2 레트로바이러스 감염 분석
푸울된 콜로니의 분석을 위하여, 메틸셀룰로오스 컬쳐로부터의 콜로니를 1.5㎖ 미세관(Rainin, Woburn, MA)에서 합하고, 따뜻한 배지 및 PBS로 세척한 다음 원심분리하여 -20℃에서 보관한다. ADA 분석을 위하여, 세포를 반복되는 냉동-해동 사이클로 5㎕의 분해 완충액중에서 분해하여 동형 효소 전기영동을 상기한 바와 같이 수행한다
실시예 4
TKNEO를 사용한 대혈 세포(cord blood cells)중으로의 유전자 전달
4.1 일반적인 방법
TKNEO 바이러스 상등액과 피브로넥틴의 키모트립신 분해 단편(도 1)을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조한다. 실시예 1의 레트로바이러스 감염 프로토콜에 따르지만 정상적인, 만삭 신생아로부터의 제대혈액을 기관(Institutional Review Board of Indiana University School of Medicine)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 헤파린을 함유하는 관중에 수거하여 골수 세포 대신 사용하는 것이 상이하다. LTC-IC(사람의 간세포) 및 메틸셀룰로오스 검정을 실시예 1에 따라서 수행한다.
4.2 수용된 선조 세포중으로의 유전자 전달 효율성
FN 30/35에 대한 감염은 3개의 별개 실험에서 BSA와 비교하여 4배 이상 증가되었다(표 3).
30/35FN 단편 및 TKNEO 벡터를 사용한 대혈액 선조 세포의 감염 효율성
BSA 12±17
30/35 55±16
실시예 5
PGK-mADA를 사용한 대혈액 세포중으로의 유전자 전달
5.1 일반적인 방법
PGK-mADA 바이러스 상등액과 피브로넥틴의 키모트립신분해 단편(도 1)을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조한다. 실시예 1의 레트로바이러스 감염 프로토콜에 따르나 정상적인 만삭 신생아로부터의 대혈액을 기관(Institutional Review Board of Indiana University School of Medicine)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 헤파린을 함유하는 관중에 수거하는 점이 상이하다. LTC-IC와 메틸셀룰로오스 검정을 실시예 1에 따라서 수행한다.
5.2 장기간의 배양 개시 세포중으로의 유전자 전달 효율성
높은 역가의 PGK-mADA 벡터를 사용하여, LTC-IC-유래 콜로니를 분석하면 FN30/35에 대한 상등액을 사용하여 감염시킨 대혈액으로부터 확립된 컬쳐로부터 콜로니에서만 도입된 mADA cDNA가 높은 수준으로 발현되는 것으로 증명되었다. BSA 대조군 판에 감염된 LTC-IC-유래 콜로니에서는 약간의 mADA 발현이 검출되었다.
실시예 4 및 5에 나타난 결과는 FN30/35를 사용하는 감염이 대혈액 선조세포 및 간세포를 사용하는 경우에도 효율성이 증가될 수 있음을 증명하는 것이다.
실시예 6
PGK-hADA를 사용하는 대혈액 세포중으로의 유전자 전달
PGK-hADA 바이러스 상등액과 피브로넥틴의 키모트립신분해 단편(도 1)을 실시예 1의 TKNEO에 대해 기술된 바와 같이 제조한다. 실시예 1에서의 레트로바이러스 감염 프로토콜에 따르지만 정상적인 만삭 신생아로부터의 대혈액을 기관(Institutional Review Board of Indiana University School of Medicine)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 헤파린을 함유하는 관중에 수거하여, 골수세포 대신 사용하는 점이 상이하다. LTC-IC와 메틸셀룰로오스 검정을 실시예 1에 따라서 수행한다.
실시예 7 내지 11
실시예 7 내지 11에 대한 레트로바이러스 벡터 및 생산 세포주
실시예 7 내지 11의 경우, 2종의 레트로바이러스-생산 패키지 세포주를 사용한다: 각각 에코트로픽 GP+E86(Markowitz, D., S. Goff, 및 A. Bank, J. Virol., Vol. 62, pp 1120-1124(1988)) 및 암포트로픽 GP+envAM12 세포주(Markowitz, D., S. Goff, 및 A. Bank, Virology, Vol. 167, pp 440-406(1988)). 본 발명에 기술된 연구에 사용되는 레트로바이러스 벡터와 생산 클론을 표 4에 나타내었다.
벡터 생산/클론 발현된 cDNA
PGK-hADA GP+E86/EPHA-5 사람의 ADA
PM5neo GP+E86/EAL2a neo 포스포트랜스퍼라제, LAC-Z
TKNeo GP+E86/TKNeo neo 포스포트랜스퍼라제
PGK-mADA GP+EnvAM12/55/6 쥐의 ADA
모든 세포주를 10% 소태아 혈청(FCS, Hyclone, Logan, UT) 및 100단위/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(P/S, 둘다 Gibco)를 함유하는 듈베코 개질 이글 배지(DME, Gibco, Grand Island, NY)에서 배양시키는데, EAL2a 세포는 10% FCS와 P/S를 함유하는 DME-F12(Gibco)에서 성장시키는 점이 상이하다. 각각 10% FCS와 P/S를 함유하는, 쥐의 세포의 경우 알파-최소 필수 배지(αMEM, Gibco) 또는 사람의 세포의 경우 이스코브의 듈베코 배지(IMDM, Gibco) 10㎖를 밤새 용융성 10㎝ 판에 가하여 바이러스 함유 상등액을 수거한다. 수확한 배지를 0.45μ 필터(Gelman Science, Ann Arbor, MI)를 통하여 여과하여 사용할 때까지 -80℃에서 보관한다.
실시예 7
쥐의 주요 조혈세포의 형질도입
7.1 실험
쥐의 세포를 사용하는 연구의 경우, 5-플루오로우라실(SoloPack Laboratories, Franklin Park, IL) 150㎎/㎏을 2일간 투여한 6 내지 8주령 C3H/HeJ 마우스(Lim, B., J. F. Apperley, S. H. Orkin, 및 D.A. Williams, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, pp 8892-8896(1989))의 대퇴골과 경골로부터 골수를 수확한다. 세포를 IMDM/20% FCS+P/S 중에서 5×105개 세포/㎖의 농도로 100ng/㎖ 래트 재조합 간세포 인자(rrSCF; Amgen, Thousands Oaks, CA) 및 100단위/㎖ 재조합 사람의 인터류킨-6(rhIL-6; Pepro Tech Inc., Rock Hill, NJ)으로 48 시간 동안 예비자극시킨다(Luskey, B.D., M. Rosenblatt, K. Zsebo, 및 D.A. Williams, Blood, Vol. 80, pp 396-402(1992)). 이어서, EPHA-5 생산 세포에 의해 생산된 PGK-hADA 벡터를 사용한 유전자 전달 효율성을 다음 3가지 상이한 감염 프로토콜을 사용하여 비교한다: 1) 상등액 감염; 2) FN 30/35에 대한 상등액 감염; 3) EPHA-5 생산 세포에 대한 동시배양. 따라서, 100㎜ 세균 접시를 인산염 완충 염수(PBS; Gibco) 5㎖중에 용해시킨 2.5㎍/㎠ FN 30/35(75pmol/㎠와 등량)로 1시간 동안 실온에 UV광 하에서 피복시키고, 이때 접시를 개방시키고 다시 1시간 동안 접시를 폐쇄시킨다. 2% 소혈청 알부민(BSA, Fraction V; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)으로 실온에서 30분간 차단시킨 후, 접시를 일단 2.5%(v/v) 1M Hepes가 보충된 행크스 균형 염수(HBSS)(둘다 Gibco)로 세척한다. 상등액 감염의 경우, 접시를 BSA 만으로 피복한다. 5×106개의 예비자극된 공여체 세포를 100U/㎖ rhIL-6, 100ng/㎖ hrSCF 및 7.5㎍/㎖ 폴리브렌이 보강된 상기한 바와 같이 EPHA-5 세포로부터 수득한 바이러스 상등액 10㎖와 함께 배양시킨다. 비-부착성 세포를 수거하여 신선한 바이러스 상등액을 다시 가한다. 동시배양의 경우, 배지 4㎖중 EPHA-5 세포를 10㎍/㎖ 미토마이신 C와 함께 2시간 동안 37℃에서 배양하여, 세척하고 트립신분해한 다음 100㎜ 조직 배양 접시상에 αMEM/20% FCS+P/S 10㎖ 중 3×106개 세포의 농도로 씨딩한다. 다음날, 100U/㎖ rhIL-6, 100ng/㎖ hrSCF 및 4㎍/㎖ 폴리브렌으로 예비자극한 5×106개의 세포를 경사시키고 제조업자의 지침에 따라 세포 해리 완충액(CDB)(효소 유리/PBS 기본, Gibco)을 사용하여 컬쳐로부터 부착성 조혈세포를 수거한다. 상기 부착성 세포를 비-부착성 분획에 가하고, 2회 세척하여 HBSS/Hepes 대략 1㎖중에 현탁시킨다. 5×106개의 예비자극시킨 세포로부터 수득한 전체 세포를 치사량의 방사선(700+400cGy,137Cs-공급원)을 몸 전체에 조사시킨 3마리의 마우스 꼬리 정맥에 주사한다(Luskey, B.D., M. Rosenblatt, K. Zsebo, 및 D.A. Williams, Blood, Vol. 80, pp 396-402(1992)). 도입된 사람의 ADA cDNA의 발현에 대해 재구성시킨 마우스를 조사하여 조혈 간세포의 형질도입을 분석한다. 상기 ADA 동형효소 분석은 셀룰로오스 아세테이트 동일계 효소 분석법(Lim, B., D.A. Williams, 및 S.H. Orkin, Mol. Cell. Biol., Vol. 7, pp 3459-3465(1987))에 의해 hADA 단백질의 존재에 대해 말초 혈액 세포를 조사함으로써 이식시킨 마우스 중에서 수행한다. 이식후 4개월에 조사를 수행하여 매달 반복한다.
7.2 결과
유전자 조작한 조혈 간세포를 사용한 마우스의 장기간의 골수 재구성은 일반적으로 이식후 4개월의 기간이 경과된 후 간세포 형질도입 효율성을 측정하는데 있어서 적절한 것으로 인정된다. 7개월후 형질도입된 골수의 동형효소 분석에 의한 수용체 분석으로 다음과 같이 밝혀졌다: 1) 사람의 ADA cDNA 발현은 동시배양 또는 FN 30/35에 대한 상등액 감염을 이용하는 경우 존재하지만 FN 30/35를 사용하지 않는 상등액 감염후 이식된 군에서는 부재하며; 2) 발현 수준은 동시배양과 FN 30/35 군의 경우 필적할만하다. 도 4, 레인 2-4에 나타낸 바와 같이, EPHA-5 세포에 대한 동시배양에 의한 형질도입된 골수가 이식된 3마리의 마우스는 사람 ADA가 용이하게 검출될 수 있는 것으로 증명되었다. 유사한 수준의 사람 ADA가 FN 20/35의 상등액 감염에 의해 형질도입된 조혈세포가 이식된 3마리의 마우스에서 검출되었다(도 4, 레인 5-7). 대조적으로, BSA에 대한 상등액 감염에 의해 형질도입된 조혈세포가 이식된 3마리의 마우스에서는 사람 ADA가 검출되지 않았다(도 4, 레인 8-10). 사람 ADA의 위치에 대한 대조군을 도 4의 레인 1과 12에 나타내며 쥐의 ADA는 도 4의 레인 11에 나타낸다. 레인 2-10의 쥐의 밴드는 등량의 단백질이 부하됨을 나타낸다. 이들 데이타는 FN 30/35에 대한 상등액 감염에 의한 장기간의 재구성 조혈 간세포의 형질도입이 동시배양과는 등가이고 FN 30/35를 사용하지 않는 상등액 감염보다는 훨씬 우수함을 나타낸다.
실시예 8
FN 30/35에 대한 레트로바이러스 벡터 결합에 의해 향상되는 형질도입 메카니즘
8.1 실험
형질도입의 증가가 바이러스와 조혈세포의 동시배양 결과인지 아닌지를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 재조합 레트로바이러스 입자가 FN 30/35에 결합하는지 증명하기위하여 분석하였다. 그러므로, FN 30/35-피복된 판을 TKNeo 바이러스를 함유하는 상등액과 함께 30분간 예비배양한 후 강력하게 세척한다. 상등액의 바이러스 역가는 표준 방법에 따라서 NIH/3T3 세포를 사용하여 측정한다(Markowitz, D., S. Goff, 및 A. Bank, J. Viol., Vol. 62, pp 1120-1124(1988)). 간략하게, 6개-웰 조직 배양판중에 1000개 세포/웰의 농도로 3T3 세포를 플레이팅시키고 밤새 성장시킨다. 바이러스 상등액의 연속 희석액을 각각의 웰에 7.5μ/㎖ 폴리브렌과 함께 가하여 2.5시간 동안 37℃에서 배양시킨후 배지 2㎖를 가한다. 24시간후, 배지를 G418(0.75㎎/㎖, 무수 분말, Gibco)를 함유하는 배지로 대체하여 판을 10 내지 12일간 배양시킨다. G418-내성 콜로니(G418r)를 10 내지 12일후 염색시켜 상등액의 감염 입자(cfu)로 사용한다. 본 발명자들은 바이러스 상등액과 예비 배양시킨후 35㎜ 세균성 접시 세포 당 1000 NIH/3T3+폴리브렌을 가하여 강력하게 세척시킨후 FN 30/35-피복된 또는 BSA-피복된 35㎜ 판에 잔류하는 레트로바이러스 입자의 양을 "역가"로 평가한다. 24시간이 경과된 후, 컬쳐에 0.75㎎/㎖ G418(무수 분말)을 함유하는 배지를 공급하여 상기 세포를 추가로 10 내지 12일간 배양한다. 배양이후, G418-내성 NIH/3T3 콜로니에 번호를 새겨 부착성 바이러스의 존재를 정량화한다.
FN 30/35에 대한 바이러스 결합이 투여량-의존성 방식으로 일어나는제 평가하기 위하여 접시를 피복시키는 FN 30/35의 농도를 증가시켜 상기 실험을 반복한다. 그러므로, 35㎜ 세균 접시를 상기한 바와 같이 1, 4, 10 및 20㎍/㎠ FN 30/35로 피복시킨다. 1×104감염성 입자/㎖로 미리 적정시킨 TKNeo 바이러스 스톡의 1:50 희석액을 FN 30/35-피복된 판상에서 30분간 배양시킨다. 강력하게 세척한 후, 각각의 웰에 2000 NIH/3T3 세포를 가한다. 상기한 바와 같이 선택하여 선택 10일후 G418-내성 NIH/3T3 콜로니를 계수한다.
8.2 결과
도 5에는 3개의 대표적인 실험 중 하나의 결과를 설정해 놓은 것이다. TKNeo 상등액을 사용하여, NIH/3T3 세포중 G418r콜로니에 의해 측정된 레트로바이러스의 역가가 BSA-피복된 판상에서 3로그(4×103내지 0) 이상 감소되는 반면, 30/35 FN으로 피복시킨 판에서는 단지 1로그였다. 이들 데이타는 레트로바이러스가 정량적으로 FN 30/35에 결합하지만 BSA로 피복시킨 접시(대조군 접시)에는 결합하지 않는다. 도 6은 증가된 농도의 FN 30/35으로 피복시킨 판상에서 바이러스-함유 상등액을 배양할 경우 증가된 수의 G418-내성 콜로니가 검출된다. 그러므로, FN 30/35에 결합하는 바이러스는 투여량-의존성 방식으로 일어난다.
실시예 9
재조합 피브로넥틴 단편에 결합하는 바이러스
9.1 실험
기미쯔가(Kimizuka) 등은 이. 콜라이중 클로닝된 FN DNA 서열의 발현에 대해 이미 보고하였다 (Kimizuka, F.,Y. Taguchi, Y. Ohdate, Y. Kawase, T. Shimojo, D. Hashino, I. Kato, K. Sekiguchi, 및 K. Titani, J. Biochem., Vol. 110, pp 284-291(1991)). 클로닝된 펩티드 및 키메릭 펩티드는 세포 부착에 관여하는 것으로 공지된 피브로넥틴중 수개의 중요한 서열 중 하나 또는 혼합물(RGDS, CS-1 및 헤파린-결합 부위 포함)을 포함한다(참고: 도 7). 레트로바이러스가 이들 재조합 FN 단편에 결합할 수 있는지 분석하기 위하여, 3T3 세포 콜로니 형성 검정을 재조합 단편 C-274, H-271, H-296, CH-271, CH-296, 및 C-CS1 뿐만 아니라 포지티브 대조군으로서 FN 30/35로 피복시킨 판상에서, 1×104감염성 입자/㎖인 동결된 레트로바이러스 TKNeo 스톡의 2개의 상이한 희석액(1:10 및 1:100)을 사용하여 반복한다. FN 단편은 120 내지 130pmol/㎠(C-274, H-271, H-296, C-CS1, FN 30/35의 경우 4㎍/㎠와 등가히고 CH-271 및 CH-296의 경우 8㎍/㎠와 등가)의 농도로 사용한다. 간략하면, 판을 피복시키고, 바이러스를 가하여 판을 강력하게 세척하고, NIH/3T3 세포를 24시간 동안 가한 다음 선택 배지중에서 10일간 성장시키고, 이러서 콜로니를 염색하여 계수한다.
9.2 결과
도 8은 G418-내성 콜로니(및 바이러스 부착)의 수는 단편 H-271, H-296, CH-271 및 CH-296중에서 증가함을 증명하는 것이다. 또한, 이 연구에 있어서 CH-271 단편이 가장 높은 수준의 바이러스 결합을 나타내지만, 재조합 단편과 FN 30/35 간을 대략 견줄만 하다는 것을 나타낸다. 이들 5 FN 단편 모두에 대해 통상적인 것은 아마도 반복체 13(Kimizuka, F., Y. Taguchi, Y. Ohdate, Y. Kawase, T. Shimojo, K. Hashino, I. Kato, K. Sekiguchi, 및 K. Titani, J. Biochem., Vol. 110, pp284-291(1991))에 존재하는 친화성이 높은 헤파린-결합 부위를 갖는 타입 III 반복체 12-14(Rouslahti, E., Ann. Rev. Biochem., Vol. 57, pp375-143(1988) 및 Kimizuka, F., Y. Taguchi, Y. Ohdate, Y. Kawase, T. Shimojo, K. Hashino, I. Kato, K. Sekiguchi, 및 K. Titani, J. Biochem., Vol. 110, pp 284-291(1991)). 이는 바이러스 결합이 상기 공지된 부착 부위를 통하여 일어나는 것을 제시하는 것이다. 이는 4㎍/㎠ CH-271로 피복된 접시를, 헤파린-결합 부위에 대한 세포 결합을 억제하는 것으로 공지된 고도로 하전된 분자인 헤파린 황산염의 농도를 증가시키면서(10-1000㎍/㎖) 예비-배양시킴으로써 명백해진다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, G418-내성 콜로니의 수는 헤파린 황산염의 농도를 증가시키면서 CH-271를 예비-배양시킴에 따라 감소한다. 이들 데이타는 FN에 결합하는 바이러스가 FN의 카복실-말단 도메인중 CS-1 부위에 가장 인접하여 위치하는 고 친화성 헤파린-결합 부위를 통해서는 매개됨을 제시하는 것이다.
실시예 10
재조합 피브로넥틴 단편에 대한 조혈세포의 형질도입
10.1 실험
FN 30/35에 대해 전술한 조혈 세포의 형질도입이 재조합 FN 단편에 의해 증가될 수 있는지에 대해 분석하기 위하여, 본 발명자들은 고 증식성 잠재적- 콜로니 형성 세포(HPP-CFC) 검정법을 사용하여 시험관내 상등액 감염의 형질도입 효율성을 평가하였다. EAL2a 벡터를 사용함으로써, 유전자 전달의 지시제로서 G418-내성 콜로니의 성장을 이용하는 조혈세포의 형질도입에 대한 여러가지 재조합 FN 단편 대 BSA에 대한 FN 30/35 상등액 감염을 비교하였다. 또한, 본 발명자들은 FN 단편에 대해 이미 부착성인 바이러스 입자(대 상등액 바이러스)의 조혈세포 형질도입 능력을 비교한다. 0.5 내지 1×106개의 예비자극된 골수 세포를 상기 논의된 바와 같이 성장 인자와 5㎍/㎖ 폴리브렌을 갖는 EAL2a 바이러스 함유 상등액 1 내지 2㎖로 35㎜ FN-피복된 페트리 접시상에서 배양시키는 것이다. FN 단편에 결합된 바이러스에 의한 조혈세포의 형질도입을 평가하기 위하여, 바이러스-함유 상등액과 함께 배양시킨 35㎜ FN-피복된 접시를 각각 2㎖의 PBS로 3회 세척한다. 이어서, 0.5 내지 1×106개의 예비자극된 골수 세포를 성장 인자와 폴리브렌이 보충된 배지 2㎖에 가한다. 22시간 후, 세포를 수확하고 상기한 바와 같이 1.5㎎/㎖의 G418을 가하거나 가하지 않고 HPP-CFC 검정에 플레이팅시킨다(Bradley, T.R. and D. Metcalf, Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., Vol. 44, pp 287-293(1966)). 상기 컬쳐를 14일간 7% CO2에 33 ℃에서 배양시키고 유전자 전달 효율성을 G418 내성 콜로니의 %로서 계산한다.
10.2 결과
상등액 감염을 통한 원시 조혈세포의 형질도입(도 10)이 헤파린-결합 부위(HBS)와 1개 이상의 활성 세포 부착 부위(진한 막대)가 포함되어 있는 모든 단편에 대해 BSA에 대한 상등액 감염보다 훨씬 더 높다. 재조합 단편 CH-271, H-296, CH-296 및 C-CS1의 형질도입 효과는 FN 30/35의 효과와 유사하며, 상기 3개의 단편은 모두 헤파린-결합 및 CS-1 부위를 둘다 포함한다. 다른 모든 경우에 있어서 형질도입이 크게 감소된다. 이들 데이타는 FN 30/35에 대해 이미 밝혀진 원시 조혈세포의 형질도입 증가가 재조합 FN 단편에 대해서도 재현될 수 있음을 나타낸다. 또한 피브로넥틴에 직접 결합하는 바이러스가 조혈세포의 유전자를 형질도입시킬 수 있음을 나타낸다. 최종적으로 원시 조혈 선구(간)세포를 형질도입시키는데 있어서 CS-1과 헤파린 결합 부위 둘다의 존재의 유용성을 확인한다.
실시예 11
재조합 피브로넥틴 단편에 대한 쥐의 공여체 세포의 형질도입을 이용하는 마우스의 장기간 골수 재구성
11.1 실험
본 발명자들은 원시 조혈 선조세포에 대하여 BSA 대 FN 30/35에 대한 상등액 감염 대 재조합 FN 단편 대 컬쳐를 비교하는 상기 시험관내 연구(실시예 10으로부터)를 골수 이식법을 이용하여 반복하여 조혈 간세포의 재구성에 있어서의 효과를 분석한다. 간략하면, 치사량의 방사선을 조사한 마우스에게 사람의 ADA cDNA를 함유하는 EPHA-5 벡터로 형질도입시킨 공여체 세포를 주사한다. 1개월후 및 대략 6개월후, ADA 동형효소 검정법으로 말초 혈액으로부터 유전자 전달 효과를 분석한다.
11.2 결과
도 11은 1개월후의 결과를 나타내는데, 헤파린 결합 부위와 CS-1을 둘다 함유하는 피브로넥틴 단편 H-296은 FN 30/35 및 동시배양과 유사한 결과를 나타냄이 명백하게 밝혀진다. 이들 부위를 둘다 함유하지 않는 단편은 이식성 조혈세포의 형질도입에 있어서 훨씬 더 효과적이다. 이들 데이타는 원시 조혈 간세포와 CS-1 및 헤파린 결합 부위를 둘다 함유하는 재조합 FN 단편에 결합되어 있는 레트로바이러스의 동시-편재화가 이식성 조혈세포를 효과적으로 형질도입시킴을 증명한다.
도 12는 이식후 4 및 6개월 결과를 나타낸다. 이 시점에서, 재집합한 조혈 간세포의 유전자 형질도입은 대조군 판 또는 CBD(C-274) 또는 III12-14(H-271) 만을 함유하는 단편에 대해 형질도입된 세포가 이식된 동물에서는 증명될 수 없다. HSCs의 유전자 형질도입은 C-CS1 단편에 대해서 훨씬 더 적은 것으로 나타났으며, 이 경우 1/3 동물이 사람 단백질에 대해 포지티브였다. 생체내 재집단화 간세포중 유전자 전달은 CBD(CH-271) 또는 CS1(H-296)과 함께 HBD를 함유하는 단편의 경우 균일하게 발견되었다. 3개의 세포 결합 부위를 모두 함유하는 단편(CH-296)에 대한 형질도입이 표적 세포인 생산 세포주의 동시배양과 필적할 정도로 가장 효율적이었다. 이들 데이타는 VLA-4 및/또는 VLA-5에 대한 결합 부위(들)과 함께 III12-14를 함유하는 피브로넥틴 단편이 쥐의 조혈 선조 및 간세포중으로의 레트로바이러스-매개된 유전자 전달을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 12
피브로넥틴은 적어도 3개의 부위(도 13): 인테그린 VLA-5를 통하여 반복체 10중에 테트라펩티드 RGDS를 함유하는 세포 결합 도메인(CBD); 세포 표면 프로테오글리칸 분자를 통한 타입 III 반복체 12-14(III12-14)내에 함유된 헤파린 결합 도메인; 및 인테그린 VLA-4를 통하여 별도로 스플라이싱되는 IIICS 영역내의 CS1 서열을 통하여 세포 부착을 지시한다. 이들 연구에서, 본 발명자들은 도 13에 나타낸 6개의 키메릭 재조합 FN 단편을 이용하였는데 이는 이들 단일 세포 부착 부위를 단독으로 또는 펩티드와 함께 함유한다.
FN-피복된 세균 접시를 암포트로픽 패키지 세포주 TKNeo로부터의 상등액(SN) 2㎖ 중에서 200cfu와 함께 배양한다. 37℃에서 30분후, 접시를 PBS로 3회 세척한 다음 2000 NIH/3T3(섬유아세포) 세포를 10% 소혈청(CS; Sigma, U.S.A.)와 2% P/S가 보강된 DMEM 2㎖에 가한다. 다음날, 세포를 0.75㎎/㎖ G418을 갖는 선택 배지 중에 넣는다. 8 내지 10일 경과후, 접시를 Stat Stain(Volu-Sol, U.S.A.)으로 염색하여 G418r콜로니를 계수한다. 본 검정법에 의해, 레트로바이러스는 피복되지 않거나 BSA-피복된 플레이트에는 결합하지 않았다. 도 14에 나타낸 바와 같이, NIH/3T3 세포중으로의 유전자 전달은 헤파린-II 결합 도메인이 함유되어 있는 단편, 본 명세서에서 "III12-14"(H-271, CH-271, H-296, CH-296)로도 언급되는 단편상에서만 일어났다. 이들 데이타는 레트로바이러스 입자가 직접 피브로넥틴의 III12-14반복체내의 서열에 결합함을 입증하는 것이다. NIH/3T3 세포의 감염은 III12-14단독인 경우와 비교하여 III12-14와 CBD를 둘다 함유하는 FN 단편상에서 훨씬 더 높았다(H-271 대 CH-271 비교). 주목할만하게도, 단지 200 NEO cfu/플레이트의 투입량으로부터 80개 이하의 G418rNIH/3T3 콜로니/플레이트가 발생되었다. 대조적으로, CS1의 첨가로 NIH/3T3 형질도입에 대한 어떠한 효과도 나타나지 않았다(H-271 대 H-296, CH-271 대 CH-296).
FN 증가된 레트로바이러스-매개된 유전자 전달이 레트로바이러스와 표적 세포를 단편에 동시에 결합시킴에 의한 메카니즘을 증명하기 위하여, 비-부착성 세포주(HL60-공지된 전골수구 백혈병 세포주)를 사용하는 실험을 수행한다. HL60 세포를 직접적으로 형광단-공액된 VLA-4(FITC; Immunotech, U.S.A.) 및 VLA-5에 대한 모노클로날 항체(PE; Antigenix America, U.S.A.) 또는 IgG1 및 IgG2a에 대한 동형 대조군(Becton Dickinson)으로 염색한다. 사멸 세포는 프로피퓸 요오드 염색으로 배제시킨다. 이어서 세포를 FACScan(Becton Dickinson) 상에서 분석한다. 유전자 전달 연구의 경우, 104개의 HL60 세포를 신경 성장 인자 수용체(NGF-R)의 세포외 도메인(역가 105cfu/㎖)을 함유하는 암포트로픽 패키지 세포주 DAG(St. Jude's Children Research Hospital, Memphis, TN, U.S.A.으로부터 수득)로부터의 바이러스 상등액과 함께 현탁시킨 다음 6개의 FN 단편으로 2㎍/㎠의 농도로 피복시킨 세균 6-웰 플레이트에 가한다. 4시간후, 개시 HL60 컬쳐로부터 정련된 배지 2㎖를 가한다. 4 내지 5일후 신선한 배지(5% FCS와 2% P/S를 갖는 RPMI(Gibco)) 4㎖를 가한다. 총 8일간 세포를 성장시킨 다음 NGF-R에 대한 모노클로날 항체 8211(Boehringer, U.S.A.) 또는 동형 IgG1 대조물(Dako, U.S.A.)으로 염색한 다음 2차 FITC-공액된 염소-항-마우스 혈청(Boehringer)과 반응시킨다. 세포 부스러기를 제외시키기 위하여 샘플을 프로피듐 요오드(PI)와 함께 배양시키고 이어서 FACScan상에서 측정한다. 유전자 전달은 NGF-R 발현 분석에 의해 생세포에 대한 게이팅후 증명된다. 모든 유전자 전달 연구는 폴리브렌 또는 프로타민을 사용하지 않고 수행한다. 도 15에 나타낸 바와 같이, HL60 세포는 유동 혈구계산 분석(A+B)에 있어서 VLA-4를 발현시키지만 VLA-5는 발현시키지 않는다. 발현 데이타와 일치하게, HL60 세포는 CS1을 함유하는 단편(H-296, CH-296, C-CS1)으로 피복시킨 플레이트에만 부착한다. 도 15에 나타낸 바와 같이, HL-60 세포의 유전자 형질도입은 CS1과 함께 III12-14가 함유되어 있는 단편(H-296, CH-296)에 대해서만 일어난다. HL-60 세포가 이들의 VLA-4 인테그린을 통하여 C-CS1에 부착하지만, 레트로바이러스가 결합하는 III12-14가 부재하는 경우 HL60 세포의 형질도입이 크게 감소한다.
다른 실험으로, 고분자량(HMW) 헤파린(Sigma, U.S.A., MW 약 7000-25000)의 농도를 증가시켜 2.5%(v/v) 1M Hepes가 보강된 행크스 균형 염 용액(HBSS/Hepes; 모두 Gibco) 2㎖에 용해시켜 상기한 FN 단편으로 4㎍/㎠의 농도로 피복시킨 세균 6-웰 플레이트에 가한다. 30분후 플레이트를 PBS로 3회 세척한 다음 400cfu/암포트로픽 TKNeo 벡터 2 ㎖를 가한다. 37℃에서 30분후, 플레이트를 다시 PBS로 세척한 다음 10% CS와 2% P/S가 보강된 DMEM중 2000개의 NIH/3T3 세포를 가한다. 상기와 같이 선택하여 유전자 전달 효율성을 배양 8 내지 10일후 G418r콜로니의 수로 평가한다. 유사한 실험으로, 분획화된 저분자량(LMW) 헤파린(Sigma, U.S.A., MW 약 3000)을 농도를 증가시키면서 HBSS/Hepes 2㎖에 용해시킨다. 이후의 실험 디자인은 HMW 헤파린에 대해 상기한 바와 같다. 유전자 전달 효율성은 8 내지 10일후 G418r콜로니의 수로 판독한다. 이들 유전자 전달 연구는 모두 폴리브렌 또는 프로타민을 사용하지 않고 수행한다. 이들 실험 결과를 도 16에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, FN에 결합하는 바이러스는 고분자량 헤파린의 경우 투여량-의존 방식인 것으로 것으로 고려되지만(16A), 저분자량 헤파린은 그렇지 않다(16B).
실시예 13
CD34+ 세포 집단에 있어서 BFU-E 세포의 선택적인 형질도입
본 실험에서는 혼합된 세포 집단내에서 선택된 세포가 바이러스 결합 도메인과 표적화된 세포에 대해 특이적인 세포 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드를 사용함으로써 형질도입용으로 표적화될 수 있음을 증명한다. 실시예 1의 일반적인 TKNeo 감염과 검정 프로토콜을 반복하지만, BFU-E, CFU-GM 및 CFU-Mix 세포를 함유하는 CD34+ 세포(대혈액(CB) 세포로부터 친화성 크로마토그라피에 의해 수득함)의 실질적으로 균질한 집단을 사용하고, 1, 2, 4, 8, 16 및 20㎍/㎠의 변화되는 농도로 재조합 FN 단편 CH-271를 사용하는 점이 상이하다. 결과를 도 17에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, VLA-5 결합 부위에 결합하는 BFU-E 세포가 높은 효율로 형질도입되는 반면(25% 이상의 G418 내성 콜로니), VLA-5에 대한 확실한 결합을 나타내는 않는 CFU-GM 및 CFU-Mix 집단은 실질적으로 더 낮은 효율로 형질도입되었다(약 5% 미만의 G418 내성 콜로니).
실시예 14
c-KIT+ 세포의 형질도입
이 실험에서는 c-KIT+로서 실질적으로 균질한 세포 집단을 본 발명에 따라서 형질도입시킨다. 따라서, c-KIT+ 세포를 유동 혈구계 분류 기술을 이용하여 쥐의 골수로부터 단리시킨다. 실시예 1에 일반적으로 기술된 바와 같은 TKNeo 벡터를 사용하는 감염 프로토콜에 따라 세포를 처리하나, 도 18에 나타낸 바와 같이 FN 단편을 변화시키고, 감염된 세포를 HPP-CFC에 대해 검정하는 점이 상이하다. 도 18에 나타낸 바와 같이, III12-14와 VLA-4 결합 부위가 함유되어 있는 FN 단편(FN 30/35, H296, 및 CH-296)이 높은 효율로 형질도입되는(80% 이상의 G418 내성 콜로니) 반면 이들 2개의 도메인이 결여되어 있는 FN 단편은 확실하게 형질도입되지 않거나(C274 및 C-CS1) 실질적으로 더 낮은 효율로 형질도입되었다(H271, CH271, 20% 미만의 G418 내성 콜로니).
실시예 15
변화되는 농도의 폴리브렌을 사용한 NIH/3T3과 클론발생성 BM 세포의 형질도입
본 실험에서는 본 발명의 유리한 형질도입 방법은 헥사디메트린 브로마이드의 부재하에서 수행함을 증명한다. NIH/3T3(섬유아세포) 세포와 클론발생성 골수 세포를 각각 실시예 12 및 1에 일반적으로 기술된 바와 같은 TKNEO 감염 프로토콜에 따라서 처리하는데, 벡터, 세포 및 변화 농도의 폴리브렌을 먼저 함께 현탁시킨 다음 FN 단편 CH-296(8㎍/㎖)으로 피복된 기질에 인가한다. 이들 세포 타입에 대해 상기한 바와 같이 검정한다. 결과를 도 19 및 20에 제시한다. 도 19에 나타낸 바와 같이, G418 내성 NIH/3T3 콜로니의 수는 폴리브렌이 없는 경우의 약 14에서 12.5㎍/㎖ 폴리브렌이 사용되는 경우의 약 4의 범위로, 폴리브렌 농도를 증가시킴에 따라 크기 감소된다. 유사하게, 도 20은 폴리브렌 부재하에서 프로토콜 수행시 거의 40개의 콜로니가 관측되는 반면, 10㎍/㎖를 사용하는 경우 상응하는 수치는 15 미만이다.
실시예 16
T 세포의 형질도입, 및 콜라겐 V와 FGF 바이러스 결합 서열을 갖는 폴리펩티드의 용도
본 실시예는 사람 T 세포중으로의 향상된 DNA 전달, 및 본 발명에 있어서 콜라겐 V와 섬유아세포 성장 인자(FGF)로부터의 레트로바이러스-결합 서열(이는 피브로넥틴의 헤파린 II 결합 부위와 실질적인 상동성을 가짐)의 용도를 설명한다. 따라서, 전혈을 모노클로날 항체(CD3(perCP; Becton Dickinson), CD49e(PE; Anitenix America), CD49d(FITC, PE, 각각: Becton Dickinson)에 대한 MoAbs)로 실온에서 15분간 염색시킨후 제조업자의 권장사항에 따라서 FACS 용해 용액(BECTON DICKINSON)으로 FACScan(BECTON DICKINSON)상의 분석용으로 제조한다. 말초 혈액-유래된 단핵 세포(PB-MNCs)를 1×106개의 세포/㎖의 농도로 1㎍/㎖ OKT-3(Ortho) 및 50U/㎖ IL-2(Cetus)으로 예비-자극시킨다. 2 내지 3일후, 세포를 수확하여 세척한 다음 1 또는 2일간 쥐의 아데노신 데아미나제(ADA) cDNA를 함유하는 암포트로픽 레트로바이러스 55/6으로 PGK 프로모터의 조정하에 7.5㎍/㎖ 폴리브렌(Aldrich)의 연속적인 존재하에서 8㎍/㎠ CH296 또는 2% 소혈청 알부민(BSA, Boehringer)으로 피복시킨 비-조직 배양 처리된 판상에서 형질도입시킨다. 매일, 배지의 50%를 50U/㎖ IL-2를 함유하는 신선한 배지로 대체시킨다. 감염후 4 내지 6일째에, 세포를 수확하고 CD3, CD56, TCR-αβ 및 HLA-DR에 대한 MoAbs(모두 Bectin Dickinson)를 사용하여 표현형을 분석한다. 유전자 전달 효율성의 분석은 형질도입된 쥐의 ADA효소의 활성을 내인성 사람의 ADA 단백질과 비교하여 ADA 동형효소 검정법으로 측정하여 비선택된 집단상에서 수행한다(Bodine, D. M. et al., Blood 82:1975-80(1993); Moritz, T. et al., J. Exp. Med. 178: 529-36(1993)).
결과:
A. T 세포
먼저, 사람의 T 세포를 FN 수용체 VLA-4 및 VLA-5의 발현에 대해 분석한다. 이를 위하여, 말초혈(PB)-유래된 단핵 세포(MNCs)를 CD3, CD49d 및 CD49e에 대한 모노클로날 항체(MoAbs)로 염색시켜 유동 혈구계로 분석한다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 말초혈 T 세포를 모두 나타내는 CD3 포지티브 임파구(R1 및 R4)에 대해 세포를 차단한다. PB T 세포의 94%가 CD49d 포지티브이고 96%가 CD49e 포지티브이다. T 세포의 90%가 VLA-4 및 VLA-5를 둘다 발현시킨다.
이어서, PB-유래된 PB-MNCs를 2 내지 3일간 CD3 MoAb OKT-3 및 재조합 IL-2로 예비자극한 다음 재조합 IL-2로 피복시킨 비-조직 배양-처리된 플레이트상에서 1 내지 2일간 형질도입시킨 다음 1 내지 2일간 쥐의 아데노신 데아미나제(ADA) cDNA를 함유하는, 재조합 FN 단편 CH-296 또는 대조군으로서 BSA로 피복시킨 비-조직 배양-처리된 플레이트상에서 암포트로픽 생산 세포주 AMmA55/6로부터의 레트로바이러스 상등액으로 PGK 프로모터의 조정하에서 형질도입시킨다(Bodine, D. M. et al., Blood 82:1975-80(1993); Moritz, T. et al., J. Exp. Med. 178:529-36(1993)).
감염후 4 내지 6일후의 유동상 분석으로 세포 컬쳐가 >90% T세포를 함유하며, 이의 대부분은 이들의 HLA-DR 및 CD56 발현에 의해 표시한 바와같이 강력하게 활성화되는 것으로 밝혀졌다(도 22).
ADA 동형효소 검정법에 의한 유전자 전달 효율성의 분석(도 23)은 형질도입 프로토콜이 재조합 펩티드 CH-296을 포함하는 경우 도입된 쥐의 ADA 단백질의 활성이 내인성 사람 단백질의 활성과 대등함을 증명한다. BSA에 대한 감염으로 검정법의 감응성 이하 수준으로 유전자가 전달된다.
이들 데이타는 주요 사람의 T 세포는 폴리브렌과 같은 다중 양이온제의 부재하에서 재조합 FN 단편 CH-296 상에서 세포-유리 레트로바이러스-함유 상등액을 사용하여 효율적으로 형질도입시킬 수 있음을 증명한다. 유전자 운반 효율은 상등액 + 폴리브렌 단독을 사용하는 표준 방법과 비교하여 훨씬 더 높다.
B. 신규한 재조합 펩티드
콜라겐 V(COL)와 기본적인 섬유아세포 성장 인자(bFGF)가 피브로넥틴의 HBD와 서열 상동성을 나타내고 또한 헤파린에 결합할 수 있기 때문에, 도 24에 나타낸 7개의 재조합 단백질을 레트로바이러스 결합 활성에 대해 분석한다.
먼저, COL과 FGF를 이들이 기능성 레트로바이러스 결합 서열을 갖는지에 대해 측정하기위하여 분석한다. 이를 위하여, 세균 플레이트를 재조합 펩티드로 피복시킨 다음 암포트로픽 NEO 레트로바이러스를 함유하는 상등액을 가한다. 30분후, 플레이트를 강력하게 세척하여 모든 비-결합 레트로바이러스 입자를 제거한 다음 각각의 플레이트에 2000개 NIH/3T3 세포를 가한다. 8 내지 10일 경과후 유전자 전달 효율성을 G418 내성(G418r) NIH/3T3 세포 콜로니의 수로 평가한다.
도 25에 나타낸 바와 같이, NIH/3T3 세포 중으로의 성공적인 유전자 운반은 HBD(단편 CH-271)와 함께 또는 콜라겐 V(C-COL) 또는 FGF(C-FGF) 서열을 갖는 FN의 세포 결합 도메인(CBD)을 함유하는 재조합 펩티드상에서 일어나는 G418r콜로니의 성장으로 평가한다. 이들 결과는 레트로바이러스 입자가 또한 콜라겐 V 또는 bFGF내의 서열에 직접 결합함을 증명하는 것으로 이는 이들 서열을 함유하는 재조합 펩티드를 사용하여 조혈세포를 표적시킬 수 있다는 증거이다.
따라서 VLA-4 및 VLA-5를 발현시키는 HEL 세포를 절단된 신경 성장 인자 수용체 p75쇄(NGF-R) cDNA를 함유하는 암포트로픽 레트로바이러스로 재조합 단편 C-274(CBD), H-271(HBD), CH-271(CBD-HBD), COL, C-COL(CBD+COL'), C-FGF, C-FGF-CS1 상에서, 및 대조군으로서 BSA상에서 형질도입시킨다. 8일후에 유전자 전달 효율성을 NGF-R 발현의 유동상 혈구계 분석법으로 분석한다.
도 26에 나타낸 바와 같이, C-274로 피복시킨 플레이트 또는 BSA에 대해서는 유전자 전달이 낮은 수준으로 일어났다. H-271(HBD) 및 COL상에서의 형질도입으로 NGF-R 포지티브 세포는 33 내지 36%였다. CBD를 HBD(CH-271)에 첨가하면 본 실험에서 형질도입된 세포의 %가 최대로 높은 수준까지 증대된다. 흥미롭게도, CBD(=VLA-4 결합 부위)를 단편 C-COL중의 COL에 첨가하거나 단편 C-FGF-CS1중의 CS-1을 첨가하여도 HEL 세포의 유전자 형질도입이 현저하게 증가되지는 않는다.
최종적으로, 1일째의 IL-6 및 SCF 예비-자극된 사람 CD34+ 골수(BM) 세포를 키메릭 펩티드상에서 암포트로픽 NEO 레트로바이러스로 1일간 형질도입시킨 다음 1.5㎎/㎖ G418의 존재 또는 부재하에서 선조세포 검정법으로 플레이팅한다. 배양 14일후에 G418r콜로니의 %로 평가되는 효율적인 유전자 전달은 세포 결합용 수용체와 함께 FGF의 H-271내의 레트로바이러스 결합 서열을 함유하는 단편상에서 일어난다. 확실하게도, NGF-R 레트로바이러스를 사용하여 HEL 세포를 유전적으로 개질시킴으로써 수득한 결과(도 27)와는 대조적으로, C-FGF에 CS1 부위를 첨가하면 클론발생성 CD34+ BM 세포중으로의 유전자 전달 효과가 단편 CH-296(CBD+HBD+CS1)상에서 수득한 수준까지 근접한다.
따라서, VLA-4 또는 VLA-5 인테그린을 통하여 피브로넥틴에 대한 T세포의 결합능을 사용하는 피브로넥틴의 특이적인 부착 도메인상에서 레트로바이러스 벡터로 T세포를 효율적으로 형질도입시킬 수 있음을 입증하는 것이다. 이는 또한 레트로바이러스 입자가 콜라겐 V 또는 bFGF내의 서열에 부착됨이 나타나 있는데, 이는 피브로넥틴의 헤파린 II 결합 도메인에 대한 상동성을 나타내는 것이며, 조혈세포와 세포주는 표적 세포에 대한 결합 부위와 함께 콜라겐 V 또는 bFGF의 레트로바이러스 결합 서열을 함유하는 재조합 펩티드 상에서 효율적으로 유전자를 개질시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
본 발명이 전술한 기술에서 상세하게 설명되고 기재되었으나, 이들은 설명하기위한 것으로 특성을 제한하는 것은 아니며, 바람직한 양태만을 기술하였으며 본 발명의 정신내의 모든 변화 및 개질은 보호되는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 인용되는 모든 공보는 각각 참조로서 개별적으로 인용되어 전체가 기술되듯이 본 명세서에서는 이들 전체가 참조로 인용되는 것이다. 또한, 함께 계류중인, 1994년 3월 25일자로 출원된 미국 특허원 제08/218,355호 및 1995년 3월 27일자로 미국을 지정하여 출원되어 계류중인 국제 특허원 PCT/US95/03817은 이들 전체가 본 명세서에서 참고로 인용된다.

Claims (15)

  1. 세포에 결합하는 리간드 및 레트로바이러스에 결합하는 리간드를 포함하는 유효 고정량의 물질의 존재하에서 세포를 헥사디메트린 브로마이드가 본질적으로 없는 배지중에서 레트로바이러스로 감염시켜, 레트로바이러스와 세포를 함께 편재시키고 세포의 형질도입 효율성을 증가시킴을 특징으로하는, 레트로바이러스에 의해 형질도입된 생존성 세포 집단의 수득 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포가 조혈 간세포를 포함하는 방법.
  3. 제1항의 방법으로 생산한 생존성 세포 집단.
  4. 제3항에 있어서, 조혈 간세포를 포함하는 생존성 세포 집단.
  5. 제1항의 방법으로 생산한 생존성 세포 집단으로 포유동물을 이식시킴을 특징으로하는 이식 방법.
  6. 실질적으로 레트로바이러스-형질도입된 생존성 세포의 집단을 포함하며, 레트로바이러스 생산 세포 및 헥사디메트린 브로마이드이 본질적으로 없는 세포 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 생존성 세포가 조혈 간세포를 포함하는 세포 조성물.
  8. 제6항에 따르는 세포 조성물로 포유동물을 이식시킴을 특징으로하는 세포 이식 방법.
  9. 제8항에 있어서, 세포 집단이 조혈 간세포를 포함하는 방법.
  10. 세포에 결합하는 리간드 및 레트로바이러스에 결합하는 리간드를 포함하는 유효 고정량의 물질의 존재하에서 세포를, 동시배양중 레트로바이러스에 의한 세포의 형질도입 효율성은 증가시키지만 상기 물질의 존재하에서 레트로바이러스에 의한 세포의 형질도입 효율성을 감소시키는 작용제가 본질적으로 없는 배지중에서 레트로바이러스로 감염시켜, 레트로바이러스와 세포를 함께 편재시키고 세포의 형질도입 효율성을 증가시킴을 특징으로하는, 레트로바이러스에 의해 형질도입된 생존성 세포 집단의 수득 방법.
  11. 세포를 결합시키는 아미노산 서열과 레트로바이러스를 결합시키는 콜라겐 V 또는 섬유아세포 성장 인자로부터의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 존재하에서 세포를 레트로바이러스로 감염시킴을 특징으로하는, 레트로바이러스에 의한 형질도입된 생존성 세포 집단의 수득 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 감염이 레트로바이러스-생산 세포의 부재하에서 세포를 레트로바이러스와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  13. T세포에 결합하는 리간드와 레트로바이러스에 결합하는 리간드를 포함하는 물질의 존재하에서 세포를 레트로바이러스로 감염시켜, 레트로바이러스와 세포를 동시에 편재시키고 세포의 형질도입 효율성을 증가시킴을 특징으로하는, 레트로바이러스를 사용하여 T세포를 형질도입시키는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 물질이 T세포를 결합시키는 제1 아미노산 서열과, 레트로바이러스를 결합시키며 다음과 같은 서열 1 또는 레트로바이러스를 결합시키는 능력을 나타내기에 충분히 유사한 아미노산 서열을 갖는 제2 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
    서열 1
  15. 레트로바이러스를 결합시키는 콜라겐 V 또는 섬유아세포 성장 인자로부터의 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드 유효량과 레트로바이러스를 접촉시킴을 특징으로하여, 레트로바이러스를 편재화하는 방법.
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