DE69636124T2 - Verfahren zum verbesserten virusvermittelten dns-transfer unter verwendung von molekülen mit virus- und zellbindenden domänen - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein Verfahren zur Verbesserung der Effizienz der Transduktion von Zellen durch Viren, und besonders Verfahren zur Verbesserung eines virusvermittelten Gentransfers in Zellen unter Benutzung von Molekülen, wie Polypeptiden, die einen Virus- und einen Zellen bindenden Bereich umfassen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Fortschritte beim Verstehen der molekularen Basis vieler humaner Krankheiten und ebenso die Verbesserung der Gentransfertechnologie haben dazu geführt, dass neulich Versuche unternommen wurden, Protokolle für die somatische Gentherapie für ernste genetische Erkrankungen zu entwickeln. Gegenwärtig vielversprechende Krankheits-Kandidaten für die humane Gentherapie umfassen die Kandidaten, bei denen ein Enzym oder ein anderes Protein Fehler aufweist oder ganz fehlt, und wo das Enzym- oder Proteinniveau nicht genau reguliert werden muss, insbesondere die Niveaus, die konsitutionsbedingt geregelt werden, und solche Defekte die im Knochenmark des Patienten gefunden werden.
  • Ein Krankheits-Kandidat für die Gentherapie ist z.B. die Adenosindeaminase-Defizienz (ADA), welche einen schweren kombinierten Immundeffekt (SCID) zur Folge hat. ADA-Defzienz-Patienten haben wenige oder keine detektierbare Enzyme in Knochenmarkzellen. Die ADA-Defizienz ist jedoch durch eine angepasste Knochenmarktransplantation geheilt worden. Normale ADA-Zellen haben einen selektiven Vorteil gegenüber Zellen mit ADA-Defizienz und werden normalerweise das Knochenmark des Patienten wieder bevölkern.
  • Knochenmarkzellen sind ein gutes Ziel für die somatische Gentherapie, da das Knochenmarkgewebe leicht in vitro manipuliert werden kann und Repopulierungszellen umfasst. Alternativ ist es für humane Nabelschnurblut gezeigt worden, dass es eine grosse Anzahl primitiver Vorläuferzellen enthalten. Ein erfolgreicher Gentransfer in hämatopoetische Stammzellen, die Langzeit Repopulierungszellen, kann zu einer lebenslangen Heilung bei einer Vielzahl von Krankheiten führen, die sich bei der Vermehrung dieser Zellen manifestiert haben.
  • Der Gentransfer in, und die Langzeit-Genexpression in Repopulierungsstammzellen ist einer Vielzahl von Forschern bei murinen Modellen gelungen. In-vivo-Experimente bei grösseren Tieren, wie Hunden und Primaten, haben einen begrenzten Erfolg gezeigt, der grossenteils auf die geringe Effizienz der Infizierung von primitiven hämatopoetischen Stammzellen zurückzuführen war. Die Grenzen der heutigen Gentransfertechnologie werden ausserdem durch mehrere Faktoren, wie die geringe Anzahl von Stammzellen im Kochenmark von Erwachsenen (ABM), das Fehlen geeigneter Verfahren zur Reinigung dieser Zellen, und der geringe Anteil solcher primitiver Zellen im Zellzyklus, kompliziert, wenn diese Technologie auf humane Protokolle angewendet wird.
  • Bei Versuchen nur Mäusen und grossen Tieren, die Knochenmarkzellen umfassen, ist festgestellt worden, dass die erfolgreichsten Protokolle eine Co-Kultivierung von Zielzellen mit retroviralen Producerzelllinien benutzen. Die meisten von der FDA genehmigten Gentransfer-Versuche bei Menschen beruhen auch auf rekombinanten retroviralen Vektoren für die Gentransduktion. Rekombinante retrovirale Vektoren sind für die Gentherapie erwünscht, da sie effizient transferieren und genau und dauerhaft exogene DNS in Zell-DNS integrieren. Diese Vektoren enthalten exogene DNS für den Gentransfer und sind ausserdem modifiziert, um virale Pathogenität zu eliminieren. Wegen dieser Modifikationen wird eine Virenproduktion im allgemeinen unter Benutzung von Retrovirus-Verpackungszellen, durchgeführt. Für eine klinische Gentherapie ist jedoch eine zellfreie Transduktion wegen Biosicherheit und Qualitätskontrolle wünschenswerter. Ein effizienter Gentransfer in hämatopoetische Zellen wie Stammzellen war im allgemeinen leider ohne Co-Kultivierung mit virusproduzierenden Zellen nicht möglich.
  • Es ist kürzlich gezeigt worden, dass die Effizienz des Gentransfers verbessert werden kann, indem die Zielzellen während der Infizierung stromalen Zellen ausgesetzt werden. Stromale Zellen sind ein Hauptbestandteil der hämatopoetischen Mikroumgebung (HM). Die HM besteht aus einem organisierten Netz von Makrophagen, stromalen Zellen, endothelialen Zellen, Adipocyten und einer komplexen extrazellulären Matrix (ECM), die aus einer Vielzahl definierter Adhäsionsmoleküle besteht. ECM-Moleküle wie Laminin, Collagen, Thrombospondin, Proteoglykanen, Glycosaminoglykanen und Fibronektin stellen für die hämatopoetischen Zellen und die Wachstumsfaktoren Verankerungstellen zur Verfügung. Der Mechanismus, der diesem Förderungseffekt des Stromas auf die retrovirale Infizierung zur Grunde liegt, ist unklar, aber man weiss seit einiger Zeit, dass eine physiologische Regelung der Proliferation und Differenziation hämatopoetischer Zellen auftritt, wenn diese Zellen in direktem Kontakt mit Zellen des HM sind.
  • WO 95/26200 offenbart ein Verfahren um die Effizienz der Transduktion der hämatopoetischen und anderen Zellen durch Retroviren zu erhöhen, wobei das Verfahren die Infizierung der Zellen in Gegenwart von Fibronektin oder Fibronektinfragmenten umfasst.
  • Effizienter Gentransfer in die Langzeitrepopulierenden hämatopoetischer und anderer Zellen bleibt problematisch, wodurch eine weitgespannte Anwendung von Gentransferprotokollen für eine heilende Therapie von hämatopoetischen und anderen Erkrankungen gegenwärtig verhindert wird. Es bleibt ein Bedarf nach Verfahren für einen effizienten Transfer genetischen Materials in Säugerzellen ohne die Gefahren und Grenzen der Verfahren der Vergangenheit. Die Erfindung spricht diesen Bedarf an.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein In-vitro-Verfahren zum Erhalten einer transduzierten Population lebensfähiger Zeilen durch ein Retrovirus, umfassend:
    das Infizieren der Zellen mit einem Retrovirus in Anwesenheit einer wirksamen immobilisierten Menge Material, um die Effizienz der Transduktion der Zellen durch das Retrovirus zu erhöhen, wobei das Material einen Liganden, der sich an die Zellen bindet, und einen Liganden, der sich an das Retrovirus bindet, enthält, derart, dass das Retrovirus und die Zellen co-lokalisiert werden, wobei die Infizierung in einem Medium durchgeführt wird, das frei ist von polykationischem Mittel, das die Effizienz der Transduktion der Zellen durch das Retrovirus in einer Co-Kultur erhöht, welches Mittel jedoch die Effizienz der Transduktion der Zellen durch das Retrovirus in Anwesenheit des besagten Materials reduziert.
  • Kurz gesagt, stellt eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Transduktionshäufigkeit von hämatopoetischen Zellen durch einen Retrovienvector zur Verfügung. Das Verfahren umfasst die Infizierung lebensfähiger hämatopoetischer Zellen mit einem replikationsdefekten rekombinanten Retrovirusvektor in Anwesenheit von im wesentlichen reinem Fibronektin und/oder Fibronektinfragmenten, mit der Wirkung, die Häufigkeit der Zelltransduktion durch das Retrovirus zu erhöhen. Fibronektin und/oder Fibronektinfragmente können aus in der Natur vorkommendem Material oder synthetisch deriviert werden (z.B. genetisch durch rekombinante oder chemische Synthesetechniken erzeugt) oder aus einer Kombination natürlich vorkommender und synthetischer Materialien deriviert werden. Ausserdem ist leicht verständlich, dass das Fibronektinpolypeptid oder die Polypeptide, die in der Erfindung benutzt werden, Mutationen an der natürlich vorkommenden Fibronektinaminosäuresequenz aufweisen können, die nichtsdestoweniger funktionelle Polypeptide zur Verfügung stellt, die Adhäsionseigenschaften aufweisen, die erforderlich sind, um erfindungsgemäss eine verbesserte Transduktion zu erreichen.
  • Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung transduzierter hämatopoetischer Zellen zur Verfügung, das die Infizierung lebensfähiger hämatopoetischer Zellen mit einem, eine exogene DNS tragende, replikationsdefekten rekombinanten Retrovirus in Anwesenheit von wirksamen Mengen von immobilisiertem Fibronektin, immobilisierten Fibronektinfragmenten oder einer immobilisierten Mischung davon, mit dem Ziel einschliesst, die Häufigkeit der Zelltransduktion durch das Retrovirus zu verbessern.
  • Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Erhalten von transduzierten Nabelschnurblutzellen zur Verfügung, die für ein Zelltransplantationsverfahren geeignet sind. Das Verfahren umfasst die Infizierung hämatopoetischer Zellen aus dem Nabelschnurblut mit einem replikationsdefekten rekombinanten Retrovirusvektor in Anwesenheit einer wirksamen immobilisierten Menge Fibronektin und/oder Fibronektinfragmenten, um die Häufigkeit der Transduktion von hämatopoetischen Zellen durch das Retrovirusvektor zu verbessern. Die Erfindung umfasst auch lebensfähige transduzierte Zellpopulationen aus Nabelschnurblut, die durch ein solches Verfahren erhalten werden können, und Zelltransplantationsverfahren, die die Einführung von transduzierten Zellpopulationen in ein Tier als Zelltransplantat umfassen.
  • Gemäss spezifischerer Aspekte der oben erwähnten Ausführungformen der Erfindung, wird das benutzte Fibronektin oder Fibronektinfragment eine erste Aminosäurensequenz, welche die retrovirusbindende Aktivität der Heparin-II-bindenden Domäne von Fibronektin zur Verfügung stellt, und eine zweite Aminosäurensequenz, welche die zellbindende Aktivität der CS-1-Domäne von Fibronektin zur Verfügung stellt, umfassen. Die Benutzung dieser beiden bindenden Domänen des Fibronektins zusammen hat bewiesen, dass die Transduktionswirkung der Zielzellen durch Retroviren auf sehr signifikante Weise verbessert wird.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Erhalten einer transduzierten Population lebenfähiger Zellen durch ein Retrovirus zur Verfügung, umfassend: das Infizieren der Zellen mit einem Retrovirus in Anwesenheit einer wirksamen immobilisierten Menge Material wie ein Polypeptid, welche Menge immobilisiertes Material einen Liganden umfasst, der sich an die Zellen bindet, und einen Liganden, der an das Retrovirus bindet, derart, dass das Retrovirus und die Zellen co-lokalisiert werden und die Transduktionseffizienz verbessert wird. Es ist ausserdem überraschenderweise entdeckt worden, dass solche Verfahren vorteilhaflerweise in Abwesenheit oder mindestens bei substantielle Abwesenheit von Hexadimethrinbromid (auch identifiziert als 1,5-Dimethyl-1,5-Diazaundecamethylen-Polymethobromid), das bisher in Gentransferprotokollen mit dem Wunsch benutzt wurde, die Transduktionseffizienz zu verbessern, ausgeführt werden. Überraschenderweise ist es jedoch für die Anwesenheit von Hexadimethrinbromid entdeckt worden, dass die Transduktionseffizienz in den co-lokalisierungs – vermittelten Gentransferverfahren der Erfindung reduziert anstatt verbessert wird. Deshalb werden bevorzugtere Verfahren der Erfindung in Abwesenheit von Hexadimethrinbromid oder anderer Wirkstoffe durchgeführt, welche die Effizienz der Transduktion in ähnlichen Protokollen erhöhen, die in Abwesenheit des Materials für Co-Lokalisation, z.B. in entsprechenden Co-Kultur-Protokollen, durchgeführt werden. Sich daraus ergebende verbesserte Zellpopulationen und Zelltransplantationsverfaren gehören ebenfalls zu der vorliegenden Erfindung.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Erhalten einer transduzierten Population lebensfähiger Zellen durch ein Retrovirus zur Verfügung, das den Zellinfizierungsschritt mit einem Retrovirus, in Anwesenheit eines Polypeptids das eine zellbindende Aminosäurensequenz und eine sich an das Retrovirus bindenden Aminosäuresequenz aus Collagen V oder einem Fibroblastwachstumsfaktor einschliesst, umfasst.
  • Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Lokalisieren eines Retrovirus zur Verfügung, das das Kontaktieren des Retrovirus mit einer wirksamen Menge eines isolierten Polypeptids mit einer sich an das Retrovirus bindenden Aminosäuresequenz aus Collagen V oder einem Fibroblastwachstumsfaktor bestehenden Polypeptids umfasst.
  • Es ist ein Ziel dieser Erfindung, Verfahren zum wirksamen retroviralen Infizieren von Säugerzellen zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Verfahren für den Gentransfer mit retroviralen Vektoren zur Verfügung zu stellen, das es vermeidet, Co-Kulturen verwenden zu müssen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, verbesserte Verfahren und Zellkulturen für eine autologe und/oder allogene Zelltransplantation zur Verfügung zu stellen.
  • Diese und andere Ziele, Vorteile und Kennzeichen der Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden Beschreibung leicht offensichtlich.
  • BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1 stellt eine schematische Darstellung eines Fibronektinmoleküls, das chymotryptische Fragmente enthält, zur Verfügung.
  • 2 zeigt die Wirksamkeit des Infizierens von determinierten humanen Vorläuferzellen in Anwesenheit von Fibronektinfragmenten unter Benutzung des TKNEO-Vektors, wie es weiter in der Referenz Beispiel 1, infra, beschrieben ist.
  • 3 vergleicht die Wirksamkeit des Infizierens verschiedener determinierter humaner hämatopoetischer Vorläuferzellen in Anwesenheit von Fibronektinfragmenten davon unter Benutzung des TKNEO-Vektors, wie es weiter in der Referenz Beispiel 1, infra, beschrieben ist.
  • 4 stellt ein schematisches Diagramm zur Verfügung, das verschiedene rekombinante, im erläuternden Beispiel 1, infra, benutzte Fibronektinfragmente darstellt.
  • 5 zeigt ein Retrovirus, das sich an verschiedene Fibronektinfragmente, einschliesslich an mehrere rekombinante Fragmente bindet, wie es im erläuternden Beispiel 1, infra, beschrieben ist.
  • 6 zeigt, dass Heparin die Bindung vom Retrovirus an Fibronekrinfragmente blockiert, wie es im erläuternden Beispiel 1, infra, beschrieben ist.
  • 7 zeigt die Struktur der α-Kette des Fibronektins und seine Beziehung zu in den Beispielen benutzten rekombinanten Fragmenten. Es sind die Fibronektin-Repeats Typ I, II und III und die von 1 bis 14 nummerierten Repeats Typ III angegeben. Die drei Bindungsstellen für Zellen sind mit „Zelle" für die Zellbindungsdomäne (CBD), mit HEPARIN für die Heparinbindungsdomäne (HBD) und mit CS1 für die, VLA-4 bindende, aus den ersten 25 Aminosäuren der alternativ gespleissten IIICS-Region gebildete, Stelle CS1, markiert.
  • 8 zeigt die Wirksamkeit des Infizierens von NIH/3T3-Zellen durch ein Retrovirus, in Anwesenheit von verschiedenen Fibronektinfragmenten, wie es weiter im erläuternden Beispiel 2, infra, beschrieben ist.
  • 9 zeigt die Wirksamkeit des Infizierens von nicht haftenden HL-60-Zellen durch einen Retrovirus, in Anwesenheit von verschiedenen Fibronektinfragmenten, wie es weiter im erläuternden Beispiel 2, infra, beschrieben ist.
  • 10 zeigt den Einfluss von Heparin mit niedrigem und hohem Molekulargewicht auf die Bindung eines Retrovirus an Fibronektin.
  • 11 zeigt, dass die Wirksamkeit des Infizierens von NIH/3T3-Zellen durch einen Retrovirus mit der Zunahme der Konzentrationen von Hexadimethrinbromid abnimmt, wie es im erläuternden Beispiel 3, infra, diskutiert wird.
  • 12 zeigt, dass die Wirksamkeit des Infizierens von klonogenen Knochenmarkzellen durch ein Retrovirus mit der Zunahme der Konzentrationen von Hexadimethrinbromid abnimmt, wie es im erläuternden Beispiel 3, infra, diskutiert wird.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Um die Prinzipien der Erfindung leichter verstehen zu können, beziehen wir uns jetzt auf gewisse Ausführungsformen der Erfindung und benutzen eine spezifische Sprache um die Erfindung zu beschreiben. Es versteht sich dennoch von selbst, dass dadurch keine Begrenzung des Erfindungsrahmens, wie Veränderungen, weitere Modifikationen und solche Anwendungen der Erfindungsprinzipien, wie sie hier als normal für einen Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung erscheinen, erzielt werden sollen.
  • Wie es oben angegeben ist, stellt die Erfindung Verfahren zur Erhöhung der Häufigkeit der Transduktion von lebensfähigen Zellen durch Viren wie z.B. Retroviren zur Verfügung. Die Erfindung stellt auch Verfahren für einen wirksamen Gentransfer in lebensfähige Zellen unter Benutzung von rekombinanten Retrovirusvektoren, Verfahren zum Erhalten von transduzierten Zellen und Verfahren und Materialien zur Ausführung von autologen und anderen Zelltransplantationen zur Verfügung.
  • Ein Kennzeichen der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung, dass Fibronektin (FN) und Fragmente von Fibronektin, die die CS-1-Zelladhäsionsdomäne von FN enthalten, auf signifikante Weise den durch Retroviren vermittelten Gentransfer in Zellen wie z.B. hämatopoetische Zellen verbessern, z.B. determinierte Vorläuferzellen und primitive hämatopoetische Stammzellen oder Langzeitkultur einleitende Zellen (LTC-IC) die einen Fibronektinrezeptor tragen und dadurch die Kapazität, an Fibronektin oder Fragmente davon zu binden, zeigen. Vorteilhafterweise macht diese erhöhte Effizienz eine Co-Kultivierung mit Viren produzierenden Zellen nicht mehr erforderlich. Andere Kennzeichen der Erfindung stützen sich auf die Entdeckung der, in der Heparin II bindenden Domäne liegenden, Viren bindenden Domäne von Fibronektin. Diese Viren bindende Domäne kann benutzt werden, um Viruspartikel in vielen Anwendungen zu lokalisieren, was z.B. für eine grosse Reihe von Konstrukten die Verabreichung des Virus an eine Zielzelle einschliesst.
  • Entsprechend gewisser bevorzugter Aspekte der vorliegenden Erfindung enthalten rekombinante virale Vektoren exogene DNS und sind nicht pathogen, d.h. replikationsdefekt. Diese Vektoren transferieren wirksam und integrieren genau und dauerhaft exogene DNS in die zelluläre DNS von Gastzellen wie z.B. Tierzellen, insbesondere Säugerzellen. In der vorliegenden Erfindung kann z.B. eine Nukleotidsequenz, die eine Serie von Basen der kodierenden Sequenz des interessierenden Gens enthält, in einen rekombinanten retroviralen Vektor unter der Kontrolle eines geeigneten Promoters zum Steuern des Gens, typischerweise eines exogenen Promoters, integriert werden. In dieser Hinsicht kann die exogene DNS DNS enthalten, die entweder natürlich oder künstlich produziert worden ist, und kann von Teilen kommen, die von heterologen Quellen deriviert sind, welche Teile natürlich vorkommen oder chemisch synthetisierte Moleküle sein können und wobei diese Teile durch Ligation oder andere in der Technik bekannte Mittel verbunden worden sein können.
  • Die in das Virus integrierte exogene DNS kann jede beliebige DNS sein, die von Interesse für die Einführung in die Zelle ist. Die exogene DNS kann z.B. für ein Protein wie ADA, das einer bekannten Funktionsstörung zugeordnet ist oder einer Antisense-RNS, einem Ribozym oder einem falschen Primer (siehe, z.B. WO 90/13641 veröffentlicht am 15. November 1990), für einen intrazellulären Antikörper siehe, z.B. WO 94/02610 veröffentlicht am 3. Februar 1994), für einen Wachstumsfaktor, oder etwas ähnliches kodieren.
  • Wie schon erwähnt, wird die eingeführte Nukleotidsequenz unter der Kontrolle eines Promoters sein, und zwar im allgemeinen dem Promoter nachgeordnet sein. Alternativ ausgedrückt, wird sich die Promotersequenz im allgemeinen der Kodierungssequenz vorgeordnet (d.h. am 5'-Ende) befinden. So ist gut bekannt, dass es dort andere Regelelemente (z.B. Enhancersequenzen) geben kann oder nicht, die mit dem Promoter oder einem Transkriptionsstartkodon zusammenwirken, um die Transkription der exogenen Kodierungssequenz zu erreichen. Der Satz „unter Kontrolle von" erwägt die Anwesenheit solcher anderen Elemente wie sie zur Ausführung der Transkription des eingeführten Gens erforderlich sind. Ausserdem wird die rekombinante DNS bevorzugt der eingeführten Kodierungssequenz nachgeordnet eine Terminationssequenz umfassen.
  • Es können auch retrovirale Vektoren, die exogene DNS die einen auswählbaren Marker oder einen anderen auswählbaren Vorteil zur Verfügung stellen können, benutzt werden. Die Vektoren können z.B. einen oder mehrere exogene Gene enthalten, die Resistenz gegenüber verschiedenen Selektionsagentien einschliesslich Antibiotika wie Neomycin zur Verfügung stellen. In der Erfindung benutzte repräsentative Vektoren schliessen z.B. den N2/ZipTKNEO-Vektor (TKNEO) (Titer : 1 × 105 G418r cfu/ml auf NIH 3T3-Zellen), den ZipPGK-hADA-Vektor, und den ZipPGK-mADA-Vektor ein, wie sie vorher von Moritz et al., (1993) J. Exp. Med. 178 : 529 beschrieben worden sind. Im TKNEO-Vektor werden Neophosphotransferasesequenzen in der Sense-Orientierung (in Bezug auf das 5'-lange terminale Repeat-LTR) mittels des Herpes-Simplex-Thymidin-Kinase-Promoters exprimiert. Dieser Vektor enthält ein auswählbares Markergen, das Neomycinresistenz verleiht, um die Identifizierung der transduzierten Zellen zu erleichtern. Im ZipPGK-hADA-Vektor, wird die humane ADA-(„hADA")-cDNS in der Sense-Orientierung in Bezug auf 5'LTR mittels des humanen Phosphoglyceratkinase (PGK)- Promoters exprimiert. Sie enthält nur eine exprimierbare genetische Sequenz und hat keinen dominanten auswählbaren Marker. Der ZipPGK-mADA (PGK-mADA)-Vektor ist, ausser für den Fall dass die humane ADA-cDNS durch murine ADA („mADA")-DNS ersetzt worden ist, identisch mit dem ZipPGK-hADA-Vektor. Diese und andere virale Vektoren und Techniken sind gut bekannt und ihre Ausführung und Benutzung in der vorliegenden Erfindung sind dem Fachmann auf dem Gebiet dieser Offenbarung gut bekannt.
  • In der Erfindung benutzte virale Vektoren zeigen die Fähigkeit, an eine Aminosäurensequenz der Heparin-II-bindenden Domäne des Fibronektins, einschliesslich der des humanen Fibronektins zu binden. Wie es in den folgenden Passagen diskutiert wird, wird angenommen, obgleich die vorliegende Erfindung durch keine Theorie begrenzt ist, dass die Co-Lokalisierung des Virus und der Zielzelle durch die Bindung des Virus und der Zelle an entsprechende funktionelle Domänen eine Verbesserung der Transduktion der Zelle durch das Virus erleichtert. In dieser Hinsicht, kann die Kapazität eines Virus sich an die Aminosäurosequenz der Heparin II-bindende Domäne zu binden und so wirksam in der Erfindung zu dienen, leicht festgestellt werden, indem routinemässige Prozeduren benutzt werden. Allgemein ausgedrückt, bestimmen diese Assays das Ausmass, mit dem Viruspartikel an immobilisierte Polypeptide, die die Heparin II-bindende Domäne enthalten, gebunden werden, um dem Auswaschen der immobilisierten Polypeptidmatrix zu widerstehen. So kann, kurz gesagt, z.B. ein Virus enthaltender Überstand in einem Loch, das ein immobilisiertes Polypeptid einschliesslich der Fibronektin-Heparin II-bindenden Domäne enthält, inkubiert werden. Das Loch wird dann gründlich mit einem physiologischen Salzpuffer gewaschen, und anschliessend werden die Zielzellen für das Virus im Loch inkubiert, um das Niveau der im Loch verbleibenden infektiösen Aktivität zu bestimmen. Es wird die Reduktion der infektiösen Aktivität, oder Titer, in Bezug auf den anfänglichen Virus enthaltender Überstand bestimmt und mit der eines ähnlichen Kontrollaufs (z.B. unter Benutzung eines BSA-beschichteten Lochs) verglichen. Ein in dem die Heparin II-Domäne enthaltenden Loch verbleibender signifikant höherer Titer verglichen mit dem des Kontrolllochs bedeutet, dass das betreffende Virus erfindungsgemäss für eine Benutzung geeignet ist. Um diese Selektions-Prozedur zu vereinfachen, kann der virale Vektor ein auswählbares Markergen, wie oben erwähnt, enthalten.
  • Fibronektinfragmente zur Benutzung in der Erfindung können natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein, und können im wesentlichen rein aus naturlich vorkommenden Materialien präpariert werden, wie es z.B. vorher durch Ruoslahti et al., (1981) J. Biol. Chem. 256 : 7277; Patel und Lodish (1986) J. Cell. Biol. 102 : 449; und Bernardi et al., (1987) J. Cell Biol. 105 : 489 beschrieben worden ist. In dieser Hinsicht wird sich hierin auf ein im wesentlichen reines Fibronektin oder auf im wesentlichen reine Fibronektinfragmente bezogen, d.h. dass sie im wesentlichen frei von anderen Proteinen sind, mit denen Fibronektin natürlich vorkommt. Im wesentlichen reines Fibronektin oder Fibronektinfragmente können zur Benutzung in der Erfindung auch rekombinant produziert werden, wie es z.B. allgemein im US-Patent n° 5198423 vom 30, März 1993 von Taguchi et al., und vergeben an Takara Shuzo Co., Ltd., Kyoto, Japan, beschrieben worden ist. Insbesondere werden die in den unteren Beispielen als H-271, II-296, CH-271, CH-296 und C-CS1 identifizierten rekombinanten Fragmente und die Verfahren um diese zu erhalten, im Detail in diesem 423-Patent beschrieben. Das in den unteren Beispielen benutzte C274-Fragment wurde so erhalten wie es im US-Patent n° 5102988 beschrieben ist. Diese Fragmente oder Fragmente von denen sie routinemässig deriviert werden können, stehen durch Kultivierung von beim Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, Japan als FERM P-10721 (H-96), FERM BP-2799 (C-277 gebunden an H-271 über Methionin), FERM BP-2800 (C-277 gebunden an H-296 über Methionin) und FERM BP-264 (H-271) hinterlegte E. Coli zur Verfügung, wie es auch im US-Patent n° 5198423 beschrieben worden ist. Man kann ausserdem nützliche Informationen bezüglich die Fibronektinfragmente, die in dieser Erfindung benutzbar sind, oder Ausgangsmaterial für solche Fragmente in Kimizuka et al., J Biochem. 110, 284-291 (1991) finden, wo die oben erwähnten rekombinanten Fragmente weiter beschrieben werden; in EMBO J. 4, 1755-1759 (1985) wo die Struktur des humanen Fibronektingens beschrieben wird; und in Biochemistry, 25, 4936-4941 (1986) wo die Heparin II bindende Domäne des humanen Fibronektins beschrieben wird, finden. Es ist gefunden worden, dass Fibronektinfragmente, die die CS1-Zelladhäsionsdomäne und die Heparin II bindende Domäne enthalten, wie sie z.B. in ungefähr einem 30 oder 35 kd-Fragment (30/35 FN) und in verschiedenen rekombinanten Fragmenten, wie es in den unteren Beispielen beschrieben wird, enthalten sind, die Effizienz des Gentransfers in hämatopoetische Zellen in der bisherigen Arbeit signifikant verbessern, und werden für eine Benutzung in dieser Erfindung bevorzugt. Allgemein gesagt wird so verständlich, dass das bzw. die in der Erfindung benutzte(n) fibronektinspezifische(n) Polypeptid(e) eine Aminosäuresequenz zur Verfügung stellt (stellen) die eins zellbindende Aktivität der CS-1-Zelladhäsionsdomäne des Fibronektins ebenso wie eine Aminosäuresequenz der Heparin-II-bindenden Domäne des virusbindenden Fibronektins zur Verfügung stellt. Der Fachmann wird feststellen, dass die erforderlichen zell- und virusbindenden Aktivitäten durch die nativen Aminosäuresequenzen dieser funktionellen Fibronektindomänen und durch Aminosäuresequenzen, die sich von den nativen Sequenzen unterscheiden und dennoch ausreichend ähnlich sind, um die zellbindenden und virusbindenden Aktivitäten aufzuweisen, zur Verfügung gestellt werden. Diese ähnlichen Aminosäuresequenzen werden eine substantielle Sequenzhomologie in Bezug auf ihre entsprechenden nativen Sequenzen zeigen und solche umfassen, in denen Aminosäuren deletiert, substituiert und/oder modifiziert worden sind, während dennoch eine Aminosäuresequenz mit dem gewünschten zellbindenden und virusbindenden Kennzeichen zur Verfügung gestellt wird.
  • In dieser Hinsicht sind die einschlägigen Biotechniken soweit fortgeschritten, dass die Deletion, Substitution, Addition oder andere Modifikationen von Aminosäuren in entsprechende funktionellen Domänen routinemässig ausgeführt werden können. Die sich ergebenden Aminosäuresequenzen können dann routinemässig für die gewünschte zellbindende und virusbindende Aktivität selektionniert werden. Wie es allgemein oben diskutiert worden ist, kann z.B. die virusbindende Aktivität von mutanten oder modifizierten Formen der Heparin II-bindenden Domäne des Fibronektins unter Benutzung der Virus-Inkubations-, -Wasch- und Virustiter-Assays selektionniert werden, um die Beibehaltung der Infektiosität verglichen mit einer Kontrolle zu bestimmen. Aus den sich daraus ergebenden Lehren, stellen diese Bindungs-Assays Routineversuche für die auf diesem Gebiet arbeitenden Fachleute dar.
  • Die Zellbindung an modifizierte oder mutante Formen der CS-1-Zelladhäsionsdomäne des Fibronektins oder an andere zellbindende Polypeptide können auf ähnliche Weise unter Benutzung herkömmlicher Prozeduren untersucht werden. Solche Prozeduren umfassen z.B. solche die in Nature 352 438-441 (1991) beschrieben worden sind. Kurz gesagt wird das zellbindende Polypeptid auf Kunststoffschalen aufgetragen und die zu untersuchende Zellpopulation wird während 30 Minuten bis 2 Stunden im Medium aufgetragen. Nach dieser Inkubations-Periode, werden die nicht am Protein haftenden Zellen entnommen, gezählt und auf Lebensfähigkeit untersucht. Die am Polypeptid haftenden Zellen werden auch unter Benutzung von Trypsin oder eine Zelldissoziierungs-Puffer (z.B. Gibco) entnommen, gezählt und auf Lebensfähigkeit untersucht. In einigen Fällen, werden die Zellen, z.B. für eine hämatopoetische Kolonie bildende Zellen, weiter während zusätzlicher 12 bis 14 Tagen in Kultur gebracht, um die koloniebildenden Kennzeichen der Zellen sicherzustellen. Dann wird der Prozentsatz der aneinander haftenden Zellen berechnet und mit einem Standard, wie mit Rinderserumalbumin (BSA) beschichteten Kunststoffschalen verglichen. Substantielle Bindung der Zielzellen an das untersuchte Polypeptid stellt einen Anhaltspunkt zur Verfügung, dass die Polypeptid-/Zellkombination für die Erfindung geeignet ist, und das Polypeptid kann an das retrovirale Fibronektinfragment gekoppelt werden, um ein Konstrukt der Erfindung zu produzieren und die Infizierung der Zielzellen durch den viralen Vektor zu verbessern.
  • Entsprechend spezifischerer Aspekte der Erfindung, umfasst das virusbindende Polypeptid, um die Transduktion durch retrovirale Vektoren zu verbessern, (i) eine erste Aminosäuresequenz, die Ala1690-Thr1690 der Heparin II-bindenden Domäne des humanen Fibronektins, das durch die Formel (Sequenz 1. D. #1)
    Figure 00090001
    oder eine ausreichend ähnliche Aminosäurensequenz dazu wiedergegeben wird, um die Fähigkeit das Retrovirus zu binden zu zeigen;
    und (ii) eine zweite Aminosäurensequenz, die einem Teil der IIICS-bindenden Domäne des humanen Fibronektins (die CS-1 bindende Domäne) entspricht, das durch die Formel (Sequenz ID. #2):
    Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr;
    oder eine ausreichend ähnliche Aminosäurensequenz dazu, wiedergegeben wird, um die Fähigkeit hämatopoetischer Zellen, wie primitiver Vorläuferzellen und/oder Langzeitrepopulierungs (Stamm-)-Zellen zu binden, zu zeigen.
  • Wie es vorher erwähnt worden ist, ist leicht zu verstehen, dass gewisse Modifikationen und/oder Mutationen dieser nativen Sequenzen in der Praxis der vorliegenden Erfindung möglich sind, solange die sich ergebende Aminosäurensequenz der nativen Sequenz ausreichend ähnlich ist, um die Fähigkeit das Virus zu binden (für den Fall der Heparin II-bindenden Domäne) und die Fähigkeit die Zielzellen zu binden (für den Fall der CS-1-Domäne) zu zeigen.
  • Bekannte Polypeptide, die z.B. Sequenzen haben, die Heparin binden und eine grosse Sequenzhomologie gegenüber der Heparin-II-bindenden Domäne des Fibronektins zeigen, umfassen z.B. Collagen V und den Fibroblastwachstumsfaktor. Wie es in dem unteren spezifischen Beispiel 10 gezeigt wird, können Polypeptide, die diese mit den zellbindenden Sequenzen wie die Bindungsstellen für VLA-4 und/oder VLA-5 verbundene Sequenzen umfassen, benutzt werden, um den durch das Retrovirus vermittelten DNS-Transfer in Zellen, die an die zellbindenden Sequenzen binden, zu verbessern.
  • Ein Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren für die somatische Gentherapie zur Verfügung, das eine in vitro-Zelltherapie und eine nachfolgende Transplantation der Zielzellen in den Wirt einschliesst, was auch als „Transplantation" des Wirts mit den transduzierten Zielzellen bekannt ist. Hämatopoetische oder andere Zellen, z.B. Stammzellen, die aus Knochenmark oder peripherem Blut isoliert werden, embrionische Stammzellen, oder Zellen, die sonst als CD34+ und/oder C-kit+ gekennzeichnet werden, können aus einer humanen oder anderen Säugerquelle unter Benutzung von Standardprotokollen gesammelt werden. Z.B. können die hämatopoetischen Zellen aus Knochenmark oder peripherem Blut eines humanen Spenders oder aus humanem fötalem Nabelschnurblut gesammelt werden. Wenn sie einmal gesammelt sind, können die hämatopoetischen Zellen z.B. optional mit Standardtechniken behandelt werden, um sie an Stammzellen und/oder primitiven Vorläuferzellen anzureichern. Die hämatopoetischen Zellen können dann auf geeignete Weise, z.B. auf Gewebekulturplatten inkubiert werden. Optional können während dieser Periode nicht haftende mononukleare Zellen geringer Dichte vor der retroviralen Infizierung vorstimuliert werden. Die aus der Technik bekannte Vorstimulierung und wie sie hier benutzt wird, bezieht sich auf den Prozess, Zellen vor dem Kontakt mit Retroviren wachstumstimulierenden Faktoren auszusetzen. Für eine solche Vorstimulierung ist gezeigt worden, dass sie die Transduktion von hämatopoetischen Zellen durch Retroviren verbessert.
  • Nach der Vorstimulierung können die Zellen geerntet werden und, wie es hier beschrieben worden ist, mit Fibronektin oder Fragmenten davon inkubiert werden, was die Häufigkeit der Zelltransduktion durch Retroviren verbessert. Bevorzugt werden die Zellen mit gereinigten und 1 oder unlöslichen, z.B., immobilisiertem Fibronektin oder Fibronektinfragmenten inkubiert. Die Zellen können dann mit dem rekombinanten Virus, z.B. einem Retrovirus, der ein Gen zur Korrektion einer Enzym- oder Proteindefizienz oder -anomalie in den Zellen enthält, in der Anwesenheit einer wirkende Menge Fibronektin oder Fibronektinfragment, um die Häufigkeit der Transduktion der Zellen durch das Virus zu verbessern, infiziert werden. Die sich ergebenden transduzierten hämatopoetischen Zellen können dann auf herkömmliche Weise, z.B. intravenös in einen tierischen Zelltransplantatempfänger, bevorzugt einen autologen Spender eingeführt werden, können jedoch auch allogene Transplantate umfassen, wobei letztere insbesondere verwendet werden, wenn Nabelschnurblutzellen für das Transplantat benutzt werden, wie es unten diskutiert wird.
  • Die Verfahren der Erfindung können in Genmarkierungs- oder Gentherapieprotokollen für eine Vielzahl von Störungen, einschliesslich Knochenmarkstörungen, einschliesslich z.B. Krebs, Leukämien, Störungen, die Proteindefizienzen oder -anomalien umfassen, und Therapien, zur Modifizierung hämatopoetischer Zellen um die Resistenz gegenüber anderen therapeutischen Protokollen wie z.B. die Chemotherapie zu verbessern, benutzt werden. Repräsentative Störungen bei denen die Erfindung benutzt werden kann, umfassen also die ADA-Defizienz, z.B. ADA-defiziente SCID, die akute myelogene Kinderleukämie (AML), das Neuroblastom, und Erwachsenen-AML, und die akute lymphozytische Leukämie (ALL).
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die für ein Zelltransplantat benutzten Zellen aus humanem Nabelschnurblut erhalten. So kann humanes Nabelschnurblut in lebensfähigen primitiven hämatopoetischen Vorläufer- und/oder Stammzellen, z.B. durch Erhalten einer nicht haftenden mononuklearen Zellpopulation geringer Dichte, gesammelt und angereichert werden. Diese Population wird dann optional vorstimuliert und in Anwesenheit eines retroviralen Vektors, und immobilisiertem und/oder gereinigten Fibronektin oder Fibronektinfragmenten inkubiert, um die Transduktionseffizienz der Zellen durch einen Vektor zu verbessern. In dieser Hinsicht ist herausgefunden worden, dass die Transduktion primitiver hämatopoetischer und/oder Stammzellen aus Nabelschnurblut in Anwesenheit von Fibronektin oder Fibronektinfragmenten stark verbessert wird, obgleich Fibronektin kein Bestandteil von ECM im Nabelschnurblut ist und obgleich primitive Vorläufer- und Stammzellen aus dem Nabelschnurblut als unterschiedlich von denen des Knochenmarks gekennzeichnet worden sind. Insbesondere ist die Nabelschnurblutstammzelle als CD34+, HLA-DR+ gekennzeichnet worden, während die Stammzelle von Knochenmark als CD34+, HLA-DR– gekennzeichnet worden ist. Die Entdeckung, dass primitive Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut in der Tat auf verbesserte Weise in Anwesenheit von Fibronektin oder Fibronektinfragmenten transduziert werden, ermöglicht die Benutzung einer geeigneten und stark an Stammzellen angereicherte Quelle von hämatopoetischen Zellen. Ausserdem macht die Tatsache einer erfolgreichen Transplantation bei zahlreichen Patienten mit allogenen Transplantaten von angereichertem Nabelschnurblut für primitive Vorläufer- und Stammzellen, aus dem Nabelschnurblut eine stark bevorzugt Quelle für hämatopoetische Zellen. Siehe Kohli-Kummer et al., Brit. Heaematol. 85 : 419-422 (1993); Broxmeyer et al., Blood Cell 17 : 313-329 (1991); Gluckmann et al., Br Journ. Heaematol. 45 : 557 (1980); Heidelberg : Springer Verlag pp. 60-68 (1989); Wagner et al., Blood 79 : 1874-1881 (1992); und Wagner et al., Blood 82-86a (Zusammenfassung).
  • Falls es gewünscht wird, können transduzierte hämatopoetische Zellen oder andere Zellen auf Transduktionswirksamkeit und Genexpression getestet werden. Die signifikanten Verbesserungen z.B. beim durch die Erfindung zur Verfügung gestellten retrovirusvermittelteten Gentransfer werden weiter unten in spezifischen Beispielen gezeigt, die verschiedene Tests beschreiben, die die hohe Infizierungs- und Gentransfereffizienz durch Retroviren in Anwesenheit von Fibronektin oder Fibronektinfragmenten zeigen. Insbesondere exprimierien mit dem PGK·hADA-Retrovirus infizierte hämatopoetische Mäusezellen hohe Niveaus von transferiertem ADA-cDNS. Auf ähnliche Weise exprimierten die mit dem individuellen PGK-mADA-Virus infizierten humanen Vorläuferkolonien murine-ADA-Niveaus bis zu 10-fach höher als das endogene humane ADA-Protein. Um der analyse der Transfereffizienz strikt zu befolgen, wurden die Vorläuferkolonien erst als transduziert betrachtet, wenn die Expression der transferierten mADA gleich oder grösser als die Niveaus der endogenen humanen ADA war. Hohe Expressionsniveaus von neo vom TKNEO-Vektor wurden durch G418-Medikamentenresistenz bei einem Assay mit Neophosphotransferase (das neo-genprodukt) entdeckt.
  • Wie oben angegeben, werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung in Gegenwart von retroviralen Producerzellen vorteilhaft durchgeführt, ohne dass eine Co-Kultivierung durchgeführt werden muss. So kann der retrovirusvermittelte Gentransfer gemäss einem Aspekt der vorliegenden Erfindung im wesentlichen bei Abwesenheit von anderen als den hämatopoetischen Zielzellen oder anderen Zellen durchgeführt werden. Die Retrovirusvektorplasmid enthaltenden Producerzellen können kultiviere und der Überstand gesammelt werden. Der das Retrovirus enthaltende Überstand kann benutzt werden, um die hämatopoetischen Zellen in Anwesenheit von Fibronektin und/oder Fibronektinfragmenten zu infizieren, was in immobilisierter Form, z.B. aufgetragen auf einem Substrat, an dem die Infizierung ausgeführt wird, oder auf andere Weise ein Kontakt mit dem Infizierungsmedium vorgezogen wird. In dieser Hinsicht werden alle Producerzellen, die Retroviren mit hohem Titer und die keinen Hilfsstoff aufweisen, produzieren, als geeignet für die Benutzung in der Erfindung betrachtet. Dazu gehören z.B. Verpackungszellen wie Psi-2, C2, PA12, PA317 und GP+envAM12, ebenso wie viele aus dem Stand der Technik bekannte andere Verpackungszellen.
  • Entsprechend anderen Kennzeichen der Erfindung kann die starke Virusbindung an Aminosäuren in der Heparin II-bindenden Domäne der Fibronektins zur Konstruktion von Verabreichungssystemen für die vitale Therapie über einen breiten Bereich von Zelltypen benutzt werden. Zu diesem Zweck kann ein Polypeptid, das die retrovirusbindende Domäne des Fibronektins umfasst, kovalent an jeden beliebigen Liganden gekoppelt werden, was diese Konstruktspezifizität für die Zielzellen ergibt. Dieser Ansatz wird vermeiden, dass frühere determinierte Retroviruszelllinien für jede Zielzelle konstruiert werden müssen (Kasahara, N., A.M. Dozy, und Y. W. Kan, Science, Vol. 266, Seiten 1373-1376 (1994) und Valsesia-Wittmann, S., A. Drynda, G. Deleage, M. Aumailley, J. M. Heard, O. Danos, G. Verdier, und F. L. Cosset, J. Virol., Vol. 68, Seiten 4609-4619, (1994)). Die Spezifizität der Zielkonstrukte kann z.B. erreicht werden, indem Liganden benutzt werden, die z.B. folgendes umfassen: 1) zellhaftende Proteine, 2) Hormone oder Zytokine, 3) monoklonale Antikörper zu den Zielzellen, 4) die Zielzellen bindende Kohlehydrate (G. Ashwell, et al., Annu. Rev. Biochem., Band 51, Seiten 531-554 (1982)), 5) Metabolite für die Zielzellen, oder 6) die Zielzellen bindende funktionelle Polypeptide. Die Effizienz des Konstrukts für die Gen-Verabreichung kann verbessert werden, indem mehrere Heparin II-Virus-bindende Domänen eingeschlossen werden und wodurch die Menge viraler Partikel, die an die Zielzellen verabreicht werden, erhöht wird. Es ist z.B. für die zellbindende Domäne des humanen Fibronektins das Pro1239-Ser1515, wie es im US-Patent n° 5198423 beschrieben worden ist, entspricht, gezeigt worden, dass sie an Zellen bindet, die BHK und B16-F10-Zellen umfassen (Kimizuka et al., J. Biochem., Band 110, Seiten 285-291 (1991)). Ausserdem ist für die Heparin II-Domäne selbst gezeigt worden, dass sie an Fibroblasten, endotheliale Zellen und Tumorzellen bindet. Diese Polypeptidsequenzen können an die retrovitrusbindende Domäne des Fibronektins gekoppelt werden, um vorbestimmte Zellen als Ziel für die Infektion durch Retrovirus zu erhalten.
  • Beispielhafte Anwendungen im hämatopoetischen System umfassen auch ein Konstrukt aus Erythropoetin oder G-CSF gekoppelt mit der Retrovirus-bindenden Domäne des Fibronektins, um jeweils hoch determinierte erythroide oder granulozytäre Vorläuferzellen als Ziel zu erreichen. Eine andere übliche erfindungsgemässe Anwendung wird es sein, eine Retrovirus-bindende Domäne bzw. Domänen mit einem Liganden zu kombinieren, der determiniert oder prädominant an maligne Zellen bindet. Es ist z.B. gezeigt worden, dass in vitro und sogar in vivo-Wachstum von Brustkarzinomzellen durch die Verwendung von Substanzen beeinflusst werden kann, die an Rezeptoren auf den Zielzellen binden, wie z.B. luteinisierende Hormone abgebende Derivate, Emons, G. et al., Hum. Reprod. 9 : 1364-1379 (1994), Östrogene, Tolcher, A. W. Oncol. 8 : 39-43 (1994), oder Antiöstrogene, Howell, A. et al., Lancet 345 : 29-30 (1995), Progestogene oder Antiprogestogene, Klijn F. G. et al., Hum. Reprod. 9 Supll. 1 : 181-189 (1994); Griffiths, K. et al., Semin. Oncol. 21 : 672-687 (1994), die als Liganden in Konstrukten der Erfindung dienen, die eine oder mehrere Virus-bindende Domänen des Fibronektins enthalten. Als weitere Beispiele können Thyroid (Krebs)-Zellen als hochdeterminierte Ziele ausgewählt werden, indem Konstrukte mit Jodid benutzt werden, und Leber (Krebs)-Zellen können mit Hilfe von Konstrukten als Ziele gewählt werden, die HDL oder Teile davon enthalten. Schliesslich erlauben es Konstrukte aus monoklonalen Antikörpern und der Retrovirus-bindenden Domäne des Fibronektins jede beliebige Zelle und jedes beliebige Organ, gegen die bzw. das ein Antikörper zur Verfügung steht, als Ziel zu wählen. So kann ein breiter Rahmen von Säugerzellentypen als Ziel gewählt werden, indem man sich der Fähigkeit der Retrovirus-bindenden Domäne des Fibronektins virale Vektoren zu binden und zu lokalisieren bedient.
  • Somit ist eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist mit der Präparierung des Konstrukts verbunden, die benutzt werden kann, um die virale Transduktion einer Zielzelle zu verbessern. Die Virus-bindende Aminosäurensequenz der Heparin II-bindenden Domäne des Fibronektins ist an einen Liganden gekoppelt, an den die Zielzelle bindet. Wie es oben diskutiert worden ist, kann der Ligand z.B. ein Polypeptid vom Fibronektin und von einem anderen Protein sein (einschliesslich ein zellhaftendes Protein, z.B. Laminin, Collagen, Vitronektin, Osteopontin oder Thrombospondin), ein Hormon, ein Metabolit, ein Antikörper (einschliesslich monoklonale Antikörper), oder jeder beliebige andere Ligand sein, der die Fähigkeit zeigt, an die Zielzelle, bevorzugt mit Spezifizität, zu binden. Das sich ergebende Gesamtkonstrukt kann in immobilisierter Form auf eine Art benutzt werden, die der ähnlich ist, die für die Fibronektinpolypeptide, die spezifisch in den unteren Beispielen beschrieben werden, benutzt werden.
  • Solche Konstrukte und Ansätze, bei denen die Zellen als Ziele dienen sollen, können in vitro benutzt werden, wie es oben diskutiert worden ist und die Retroviren können ebenfalls in vivo als Ziele gewählt werden, wobei verschiedene Faktoren wie die Stabilität und Spezifizität des Konstrukts und die Interaktion des Retrovirus-Konstrukts unter physiologischen Bedingungen in Anbetracht gezogen werden. Die Spezifizität kann auch verbessert werden indem das Verabreichungssystem modifiziert wird um die Verabreichung des Konstrukts an die Zielzellen sicherzustellen, indem man z.B. die Portalvene katherisiert, um die Leberzellen als Ziel zu erhalten.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung, dass die Transduktionsprozesse der Erfindung, die die Co-Lokalisierung des Virus und der Zelle umfassen, vorteilhafter sind, wenn sie in Abwesenheit oder substantieller Abwesenheit von Hexadimethrinbromid ausgeführt werden. Hexadimethrinbromid (kommerziell verfügbar unter dem Namen Polybrene®) ist eine polykationische Substanz, die intensiv in Retrovirus-vermittelten Gentransferprotokollen mit dem Zweck benutzt worden ist, die Effizienz der Transduktion durch das Retrovirus zu verbessern. Es ist hingegen entdeckt worden, dass die Anwesenheit von Hexadimethrinbromid in durch die Co-Lokalisierung verbesserten Gentransferprotokollen, wie sie in diesem Text beschrieben werden, die Transduktionseffizienz auf signifikante Weise reduziert. So werden verbesserte Prozesse der Erfindung in einem Medium ausgeführt, dass im wesentlichen frei von Hexadimethrinbromid ist (d.h. nicht mehr als ungefähr 1 μg/ml Hexadimethrinbromid enthält) und bevorzugter in Abwesenheit von Hexadimethrinbromid durchgeführt wird. Solche Prozesse stellen bevorzugte erfindungsgemässe Zellzusammensetzungen zur Verfügung, die im wesentlichen Retrovirus-transduzierte lebensfähige Zellpopulationen umfassen, die im wesentlichen frei von retroviralen Producerzellen und Hexadimethrinbromid sind. In dieser Hinsicht, sollen wesentlich transduzierte lebensfähige Zellpopulationen wie sie hier benutzt werden, bedeuten, dass mindestens 20% der Zellen in dieser Population von einem Retrovirus transduziert worden sind. Bevorzugtere Populationen haben mindestens ungefähr 50% transduzierte Zellen, und noch bevorzugter mindestens ungefähr 75% transduzierte Zellen. Bevorzugte Zellzusammensetzungen umfassen gemäss diesem Aspekt der Erfindung hämatopoetische Zellen, und umfassen bevorzugter hämatopoetische Zellpopulationen, die mit primitiven Vorläufer- und Stammzellen angereichert sind. Allgemein ausgedrückt, können vorteilhafte Prozesse der Erfindung ohne Anwesenheit von polykationischen oder anderen Wirkstoffen in entsprechenden Retrovirus-Infizierungsprotokollen (z.B. Co-Kultur) ohne das Fibronektinfragment oder anderem Material für die Co-Lokalisierung ausgeführt werden und führen zu einer Zunahme der Transduktionseffizienz, wobei diese Wirkstoffe die Transduktionseffizienz in Anwesenheit von Material für die Co-Lokalisierung reduzieren.
  • Es wird betrachtet, dass ein besonders geeigneter Retrovirus-vermittelter DNS-Transfer ausgeführt wird, indem Kits benutzt werden, die zur Ausführung der Verfahren der Erfindung speziell konzipiert worden sind. Entsprechend stellt ein anderer Aspekt der Erfindung Kits zur Verfügung, die eine Menge von im wesentlichem reinem Polypeptid oder oben diskutiertem Konstrukt umfassen, die die Transduktion der Zielzellen durch Retroviren auf einem künstlichen Substrat, auf dem die retrovirale Infizierung ausgeführt werden kann, verbessern. Das Polypeptid oder anderes Konstrukt kann getrennt oder auf einem Substrat aufgetragen zur Verfügung gestellt werden. Im Falle von Infizierungsprotokollen für humane hämatopoetische Zellen umfassen die Kits auch hämatopoetische Zellwachstumsfaktoren für die Zellvorstimulierung. Ausserdem können die Kits rekombinante Retrovirus-Vektoren umfassen, wie es oben für die Transduktion beschrieben worden ist. Allgemein gesagt umfassen die Kits eine sterile Verpackung, die diese verschiedenen Kit-Komponenten in einer beabstandeten Beziehung zueinander hält, die ausreicht, um ein Zerbrechen der Komponenten während der Handhabung des Kits verhindert. Es ist z.B. allgemein üblich, gegossene Kunststoffartikel zu benutzen, die mehrere Fächer oder Flächen aufweisen, um die Kitkomponenten in einer beabstandeten Beziehung zu halten.
  • Es werden weitere Beispiele zur Verfügung gestellt um ein tiefgreifenderes Verständnis und Einschätzung der Erfindung zu fordern. Das erste Beispiel ist ein Referenzbeispiel das nicht zur vorliegenden Erfindung gehört, jedoch Einzelheiten der Protokolle zur Verfügung stellt, die in den späteren erläuternden Beispielen benutzt werden. Es ist leicht zu verstehen, dass diese Beispiele von ihrer Natur her nicht begrenzend sind.
  • REFERENZBEISPIEL 1
  • Gentransfer in Knochenmarkzellen bei Benutzung von TKNEO
  • 1.1 PRÄPARIERUNG VON VIRUS-ÜBERSTAND
  • GP+EnvAM12-Producerzellen (siehe Markowitz et al., (1998) Virology 167 : 400), die einen retroviralen Plasmid-TKNEO-Vektor enthalten, wurden in Iscoves modifiziertem Dulbeccus-Medium (IMDM, Gibco, Gaithersburg, MD), das 10% fötales Kalbserum (FCS, Hyclone, Logan, UT) und 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 Milligramm/ml Streptomycin (P/S, beide Gibco) umfasst, in Kultur gebracht. Der Virus-enthaltende Überstand wurde gesammelt indem über Nacht 10 ml IMDM, das 20% FCS enthält, auf konfluenten Platten hinzugefügt wurden. Das geerntete Medium wurde durch 0,45 Mikronfilter (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) gefiltert und bis zur Benutzung bei –80°C gelagert.
  • 1.2 PRÄPARIERUNG VON FIBRONEKTINFRAGMENTEN
  • FN wurde von humanem Plasma (Lifesource, Glenview, IL) getrennt, wie es in Ruoslahti et al., Methods Enzymol. 82 : 803-831 (1982) beschrieben ist, ausser dass die Gelatine-Agarose-Säule vor der Elution von FN mit 4M Harnstoff mit 1M Harnstoff gewaschen war. Das abgetrennte FN wurde gründlich bei 4°C gegenüber 10mM 3-(cyclohexamino)-I-Propan-Sulfonssäure (CAPS), 150 mM NaCl, 2mM CaCl2 pH 11,0 dialysiert und bei –80°C in Aliquots gelagert. Die chymotryptische Zellbindungsdomäne (CBD) (CS·1) und Heparin-II-bindende Fragmente von FN wurden, wie vorher in (Ruoslahti et al., (1982) supra, Patel und Lodish, J. Cell. Biol., 102, Seiten 449-456 (1986), und Bernardi et al., J. Cell. Biol., 105, Seiten 489-498 (1987) beschrieben, abgeschieden. Drei Haupt-Heparin-bindende Fragmente (30kD, 35kD, und 42kD) wurden in dem 1 M NaCl-Eluat aus der Heparin-Agarose-Säule erhalten. Um diese Heparin-bindenden Fragmente abzuscheiden, wurde das 1 M NaCl-Eluat über Nacht bei 40°C gegen 10 mM Tris-HCl, PH 7,0 dialysiert und über eine Anionenaustauschsäule geschickt (2ml DEAE Sepharose-Fast Flow (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsale, Sweden)/mg Protein) die mit 10mM Tris-HCl pH 7,0 equilibriert wurde. Die 30/35 kD-Fragmente wurden in. der ungebundenen Fraktion gesammelt, während das 42 kD-Fragment von der Säule mit 100mM NaCl eluiert wurde. Aus 500 mg FN wurden ungefähr 26 mg 30/35 kD-Fragmente und 4mg 42 kD-Fragment erhalten. Das 42 kD-Fragment, aber nicht die 30/35 kd-Fragmente wurde durch einen Antikörper gegenüber der Fibrin-bindende Domäne erkannt, wie es durch die Western blotting – Technik bestimmt wird. Das 42 kD-Fragment bindet an eine Fibrin-Sepharose-Affinitätssäule.
  • Für die Benutzung im Infizierungsprotokoll wurden Fibronektinfragmente auf 35 oder 100 nun Petrischalen (Falcon, Lincoln Park, NJ) bei einer Konzentration von 75 pmol/cm2 immobilisiert, wie es von Patel und Lodish (1986), supra, beschrieben worden ist. Kontrollplatten wurden in analoger Weise mit 2% (FN-frei) Rinderserumalbumin (BSA, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) beschichtet.
  • 1.3. RETROVIRALES INFIZIERUNGSPROTOKOLL
  • Knochenmarkproben von gesunden adulten Spendern wurden in Röhren gesammelt, die steriles Konservierungsmittel – freies Sodiumsulfatheparin nach Protokollen enthalten, die vom Institutionale Review Board der Indiana University School of Medicine zugelassen ist. Mononukleare Zellen niedriger Dichte wurden durch Präparierung durch Zentrifugierung auf Ficoll-Hypaque (Dichte 1,077 g/ml, Pharmacia, Piscataway, NJ) während 45 Minuten bei 25 °C präpariert. Plastikhaftende Zellen wurden von Knochenmarkzellen niedriger Dichte durch eine zusätzliche Inkubation auf Gewebekulturplatten während 4 bis 16 Stunden bei 37°C in 5% CO2 in IMDM mit 2-% FCS entfernt.
  • Nicht haftende mononukleare Zellen geringer Dichte wurden vor der Retrovirus-Infizierung, wie es von Luskey et al., (1992) Blood 80 : 396 beschrieben worden ist, während 48 Stunden bei 37°C und 5% CO2 in IMDM, das 20% FCS, 100 U/ml rhIL – 6, 100 ng/ml rhSCF (beides Amgen, Thousand Oaks, CA) und P/S bei einer Zelldichte von 1 × 106 Zellen/ml auf den Petrischalen enthält, vorstimuliert. Die vorstimulierten Zellen wurden durch starkes Pipettieren geerntet, um die lose auf dem Kunststoff haftenden Zellen zu entfernen.
  • Die vorstimulierten Zellen (5 × 105 Zellen/ml) wurden während 6 Stunden auf mit BSA (Kontrollplatten) oder Fibronektin oder Fragmenten davon (UV-bestrahlt, damit die Proteine besser an den Kunstoffplatten haften) beschichteten Platten inkubiert und dann mit einem Virus-Überstand in Anwesenheit von Wachstumsfaktoren (wie oben) und 7,5 Mikrogramm/ml Polybrene (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) infiziert. Der Virus-Überstand wurde (einschliesslich der Wachstumsfaktoren und 5,0 Mikrogramm/ml Polybrene) nach 2 Stunden ersetzt und die Zellen wurden während zusätzlicher 12 bis 24 Stunden inkubiert. Nicht haftende Zellen wurden bei jedem Mediumwechsel wieder hinzugefügt.
  • Nach dem Infizierungsprotokoll wurden nicht haftende Zellen abgegossen und haftende hämatopoetische Zellen wurden unter Benutzung des Zellen-Dissoziations-puffers (CDB) (enzymfrei/auf der Basis von PBS/Gibco) nach den Herstellervorschriften von den Kulturen gesammelt. Die haftenden Zellen wurden zur nicht haftenden Fraktion hinzugefügt, zweimal gewaschen und gezählt. Die geernteten Zellen wurden entweder in klonogenen Methylzellulose-Vorläuferzellen-Assays oder Langzeit- Knochenmarkkulturen ausplattiert.
  • 1.4. LANGZEITKNOCHENMARKKULTUREN
  • LTC-IC(humane Stammzelle)-Assays wurden gemäss den vorher beschriebenen Verfahren mit leichten Modifikationen ausgeführt. Sutherland et al., Blood 74 : 1563 (1989). Kurz gesagt, wurden 0,5-1 × 106 infizierte Zellen in Langzeit-Knochenmarkzellen (LTMC) auf konfluente, vorbestrahlte (wie oben beschrieben) allogene humane Knochenmarkfibroblasten (BMF) in 5 ml IMDM, das 10% FCS, 10% Pferdeserum (Sigma) und P/S, 1 × 10–5 M Hydrocortison (Upjohn, Kalamazoo, MI) und 320 Mosmol Natriumchlorid enthält auf 6-Loch-Gewebekultur-Platten (Costar, Cambridge, MA) aufgebracht. LTMC wurde bei 33°C in 5% CO2 inkubiert und wöchentlich gefüttert indem 50% der Medien und der nicht haftenden Zellen entfernt wurden. Nach funf Wochen wurden die LTC-IC-Kulturen geopfert indem CDB benutzt wurden, um anhaftende hämatopoetische Zellen von BMF zu entfernen. Beide, die nicht anhaftenden und die anhaftenden hämatopoetischen Zellen wurden kombiniert und in Methylzellulose ausplattiert, um von LTC-IC derivierte Kolonien zu erhalten.
  • 1.5. KLONOGENE METHYLZELLULOSE-ASSAYS
  • Die Methylzellulose-Assays wurden, wie es von Toksoz et al., Proc. Natl. Acad Sci., USA, Band 89, Seite 7350 (1992) beschrieben wurde, mit geringen Modifikationen ausgeführt. Kurz gesagt, wurden 2-5 × 104 infizierte Knochenmarkzellen mit 5 Einheiten/ml Erythropoietin (Epo, Amgen), 100 ng/ml rhSCF, 10 ng/ml rhIL – 3 (Genzyme, Cambridge, MA) in 1 ml von 2,4% IMDM Methylzellulose (Fluka, Ronkonkoma, NY), die 25% FCS, 10% humanes Plasma, 10–5 M Beta-Mercaptoethanol (Sigma) und P/S enthält, ausplattiert. Die Kulturen wurden bei 37°C in 5% CO2/95% Luft inkubiert und die Kolonien (> 50 Zellen) wurden gezählt, indem sie auf einem invertierten Mikroskop am 13. Tag als CFU-GM (Granulocyten und Macrophagen enthaltend), CFU-Mix (Myeloide und erythroide Elemente enthaltend) oder BFU-E (nur erythtroide Elemente enthaltend) angezeigt wurden.
  • 1.6. ANALYSE DER RETROVIRALEN INFIZIERUNG
  • Die Effizienz der Infizierug mit dem TKNEO-Virus wurde analysiert, indem der Prozentsatz der am Tage 13 gegenüber 1,5 mg/ml (trockenes Puder, Gibco) G418 widerstehende Methylzellulose-Kolonien festgestellt wurde. Bei jedem Experiment wurden Scheininfizierungen durchgeführt, indem Knochenmark auf der GP + EnvAM12 Verpackungslinie inkubiert wurden, die keinen rekombinanten Virus erzeugten. Die Kultur dieser mit 1,5 mg/ml G418 scheininfizierten Zellen zeigte ständig < 1% Hintergrundkolonien.
  • 1.7. GENTRANSFEREFFIZIENZ IN DETERMINIERTEN VORLÄUFERZELLEN
  • Die Transduktionseffizienz wurde verglichen, indem Knockenmarkzellen infiziert wurden, während sie auf 30/35 FN- oder BSA-beschichteten Schälchen ausplattiert waren. Es wurde kein Unterschied in der nach der Infizierung ohne Auswahl erhaltenen Kolonienanzahl zwischen diesen Zuständen beobachtet. 2 zeigt den Prozentsatz von G418r Kolonien nach der Infizierung. Von allen Progenitortypen, einschließlich der, die von Lineage-begrenzten (BFU-E und CFU-GM) ebenso wie von Multilineage (CFU-Mix)-Vorläuferzellen deriviert waren, wurde ein höherer Prozentsatz von G418r-Kolonien auf 30/35 FN festgestellt. Die Infizierung aller determinierten Progenitoren war im Vergleich zu 30/35 FN auf BSA neun mal höher.
  • 1.8. GENTRANSFEREFFIZIENZ BEI LANGZEIT-KULTURBILDENDEN-ZELLEN
  • Der Gentransfer in LTC-IC wurde durch Benutzung des TKNEO-Vektors bewertet. Der Getransfer in LTC-IC derivierte Kolonien wurden erst nach Infizierung auf 30/35 FN (16% G418' gegenüber 0% G418r-Kolonien, 30/35 FN gegenüber BSA) detektiert.
  • 1.9. SPEZIFIZITÄT DER 30/35 FN-WIRKUNGEN AUF DIE INFIZIERUNGSEFFIZIENZ VON HÄMATOPOETISCHEN ZELLEN
  • Um die Spezifizität einer auf 30/35 beobachteten verbesserten Gentransfereffienz zu bestimmen, wurde eine Infizierung mit TKNEO auf mit BSA, 30/35 FN, intaktem Fibronektin, einem die zentrale Zellbindungsdomäne (CBD), die die RGDS-Tetrapeptid-Sequenz enthält, enthaltenden 115 kd-Fragment und einem 42 kd-C-Terminal-FN-Fragment (42FN) gekennzeichnet durch die Heparin II- bindende Domäne, aber bei dem die CS1-Sequenz fehlt (1), beschichteten Platten durchgeführt. Die Infizierung auf BSA erzeugte 3 +/- 1% G418r BFU-E, 1 +/- 1% G418r CFU-GM, und 0 +/- 0% G418r CFU-MIX. Es wurde keine signifikante Verbesserung des Anteils von G418r-Kolonien auf CBD festgestellt, während eine leicht höhere Infizierug von BFU-E (6,0 +/- - 1%) auf 42 FN (3) beobachtet wurde. Intaktes FN hat jedoch einen verbesserten Gentransfer in alle determinierten Progenitoren gefördert. Der Prozentsatz von G418r- Kolonien nach der Infizierung war in allen Lineages auf intaktem FN geringer als auf 30/35 FN, einschliesslich BFU-E (16 +/- - 2 gegenüber 24 +/- 4%), CFU-GM (5 +/- 2 gegenüber 20 +/- 4%) und CFU-Mix (6 +/- 1 gegenüber 9 +/- 1%); jeweils bei intaktem FN gegenüber 30/35 FN.
  • ERLÄUTERNDES BEISPIEL 1
  • An rekombinante Fibronektinfragmente bindender Virus
  • 1.1. EXPERIMENT
  • Kimizuka et al., haben die Expression von geklonten FN-DNS-Sequenzen in E. Coli beschrieben (Kimizuka, F., Y. Taguchi, Y. Ohdate, Y. Kawase, T. Shimojo, D. Hashino, I. Kato, K. Sekiguchi und K. Titani, J. Biochem., Vol. 110, Seiten 284-291 (1991)). Geklonte und chimerische Peptide umfassen eine Sequenz oder eine Kombination von mehreren wichtigen Sequenzen in Fibronektin, von denen man weiss, dass sie an der Zellhaftung beteiligt sind (einschliesslich RGDS, CS-1 und Heparin-bindender Ort), siehe 4. Um zu analysieren, ob das Retrovirus an diese rekombinanten FN-Fragmente binden kann, wurden 3T3-Zellkolonie-Bildungs-Assays auf mit den rekombinanten Fragmenten C-274, H-271, H-296, CH-271, CH-296 und C-CS1 ebenso wie FN 30/35 als positive Kontrolle beschichteten Platten wiederholt, wobei zwei verschiedene Auflösungen (1 : 10 und 1: 100) des gefrorenen Retrovirus-TKNEO-Lagerbestands mit 1 × 104 infektiöser Partikel/ml benutzt wurden. Es wurden FN-Fragmente mit einer Konzentration von 120-130 pmol/cm2 (gleichwertig mit 4 μg/cm2 für C-274, H-271, H-296, C-CS 1, FN 30135 und 8 μg/cm2 für CH-271 und CH-296) benutzt. Kurz gesagt, wurden die Platten beschichtet, das Virus hinzugefügt, die Platten wurden ausführlich gewaschen, NIH/3T3-Zellen wurden während 24 Stunden hinzugefügt und dann während 10 Tagen in einem Selektionsmedium gezüchtet, und anschliessend wurden die Kolonien eingefärbt und gezählt.
  • 1.2. ERGEBNISSE
  • Die 5 zeigt, dass die Anzahl der G418-resisten Kolonien (und deshalb Virusadhäsion) bei den Fragmenten H-271, H-296, CH-271 und CH-296 erhöht wurde. Ausserdem zeigt sie, dass der Anteil der Virusbindung zwischen diesen rekombinanten Fragmenten und FN 30/35 annähernd vergleichbar war, obwohl in dieser Arbeit das CH-271-Fragment das höchste Virusbindungsniveau gezeigt hat. Allen diesen fünf FN-Fragmenten waren die Repeats 12-14 vom Typ III gemein, die den Hochaffinitäts-Heparinbindungsort umfassen (Ruoslahti, E., Ann. Rev. Biochem., Band 57, Seiten 375-413, (1988) und Kimizuka, F. Y. Taguchi, Y. Ohdate, Y. Kawase, T. Shimojo, K. Hashino, I. Kato, K. Sekiguchi und K. Titani, J. Biochem., Vol. 110, Seiten 284-291 (1991)), der möglicherweise im Repeat 13 liegt (Kimizuka, F. Y, Taguchi, Y. Ohdate, Y. Kawase, T. Shimojo, K. Hashino, I. Karo, K. Sekiguchi und K. Titani, J. Biochem., Vol. 110, Seiten 284-29l (1991)). Dies legt nahe, dass die Virusbindung mittels dieses bekannten Adhäsionsorts stattfindet. Das wurde durch vorinkubierte Schalen bewiesen, die mit 4 μg/cm2 CH-271 mit zunehmenden Konzentrationen (10-1000 μg/ml) Heparinsulfat, einem stark geladenen Molekül beschichtet wurden, das dafür bekannt ist, dass es die Zellbindung an den Heparinbindungsort hemmt. Wie es auf der 6 zu sehen ist, wird die Anzahl der G418-resistenten Kolonien nach der Vorinkubation von CH-271 mit zunehmenden Konzentrationen von Heparinsulfat verrringert. Diese Daten legen nahe, dass die Virusbindung an FN durch den unmittelbar an den CS-1-Ort angrenzenden, in Carboxyl-Terminal-Domänen von FN gelegenen Hochaffinitäts-Heparinbindungsort vermittelt wird.
  • ERLÄUTERNDES BEISPIEL 2
  • Fibronektin realisiert die Zelladhäsion durch mindestens drei Orte (7) : die Zellbindungsdomäne (CBD), die das Tetrapeptid RGDS im Repeat 10 mittels des Integrins VLA-5 enthält; die in den Typ III-Repeats 12-14 (III12-14) mittels Zelloberflächen-Proteoglykan-Moleküle enthaltene Heparin-bindende Domäne; und die CS 1-Sequenz in der alternativ gespleissten IIICS-Region mittels des Integrins VLA-4. In diesen Studien haben wir sechs in der 7 gezeigte chimerische rekombinante FN-Fragmente benutzt, die diese einzelnen Zelladhäsionsorte allein oder kombiniert enthalten.
  • FN-beschichtete Bakterienschalen wurden mit 200 cfu in 2 ml Überstand (SN) von der amphotropischen Verpackungszelllinie TKNeo inkubiert. Nach 30 Minuten bei 37°C wurden die Schalen dreimal mit PBS gewaschen und dann wurden 2000 NIH/3T3 (Fibroblast)-Zellen in 2 ml DMEM mit 10% Kalbserum (CS; Sigma, USA) und 2% P/S hinzugefügt. Am nächsten Tag wurden die Zellen in ein Selektionsmedium mit 0,75 mg/ml G418 hinzugefügt. 8 bis 10 Tage später wurden die Schalen mit Stat Stain (Volu-Sol, U. S. A.) eingefärbt und die G418r- Kolonien wurden gezählt. Bei diesem Assay bindet das Retrovirus nicht an unbeschichtete oder BSA-beschichtete Platten. Wie es auf der 8 gezeigt wird, findet der Gentransfer in die NIH/3T3-Zellen nur auf Fragmenten statt die die Heparin-II-bindende Domäne aufweisen, was in diesem Text auch als „ III12-14„ bezeichnet wird (H-271, CH-271, H-296, CH-296). Diese Daten zeigen, dass sich die Retroviruspartikel direkt an Sequenzen in den „ III12-14„-Repeats des Fibronektins binden. Die Infizierung von NIH/3T3-Zellen war verglichen mit FN-Fragmenten die nur „ III12-14 „ enthielten deutlich höher bei FN -Fragmenten die sowohl „ III12-14„ als auch CBD enthielten (vergleiche H-271 mit CH-271). Bemerkenswerterweise wurden bis zu 80 G418r NIH/3T3 Kolonien/Platten bei einer Eingabe von nur 200 NEO cfu/Platte erzeugt. Dahingegen zeigte eine Zugabe von CSI keine Wirkung auf die NIH/3T3-transduktion (H-271 gegenüber H-296, CH-271 gegenüber CH-296).
  • Um zu zeigen, dass der Mechanismus durch den ein verbesserter Retrovirus-vermittelter Gentransfer durch gleichzeitige Bindung von Retrovirus und Zielzellen an das Fragment stattfindet, wurden Assays ausgeführt, die eine nicht haftenden Zelllinie benutzten (HL60 – eine bekannte promyelozytische Leukämie-Zellinie). Die HL 60-Zellen wurden mit direkt fluorokonjugierten monoklonalen Antikörpern gegenüber VLA-4 (FITC; Immunotech, USA) und VLA-5 (PE, Antigenix America, U. S. A.) oder mit Isotypkontrollen für IgG1 und IgG2a (Becton Dickinson) eingefärbt. Die toten Zellen wurden durch Propidium-Iodin-Einfärbung ausgeschlossen. Die Zellen wurden dann auf einem FACScan (Becton Dickinson) analysiert. Für die Gentransferstudien wurden 104 HL 60-Zellen mit viralem Überstand aus der amphotropischen Verpackungszelllinie DAG (erhalten vom St. Jude's Children research Hospital, Memphis, TN, U. S. A.), die die extrazelluläre Domäne des Nervenwachstumsfaktor-Rezeptors (NGF-R) (Titer 105 cfu : ml) suspendiert und dann auf Bakterien-6-Lochplatten gegeben, die mit den 6 FN-Fragmenten mit einer Konzentration von 2 μg/cm2 beschichtet waren. Nach 4 Stunden wurden 2 ml konditionniertes Medium von den augenblicklichen Kulturen HL 60 hinzugefügt. 4 ml frischen Mediums (RPMI (Gibco) mit 5% FCS und 2% P/S) wurden nach 4 bis 5 Tagen hinzugefügt. Die Zellen durften während insgesamt 8 Tagen wachsen und wurde dann gegenüber NGF-R (Boehringer, U.S.A.) mit dem monolonalen Antikörper 8211 oder mit einer Isotyp IgG1- Kontrolle (Dako, USA) eingefärbt und dann mit einem sekundären FITC – konjugierten Gänse-Antimausserum (Boehringer) zur Reaktion gebracht. Die Proben wurden zum Ausschluss der Zellreste mit Propidium-Iodin (PI) inkubiert und anschliessend auf einem FACScan ausgemessen. Der Gentransfer wurde nach dem Ausblenden der lebenden Zellen durch eine Analyse der NGF-R-Expression gezeigt. Alle Gentransferstudien wurden ohne Polybrene oder Protamine ausgeführt. Wie es auf der 9 gezeigt ist, exprimieren HL 60-Zellen VLA-4 aber nicht VLA-5 in der Zytometrieanalyse (A + B). In Übereinstimmung mit den Expressionsdaten, haften HL 60-Zellen nur an Platten, die mit Fragmenten beschichtet sind, die CS1 (H-296, CH-296, C-CS1) enthalten. Wie es auf der 9 gezeigt ist, fand die genetische Transduktion von HL-60-Zellen nur auf Fragmenten statt, die in Kombination mit CS 1 (H-296, CH-296) „ III12-14„ enthielten. Obwohl HL-60-Zellen über ihr VLA-4-Integrin am C-CS1-Fragment haften, reduziert die Abwesenheit von „ III 12-14„ an dem die retrovirale Bindung stattfindet, drastisch die Transduktion von HL 60-Zellen.
  • In einer anderen Gruppe von Experimenten wurde die zunehmende Konzentration von Heparin (Sigma, USA, MW (Molekulargewicht) ungefähr 7000 bis 25000) mit hohem Molekulargewicht (HMW) in 2 ml Hanks ausgewogenen Salzlösung unter Zugabe von 2,5% (V/V) 1 M Hepes (HBSS/Hepes; alle von Gibco) aufgelöst und in, mit verschiedenen FN-Fragmenten in einer Konzentration von 4μg/cm2 beschichteten Bakterien 6-Loch-Platten zugefügt. Nach 30 Minuten wurden die Platten dreimal mit PBS gewaschen und anschliessend wurden 400 cfu/2ml amphotropischer TKNeo-Vektor hinzugefügt. Nach 30 Minuten bei 37°C wurden die Platten wieder mit PBS gewaschen und dann wurden 2000 NIH/3T3-Zellen in DMEM mit 10% CS und 2% P/S hinzugefügt. Die Selektion wurde wie oben angegeben ausgeführt und die Effizienz des Gentransfers wurde gemäss der Anzahl der G418r-Kolonien nach 8 bis 10 Tagen Kulturen beurteilt. In einer ähnlichen Gruppe von Experimenten wurde mit niedrigem Molekulargewicht (LMW) fraktioniertes Heparin (Sigma, U.S.A., MW etwa 3.000) bei zunehmender Konzentration in 2 ml HBSS/Hepes gelöst Der Versuchsaufbau war dann wie vorstehend beschrieben für das HMW Heparin. Die Gentransfereffizienz wurde als die Zahl der G418r Kolonien nach 8-10 Tagen angegeben. Alle diese Gentransferstudien wurden ohne Polybrene oder Protamine ausgeführt. Die Ergebnisse dieser Experimente wurden auf der 10 gezeigt. Wie gezeigt, kann die Bindung des Virus an FN in einer von der Dosis abhängigen Art durch hohes (10A) aber kein niedriges (10B) Molekulargewicht erreicht werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Retroviruspartikel an Sequenzen in III12-14 binden.
  • ERLÄUTERNDES BEISPIEL 3
  • Transduktion von NIH/3T3- und klonogene BM-Zellen bei Benutzung variierender Polybrene-Konzentrationen
  • In dieser Gruppe von Experimenten wurde gezeigt, dass vorteilhafte Transduktionsverfahren der Erfindung in Abwesenheit von Hexadimethrinbromid durchgeführt werden. Jeweils NIH/3T3 (Fibroblast)-Zellen und klonogene Knochenmarkzellen wurden TKNEO-Infizierungsprotokollen, wie es in den Referenzbeispielen 1 und 2 beschrieben ist, unterzogen, ausser dass der Vektor, die Zellen und die variierenden Konzentrationen von Polybrene zuerst zusammen suspendiert wurden, und dann auf ein mit dem FN-Fragment CH-296 (8μg/ml) beschichteten Substrat aufgetragen wurden. Die Assays wurden wie für diese Zelltypen vorher beschrieben ausgeführt. Die Ergebnisse werden in den 11 und 12 angegeben. Wie es auf der 11 gezeigt ist, nimmt die Anzahl der G418-resistenten NIH/3T3-Kolonien drastisch mit zunehmenden Polybrene-Konzentrationen von ungefähr 14 wenn kein Polybrene benutzt wurde bis zu ungefähr 4 wenn 12,5 μg/ml Polybrene benutzt wurden, ab. Auf ähnliche Weise zeigt die 12 dass ungefähr 40 Kolonien beobachtet wurden, wenn das Protokoll in Abwesenheit von Polybrene ausgeführt wurde, während der entsprechende Wert geringer als 15 war, wenn 10 μg/ml benutzt werden.

Claims (15)

  1. In vitro-Methode zum Erhalten einer transduzierten Population lebensfähiger Zellen durch ein Retrovirus, umfassend: das Infizieren der Zellen mit einem Retrovirus in Anwesenheit einer wirksamen immobilisierten Menge Material, um die Effizienz der Transduktion der Zellen durch das Retrovirus zu erhöhen, wobei das Material einen Liganden, der sich an die Zellen bindet, und einen Liganden, der sich an das Retrovirus bindet, enthält derart, dass das Retrovirus und die Zellen co-lokalisiert werden, wobei die Infizierung in einem Medium durchgeführt wird, das frei ist von polykationischem Mittel, das die Effizienz der Transduktion der Zellen durch das Retrovirus in einer Co-Kultur erhöht welches Mittel jedoch die Effizienz der Transduktion der Zellen durch das Retrovirus in Anwesenheit des Materials reduziert.
  2. Methode nach Anspruch 1, wobei die Zellen hämatopoetische Stammzellen umfassen.
  3. Methode nach Anspruch 1, wobei die Zellen Säugerzellen sind.
  4. Methode nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Zellen menschliche Zellen sind.
  5. Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Infektion zu einer Population lebensfähiger Zeilen führt, die mit einer höheren Effizienz transduziert werden als derjenigen, die in Anwesenheit des polykationischen Mittels erreicht werden würde.
  6. Methode nach Anspruch 5, wobei der Ligand, der das Retrovirus bindet ein Polypeptid mit einer Sequenz von: SEQ ID No 1 ist.
  7. Methode nach Anspruch 5, wobei die Zellen menschliche hämatopoetische Zellen sind und das Material ein Polypeptid ist das eine Aminosäuresequenz von: SEQ ID No 1 und eine Aminosäuresequenz von: SEQ ID No 2 enthält.
  8. Methode nach Anspruch 5, wobei die Zellen Säugerzellen sind und die Infektion in einem Medium durchgeführt wird, das von Retrovirus-Co-Erzeugerzellen frei ist.
  9. Verwendung von Zellen, die durch die Methode einem der Ansprüche 1-8 gemäß erzeugt werden, welche Zellen von dem polykationischen Mittel frei sind und das Material enthalten, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung beim Transplantieren einer lebensfähigen Säugerzellpopulation in einen Säuger.
  10. Lebensfähige Zellpopulation hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 1, welche Population von dem polykatonischen Mittel frei ist und das Material enthält.
  11. Zellzusammensetzung umfassend: eine im Wesentlichen in vitro retroviral transduzierte Population lebensfähiger Zellen, wobei die Zusammensetzung sowohl von retroviralen Erzeugerzellen als auch von polykationischem Mittel frei ist, das die Effizienz der Transduktion der Zellen durch das Retrovirus in Co-Kultur erhöht wobei die Zusammensetzung des Weiteren ein Material umfasst, das einen Liganden enthält, der sich an die Zellen bindet, und einen Liganden, der sich an das Retrovirus bindet.
  12. Zellzusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die lebensfähigen Zellen hämatopoetische Stammzellen umfassen.
  13. Verwendung einer Zellzusammensetzung nach den Ansprüchen 11 oder 12 bei der Verstellung eines Medikaments zur Verwendung bei Zelltransplantation.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Zellpopulation aus der gleichen Spezies wie der Säuger stammt.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Säuger ein Mensch und die Zellpopulation eine menschliche Zellpopulation ist.
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