CN113144199A - 与心血管疾病诊疗和防治相关的靶点zip7及其应用 - Google Patents

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CN113144199A
CN113144199A CN202110455493.8A CN202110455493A CN113144199A CN 113144199 A CN113144199 A CN 113144199A CN 202110455493 A CN202110455493 A CN 202110455493A CN 113144199 A CN113144199 A CN 113144199A
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徐哲龙
张华璐
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Abstract

本发明公开了与心血管疾病诊疗和防治相关的靶点ZIP7及其应用，抑制或沉默ZIP7基因表达或抑制ZIP7蛋白活性的物质在如下任一种中的应用：制备增加线粒体内锌离子浓度的药物；制备使线粒体膜电位降低的药物；制备增加PINK1在线粒体聚集的药物；制备增加Parkin在线粒体聚集的药物；制备诱导线粒体自噬的药物；制备降低心肌组织活性氧释放水平的药物；制备降低心梗风险的药物；制备治疗或辅助治疗心梗的药物；制备改善心梗后心脏功能的药物；制备抑制心梗后梗死面积扩大的药物；制备抑制心梗后心室负性重构的药物；制备减少心肌梗死过程中心肌细胞和心肌组织的损伤的药物；制备减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量的药物。

Description

与心血管疾病诊疗和防治相关的靶点ZIP7及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及与心血管疾病诊疗和防治相关的靶点ZIP7及其应用。
背景技术
急性心梗引起的心肌缺血损伤在临床上非常常见并且其后果非常严重，经常会导致心肌坏死，心律失常，心功能不全，心力衰竭乃至死亡。近年来心肌缺血损伤的研究取得了很大进展，已有很多实验研究证明不少药物能够减轻缺血损伤，但临床效果甚微。这主要是因为在大部分实验研究中，在缺血发生之前进行药物投入(预处理)，这显然和实际临床情况不符，因为在临床上大部分患者赶到急诊室之前已经发生梗塞，预处理已不可能。因为再灌注治疗(开通梗塞相关血管)在挽救濒死心肌的同时也加重缺血心肌的损伤，即再灌注损伤，在再灌注开始时投入并有效地减轻再灌注损伤的药物能够应用于临床治疗上。到目前为止有几种药物已在动物实验中被证明在再灌注时投入有效，但临床试验结果均不理想。究其原因，我们还不完全了解再灌注损伤的发病和保护机制。
研究表明，线粒体ROS的大量产生是心肌缺血再灌注损伤的最重要的原因之一，其最重要的攻击对象为线粒体本身，而受损的线粒体更容易产生ROS，形成恶性循环，导致细胞损伤。因此，及时清除受损的线粒体以减少ROS产生将有利于保护缺血再灌心脏。目前认为，线粒体自噬(mitophagy)是选择性地清除受损线粒体的最有效方式之一，它可通过定向清除受损的线粒体来限制ROS的大量产生，从而保护细胞。越来越多的研究表明，线粒体自噬在心肌缺血再灌注损伤中起到重要保护作用，但尚无诱导线粒体自噬的药物或手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种抑制ZIP7蛋白活性的物质的应用。
本发明是通过以下技术方案予以实现：
抑制ZIP7蛋白活性的物质在如下1)-13)中任一种中的应用：
1)制备增加线粒体内锌离子浓度的药物；
2)制备使线粒体膜电位降低的药物；
3)制备增加PINK1在线粒体聚集的药物；
4)制备增加Parkin在线粒体聚集的药物；
5)制备诱导线粒体自噬的药物；
6)制备降低心肌组织活性氧释放水平的药物；
7)制备降低心梗风险的药物；
8)制备治疗或辅助治疗心梗的药物；
9)制备改善心梗后心脏功能的药物；
10)制备抑制心梗后梗死面积扩大的药物；
11)制备抑制心梗后心室负性重构的药物；
12)制备减少心肌梗死过程中心肌细胞和心肌组织的损伤的药物；
13)制备减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量的药物。
本发明还提供了一种抑制或沉默ZIP7基因表达的物质的应用。
本发明是通过以下技术方案予以实现：
抑制或沉默ZIP7基因表达的物质在如下1)-13)中任一种中的应用：
1)制备增加线粒体内锌离子浓度的药物；
2)制备使线粒体膜电位降低的药物；
3)制备增加PINK1在线粒体聚集的药物；
4)制备增加Parkin在线粒体聚集的药物；
5)制备诱导线粒体自噬的药物；
6)制备降低心肌组织活性氧释放水平的药物；
7)制备降低心梗风险的药物；
8)制备治疗或辅助治疗心梗的药物；
9)制备改善心梗后心脏功能的药物；
10)制备抑制心梗后梗死面积扩大的药物；
11)制备抑制心梗后心室负性重构的药物；
12)制备减少心肌梗死过程中心肌细胞和心肌组织的损伤的药物；
13)制备减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量的药物。
优选的，所述改善心梗后心脏功能体现在如下a1)-a6)中任一种：
a1)减轻心梗后心脏功能性指标的下降程度；
a2)减轻心梗后心室扩张指标的升高程度；
a3)减轻心梗后心室纤维化程度；
a4)减轻心梗后室壁变薄程度；
a5)减轻心梗后室腔扩张程度；
a6)提高心梗后生存率。
优选的，所述诱导线粒体自噬，体现在如下b1)-b4)中任一种：
b1)增加PINK1在线粒体上的聚集；
b2)增加Parkin在线粒体上的聚集；
b3)上调线粒体LC3-2/LC3-1的比值；
b4)使线粒体膜电位下降。
优选的，所述抑制ZIP7蛋白活性的物质为抑制ZIP7蛋白合成或促进ZIP7蛋白降解或抑制ZIP7蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物；
或，所述抑制或沉默ZIP7基因表达的物质为干扰ZIP7基因表达的RNA或敲除、敲低或突变ZIP7基因的物质。
本发明还提供了一种药物。
本发明是通过以下技术方案予以实现：
一种药物，其活性成分为抑制ZIP7蛋白活性的物质或抑制或沉默ZIP7基因表达的物质；
所述药物的功能体现在如下c1)-c13)中任一种：
c1)增加线粒体内锌离子浓度；
c2)使线粒体膜电位降低；
c3)增加PINK1在线粒体聚集；
c4)增加Parkin在线粒体聚集；
c5)诱导线粒体自噬；
c6)降低心肌组织活性氧释放水平；
c7)降低心梗风险；
c8)治疗或辅助治疗心梗；
c9)改善心梗后心脏功能；
c10)抑制心梗后梗死面积扩大；
c11)抑制心梗后心室负性重构；
c12)减少心肌梗死过程中心肌细胞和心肌组织的损伤；
c13)减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量。
优选的，所述改善心梗后心脏功能的体现在如下a1)-a6)中任一种：
a1)减轻心梗后心脏功能性指标的下降程度；
a2)减轻心梗后心室扩张指标的升高程度；
a3)减轻心梗后心室纤维化程度；
a4)减轻心梗后室壁变薄程度；
a5)减轻心梗后室腔扩张程度；
a6)提高心梗后生存率，
或，所述诱导线粒体自噬体现在如下b1)-b4)中任一种：
b1)增加PINK1在线粒体上的聚集；.
b2)增加Parkin在线粒体上的聚集；
b3)上调线粒体LC3-2/LC3-1的比值；
b4)使线粒体膜电位下降。
优选的，所述抑制ZIP7蛋白活性的物质为抑制ZIP7蛋白合成或促进ZIP7蛋白降解或抑制ZIP7蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物；
或，所述抑制或沉默ZIP7基因表达的物质为干扰ZIP7基因表达的RNA或敲除、敲低或突变ZIP7基因的物质。
ZIP7蛋白作为靶点在开发或设计治疗心血管疾病的药物中的应用。
本发明的有益效果是：
通过抑制或沉默ZIP7基因表达或抑制ZIP7蛋白活性促进线粒体自噬并防止线粒体来源的ROS的产生，清除受损线粒体，减轻心肌氧化应激，从而有效保护缺血再灌注心脏，鉴于线粒体来源的氧化应激也是引起其他很多心血管疾病的重要原因，因此可应用于治疗急性心肌梗死引起的缺血再灌注损伤或其他心血管疾病。
附图说明
图1是本发明实施例中生理条件下敲除ZIP7诱导自噬和线粒体自噬实验结果示意图，其中图1a为生理条件下敲除ZIP7(KO)对H9c2细胞中P62、TOM20和LC3II蛋白表达的影响，图1b为免疫印迹实验检测在生理条件下ZIP7 siRNA对H9c2细胞中TOM20表达的影响，图1c为心脏特异性敲除ZIP7(ZIP7 cKO)后对线粒体自噬的影响，检测正常条件下小鼠体内心脏中TOM22、TOM20和LC3II蛋白的表达；
图2是本发明实施例中缺氧/复氧(H/R)或缺血/再灌注(I/R)上调ZIP7的表达实验结果示意图，其中图2a为H9c2细胞缺氧4小时/复氧2小时后ZIP7表达上调，图2b为离体大鼠心脏缺血30分钟再灌注60分钟ZIP7表达上调，图2c为小鼠在体心脏缺血45分钟(I45’)，再灌注10或30分钟(I/R10’或I/R30’)后ZIP7表达情况；
图3是本发明实施例中敲除ZIP7诱导H/R或I/R时线粒体自噬实验结果示意图，其中图3a为免疫印迹实验检测缺氧4h/复氧2h H9c2细胞中ZIP7和TOM20的表达，图3b为心脏特异性敲除ZIP7(ZIP7 cKO)小鼠心脏缺血45分钟(I45’)和再灌注10分钟(I/R10’)后TOM22和TOM20表达情况，图3c为敲除ZIP7后H9c2细胞生理条件下和缺氧/复氧条件下线粒体自噬的变化，用流式细胞仪或共聚焦显微镜分析线粒体自噬情况，左图为流式散点图，中间为量化数据统计，右边为小鼠心肌细胞，图3d为心脏特异性敲除ZIP7(ZIP7 cKO)对小鼠在体心脏缺血45分钟(I45’)和再灌注10分钟(I/R10’)后线粒体自噬的影响，用共聚焦显微镜对转染了mitoQC质粒的心脏切片进行线粒体自噬分析，mitoQC质粒经尾静脉注射(17μg)，比例尺:30μm；
图4为本发明实施例中敲除ZIP7增加线粒体PINK1和Parkin的聚集实验结果示意图，其中，图4a为蛋白免疫印迹分析正常条件下H9c2细胞线粒体中Parkin和LC3的表达，图4b,为小鼠心肌细胞共定位分析，心肌细胞用Mitotracker Red标记，Parkin和PINK1用抗体进行免疫标记，比例尺:20μm，图4c为蛋白免疫印迹分析生理条件下小鼠心脏线粒体中Parkin、PINK1和LC3的表达；
图5为本发明实施例中敲除ZIP7增加线粒体中Zn2+导致线粒体去极化实验结果示意图，其中，图5a为用共聚焦显微镜检测ZIP7在小鼠心肌细胞线粒体中的表达，Mitotracker Red标记心肌细胞线粒体，ZIP7用抗体进行免疫标记，用共聚焦显微镜成像，比例尺:20μm，图5b为Zinpyr-1荧光染料标记小鼠心肌细胞Zn2+，Mitotracker标记线粒体，共聚焦成像，比例尺:20μm，图5c为小鼠心脏线粒体蛋白免疫印迹(左)和共聚焦显微镜成像(右)检测ZIP7在线粒体中的表达，Mitotracker Red标记心肌细胞线粒体，ZIP7用抗体进行免疫标记，用共聚焦显微镜成像，比例尺:30μm，小鼠心肌缺血45min，再灌注10min(I/R10’)后分离并提取线粒体蛋白。图5e为采用电感耦合等离子体光学发射光谱法(ICPOES)测定小鼠心脏线粒体Zn2+水平，小鼠心脏缺血45min，再灌注10min(I/R10’)，sham,假手术组，不进行I/R，图5f为线粒体膜电位(MMP)检测，将H9c2细胞或小鼠心肌细胞分别用JC-1或TMRE染色，共聚焦显微镜成像分析；
图6为敲除ZIP7减少再灌注时线粒体ROS的产生，并减少在体小鼠心脏的心肌梗死面积实验结果示意图，其中，图6a为小鼠心脏切片DHE染色评估再灌注时ROS的产生，小鼠心脏缺血45min，再灌注10min(I/R10’)，sham,假手术组，不进行I/R，比例尺:30μm，图6b为通过MitoB氧化来评估体内再灌注时线粒体ROS的产生，小鼠心脏缺血45min，再灌注10min(I/R10’)，虚假的,没有I/R，图6c为TTC染色评估心肌梗死面积，小鼠心脏缺血45min，再灌注2h，顶部代表心脏染色切片，底部为心肌梗死面积的测定，图6d模式图显示了ZIP7上调如何抑制线粒体自噬导致心肌缺血/再灌注损伤。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
锌是维持人体正常细胞结构和功能所必需的微量元素。大多数锌与蛋白结合，在许多新陈代谢中起重要作用，其稳态受到许多蛋白尤其是锌转运蛋白的严密调控。哺乳动物的锌转运体分为两大家族：ZnT(SLC30)和Zip(SLC39)锌转运体。在锌稳态调控中，ZnT和ZIP转运蛋白起相反作用，ZnT家族协助锌离子从细胞浆流出到细胞外或转运到细胞器内以减少细胞浆中游离锌浓度；而ZIP转运蛋白促进细胞器或细胞外的锌进入细胞浆而增加胞浆中锌浓度。
线粒体作为心肌细胞的能量工厂，不仅通过三羧酸循环和氧化磷酸化(OXPHOS)进行能量转换，也是细胞内ROS的主要来源之一。ROS是正常氧化磷酸化的副产物，特别是在电子传递链复合体Ⅰ和Ⅲ中。同时ROS也是重要的细胞内信号物质，调节细胞的分化、生长、死亡和衰老。近年来研究表明，过量的ROS会破坏细胞脂质、蛋白质和DNA，通过多种信号通路对细胞内大分子物质和线粒体造成氧化损伤。研究表明，线粒体ROS的大量产生是心肌缺血再灌注损伤的最重要的原因之一，其最重要的攻击对象为线粒体本身，而受损的线粒体更容易产生ROS，形成恶性循环，导致细胞损伤。因此，及时清除受损的线粒体以减少ROS产生将有利于保护缺血再灌心脏。
近年来研究表明，自噬及线粒体自噬与心肌缺血/再灌注损伤密切相关。自噬通过在细胞内形成具有双层膜结构的自噬小体，进一步包裹受损和衰老的蛋白或亚细胞结构，随后运输到溶酶体内，进而发生降解并循环利用。而选择性降解线粒体的过程，即为线粒体自噬。目前研究较深入的是PINK1/Parkin线粒体自噬通路。当线粒体受损时，线粒体膜电位会降低，并发生去极化，此时定位在线粒体外膜的PINK1蛋白会增加，并进一步招募细胞浆游离的Parkin蛋白聚集在线粒体外膜，从而诱导线粒体自噬。
锌转运蛋白ZIP7存在于细胞亚器上，它的作用是通过释放细胞亚器的锌离子来增加细胞浆锌离子浓度(使细胞亚器的锌离子浓度减少)。发明人通过研究发现，锌转运蛋白ZIP7存在于心肌细胞线粒体上，因此其表达水平或活性的变化会导致线粒体膜电位的改变，即ZIP7表达水平或活性下降会导致线粒体内锌离子浓度升高，反之亦然。由于线粒体膜电位是内负外正，线粒体内锌离子浓度升高会使线粒体发生去极化，进而诱导线粒体自噬的发生。发明人利用这个原理，通过敲降或敲除ZIP7基因的方法观察其对线粒体自噬(在生理条件下和缺血再灌注损伤时)的影响，以此评价ZIP7蛋白在心肌缺血再灌注损伤中的作用。发明人在细胞和在体心脏缺血再灌注模型上利用心肌特异性ZIP7基因敲除细胞和心脏评价其对线粒体自噬，线粒体ROS产生以及心肌梗死的影响。
研究对象：细胞实验使用大鼠心房肌来源的H9c2细胞系和ZIP7基因敲除的H9c2细胞系，动物实验使用8-10周龄的野生型C57BL/6小鼠(WT)和心脏特异性ZIP7基因敲除的C57BL/6小鼠(cKO)。
1、研究方法：
建立H9c2细胞缺氧复氧(H/R)损伤模型
用无葡萄糖的DMEM培养基代替正常的DMEM细胞培养基，将细胞置于缺氧箱内(1％O2)培养4小时,然后换成含10％血清的正常DMEM培养基，置于含5％CO2的37度细胞培养箱内继续培养2小时。
2、建立小鼠在体急性心肌缺血再灌注损伤模型
用戊巴比妥钠麻醉雄性小鼠(8-10周)，行气管切开插管。打开胸腔后，用7号线包绕左冠状动脉前降支，然后穿过一个小塑料管。将导管紧靠心脏表面引起局部缺血。所有心脏行冠状动脉左前降支阻断45分钟，分不同时间节点进行再灌注，假手术组7号线置于左前降支下，不阻断左前降支。
3、小鼠心肌梗死面积测量
用埃文斯蓝和三苯基四唑(TTC)双染色法测定再灌注结束时心肌梗死面积。将心脏切片后，用1％TTC 37℃孵育20分钟，10％福尔马林室温固定。用Image J在单盲模式下测量梗死面积，并以危险区域的百分比表示。
4、成年小鼠心肌细胞分离
雄性C57BL/6小鼠(8-10周)用戊巴比妥钠麻醉后，迅速取出心脏，并通过导管连接到主动脉，安装在Langendorff灌流装置上。用灌注缓冲液(12NaCl,0.54KCl,0.12NaH2PO4,0.56Glucose,2NaHCO3,480MgSO4,5牛磺酸，102,3-丁二酮单肟，单位mM)恒压灌注心脏4-5分钟。流速2-4mL/分钟。当水槽中剩余约10ml灌注缓冲液时，灌注胶原蛋白30mg和蛋白酶0.6mg。2分钟后，将水槽中剩余的缓冲液丢弃。6.4μL 0.25M CaCl2灌注心脏15-20分钟，之后将心脏剪下，剪成2片。
然后用移液管反复吹打心脏，直到组织分散。将分散的细胞悬液用100目筛网过滤，并转移到50毫升离心管，500rpm，离心1分钟。弃上清,将细胞沉淀用7毫升的缓冲液(包含5.6μL 0.25氯化钙和0.7毫升牛牛血清)重悬后静置10分钟。重复这个步骤两次。最后用M199培养基重悬细胞，接种于提前用层粘连蛋白包被的培养皿中，在37℃培养箱中培养。3-4小时后，更换新的M199细胞培养基，然后放入培养箱中继续培养。
5、体外siRNA和质粒转染
对于H9c2细胞用Lipofectamine RNAiMAX试剂(Invitrogen)转染ZIP7siRNA(Sigma)，用Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen)转染质粒，按照说明书操作。所有实验均在转染48h后进行。
6、siRNA的体内转染
雄性C57BL/6小鼠(8-10周)用29号针头通过尾静脉注射PINK1 siRNA或ZiP7siRNA均提前溶解在200μL生理盐水(0.9％NaCl)中。第一次注射后8、24h重复注射。第一次注射后48h进行实验。对照组注射生理盐水(0.9％NaCl)。
7、免疫印迹分析
等量的蛋白质裂解液进行凝胶电泳，然后将蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜孵育一抗，4℃过夜。使用的一抗如下:抗zip7、抗p62、抗lc3、抗tom20、抗tom22、抗cox IV、抗gapdh、抗Tubulin、抗parkin、抗pink1、抗calnexin。每个一抗均与兔或鼠二抗结合。用增强化学发光法(ECL)对蛋白质进行可视化观察。
8、免疫荧光染色
活细胞或组织切片用200nM MitoTracker Red CMXRos(Invitrogen)在37℃条件下预孵育30分钟。然后，样品用4％多聚甲醛室温固定，之后用0.1％Triton-×100膜通透，用正常山羊血清(1:10)封闭，37℃50分钟。然后将样品与抗PINK1(1:100,Novus)、ZIP7(1:100,Invitrogen)和Parkin(1:100,Santa cruz)的一抗孵育，4℃过夜。PBS洗涤后，用二抗(抗兔IgG488或抗鼠IgG 488,1:100,Invitrogen)室温作用1-2h。PBS洗涤后，用DAPI(Beyotime)染细胞核。样品用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1000)成像。
9、线粒体膜电位的测定
JC-1荧光探针检测线粒体膜电位(MMP)。细胞用JC-1(5mg/ml)染色，37℃20分钟，之后细胞用PBS洗2次。用FACSVERSE流式细胞仪检测细胞的JC-1荧光强度(BDBiosciences,CA,USA)。JC-1单体的绿色荧光通过488nm的滤光片进行成像，而JC-1聚合体的红色荧光通过559nm的滤光片进行成像。通过红绿荧光比值进行定量。
10、心脏活性氧测定
用二氢乙缇(DHE)检测心脏ROS的产生。实验后，心脏用4％多聚甲醛固定。然后，OCT包埋组织，液氮快速冷冻。组织在低温恒温器上以14μm厚度切片，置于玻片上。然后用5μM DHE在37℃下避光孵育15分钟。PBS洗涤后，用共聚焦显微镜(Olympus,FV1200)拍摄图像。
11、体内线粒体过氧化氢(H2O2)水平的测定
用MitoB探针测定活小鼠的过氧化氢(H2O2)水平。MitoB可靶向于线粒体基质，并被线粒体H2O2氧化为MitoP。通过高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对MitoB和MitoP进行定量。MitoP/MitoB比值可反映线粒体H2O2水平。在缺血再灌注手术前3小时，雄性C57BL/6小鼠(8-10周)尾静脉注射MitoB(0.8μmol/kg)。术后，心脏在液氮中快速冷冻，-80℃保存，用于后续提取和定量MitoB和MitoP。心脏组织用500μL 60％ACN/0.1％FA匀浆，以提取MitoB和MitoP。匀浆中加入同位素IS(100pmol的d15-MitoB和50pmol的d15-MitoP)，涡旋30s,16000g离心10min。将上清液转移到新鲜试管中，再用500μL 60％ACN/0.1％FA匀浆，与第一个上清液混合。然后将上清液以16000g离心10分钟，通过0.22μm PVDF过滤器过滤到新鲜管中。样品在真空下用Savant SpeedVac干燥2-3小时。干燥后的样品在150μL 20％ACN/0.1％FA中通过涡流重悬5分钟。最后，样品在16000g离心10分钟，120μL转移到自动取样瓶。然后用LC-MS/MS对样品进行分析。
12、线粒体分离
用细胞线粒体分离试剂盒或组织线粒体分离试剂盒(Beyotime,Shanghai,China)通过差速离心分离线粒体。取小鼠心脏缺血再灌注后的心肌组织进行线粒体分离。
13、细胞内游离锌的测定
ZinPyr-1是一种细胞通透性锌荧光探针。根据说明书，用ZinPyr-1(5μM,ChemCruz)检测小鼠心肌细胞中的游离锌浓度。用共聚焦显微镜测定荧光。
14、心肌组织线粒体Zn2+浓度的测定
心肌组织线粒体称重，用1mL 65％硝酸(HNO3)在120℃下消化30min，室温冷却15min后，用去离子水稀释。采用电感耦合等离子体光学发射光谱(ICPOES,Perkin Elmer,USA)对波长为206.200nm的Zn2+浓度进行定量。采用多元素标准溶液(美国Perkin Elmer)建立Zn2+浓度标准曲线。
15、体内线粒体自噬的检测
小鼠经尾静脉注射17μg mito QC质粒(MRC PPU)后行心肌缺血再灌注手术。实验结束后，用PBS经心灌注，直到血液清澈，切换为含3.7％甲醛的200mM HEPES，pH 7.0(第一天或前24小时新鲜，4℃保存)。迅速取下心脏，用含3.7％甲醛的200mM HEPES固定组织，4℃过夜。之后用PBS洗涤组织，然后用30％的蔗糖脱水(4℃)。心脏放入包埋剂中，在液氮中快速冷冻。组织在低温恒温器上以8μm厚度切片，置于玻片上。PBS冲洗后，用DAPI染色。用共聚焦显微镜拍摄图像。
16、mKeima法检测线粒体自噬
用mKeima-Red-Mito-7质粒(Addgene,56018)转染H9c2细胞48小时。质粒转染如前所述。用胰蛋白酶消化细胞后，PBS洗涤细胞两次，并300目筛网过滤细胞悬液。荧光检测采用FACSVERSE流式细胞仪(BD Biosciences,CA,USA)。分别在488nm(pH值7)和561nm(pH值4)激光(发射滤光片527/32nm和586/42nm)下进行荧光测量。
研究结果：
1、生理条件下，敲除ZIP7可诱导自噬和线粒体自噬。
再灌注开始后ROS会大量爆发，特别是来自线粒体的ROS已被证实是心肌再灌注损伤的关键因素，但临床上通过清除ROS来预防再灌注损伤并没有达到很好的疗效。因为受损的线粒体会促进ROS的产生，最近，有研究人员提出通过线粒体自噬选择性地消除受损的线粒体可能是防止线粒体过度产生ROS的有效策略。
为此，我们首先确定了敲除ZIP7对正常条件下H9c2细胞和小鼠心脏线粒体自噬的影响。敲除ZIP7后，H9c2细胞中TOM20和P62表达降低，LC3II表达增加，表明ZIP7负调控线粒体自噬和自噬(图1a)。同样，使用siRNA敲降ZIP7后TOM20的表达显著降低了(图1b)。此外，心脏特异性敲除ZIP7基因(ZIP7 cKO)后TOM20和TOM22的表达降低，但LC3 II的表达增加表明小鼠心脏的线粒体自噬增强(图1c)。
2、缺氧/复氧(H/R)或缺血/再灌注(I/R)可上调ZIP7的表达。
由于生理条件下敲除ZIP7可诱导线粒体自噬，因此有可能再灌注时ZIP7表达的改变可导致线粒体自噬状态的改变。因此，我们检测了缺血/再灌注(I/R)是否改变ZIP7的表达。缺氧/复氧(H/R)(H9c2细胞，图2a)和I/R(离体大鼠心脏，图2b)均显著增加了ZIP7的表达。特别是，在缺血结束时(45分钟)ZIP7上调，并在心脏再灌注开始10分钟后进一步升高(图2c)。这些结果促使我们提出假设，再灌注时ZIP7上调可能通过调节的线粒体自噬发挥作用。
3、敲除ZIP7可诱导H/R或I/R时线粒体自噬。
为了证明上述假设，我们研究了敲除ZIP7对复氧或再灌注时线粒体自噬的影响。在H9c2细胞中，从TOM20的降低可以看出，敲除ZIP7不仅在生理条件下增强了线粒体自噬，也增强了H/R时的线粒体自噬(图3a)，这表明再灌注时ZIP7的上调可能导致了线粒体自噬的抑制。与对照组相比，野生型小鼠心肌缺血再灌注10分钟后ZIP7、TOM20、TOM22表达显著增加，而ZIP7cKO鼠ZIP7、TOM20、TOM22表达显著下降(图3b),表明在再灌注时线粒体自噬被抑制，而再灌注时ZIP7表达的上调可能进一步抑制线粒体自噬。
为了证实这一假设，我们接下来用mKeima评估了线粒体自噬，mKeima是一种敏感和定量的荧光团，可以检测H9c2细胞或小鼠心肌细胞中的线粒体自噬。H/R时正常H9c2细胞线粒体自噬没有变化，而ZIP7敲除的细胞中线粒体自噬显著增加(左，图3c)。进一步实验发现，ZIP7 cKO小鼠心肌细胞线粒体自噬增强(右，图3c)。
为了证实ZIP7在体状态下对线粒体自噬的影响，我们将线粒体靶向串联GFP-mCherry质粒(mitoQC)注入小鼠体内，并测量其荧光强度。MitoQC是一种pH敏感的线粒体荧光探针，在正常条件下显示红色和绿色荧光，但当受损的线粒体被溶酶体吞噬后，溶酶体内的酸性环境导致GFP绿色信号淬灭，只保留mCherry红色信号。如图3d所示，缺血45分钟后再灌注10分钟并不改变线粒体自噬。与对照组相比，ZIP7 cKO组在再灌注开始10分钟后线粒体自噬显著增强，提示ZIP7是线粒体自噬的抑制因子。
由于在再灌注时ZIP7上调(图2c和图3b)，因此有理由认为再灌注时上调ZIP7可能抑制线粒体自噬。鉴于抑制线粒体自噬可促进心肌细胞在再灌注时死亡，上调ZIP7抑制线粒体自噬可能有助于再灌注损伤的发生。
4、敲除ZIP7可增加线粒体PINK1和Parkin的聚集。
线粒体自噬是由PINK1-Parkin通路调控的。在健康的线粒体中，PINK1蛋白被导入线粒体并通过蛋白水解途径降解。线粒体损伤或去极化导致外膜上的PINK1因无法正常降解而聚集在线粒体外膜，此时PINK1会招募细胞浆游离的Parkin定位于线粒体。然后，Parkin诱导线粒体蛋白泛素化，以清除受损的线粒体。
为了验证该通路是否参与ZIP7抑制线粒体自噬，我们检测了H9c2细胞线粒体中Parkin和LC3II蛋白的水平。敲除ZIP7显著增加了细胞线粒体Parkin和LC3II，表明敲除ZIP7通过招募Parkin聚集到线粒体诱导线粒体自噬(图4a)。为了证实这些观察结果，我们随后用从体内小鼠心脏分离的线粒体进行了实验。与上述结果类似，ZIP7 cKO再次增加了线粒体Parkin、PINK1和LC3II的表达(图4c)。同样，免疫荧光结果显示分离的ZIP7 cKO小鼠心肌细胞中Parkin和PINK1的线粒体积累增加(图4b)。这些数据表明，敲除ZIP7通过PINK1-Pakin途径促进线粒体自噬。另外，在再灌注时，ZIP7的上调可能通过抑制Parkin的募集来抑制线粒体自噬。
5、ZIP7定位于线粒体，敲除ZIP7可增加线粒体中Zn2+导致线粒体去极化。
早期研究报道ZIP7主要定位于高尔基体和内质网。然而，最近的一项研究表明，ZIP7也定位于H9c2细胞和大鼠心肌细胞的线粒体。我们通过细胞免疫荧光技术证实了ZIP7定位于小鼠心肌细胞线粒体，ZIP7 cKO小鼠线粒体Zn2+显著增加(图5a和b)。免疫印迹实验和共焦成像证实ZIP7存在于从小鼠心脏分离的线粒体中(图5c)。
此外，我们发现小鼠心脏再灌注10分钟后线粒体ZIP7也增加了(图5d)。这些数据表明，ZIP7可能在再灌注时调节线粒体Zn2+水平。通过对线粒体内锌离子检测我们发现，与对照组相比I/R导致小鼠心脏线粒体中锌离子丢失，而ZIP7 cKO小鼠I/R后线粒体内锌离子水平正常(图5e)。
由于ZIP7可将细胞器内的Zn2+转运到细胞浆，因此，敲除或使ZIP7失活将导致Zn2+在线粒体内的积累。
由于Zn2+是一种阳离子，其在线粒体中的积累将导致线粒体去极化，这可能通过促进PINK1在线粒体外膜上的定位而诱导线粒体自噬。相反，ZIP7上调触发线粒体释放Zn2+会导致线粒体超极化或减少去极化状态，从而阻碍PINK1在线粒体聚集，抑制线粒体自噬。
进一步的研究表明，在H9c2细胞中，敲除ZIP7导致JC-1的聚合体/单体比例显著降低(左，图5f)，表明敲除ZIP7导致线粒体膜电位(MMP)降低。同样，ZIP7 cKO小鼠心肌细胞TMRE荧光强度降低，表明线粒体发现去极化，线粒体膜电位降低(右，图5f)。
6、敲除ZIP7可防止再灌注时线粒体ROS的产生，并减少在体小鼠心脏的心肌梗死面积。
线粒体自噬最重要的作用之一是通过消除功能障碍的线粒体来防止氧化应激。因此，在再灌注时ZIP7可能通过抑制线粒体自噬来调节ROS的产生。小鼠心脏切片染色显示，与对照组相比I/R时二氢乙缇(dihydroethidium,DHE)的荧光强度增加，提示ROS的产生显著增加，而ZIP7 cKO组荧光强度不增加(图6a)，这表明再灌注时ZIP7上调可通过抑制线粒体自噬来增加ROS的产生。
为了进一步证实ZIP7通过控制线粒体自噬来调控ROS的产生，我们利用MitoB在体检测小鼠心脏线粒体H2O2的含量。MitoB是一种靶向定位于线粒体的H2O2光谱探针，用来在体测定线粒体H2O2的浓度。结果显示，与对照组相比，I/R增加了线粒体H2O2含量，表现为MitoP/MitoB比率的增加，而ZIP7cKO组逆转了这一趋势(图6b)。
这一结果使我们确信，敲除ZIP7可通过增强线粒体自噬来阻止再灌注时线粒体ROS的产生。
由于功能障碍的线粒体产生过多的ROS是心脏再灌注损伤的主要决定因素，线粒体自噬消除功能失调的线粒体被认为具有心脏保护作用。
因此，我们有理由推测ZIP7表达的改变可能在心肌I/R损伤中起作用。与我们的假设一致，小鼠心肌梗死面积实验显示，与对照组相比，ZIP7 cKO或ZIP7 siRNA组心肌梗死面积显著减少(图6c)。为了证实PINK1/Parkin在ZIP7调控线粒体自噬中的作用，我们测试了PINK1 siRNA是否改变ZIP7cKO的保护作用。如图6c所示，ZIP7 cKO的抗梗死作用被PINK1siRNA逆转。
这些数据表明，ZIP7的上调可能通过抑制线粒体自噬而导致I/R引起的心肌梗死，从而下调ZIP7的表达或使其失活可能是治疗急性心肌梗死等心血管疾病的一种有效策略。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.抑制ZIP7蛋白活性的物质在如下1)-13)中任一种中的应用：
1)制备增加线粒体内锌离子浓度的药物；
2)制备使线粒体膜电位降低的药物；
3)制备增加PINK1在线粒体聚集的药物；
4)制备增加Parkin在线粒体聚集的药物；
5)制备诱导线粒体自噬的药物；
6)制备降低心肌组织活性氧释放水平的药物；
7)制备降低心梗风险的药物；
8)制备治疗或辅助治疗心梗的药物；
9)制备改善心梗后心脏功能的药物；
10)制备抑制心梗后梗死面积扩大的药物；
11)制备抑制心梗后心室负性重构的药物；
12)制备减少心肌梗死过程中心肌细胞和心肌组织的损伤的药物；
13)制备减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量的药物。
2.抑制或沉默ZIP7基因表达的物质在如下1)-13)中任一种中的应用：
1)制备增加线粒体内锌离子浓度的药物；
2)制备使线粒体膜电位降低的药物；
3)制备增加PINK1在线粒体聚集的药物；
4)制备增加Parkin在线粒体聚集的药物；
5)制备诱导线粒体自噬的药物；
6)制备降低心肌组织活性氧释放水平的药物；
7)制备降低心梗风险的药物；
8)制备治疗或辅助治疗心梗的药物；
9)制备改善心梗后心脏功能的药物；
10)制备抑制心梗后梗死面积扩大的药物；
11)制备抑制心梗后心室负性重构的药物；
12)制备减少心肌梗死过程中心肌细胞和心肌组织的损伤的药物；
13)制备减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量的药物。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述改善心梗后心脏功能体现在如下a1)-a6)中任一种：
a1)减轻心梗后心脏功能性指标的下降程度；
a2)减轻心梗后心室扩张指标的升高程度；
a3)减轻心梗后心室纤维化程度；
a4)减轻心梗后室壁变薄程度；
a5)减轻心梗后室腔扩张程度；
a6)提高心梗后生存率。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其功能特征在于：所述诱导线粒体自噬，体现在如下b1)-b4)中任一种：
b1)增加PINK1在线粒体上的聚集；
b2)增加Parkin在线粒体上的聚集；
b3)上调线粒体LC3-2/LC3-1的比值；
b4)使线粒体膜电位下降。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述抑制ZIP7蛋白活性的物质为抑制ZIP7蛋白合成或促进ZIP7蛋白降解或抑制ZIP7蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物；
或，所述抑制或沉默ZIP7基因表达的物质为干扰ZIP7基因表达的RNA或敲除、敲低或突变ZIP7基因的物质。
6.一种药物，其活性成分为抑制ZIP7蛋白活性的物质或抑制或沉默ZIP7基因表达的物质；
所述药物的功能体现在如下c1)-c13)中任一种：
c1)增加线粒体内锌离子浓度；
c2)使线粒体膜电位降低；
c3)增加PINK1在线粒体聚集；
c4)增加Parkin在线粒体聚集；
c5)诱导线粒体自噬；
c6)降低心肌组织活性氧释放水平；
c7)降低心梗风险；
c8)治疗或辅助治疗心梗；
c9)改善心梗后心脏功能；
c10)抑制心梗后梗死面积扩大；
c11)抑制心梗后心室负性重构；
c12)减少心肌梗死过程中心肌细胞和心肌组织的损伤；
c13)减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于：所述改善心梗后心脏功能的体现在如下a1)-a6)中任一种：
a1)减轻心梗后心脏功能性指标的下降程度；
a2)减轻心梗后心室扩张指标的升高程度；
a3)减轻心梗后心室纤维化程度；
a4)减轻心梗后室壁变薄程度；
a5)减轻心梗后室腔扩张程度；
a6)提高心梗后生存率，
或，所述诱导线粒体自噬体现在如下b1)-b4)中任一种：
b1)增加PINK1在线粒体上的聚集；.
b2)增加Parkin在线粒体上的聚集；
b3)上调线粒体LC3-2/LC3-1的比值；
b4)使线粒体膜电位下降。
8.根据权利要求6或7所述的药物，其特征在于：所述抑制ZIP7蛋白活性的物质为抑制ZIP7蛋白合成或促进ZIP7蛋白降解或抑制ZIP7蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物；
或，所述抑制或沉默ZIP7基因表达的物质为干扰ZIP7基因表达的RNA或敲除、敲低或突变ZIP7基因的物质。
9.ZIP7蛋白作为靶点在开发或设计治疗心血管疾病的药物中的应用。
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