CN110804579A - 慢病毒载体制备用293t细胞培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种慢病毒载体制备用293T细胞培养基，它以DMEM培养基作为基础液，添加胎牛血清、GlutaMax‑Ⅰ、非必需氨基酸、丙酮酸钠、D‑(+)‑半乳糖、Hepes制成。本发明还公开了该细胞培养基的制备方法，包括步骤：1）将D‑(+)‑半乳糖加入DMEM培养基；2）D‑(+)‑半乳糖溶解完再依次加入胎牛血清、丙酮酸钠、非必需氨基酸、Hepes及GlutaMax‑Ⅰ，混合溶解；3）将步骤2）中配制的混合液补加DMEM培养基定容至1L；4）过滤得到无菌的293T细胞培养基。本发明培养基相较于传统培养基更有利于实现细胞的稳定增殖，提高病毒的包装效率，病毒滴度高，纯度好，适用于商业化批量生产。

Description

慢病毒载体制备用293T细胞培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及病毒生物技术领域，具体涉及一种细胞培养基，特别是涉及一种慢病毒载体制备用293T细胞培养基。此外，本发明还涉及该慢病毒载体制备用293T细胞培养基的制备方法。
背景技术
随着免疫细胞治疗产业的发展，CAR-T细胞治疗已经成为肿瘤免疫治疗领域中新的国际研究热点，被越来越多的生物公司和研究机构所青睐。293T细胞作为慢病毒包装的宿主细胞，被广泛应用于CAR-T技术的慢病毒载体制备中。该细胞是由293细胞派生并表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系。293T细胞常规培养基是以DMEM培养基为基础液，添加胎牛血清配制而成的，缺少一些关键的成分：如丙酮酸钠、非必需氨基酸、GlutaMax-Ⅰ等，从而导致细胞营养代谢中缺少碳源，阻碍正常营养代谢；同时含有的L-谷氨酰胺容易降解形成氨的积累，影响细胞的稳定生长。
因此，为了提高病毒包装效率以及商业化批量生产需求并克服293T细胞常规培养基存在的上述问题，亟需在常规培养基配方的基础上添加几种关键的原料：非必需氨基酸、丙酮酸钠、GlutaMax-Ⅰ、HEPES等，通过优化配方，获得更有利于维持细胞生长、能量代谢和包装病毒，且易于通过纯化方式去除培养基及宿主细胞残留的培养基配比，使细胞扩增、病毒包装可满足CAR-T技术的临床应用推广，符合最终药品质量要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种慢病毒载体制备用293T细胞培养基，实现293T细胞的稳定增殖，提高病毒的包装效率，获得满足商业化生产的批量要求及临床用药的质量要求。
本发明要解决的技术问题之二是提供该慢病毒载体制备用293T细胞培养基的制备方法。
为解决现有技术存在的问题，本发明采用的技术方案是：
一种慢病毒载体制备用293T细胞培养基，它是以DMEM培养基作为基础液，添加胎牛血清、GlutaMax-Ⅰ、非必需氨基酸、丙酮酸钠、D-(+)-半乳糖、Hepes制成。
作为本发明优选的技术方案，所述的作为基础液的DMEM培养基是不含葡萄糖的。
作为本发明优选的技术方案，所述基础液DMEM培养基的加入量为80%~90%（体积/体积百分比）；所述胎牛血清的加入量为8.0~11.0%（体积/体积百分比）；含有1.5-3.0mMGlutaMax-Ⅰ、7~12mL/L非必需氨基酸（成分终浓度为10mM，100倍浓度）、0.7~1.1mM 丙酮酸钠、3~6 g/L的D-(+)-半乳糖、1.5~3.0 g/L Hepes。
作为本发明优选的技术方案，所述胎牛血清的加入量为10%。
作为本发明优选的技术方案，含有1.5mM的GlutaMax-Ⅰ、11mL/L非必需氨基酸、0.9mM丙酮酸钠、3.5g/L 的D-(+)-半乳糖、2.54g/LHepes。
以上术语说明如下：
所述DMEM培养基是一种含各种氨基酸和/或葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。DMEM是dulbecco's modified eagle medium的缩写，所以其特点主要包括以下:(1)氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等;(2)维生素含量为依格尔培养基的4倍;(3)含有糖酵解途径中的重要物质--丙酮酸;(4)含有微量的铁离子。
所述胎牛血清是一种性状、外观浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。
所述GlutaMax-Ⅰ是一种高级细胞培养添加剂,可直接替代细胞培养基中的L-谷氨酰胺。GlutaMax-Ⅰ是一种二肽——L-丙氨酰-L-谷氨酰胺——在水溶液中更稳定，不会自发降解。
所述非必需氨基酸不一定非从食物直接摄取不可。这类氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸等。有些非必需氨基酸如胱氨酸和酪氨酸如果供给充裕还可以节省必需氨基酸中蛋氨酸和苯丙氨酸的需要量。
所述丙酮酸钠是最常见的丙酮酸盐，别名焦葡萄酸钠、2-羰基丙酸钠盐，分子式为C3H3NaO3，是一类内源性小分子物质，丙酮酸钠和丙酮酸均是天然存在于人体内，并参与全身各组织和器官的代谢。丙酮酸钠在医学上、诊断试剂以及医疗器械中被广泛用作缓冲剂、赋形剂和抗氧化剂。
所述D-(+)-半乳糖为白色结晶或粉末。无气味。微有甜味。易溶于水，溶于吡啶，微溶于乙醇和甘油。用于肝功能试验、生物培养、生化研究、有机合成。
所述Hepes，中文全称：4-羟乙基哌嗪乙磺酸，对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。细胞培养常用10mmol/L。
此外，本发明还提供一种上述慢病毒载体制备用293T细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：
（1）将D-(+)-半乳糖加入DMEM培养基；
（2）D-(+)-半乳糖溶解完之后，再依次加入胎牛血清、丙酮酸钠、非必需氨基酸、Hepes以及GlutaMax-Ⅰ，混合溶解；
（3）将步骤（2）中配制的混合液补加DMEM培养基定容至1L；
（4）过滤得到无菌的293T细胞培养基。
作为本发明优选的技术方案，步骤（3）完成后记录pH值。
作为本发明优选的技术方案，步骤（4）中，所述过滤采用囊式滤器进行过滤。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明在常规培养基配方的基础上添加几种关键的原料：非必需氨基酸、丙酮酸钠、GlutaMax-Ⅰ、HEPES等，通过优化配方，获得更有利于维持细胞生长、能量代谢和包装病毒，且易于通过纯化方式去除培养基及宿主细胞残留的培养基配比，使细胞扩增、病毒包装可满足CAR-T技术的临床应用推广，符合最终药品质量要求。经对比试验验证，本发明公开的293T细胞培养基所饲养的细胞最终得到的病毒滴度为2.95×107TU/mL明显高于传统293T细胞培养基1.62×107TU/mL，且最终产品的杂质残留比传统293T细胞培养基的要低。本发明293T细胞培养基相较于传统的293T培养基更有利于实现细胞的稳定增殖，提高病毒的包装效率，病毒滴度高，纯度好，适用于商业化批量生产。
具体实施方式
现在结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
说明：本发明中所涉及的原料均为市售产品。
实施例1：最佳配方293T细胞培养基的制备
1)称取3.50g D-(+)-半乳糖，加入DMEM培养基500mL作为基础液溶解其他成分；
2)D-(+)-半乳糖溶解完之后，再加入100mL胎牛血清、0.90mM丙酮酸钠、11.00mL非必需氨基酸、2.54g Hepes以及1.50mM的GlutaMax-Ⅰ，混合溶解；
3)将步骤2）中配制的混合液补加DMEM培养基定容至1L，记录pH值；
4)用0.22µm囊式滤器（Millipore-SGEPA47HH3）进行过滤，即得到无菌的293T细胞培养基。
上述的D-(+)-半乳糖、DMEM培养基、胎牛血清、丙酮酸钠、GlutaMax-Ⅰ等成分以市售产品为例，但不限定于所述产品，按照药典规定即可。
实施例2：293T细胞培养基的制备
1）称取3g D-(+)-半乳糖，加入DMEM培养基500mL作为基础液溶解其他成分；
2）D-(+)-半乳糖溶解完之后，再加入80mL胎牛血清、0.70mM丙酮酸钠、7.00mL非必需氨基酸、1.5g Hepes以及2.0mM的GlutaMax-Ⅰ，混合溶解；
3）将步骤2）中配制的混合液补加DMEM培养基定容至1L，记录pH值；
4）用0.22µm囊式滤器（Millipore-SGEPA47HH3）进行过滤，即得到无菌的293T细胞培养基。
上述的D-(+)-半乳糖、DMEM培养基、胎牛血清、丙酮酸钠、GlutaMax-Ⅰ等成分以市售产品为例，但不限定于所述产品，按照药典规定即可。
实施例3：293T细胞培养基的制备
1）称取6g D-(+)-半乳糖，加入DMEM培养基500mL作为基础液溶解其他成分；
2）D-(+)-半乳糖溶解完之后，再加入110mL胎牛血清、1.1mM丙酮酸钠、12.00mL非必需氨基酸、3.0g Hepes以及3.0mM的GlutaMax-Ⅰ，混合溶解；
3）将步骤2）中配制的混合液补加DMEM培养基定容至1L，记录pH值；
4）用0.22µm囊式滤器（Millipore-SGEPA47HH3）进行过滤，即得到无菌的293T细胞培养基。
上述的D-(+)-半乳糖、DMEM培养基、胎牛血清、丙酮酸钠、GlutaMax-Ⅰ等成分以市售产品为例，但不限定于所述产品，按照药典规定即可。
实施例4：293T细胞的复苏、接种
1)从液氮罐中取出冻存的细胞，置于37.0±1.0 ℃水浴锅中快速解冻，1-2min内使细胞溶液完全溶解，70%无菌乙醇擦拭外表面；
2)解冻后的细胞悬液转移至10%FBS培养基的转移瓶中，手动混匀；
3)取样进行细胞计数，将转移瓶中的细胞悬液转移至三层细胞培养瓶中，使分布均匀；
4)培养：37.0±1.0℃，5±1% CO2培养，至细胞达到一定汇合率后，进行传代扩增。
实施例5：培养后的293T细胞用于病毒载体的生产
1)细胞增殖到一定的汇合率进行预处理，继续培养一段时间后加入质粒氯化钙转染试剂，继续培养；
2)隔天进行病毒上清的收集，进入纯化阶段，进行初步的澄清、消化处理；
3)处理完的病毒上清进行中空纤维柱的超滤浓缩以及层析柱的分离纯化，得到病毒载体的半成品；
4)半成品加入保护剂，经滤膜过滤，进行分装和包装即为病毒载体的成品。
实施例6：传统293T细胞培养基和本发明293T细胞培养基培养的293T细胞病毒滴度以及杂质残留比较
1）分别用传统293T细胞培养基和本发明优化的293T细胞培养基按照实施例4、5得到病毒载体成品；
2）对成品进行滴度的测定，测定纯化后的病毒载体杂质的残留；
3）结果分析，本发明公开的293T细胞培养基所饲养的细胞最终得到的病毒滴度为2.95×107TU/mL明显高于传统293T细胞培养基1.62×107TU/mL，且最终产品的杂质残留比传统293T细胞培养基的要低，见下表1。
表1
Figure 263577DEST_PATH_IMAGE002
以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以列举说明。凡采用等同变换或者等效替换而形成的类似此种的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims (8)

1.一种慢病毒载体制备用293T细胞培养基，其特征在于，它是以DMEM培养基作为基础液，添加胎牛血清、GlutaMax-Ⅰ、非必需氨基酸、丙酮酸钠、D-(+)-半乳糖、Hepes制成。
2.根据权利要求1所述的293T细胞培养基，其特征在于，所述的作为基础液的DMEM培养基是不含葡萄糖的。
3.根据权利要求1或2所述的293T细胞培养基，其特征在于，所述基础液DMEM培养基的加入量为80%~90%；所述胎牛血清的加入量为8.0-11.0%；含有1.5-3.0mM GlutaMax-Ⅰ、7~12mL/L非必需氨基酸、0.7~1.1mM 丙酮酸钠、3~6 g/L的D-(+)-半乳糖、1.5~3.0 g/LHepes。
4.根据权利要求3所述的293T细胞培养基，其特征在于，所述胎牛血清的加入量为10%。
5.根据权利要求3所述的293T细胞培养基，其特征在于，含有1.5mM的GlutaMax-Ⅰ、11mL/L非必需氨基酸、0.9mM丙酮酸钠、3.5g/L 的D-(+)-半乳糖、2.54g/LHepes。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述的慢病毒载体制备用293T细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将D-(+)-半乳糖加入DMEM培养基；
（2）D-(+)-半乳糖溶解完之后，再依次加入胎牛血清、丙酮酸钠、非必需氨基酸、Hepes以及GlutaMax-Ⅰ，混合溶解；
（3）将步骤（2）中配制的混合液补加DMEM培养基定容至1L；
（4）过滤得到无菌的293T细胞培养基。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）完成后记录pH值。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述过滤采用囊式滤器进行过滤。
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