CN109010368B - 用于治疗“女运动员三联征”和修复女运动员卵巢功能的细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于治疗“女运动员三联征”和修复女运动员卵巢功能的细胞制剂，所述的细胞制剂由被rhSDF‑1α和IGF‑II充分驯化的间充质干细胞，以及用于承载间充质干细胞的生理盐水组成，所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞或胎盘间充质干细胞。该制剂通过静脉滴注的方式输入患者体内，通过干细胞的免疫调节作用、激素调节作用等改善女运动员三联症的症状。本发明可解决患有“女运动员三联征”的运动员卵巢损伤修复，对运动员的康复起到疗效。本发明所提供的制剂制备方法简单，易于实施，安全有效。

Description

用于治疗“女运动员三联征”和修复女运动员卵巢功能的细胞 制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于运动与健康科学领域，其涉及用于治疗“女运动员三联征”的细胞制剂及其制备方法。
背景技术
“女运动员三联征”(Female Athlete Triad,FAT)这一概念是在1992年由美国运动医学会(ACSM提出的)，具体包含进食障碍(摄食紊乱)、下丘脑功能性闭经和骨质疏松。三联征的三个因素是相互影响的，并且有研究发现，即使是月经稀疏的运动员，其骨密度也非常低。闭经会导致雌激素下降，而雌激素下降和营养不良也会使骨密度降低，影响运动员的健康。而饮食紊乱包括了严重的饮食障碍及不典型的饮食紊乱，该问题已经成为了运动员中乃至社会人群中一项严重的问题，该症状的发生目前认为可能与神经肽Y及瘦素的异常有关，其中关键为能量缺失、有时为临床或亚临床饮食疾病状态。而严重的饮食紊乱会导致脱水、心率不齐、心搏缓慢、低血压等症状，并会引起焦虑、抑郁等严重的神经精神症状。骨质疏松症主要为一种骨骼代谢异常疾病，可导致运动训练中的骨质疏松性骨折，以及增加了运动中持续性骨应力损伤，从而对运动员的健康状况产生影响。这三种症状之间往往相互关联，对女运动员的健康及训练造成影响。干细胞与相关细胞因子联合应用的技术为女运动员治疗“女运动员三联征”及其相关症状开拓了新的方向，具有可观的临床应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，通过干细胞的免疫调节作用、激素调节作用，提供一种能够治疗和改善“女运动员三联征”的干细胞制剂及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种用于治疗“女运动员三联征”和修复女运动员卵巢功能的细胞制剂，所述的细胞制剂由被rhSDF-1α和IGF-II充分驯化的间充质干细胞，以及用于承载间充质干细胞的生理盐水组成，所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞或胎盘间充质干细胞。生理盐水为浓度为0.9％的氯化钠溶液(0.9克氯化钠/100毫升水)。
所述的间充质干细胞的来源为人脐带或胎盘；
所述的细胞制剂中，间充质干细胞的浓度为5×106～2×108个/100mL生理盐水；(优选为5×107个细胞/100ml生理盐水。)
所述的间充质干细胞为原代-第10代的间充质干细胞。
所述的细胞制剂为混悬液。
所述的细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
1)制备脐带或胎盘间充质干细胞；
2)制备被rhSDF-1α和IGF-II充分驯化的间充质干细胞：将rhSDF-1α、IGF-II加入上述脐带或胎盘间充质干细胞的培养基中进行驯化，其中，rhSDF-1α的质量浓度为10-150ng/mL(优选为100ng/mL)；所述的IGF-II的质量浓度为200ng/ml；
3)收集生长状况良好，生长密度为80-90％的细胞。将细胞通过胰酶进行消化，待细胞悬浮后加入带有10％FBS的培养基终止消化。将悬浮的细胞收集后置于离心机中，1000转/6分钟进行离心，并重复离心清洗；收集离心管底部的细胞，计数后加入生理盐水中待进行静脉注射。
所述的脐带间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
1)取志愿、健康合格孕妇的足月剖宫产的新生儿脐带，充分洗涤去除杂质；
2)将脐带组织剪成块状，加入胶原酶消化液，37℃恒温摇床中振荡消化，完全培养基(DMEM)和10％胎牛血清(FBS)终止消化；
3)50目筛网过滤人脐带组织消化后的产物；
4)将收集的过滤液离心、分离获得单个核细胞；
5)将离心后获得单个核细胞重悬于完全培养基(DMEM+5％FBS)并加入rhSDF-1α、IGF-II，接种于培养皿中，在37℃，体积分数为5％CO2培养箱中培养；
6)待细胞生长至80-90％融合度时，用胰酶消化进行传代培养，即得脐带间充质干细胞；必要时进行冻存待用。
所述的胎盘间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
1)取志愿、健康合格孕妇的足月剖宫产胎儿的胎盘，PBS反复冲洗去除胎盘血；
2)将胎盘组织剪成块状，加入胶原酶消化液，37℃恒温摇床中振荡消化，完全培养基(DMEM+10％FBS)终止消化；
3)50目筛网过滤人胎盘组织消化后的产物；
4)将收集的过滤液离心、分离获得单个核细胞；
5)将离心后获得单个核细胞重悬于完全培养基(DMEM+5％FBS)并加入rhSDF-1α、IGF-II，接种于培养皿中，在37℃，体积分数为5％CO2培养箱中培养；
6)待细胞生长至80-90％融合度时，用胰酶消化进行传代培养，即得胎盘间充质干细胞；必要时进行冻存待用。
所述的细胞制剂在制备治疗“女运动员三联征”和修复女运动员卵巢功能药物中的用途。细胞制剂中，细胞含量为5×107细胞/100ml生理盐水，或者2×108细胞/100ml生理盐水。
本发明提供的细胞制剂可静脉注射，制剂经注射至静脉后，细胞的归巢效应可使间充质干细胞向卵巢定植，在rhSDF-1α、IGF-II的驯化作用下，间充质干细胞制剂可更好的向病灶区迁移、定植、生长和分化，并可帮助刺激卵泡发育，调节微环境免疫稳态，利用协同作用可以发挥更好的疗效。
本发明提供的细胞制剂可通过静脉注射。
本发明提供的细胞制剂可用于治疗和修复女运动员月经异常、膳食紊乱及骨质疏松等问题，可用于治疗治疗“女运动员三联征”。
本发明具有如下技术优势：
1)rhSDF-1α，其具有趋化作用，可通过其受体CXCR4发挥细胞募集作用。研究表明rhSDF-1α可以动员组织自身干细胞以及外源干细胞归巢，提高损伤部位干细胞浓度，细胞经rhSDF-1驯化后可延长干细胞的作用时间，从而达到促进受损卵巢再生修复，提高激素调节能力。此外，rhSDF-1α可诱导间充质干细胞血管内皮细胞生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)表达，来促进新生血管生成，而新生的血管可使局部血液灌流增加，改善移植细胞的生存环境，提高干细胞的存活，干细胞的存活又能提高其旁分泌作用。另外IGF也可以调节局部的炎症反应，降低炎性因子含量，改善干细胞定植环境。经IGF驯化的间充质干细胞能够更好的调节局部免疫反应。
2)脐带或胎盘间充质干细胞作为用于治疗“女运动员三联征”的活性成分，其不仅获取方便，且具有组织再生修复能力及强大的免疫调节功能，能分泌多种生长因子改善局部微环境，调节激素水平、改善营养吸收情况、及增加骨密度等。
3)因此，干细胞与多种细胞因子驯化联合应用的技术为治疗“女运动员三联征”开拓了新的方向，间充质干细胞制剂可在病灶区定植、生长、分化和发挥作用，联合rhSDF-1α的趋化调节作用及IGF的免疫调节作用，可以发挥更好的疗效。具有可观的临床应用前景。
附图说明
图1为治疗前后血清维生素D检测结果。
图2为治疗前后腰椎骨密度检测结果。
图3为治疗前后除头部外其他位置骨密度检测结果。
图4为治疗前后全髋部骨密度检测结果。
图5为治疗前后股骨颈骨密度检测结果。
图6为治疗前后月经周期统计结果。
图7为治疗前后血清雌二醇比性激素结合球蛋白测定结果。
图8为治疗前后血清促黄体生成素测定结果。
图9为治疗前后血清卵泡刺激素测定结果。
图10为治疗前后每日去脂能量摄入结果。
图11为治疗前后每日碳水化合物摄入量结果。
图12为治疗前后每日蛋白摄入结果。
图13为治疗前后每日脂肪摄入量结果。
图14为治疗前后每日能量摄入结果。
具体实施方式
脐带和胎盘间充质干细胞的制备参考如下文献：
Comparative study of regenerative effects of mesenchymal stem cellsderived from placental amnion,chorion and umbilical cord on dermal wounds[J].Placenta,2018,65.Ertl J,Pichlsberger M,Tuca A C,et al.
骨密度测定实验，参考如下文献：
Bone mass of female dance students prior to professional dancetraining:A cross-sectional study[J].Plos One,2017,12(7):e0180639.Amorim T,Metsios G S,Wyon M,et al.
Low Bone Mineral Density in Male Athletes Is Associated With BoneStress Injuries at Anatomic Sites With Greater Trabecular Composition[J].American Journal of Sports Medicine,2017,46(3):363546517730584.Tenforde A S,Parziale A L,Popp K L,et al.
女性生理测定实验，参考如下文献：
Increasing training load without risking the female athlete triad:menstrual cycle based periodized training may be an answer？[J].Journal ofSports Medicine&Physical Fitness,2016,57(11).L
Figure GDA0003107763090000051
CJ Boraxbekk，KHenriksson-Larsén
能量摄入测定实验，参考如下文献：
Assessment of Energy Intake and Energy Expenditure of Male AdolescentAcademy-Level Soccer Players during a Competitive Week[J].Nutrients,2015,7(10):8392-8401.Briggs M A,Emma C,Rumbold P L S,et al.
实施例1制备被rhSDF-1α和IGF-II充分驯化的脐带间充质干细胞
收集健康合格孕妇的足月剖宫产的新生儿脐带，充分洗涤。将组织剪成块状，加入胶原酶消化液，37℃恒温摇床中振荡消化30分钟，完全培养基(含10％FBS)终止消化。用50目筛网过滤消化后的组织，得到悬浮细胞组织。将悬浮的细胞组织加入缓冲液后离心清洗3次，加入培养基接种于培养皿中。置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。
待细胞贴壁后换液，加入含5％FBS的培养基培养，并加入100ng/mL rhSDF-1α和200ng/ml IGF-II进行驯化，并在换液时及时补充相应细胞因子。待细胞生长至80-90％融合度时，用胰酶消化进行传代培养。
待细胞传代次数达到3次，或达到1×109个后，进行人体应用或进行冻存备用。
实施例2制备被rhSDF-1α和IGF-II充分驯化的胎盘间充质细胞
收集健康合格孕妇的足月剖宫产的胎盘组织，充分洗去血凝块。将组织剪成块状，去除结缔组织，加入胶原酶消化液，37℃恒温摇床中振荡消化30-40分钟，完全培养基(含10％FBS)终止消化。用50目筛网过滤消化后的组织，得到悬浮细胞组织。将悬浮的细胞组织加入缓冲液后离心清洗3次，加入培养基接种于培养皿中。置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。
驯化培养方式同实施例1。
实施例3效果验证
纳入10名从事耐力(长跑)训练的女运动员，该十名女运动员被诊断患有女运动员三联症，进行细胞干预。患者的基本情况如下：平均年龄为27.6±2.1，BMI18.9±2.2kg/cm2，从事运动均为长跑运动。训练时长为8.6±1.7小时/周。
治疗方案：
取实施例1获取的被rhSDF-1α和IGF-II充分驯化的间充质干细胞，收集生长状况良好，生长密度为90％的细胞。将细胞通过胰酶进行消化，待细胞悬浮后加入带有10％FBS的培养基终止消化。将悬浮的细胞收集后置于离心机中，1000转/6分钟进行离心，并重复离心清洗；收集离心管底部的细胞，计数后加入生理盐水中制成细胞制剂待进行静脉注射。细胞制剂中，细胞含量为5×107个细胞/100ml生理盐水。
连续2天，每天一次进行静脉输注，剂量为1×108个细胞/次。此后每隔一个月输注两天，连续输注6个月，共12次。对十名女运动员进行如下实验：
一、骨密度测定实验，实验方法参考上述文献。
二、女性生理测定实验，实验方法参考上述文献。
三、能量摄入测定实验，实验方法参考上述文献。
结果如图1-14所示。
一、骨密度测定实验中骨质疏松改善相关结果
如图1所示，酶联免疫吸附法(ELISA)血清维生素D含量治疗前为27.89±10.27ng/ml，治疗6个月后为35.83±9.83ng/ml。配对t检验显示没有统计学差异(p＝0.0943)。
如图2所示，双能X线吸收法(DXA)检测腰椎骨密度结果显示治疗前为0.91±0.17g/cm2，治疗6个月后为1.02±0.11g/cm2。配对t检验显示治疗前后没有统计学差异(p＝0.103)。
如图3所示，双能X线吸收法(DXA)检测除头部外其他位置骨密度(total bodyless head,TBLH)结果显示治疗前为0.85±0.08g/cm2，治疗后结果为1.02±0.06g/cm2，配对t检验显示治疗前后结果具有统计学差异(p<0.001)。
如图4所示，双能X线吸收法(DXA)检测全髋部骨密度检测显示治疗前为1.08±0.15g/cm2，经过6个月治疗后为1.07±0.21g/cm2，配对t检验结果显示治疗前后无显著差异(p＝0.9038)。
如图5所示，双能X线吸收法(DXA)检测股骨颈骨密度结果显示治疗前为0.95±0.16g/cm2，经过6个月治疗后为1.02±0.16g/cm2，配对t检验结果显示无统计学差异(p＝0.3409)。
经过骨密度检测发现经过间充质干细胞干预治疗后，仅在总骨密度(除头部)中发现了显著的改善。而其他部位的结果未显示出统计学差异，这可能与干预时间较短相关。
二、女性生理测定实验中激素相关结果
如图6所示，经过6个月细胞干预后，月经周期从之前56.4±15.8天，改善为27.7±2.1天。前后差别具有统计学意义(p<0.001)。
如图7所示，ELISA法测定血清雌二醇比性激素结合球蛋白(sex hormone-bindingglobulin,SHBG)结果显示，治疗前为1.77±1.22％，治疗后为1.88±1.55％，结果没有统计学差异(p＝0.862)。
如图8所示，ELISA法测定血清促黄体生成素(LH)结果显示，治疗前为4.78±2.33μIU/L，治疗后为5.69±3.76μIU/L。前后对比没有统计学差异(p＝0.5236)。
如图9所示，ELISA法测定血清卵泡刺激素(FSH)结果显示，治疗前为4.89±1.93IU/L，治疗后为5.42±2.11IU/L。前后对比没有统计学差异(p＝0.5651)。由于纳入患者为年轻女运动员，所以该治疗方式并没有对患者的雌性激素水平产生明显的影响，仅对于月经周期调节较为明显。
三、能量摄入测定实验中摄食异常改善情况
如图10所示，采用生活观察记录法检测每日去脂能量摄入结果显示治疗前为46.5±12kcal/kg FFM/day，治疗后为52.2±11.6kcal/kg FFM/day，前后对比结果没有统计学差异(p＝0.2944)。
如图11所示，采用生活观察记录法检测每日碳水化合物摄入量结果显示，治疗前为2.1±1.5g/kg/day，治疗后为7.1±2.5g/kg/day，前后对比结果具有统计学差异(p<0.001)。
如图12所示，采用生活观察记录法检测每日蛋白摄入结果显示，治疗前为2.5±0.9g/kg/day，治疗后为1.6±0.7g/kg/day，前后对比具有统计学差异(p＝0.0225)。
如图13所示，采用生活观察记录法检测每日脂肪摄入量结果显示，治疗前为36.4±6.3％，治疗后为25.7±7.1％，治疗后脂肪摄入比例显著降低(p＝0.0022)。
如图14所示，采用生活观察记录法检测每日能量摄入结果显示，治疗前为1653.9±569.2kcal/day，治疗后为1818.7±492kcal/day，治疗前后没有统计学差异(p＝0.4975)。
另外，在治疗前有2人(20％)具有明显的膳食紊乱，治疗后没有运动员具有膳食紊乱发生。卡方检验没有统计学差异(p＝0.237)。结果发现，对于膳食紊乱以及能量摄取的紊乱改善较为明显，但也可能为疾病诊断后患者对膳食的重视有关，另外，神经精神的改善也会对结果产生一定的影响作用。
结论：经驯化间充质干细胞注射后能够改善“女运动员三联症”患者的总骨密度，改善女性患者的生理周期，及可能改善患者膳食紊乱以及能量摄取的紊乱改善情况。

Claims (10)

1.一种用于治疗“女运动员三联征”和修复女运动员卵巢功能的细胞制剂，其特征在于，所述的细胞制剂由被rhSDF-1α和IGF-II充分驯化的间充质干细胞，以及用于承载间充质干细胞的生理盐水组成，所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞或胎盘间充质干细胞；所述的rhSDF-1α的质量浓度为10-150ng/mL；所述的IGF-II的质量浓度为200ng/ml。
2.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于：所述的rhSDF-1α的质量浓度为100ng/mL。
3.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于：所述的间充质干细胞的来源为人脐带或胎盘；所述的细胞制剂中，间充质干细胞的浓度为5×106～2×108个/100mL生理盐水。
4.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于，所述的间充质干细胞为原代-第10代的间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于，所述的细胞制剂为混悬液。
6.如权利要求1-5任意一项所述的细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备脐带或胎盘间充质干细胞；
2)制备被rhSDF-1α和IGF-II充分驯化的间充质干细胞：将rhSDF-1α、IGF-II加入上述脐带或胎盘间充质干细胞的培养基中进行驯化，其中，rhSDF-1α的质量浓度为10-150ng/mL；所述的IGF-II的质量浓度为200ng/ml；
3）收集生长状况良好，生长密度为90%的细胞；将细胞通过胰酶进行消化，待细胞悬浮后加入带有10%FBS的培养基终止消化；将悬浮的细胞收集后置于离心机中，1000转/6分钟进行离心，并重复离心清洗；收集离心管底部的细胞，计数后加入生理盐水中待进行静脉注射。
7.根据权利要求6所述的细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中，rhSDF-1α的质量浓度为100ng/mL。
8.根据权利要求6所述的细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述的脐带间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
1)取志愿、健康合格孕妇的足月剖宫产的新生儿脐带，充分洗涤去除杂质；
2)将脐带组织剪成块状，加入胶原酶消化液，37℃恒温摇床中振荡消化，完全培养基DMEM和10％胎牛血清FBS终止消化；
3)50目筛网过滤人脐带组织消化后的产物；
4)将收集的过滤液离心、分离获得单个核细胞；
5)将离心后获得单个核细胞重悬于完全培养基DMEM+5％FBS，并加入rhSDF-1α、IGF-II，接种于培养皿中，在37℃，体积分数为5％CO2培养箱中培养；
6)待细胞生长至80-90％融合度时，用胰酶消化进行传代培养，即得脐带间充质干细胞；必要时进行冻存待用。
9.根据权利要求6所述的细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述的胎盘间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
1)取志愿、健康合格孕妇的足月剖宫产胎儿的胎盘，PBS反复冲洗去除胎盘血；
2)将胎盘组织剪成块状，加入胶原酶消化液，37℃恒温摇床中振荡消化，完全培养基DMEM+10％FBS，终止消化；
3)50目筛网过滤人胎盘组织消化后的产物；
4)将收集的过滤液离心、分离获得单个核细胞；
5)将离心后获得单个核细胞重悬于完全培养基DMEM+5％FBS 并加入rhSDF-1α、IGF-II，接种于培养皿中，在37℃，体积分数为5％CO2培养箱中培养；
6)待细胞生长至80-90％融合度时，用胰酶消化进行传代培养，即得胎盘间充质干细胞；必要时进行冻存待用。
10.如权利要求1-5任意一项所述的细胞制剂在制备治疗“女运动员三联征”和修复女运动员卵巢功能药物中的用途。
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