ES2906161T3

ES2906161T3 - Métodos complementarios para terapias basadas en IL-2 y terapias basadas en células madre mesenquimales

Info

Publication number: ES2906161T3
Application number: ES16804415T
Authority: ES
Inventors: Victoria Lunyak; Meenakshi Gaur
Original assignee: Aelan Cell Technologies Inc
Current assignee: Aelan Cell Technologies Inc
Priority date: 2015-06-03
Filing date: 2016-06-02
Publication date: 2022-04-13
Anticipated expiration: 2036-06-02
Also published as: JP2022140711A; US20180136209A1; WO2016196765A9; WO2016196765A3; JP7455165B2; EP3303636A2; EP4015652A1; WO2016196765A2; EP3303636B1; EP3302541A4; WO2016196774A1; US20220370503A1; JP7118886B2; CN108289937A; JP7186251B2; CN108699605A; EP3302541A1; JP2018518692A; EP3303636A4; JP2021089290A

Abstract

Un método para determinar si un individuo elegible para recibir una terapia basada en IL-2 puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2, comprendiendo el método: (a) medir los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores en una muestra de sangre, plasma o suero obtenida del individuo, en el que la muestra se combina con IL-2 in vitro antes de la terapia basada en IL-2, y en el que el panel de biomarcadores consiste en TGFβ1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1; y (b) comparar los niveles de los biomarcadores con los niveles de referencia, en el que un aumento en los niveles por encima de los niveles de referencia indica que el individuo puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2, y en el que una disminución o ningún cambio en los niveles comparados con los niveles de referencia indica que es posible que el individuo no experimente un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos complementarios para terapias basadas en IL-2 y terapias basadas en células madre mesenquimales

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La interleucina 2 (IL-2) es un tipo de molécula de señalización de citocinas en el sistema inmune, y se usa terapéuticamente. La IL-2 se fabrica usando tecnología de ADN recombinante, y se comercializa como una sustancia terapéutica proteica denominada aldesleukina (con la marca Proleukin®). La IL-2 está aprobada en varios países para el tratamiento de cánceres (melanoma metastásico y carcinoma de células renales) y del VIH.

La IL-2 ha sido aprobada como agente quimioterapéutico para el tratamiento del cáncer con un régimen de dosis alta, pero también puede administrarse en forma de dosis baja. El régimen de dosis alta consiste en administrar el fármaco por vía intravenosa, cada ocho horas, según se tolere, hasta 15 dosis. La terapia con dosis alta de IL-2 produce tasas de respuesta general de solo alrededor del 15% al 20%; además, se asocia con toxicidades significativas que afectan esencialmente a todos los sistemas de órganos. Debido a la gravedad de estos efectos secundarios, los pacientes son hospitalizados, y a veces necesitan apoyo de la unidad de cuidados intensivos mientras se administra el medicamento; en casos graves, se suspende el tratamiento con IL-2.

Las células madre mesenquimales humanas (MSC) son actualmente una de las principales fuentes de células madre para el trasplante para tratar una variedad de afecciones (Kucerova, Cancer Res 1 de julio de 2007 67; 6304). Tales células madre trasplantadas, en presencia de un entorno proinflamatorio o de otro modo inhóspito in vivo, pueden producir eventos adversos no deseados. Poco se sabe sobre el grado en el que las propiedades beneficiosas de las MSC se ven afectadas por su entorno local. PANELLI MONICA C ET AL: “Forecasting the cytokine storm following systemic interleukin (IL)-2 administration”, JOURNAL OF TRANSLATIONAL MEDICINE, BIOMED CENTRAL, vol. 2, no. 1,2 de junio de 2004, página 17, y el documento US 2013/252821A1 se refieren a eventos adversos que ocurren durante o después de la terapia basada en IL-2.

En conjunto, hasta la fecha, se sabe poco sobre cómo determinar los posibles eventos adversos asociados con la administración de una terapia con IL-2, y los posibles efectos adversos del entorno en las MSC trasplantadas. De este modo, existe la necesidad de métodos y kits complementarios para mejorar el tratamiento de pacientes que son tratados con IL-2, y para pacientes que reciben terapias basadas en MSC. Se describen aquí métodos y kits para estos fines.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se describe en las reivindicaciones adjuntas. Se describen aquí métodos y kits complementarios para determinar si una persona elegible para recibir una terapia basada en IL-2 o si una persona que ya recibe una terapia basada en IL-2 experimentará potencialmente eventos adversos asociados con esa terapia basada en IL-2. Si se determina que el individuo puede experimentar eventos adversos, tal como un mayor riesgo de tumorigénesis o metástasis, en lugar de la erradicación de la enfermedad subyacente tal como cáncer, se puede tomar la decisión de tratamiento de no someterse a ninguna otra terapia adicional basada en IL-2. Asimismo, si se determina que es probable que el individuo puede no experimentar eventos adversos asociados con la terapia basada en IL-2, se puede tomar la decisión de comenzar o continuar la administración de la terapia basada en IL-2.

También se describen aquí métodos y kits complementarios para determinar si un individuo elegible para recibir una terapia basada en MSC experimentará potencialmente eventos adversos asociados con la terapia.

De este modo, en un aspecto de la descripción, se proporcionan aquí métodos para determinar si un individuo elegible para recibir una terapia basada en IL-2 puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2, comprendiendo el método: (a) medir los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores en una muestra del individuo, en el que (1) el individuo ha recibido al menos una dosis de una terapia basada en IL-2 o (2) la muestra se combina con IL-2 in vitro, y en el que el panel de biomarcadores comprende TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFP1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1; y (b) comparar los niveles de los biomarcadores con los niveles de referencia, en el que un aumento en los niveles por encima de los niveles de referencia indica que el individuo puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2, y en el que una disminución o ningún cambio en los niveles comparados con los niveles de referencia indica que es posible que el individuo no experimente un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2. En una variación de la descripción, el individuo ha recibido (por ejemplo, se le ha administrado) al menos una dosis de una terapia basada en IL-2; en algunas variaciones, el individuo ha recibido la terapia basada en IL-2 para el tratamiento de un cáncer. En algunas variaciones, la muestra se ha obtenido del individuo 24, 48 o 72 horas después de haber recibido la terapia basada en IL-2. En otra variación, la muestra del individuo se combina con IL-2 in vitro para un análisis más detallado; en algunas variaciones, la muestra se puede combinar durante un período de alrededor de 24 horas, después de lo cual se miden los biomarcadores 24, 48 o 72 horas después de la eliminación de la IL-2. Como se contempla aquí, la muestra puede ser cualquier muestra biológica; en una variación, la muestra es una muestra de sangre, plasma o suero. En una variación particular, el método comprende medir los niveles de expresión de al menos tres biomarcadores del panel de biomarcadores, al menos cuatro biomarcadores del panel de biomarcadores, o al menos cinco biomarcadores del panel de biomarcadores. En algunas variaciones, el método comprende medir los niveles de expresión de TIE-1, TIE-2, TIMP-4, VEGFA, PLEKHA1, VEGFB, CRMP1, FERMT1, CTSB, PLEKHA6, GNB2L1, y TGFP1. En algunas variaciones, el método puede comprender además medir biomarcadores adicionales. En una variación particular, el método comprende además medir el nivel de expresión de SIVA1, y preguntar por la disminución de la expresión de este biomarcador. Como se contempla aquí, se pueden medir los niveles de expresión de ARN o proteína. Por consiguiente, en una variación, el método comprende medir los niveles de proteína de los biomarcadores, por ejemplo con un ensayo ELISA, una matriz proteómica de anticuerpos, inmunohistoquímica, o espectrometría de masas. En otra variación, el método comprende medir los niveles de ARN de los biomarcadores, por ejemplo con un ensayo de Q-PCR o RNA-seq. En algunas variaciones, el método comprende obtener la muestra del individuo como parte del método. Tras la determinación de los resultados de la expresión, el método puede comprender además administrar una cantidad eficaz de la terapia basada en IL-2 al individuo si se determina en la etapa (b) que el individuo puede no experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2. El método puede incluso comprender además administrar una terapia de rejuvenecimiento al individuo si se determina en la etapa (b) que el individuo puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2.

En otro aspecto, la descripción proporciona un método de tratamiento de un individuo para cáncer con una terapia basada en IL-2. En una variación, el método de tratamiento de un individuo para cáncer con una terapia basada en IL-2 comprende (a) medir los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores en una muestra del individuo, en el que (1) el individuo ha recibido al menos una dosis de una terapia basada en IL-2 o (2) la muestra se combina con IL-2 in vitro, y en el que el panel de biomarcadores comprende comprises TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFP1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1B, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1; (b) comparar los niveles de los biomarcadores con los niveles de referencia, en el que ningún cambio o una disminución en los niveles por debajo de los niveles de referencia indica que el individuo puede no experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2; y (c) administrar una cantidad eficaz de la terapia basada en IL-2 al individuo si se determina en la etapa (b) que el individuo puede no experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2. En otra variación, el método de tratamiento de un individuo para cáncer con una terapia basada en IL-2 comprende administrar una cantidad eficaz de la terapia basada en IL-2 al individuo cuando los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores disminuyen o no muestran cambio, en comparación con los niveles de referencia en una muestra del individuo, en el que (1) el individuo ha recibido al menos una dosis de una terapia basada en IL-2 o (2) la muestra se combina con IL-2 in vitro, y en el que el panel de biomarcadores comprende TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFP1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1B, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, c Rm P1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1. En una variación de la descripción, el individuo ha recibido (por ejemplo, se le ha administrado) al menos una dosis de una terapia basada en IL-2. En algunas variaciones, la muestra se ha obtenido del individuo 24, 48 o 72 horas después de haber recibido la terapia basada en IL-2. En otra variación, la muestra del individuo se combina con IL-2 in vitro para un análisis más detallado; en algunas variaciones, la muestra se puede combinar durante un período de alrededor de 24 horas, después de lo cual se miden los biomarcadores 24, 48 o 72 horas después de la eliminación de la IL-2. Como se contempla aquí, la muestra puede ser cualquier muestra biológica; en una variación, la muestra es una muestra de sangre, plasma o suero. En una variación particular, el método comprende medir los niveles de expresión de al menos tres biomarcadores del panel de biomarcadores, al menos cuatro biomarcadores del panel de biomarcadores, o al menos cinco biomarcadores del panel de biomarcadores. En algunas variaciones, el método comprende medir los niveles de expresión de TIE-1, TI E-2, TIMP-4, VEGFA, PLEKHA1, VEGFB, CRMP1, FERMT1, CTSB, PLEKHA6, GNB2L1, y TGF¡31. En algunas variaciones, el método puede comprender además medir biomarcadores adicionales. En una variación particular, el método comprende además medir el nivel de expresión de SIVA1, y preguntar por la disminución de la expresión de este biomarcador. Como se contempla aquí, se pueden medir los niveles de expresión de ARN o proteína. Por consiguiente, en una variación, el método comprende medir los niveles de proteína de los biomarcadores, por ejemplo con un ensayo ELISA, una matriz proteómica de anticuerpos, inmunohistoquímica, o espectrometría de masas. En otra variación, el método comprende medir los niveles de ARN de los biomarcadores, por ejemplo con un ensayo Q-PCR o RNA-seq. En algunas variaciones, el método comprende obtener la muestra del individuo como parte del método. El método puede incluso comprender además administrar una terapia de rejuvenecimiento al individuo si se determina que el individuo puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2.

En otro aspecto, la descripción proporciona un método para determinar si una población de células madre mesenquimales (MSC) es adecuada para la administración a un individuo para una terapia basada en MSC, que comprende: (a) incubar IL-2 con la población de MSC; (b) medir los niveles de expresión en las MSC de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores, en el que el panel de biomarcadores comprende TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFP1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1B, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1; y (c) comparar los niveles de los biomarcadores con los niveles de referencia, en el que un aumento en los niveles por encima de los niveles de referencia indica que las MSC no son adecuadas para la administración a un individuo, y ningún cambio o disminución en los niveles por debajo de los niveles de referencia indica que las MSC son adecuadas para la administración a un individuo. En algunas variaciones, el método comprende medir los niveles de expresión de al menos tres biomarcadores del panel de biomarcadores, medir los niveles de expresión de al menos cuatro biomarcadores del panel de biomarcadores, o medir los niveles de expresión de al menos cinco biomarcadores del panel de biomarcadores. En algunas variaciones, el método comprende medir los niveles de expresión de TIE-1, TIE-2, TIMP-4, VEGFA, PLEKHA1, VEGFB, CRMP1, FERMT1, CTSB, PLEKHA6, GNB2L1, y TGFP1. En algunas variaciones, el método puede comprender además medir biomarcadores adicionales. En una variación particular, el método comprende además medir el nivel de expresión de SIVA1, y preguntar por la disminución de la expresión de este biomarcador. Como se contempla aquí, se pueden medir los niveles de expresión de ARN o proteína. Por consiguiente, en una variación, el método comprende medir los niveles de proteína de los biomarcadores, por ejemplo con un ensayo ELISA, una matriz proteómica de anticuerpos, inmunohistoquímica, o espectrometría de masas. En otra variación, el método comprende medir los niveles de ARN de los biomarcadores, por ejemplo con un ensayo Q-PCR o RNA-seq. En algunas variaciones, el período de incubación es de alrededor de 24 horas. En algunas variaciones, la medida se realiza 24, 48 o 72 horas después del período de incubación con IL-2. En algunas variaciones, el método comprende además administrar la población de células al individuo. El método puede comprender además rejuvenecer las células antes de administrar las células al individuo.

En otro aspecto de la descripción, se proporcionan aquí kits para evaluar la idoneidad de una población de MSC para trasplante o para determinar si se debe administrar una terapia basada en IL-2, que comprenden reactivos para medir el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores en una muestra, en el que el panel de biomarcadores comprende TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFP1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1. En algunas variaciones, el kit comprende reactivos para medir el nivel de expresión de al menos tres biomarcadores en la muestra, para medir el nivel de expresión de al menos cuatro biomarcadores en la muestra, o para medir el nivel de expresión de al menos cinco biomarcadores en la muestra. En algunas variaciones, el kit comprende reactivos para medir TIE-1, TIE-2, TIMP-4, VEGFA, PLEKHA1, VEGFB, CRMP1, FERMT1, CTSB, PLEKHA6, GNB2L1, y TGFP1. En algunas variaciones, el kit comprende IL-2.

Debe entenderse que una, algunas o todas las propiedades de las diversas variaciones descritas aquí pueden combinarse para formar otras variaciones de la presente descripción. Estos y otros aspectos resultarán evidentes para un experto en la técnica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1A es un esquema que ilustra el posicionamiento de los MSC in vivo en los vasos sanguíneos, haciéndolas capaces de detectar y responder a un entorno inflamatorio, y tratamiento con citocinas.

La FIG. 1B es un gráfico que ilustra un método ejemplar para evaluar a un individuo o a una célula madre para determinar si se debe iniciar o continuar una terapia basada en IL-2.

La FIG. 2A es un esquema de un ensayo ejemplar para determinar si debe administrarse una terapia basada en IL-2. La FIG. 2B ilustra los resultados del cribado ejemplares usando el ensayo que se muestra en la FIG. 2A. En la FIG. 2B, el resultado es positivo, con la expresión de varios marcadores aumentada, lo que indica que los posibles eventos adversos podrían estar asociados con la administración de IL-2.

Las FIGS. 3A-3D ilustran cómo la senescencia replicativa (SEN) perjudica las propiedades migratorias de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano (hADSC, también denominadas aquí indistintamente hADSC). La FIG. 3A muestra una curva de crecimiento de las hADSC, y se representa como duplicación de la población acumulativa a lo largo del día en cultivo. La FIG. 3B muestra la detección de P-galactosidasa asociada a la senescencia. La FIG. 3C muestra ensayos de migración ex vivo para hADSC SR (izquierda) y SEN (derecha). La FIG. 3D muestra la migración de SR-hADSC (izquierda) y SEN-hADSC (derecha).

Las FIGS.4A-4C ilustran la expresión génica de las isoformas del receptor de IL-2 y su asociación con la membrana en SR-hADSC y SEN-hADSC inducidas con IL-2. La FIG. 4A muestra una representación esquemática de la composición del receptor de IL-2. La FIG. 4B muestra los receptores a, P y g de IL-2 evaluados mediante PCR cuantitativa (Q-PCR) de hADSC SR y SEN, en presencia o ausencia de IL-2. La FIG. 4C muestra los niveles de proteína asociada a la membrana celular de IL-2Ra e IL-2Rp.

La FIG. 5 ilustra el efecto de la estimulación de las hADSC SR y SEN con IL-2. La expresión de ARNm de STAT5A, STAT5B y VEGFA se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa.

Las FIGS. 6A-6D muestran una comparación de los niveles de expresión génica entre células SR y SEN tras el tratamiento con IL-2.

Las FIGS. 7A-7D ilustran los niveles de expresión génica para células SR y SEN tras el tratamiento con IL-2 entre conjuntos de genes funcionalmente coherentes.

Las FIGS. 8A-8D ilustran el análisis para el perfilado de RNA-seq de hADSC SR y SEN sometidas a tratamiento con IL-2. La FIG. 8A proporciona una representación esquemática del diseño del análisis de RNA-seq. La FIG. 8B muestra las distribuciones de los recuentos de lectura de RNA-seq específicos de genes para cada condición antes de la normalización de ACTB. La FIG. 8C muestra los recuentos de lectura de RNA-seq específicos de la condición para ACTB que se usaron para la normalización. La FIG. 8D muestra las distribuciones de los recuentos de lectura de RNA-seq específicos del gen para cada condición después de la normalización de ACTB.

La FIG. 9 muestra la respuesta a la dosis del Consorcio de Controles de ARN Externos (ERCC, un conjunto común de controles de ARN externos) usada para el control de calidad de los experimentos de RNA-seq.

Las FIGS. 10A-10B representan tablas de los genes expresados diferencialmente tras el tratamiento con IL-2 en hAMCS SEN y SR. La FIG. 10A muestra rutas biológicas enriquecidas para genes regulados al alza tras el tratamiento con IL-2 en hADSC SR y SEN. La FIG. 10B muestra rutas biológicas enriquecidas para genes regulados a la baja tras el tratamiento con IL-2 en hADSC SR y SEN.

Las FIGS. 11-90 ilustran el aumento en la secreción de las proteínas mencionadas (factores) de SR-hADSC o SEN-hADSC, después de la incubación con medio solo (sin estimulación con IL-2) o después de la estimulación con IL-2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

1. Métodos

1. Introducción

Se proporcionan aquí métodos y kits complementarios útiles para terapias basadas en IL-2 y para terapias basadas en células madre mesenquimales.

Específicamente, en una variación de la descripción, se proporcionan aquí métodos para determinar si un individuo elegible para recibir una terapia basada en IL-2, para el tratamiento de una afección tal como cáncer o VIH, puede experimentar un evento adverso asociado con esa terapia basada en IL-2. El método implica medir un aumento en los niveles de expresión de ciertos biomarcadores en una muestra del individuo tras la exposición a IL-2, siendo tales biomarcadores indicativos de la senescencia celular de las MSC en la muestra. La expresión de dichos biomarcadores indicaría que el individuo podría experimentar un evento adverso (tal como tumorigénesis o metástasis) si se administrara o continuara la terapia basada en IL-2. Las decisiones de tratamiento se pueden tomar con base en la práctica de este método y el uso de los kits descritos aquí.

En otra variación de la descripción, se proporcionan aquí métodos para determinar la idoneidad de una población de MSC para administración (por ejemplo, trasplante) a un individuo para una terapia basada en MSC. El método implica medir un cambio en los niveles de expresión de ciertos biomarcadores en las MSC tras la exposición a IL-2, estando tales biomarcadores asociados con la senescencia celular de las MSC. Si se observa un aumento en los biomarcadores, indicaría que si las células se administraran a un individuo, el individuo podría experimentar eventos adversos asociados con el trasplante, tales como transformación metastásica y crecimiento invasivo. Por el contrario, si no se observa ningún cambio o se observa una disminución en los niveles de expresión de los biomarcadores, podría indicar la idoneidad de la población de células para la administración. Las decisiones de tratamiento con respecto al trasplante de MSC se pueden tomar en base a la práctica de este método y el uso de los kits descritos aquí.

Estos se discuten con más detalle aquí.

2. SEN-MSC y SR-MSC

Se proporcionan aquí métodos para medir los niveles de expresión de biomarcadores al exponer una muestra que comprende MSC a IL-2, en los que los biomarcadores son indicativos de senescencia celular. Como se usa aquí, las MSC SEN son aquellas células que son replicativamente senescentes. La senescencia replicativa se caracteriza por la detención del crecimiento, resistencia a la apoptosis, altos niveles de actividades metabólicas, cambios morfológicos y de tamaño celular, altos niveles de expresión de los supresores tumorales P16, P21, P53 y/o RB, aumento de la actividad de la beta galactosidasa asociada a la senescencia (SA-p-gal), y la pérdida de la capacidad de sintetizar y reparar el ADN. El envejecimiento replicativo de las MSC puede influir en sus propiedades biológicas.

Las SR-MSC, por otro lado, están asociadas con ser productivas: expresan un conjunto de ARN codificantes o no codificantes indicativos de calidad; se renuevan a sí mismas; no son senescentes; no se acercan a la senescencia; se han hecho pasar 6 veces o menos; exhiben un alto potencial de crecimiento; producen proteínas de interés; permiten la regeneración de tejidos a largo plazo; inducen la corrección a largo plazo de una enfermedad; no exhiben ninguna o exhiben solo una baja probabilidad de inmortalización; exhiben potencial tumorigénico bajo o nulo; y contienen pocas o ninguna integración pro-viral. En una variación ejemplar, las células madre productivas se autorrenuevan. En algunas variaciones, las células madre productivas muestran al menos dos, tres, cuatro, cinco, o más de las características asociadas con la productividad.

3. Detección de los biomarcadores de interés

Los métodos complementarios descritos aquí dependen de la medida de los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores de un panel de biomarcadores asociados con la senescencia celular; por ejemplo, el panel puede comprender biomarcadores que son antiapoptóticos, angiogénicos, tumorigénicos, conducen al desarrollo vascular, responsables del crecimiento invasivo, metástasis, motilidad celular, migración, y similares. En general, los métodos proporcionan la medida de los marcadores para determinar si el uso de una terapia con IL-2 o el trasplante de las MSC podría provocar eventos adversos. Como se usa aquí, los eventos adversos que siguen a una terapia con IL-2 o trasplante de MSC incluyen, pero no se limitan a, un aumento en la tumorigénesis, actividad antiapoptótica, angiogénesis, desarrollo vascular, crecimiento invasivo, metástasis, motilidad celular, y migración.

Como se proporciona aquí, los biomarcadores asociados con la senescencia celular que se regulan al alza en respuesta a la IL-2 pueden incluir los enumerados en las Tablas 1-4, Tabla 5B, y FIGS. 7A-7D.

En algunas variaciones, el método comprende medir los niveles de ARN de los biomarcadores. Dichos métodos son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, el uso de Q-PCR, tecnologías basadas en matriz, RNA-seq, análisis transcriptómico, análisis transcriptómico de una sola célula, e hibridación in situ.

En algunas variaciones, el método comprende medir los niveles de proteína de los biomarcadores. Dichos métodos son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, el uso de un ensayo ELISA, una matriz proteómica, inmunohistoquímica, transferencia Western, espectrometría de masas (MS), una matriz de anticuerpos, o un ensayo de quimioluminiscencia.

En algunas variaciones, el método comprende medir tanto los niveles de ARN como de proteína de los biomarcadores.

Los biomarcadores se miden y se comparan con un nivel de referencia. Como se contempla aquí, un nivel de referencia puede comprender una muestra del mismo individuo antes del tratamiento con IL-2; puede comprender una muestra de un individuo sano que no ha recibido nada de IL-2; o puede comprender una colección de muestras que representan un grupo heterogéneo de individuos que no han recibido tratamiento con IL-2.

En variaciones particulares, se determina que los niveles de expresión de ARN de un biomarcador aumentan si muestran una expresión al menos 1,1, al menos 1,2, al menos 1,3, al menos 1,4, al menos 1,5, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 50, al menos 75, o incluso al menos 100 veces mayor que el nivel de referencia del biomarcador. El número de veces puede referirse generalmente a los valores del número de veces en bruto, a los valores GFOLD, o a los valores del número de veces calculados usando algoritmos conocidos por el experto.

Las diferencias dependientes del ARN en la expresión génica se pueden medir usando un método de cálculo GFOLD (Feng et al, Bioinformatics. 2012), para estimar el número de veces de los cambios que tiene en cuenta la incertidumbre de la medida de la expresión génica por RNA-seq. En estas variaciones, el uso de GFOLD permite la diferencia relativa de expresión génica, y facilita la comparación de genes con diferentes niveles de expresión o de diferentes longitudes.

En variaciones particulares, se determina que los niveles de expresión de proteínas de un biomarcador aumentan si muestran una expresión al menos 1,1, al menos 1,2, al menos 1,3, al menos 1,4, al menos 1,5, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 50, al menos 75, o incluso al menos 100 veces mayor que el nivel de referencia del biomarcador.

4, Identidad de los biomarcadores de interés

Tal como se menciona aquí, por “biomarcador” se entiende cualquier molécula biológica (o fragmento de la misma) de interés, por ejemplo un biomarcador que está presente en el citoplasma celular, en la superficie, o se segrega. Tales biomarcadores incluyen, pero no se limitan a, biomoléculas que comprenden polipéptidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, glicoproteínas, ribonucleoproteínas, lipoproteínas, glicolípidos, y fragmentos de los mismos. Cuando el biomarcador comprende una proteína, la proteína puede ser una proteína segregada, una proteína intracelular, o una proteína de membrana. Las proteínas biomarcadoras incluyen, pero no se limitan a, péptidos, polipéptidos, glicoproteínas, lipoproteínas, citocinas, factores de crecimiento, anticuerpos, y otras moléculas inmunogénicas. El biomarcador también puede ser una proteína transmembránica, o puede estar unido a una proteína transmembránica o a un lípido de membrana, por ejemplo.

Como se proporciona aquí, los biomarcadores asociados con la senescencia celular que se regulan al alza en respuesta a la IL-2 son los enumerados en las Tablas 1-4, Tabla 5B, y FIGS. 7A-7D.

En algunas variaciones, los métodos comprenden medir los niveles de expresión de al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o incluso al menos 20 biomarcadores del panel de biomarcadores para la determinación de posibles eventos adversos asociados con terapias basadas en IL-2 y/o para la determinación de la idoneidad de una población de MSC para trasplante.

En algunas variaciones, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de cualquiera de los biomarcadores presentados en las Tablas 1-4. En algunas variaciones, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores presentados en las FIGS. 7A-7D. En algunas variaciones, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores presentados en la Tabla 5B.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es TIE-1 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1 RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es TIE-2 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1 RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1. En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es TIE-1 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es TIMP-4 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1 RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es FGF1 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1 RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es LIF y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1 RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es TGFBR2 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1 RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es CSF1 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es TGFa y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es TGFb1 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es IL17D y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es SDF2 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es TGFBRAP1 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TG Fpi, IL17D, SDF2, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es FGF11 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFP1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es TNFSF13B y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es FGF14 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1 RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es IL1 b y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, TGFa, TGFb1 IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es IL-11, y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es IL-32 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es IL-6 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es IL1RN y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es IL-20RB y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es IL-21R y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es PLAU y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es GNB2L1 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es PLEKHA6y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es CTSB y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es FERMT1 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es CRMP1 y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es VEGFB y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, TNFSF13B, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es VEGFA y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, FGF14, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores, en el que el primer biomarcador es PLEKHAl y el segundo biomarcador se selecciona del grupo que consiste en TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, CSF1, TGFa, TGFb1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, IL1 b, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21 R, PLAU, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, y VEGFA.

En otras variaciones proporcionadas aquí, de los al menos dos biomarcadores medidos, al menos un biomarcador es un factor que conduce al desarrollo vascular, incluyendo los factores implicados en el desarrollo vascular y la ^{remodelación relacionada con la angiogénesis, tales como TIE-1, TIE-2,}TiMp-4, ^{VEGFA, VEGFB, FBLN5, FBLN7,}PGF, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL2, ANGPTL6, TNFSF12, PRKCA, PIK3CA, y ESM1.

En algunas variaciones proporcionadas aquí, de los al menos dos biomarcadores medidos, al menos un biomarcador es un factor antiinflamatorio o inmunomodulador tal como CD99, CERCAM, HIVEP1, PTGER1, IL-32, ITFG1, ITGA V, HIVEP2, CSF1R, TNFSF13, IRAK3, MYL9, NOS3, IL12A, TNFRSF21, IRAK1, IL33, LRRC8A, CLEC11A, CCL28, ESM1, CMIP, TNFRSF25, CHST3, CD72, CD320, CD83, IL6, CD68, CD99, IL-16, o ILF3. El método puede comprender además determinar si los niveles de expresión de KIF 14, CCL2, ILF2, IL7R, PEAR 1, o IL 16 disminuyen.

En algunas variaciones proporcionadas aquí, de los al menos dos biomarcadores medidos, al menos un biomarcador es un factor de crecimiento transformante (TGFa, TGFb1 o TGFb2), el receptor del factor beta de crecimiento transformante TGFBR2, o la proteína asociada al receptor del factor beta de crecimiento transformante TGFBRAP1.

En algunas variaciones proporcionadas aquí, de los al menos dos biomarcadores medidos, al menos un biomarcador es un factor promotor de la motilidad celular, la migración y el crecimiento invasivo, tal como TIE-1, TIE-2, TIMP-4, CGNL1, CGREF1, CRMP1, FGD6, TNK2, PTGS1, TNFAIP8, CTSB, CTSO, FAP, FERMT1, PLEKHA1, PLEKHA6, ROCK1, o ROCK2.

En algunas variaciones proporcionadas aquí, de los al menos dos biomarcadores medidos, al menos un biomarcador ^{es un factor antiapoptótico, por ejemplo}vEgFA, ^{VEGFB, PLEKHA1, PLEKHA6, CRMP1, FERMY1, CTSB, TGFB1, o}GNB2L1.

En algunas variaciones proporcionadas aquí, la disminución en los niveles de expresión de CHD24, CYR61, ILK, ^{NEDD9, MYL9, PPAP2B,}rElN, ^{ICAM 2, lCAM3 y TLN2 se monitoriza adicionalmente, ya que estos son factores que}promueven la adhesión celular.

En algunas variaciones, se mide adicionalmente la disminución en los niveles de expresión de SIVA1.

En algunas variaciones proporcionadas aquí, de los al menos dos biomarcadores medidos, al menos un biomarcador es una interleucina, por ejemplo, IL1b, IL3, IL5, IL6, IL9, IL10, IL12b, proteína a de unión a IL18, IL9, IL-11, IL12a, IL12b, IL-4, o IL-16.

En algunas variaciones proporcionadas aquí, de los al menos dos biomarcadores medidos, al menos un biomarcador es un receptor de interleucina, por ejemplo IL1Ra, IL1R4, IL10Rb, IL18Rb, IL1R2, IL-21R, IL-2Rb, IL-2Ry, IL5Ra, IL1R1, IL1R2, o IL1R4.

En algunas variaciones proporcionadas aquí, de los al menos dos biomarcadores medidos, al menos un biomarcador es una quimiocina, por ejemplo CCL8, CCL13, CCL15, CCL17, CCL18, CCL20, CCL22, CCL24, CCL26, CXCL9, CXCL11, CCL2, CCL4, CCL5, CCL23, CCL25, CCL27, CXCL10, CCL23, CXCL16, o CCL27.

En algunas variaciones proporcionadas aquí, de los al menos dos biomarcadores medidos, al menos un biomarcador es un factor de crecimiento, una hormona, o un receptor del factor de crecimiento, por ejemplo FGF6, IGF1, IGF2, LAP, NT3, PDGFAA, PDGFAB, SCF, TGF2, TGFa, TGFp1, TGFb3, TNFp, PDGFRa, PDGFRp, VEGF, VEGFD, VEGFR, FGF4, FGF9, similar a HGF, IGFBP 6, PDGFBp, IFNg, SDF1A, DR6, ENDOGLINA, ERBB3, FAS LG, GDNF, GITR LG, LEPR, SCFR, SIGLEC 5, TIE-1&2, BDNF, BMP4, FGF7, IGFBP2, DR6, ANG, CNTF, EGF, EOTAXINA 1, NGFR, ACRP30, AGRP, ANGPT2, LEP, NT4, HGF, PRL, SCFR, FAS LG, IGFBP 1, o IGFBP 2.

En una variación, los al menos dos biomarcadores se seleccionan de un panel de biomarcadores que comprende TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFp1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 p, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, el método comprende medir los niveles de expresión de al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o incluso al menos 20 biomarcadores seleccionados de TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFp1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 p, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, se miden los niveles de TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFp1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 p, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

En una variación, el método comprende medir los niveles de expresión de al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, o incluso al menos 8 biomarcadores seleccionados de VEGFA, PLEKHA1, VEGFB, CRMP1, FERMT1, CTSB, PLEKHA6, GNB2L1, y TGFp1.

En una variación, el método comprende medir los niveles de expresión de VEGFA, PLEKHA1, VEGFB, CRMP1, FERMT1, CTSB, PLEKHA6, GNB2L1, y TGFp1.

En algunas variaciones, el método comprende además medir el nivel de SIVA1. SIVA1 es uno de los pocos biomarcadores observados que disminuyen en las SEN-MSC, cuando se exponen a IL-2.

En algunas variaciones, se mide la expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores que comprende TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFp1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 p, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, c Rm P1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1, y se mide el nivel de expresión de SIVA1. Si se determina que el nivel de expresión de los al menos dos biomarcadores aumenta, con respecto a los niveles de referencia, y el nivel de expresión de SIVA1 disminuye, con respecto a los niveles de referencia, entonces se determina que (1) el individuo tiene una mayor probabilidad de experimentar eventos adversos asociados con la terapia basada en IL-2, o (2) la población de las MSC no es adecuada para uso en trasplantes.

En algunas variaciones, se mide la expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores que comprende TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFp1, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, FGF11, TNFSF13B, FGF14, IL1 p, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, c Rm P1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1, y se mide el nivel de expresión de SIVA1. Si se determina que el nivel de expresión de los al menos dos biomarcadores disminuye, o no presenta cambios, con respecto a los niveles de referencia, y el nivel de expresión de SIVA1 aumenta, con respecto a los niveles de referencia, entonces se determina que (1) el individuo tiene una mayor probabilidad de experimentar eventos adversos asociados con la terapia basada en IL-2, o (2) la población de las MSC no es adecuada para uso en trasplantes.

En algunas variaciones, se mide la expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores que comprende VEGFA, PLEKHA1, VEGFB, CRMP1, FERMT1, CTSB, PLEKHA6, GNB2L1, y TGFp1, y se mide el nivel de expresión de SIVA1. Si se determina que el nivel de expresión de los al menos dos biomarcadores aumenta, con respecto a los niveles de referencia, y el nivel de expresión de SIVA1 disminuye, con respecto a los niveles de referencia, entonces se determina que (1) el individuo tiene una mayor probabilidad de experimentar eventos adversos asociados con la terapia basada en IL-2, o (2) la población de las MSC no es adecuada para uso en trasplantes.

En algunas variaciones, se mide la expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores que comprende TIE-1, TIE-2, TIMP-4, VEGFA, PLEKHA1, VEGFB, CRMP1, FERMT1, CTSB, PLEKHA6, GNB2L1, y TGFp1, y se mide el nivel de expresión de SIVA1. Si se determina que el nivel de expresión de los al menos dos biomarcadores disminuye, o no presenta cambios, con respecto a los niveles de referencia, y el nivel de expresión de SIVA1 aumenta, con respecto a los niveles de referencia, entonces se determina que (1) el individuo tiene una mayor probabilidad de experimentar eventos adversos asociados con la terapia basada en IL-2, o (2) la población de las MSC no es adecuada para uso en trasplantes.

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de ARN del biomarcador TGFP1 disminuye aproximadamente 0,25 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2). El número de veces puede ser un valor de número de veces bruto o un valor GFOLD.

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de ARN del biomarcador SIVA1 disminuye en alrededor de al menos 0,2 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2). El número de veces puede ser un valor de número de veces bruto o un valor GFOLD.

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de ARN del biomarcador CRMP1 aumenta en alrededor de al menos 0,22 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2). El número de veces puede ser un valor de número de veces bruto o un valor GFOLD.

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de ARN del biomarcador VEGFB aumenta en alrededor de al menos 0,19 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2). El número de veces puede ser un valor de número de veces bruto o un valor GFOLD.

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de ARN del biomarcador VEGFA aumenta en alrededor de al menos 1,5 veces o alrededor de 1,78 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2). El número de veces puede ser un valor de número de veces bruto o un valor GFOLD.

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de ARN del biomarcador PLEKHA1 aumenta en alrededor de al menos 0,46 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2). El número de veces puede ser un valor de número de veces bruto o un valor GFOLD.

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de ARN del biomarcador CTSB aumenta en alrededor de al menos 0,25 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2). El número de veces puede ser un valor de número de veces bruto o un valor GFOLD.

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de ARN de TGFP1 disminuye en alrededor de -0,25 GFOLD, y SIVA1 disminuye en alrededor de -0,2 GFo Ld con el tratamiento con IL-2, y los niveles de CRMP1 aumentan en alrededor de 0,22 GFOLD, VEGFB aumenta en alrededor de 0,19 GFOLD, VEGFA aumenta en alrededor de 1,78 GFOLD, PLEKHA1 aumenta en alrededor de 0,459 GFOLD, CTSB aumenta en alrededor de 0,25 GFOLD, en las mismas condiciones.

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de proteína del biomarcador TIE-1 aumenta en alrededor de al menos 2 veces, al menos 3 veces, o alrededor de 3,73 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2).

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de proteína del biomarcador TIE-2 aumenta en alrededor de al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, o alrededor de 5,24 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2).

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de proteína del biomarcador TIMP-4 aumenta en alrededor de al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, o alrededor de 4,31 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2).

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de proteína del biomarcador IL-11 aumenta en alrededor de al menos 1,1 veces, al menos 1,2 veces, al menos 1,3 veces, al menos 1,4, o alrededor de 1,42 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2).

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de proteína del biomarcador IL1 b aumenta en alrededor de al menos 1,1 veces, o alrededor de 1,14 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2).

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de proteína del biomarcador TGFa aumenta en alrededor de al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, o alrededor de 2,4 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2).

En una variación particular de la descripción, el nivel de expresión de proteína del biomarcador TGFP1 aumenta en alrededor de al menos 1,1 veces, al menos 1,2 veces, al menos 1,3 veces, al menos 1,4 veces, o alrededor de 1,44 veces en la muestra tras el tratamiento con IL-2, en comparación con un nivel de referencia (muestra no tratada con IL-2).

En una variación particular de la descripción, en una muestra, el nivel de expresión de proteína del biomarcador TIE-1 aumenta en alrededor de 3,73 veces, el nivel de expresión de proteína de TIE-2 aumenta en alrededor de 5,24 veces, el nivel de expresión de proteína de TIMP-4 aumenta en alrededor de 4,31 veces, el nivel de expresión de proteína de IL-11 aumenta en alrededor de 1,42 veces, el nivel de expresión de proteína de IL1 b aumenta en alrededor de 1,14 veces, el nivel de expresión de proteína de TGFa aumenta en alrededor de 2,4 veces, TGFP1 aumenta en alrededor de 1,44 veces, en comparación con los niveles de referencia.

5. Métodos complementarios para la terapia de IL-2

Como se contempla aquí, la administración de IL-2 influye en las propiedades secretoras de las MSC, y el tratamiento con IL-2 puede conducir a posibles resultados adversos en ciertos individuos. Se describen aquí kits de diagnóstico, ensayos y métodos que se pueden usar para determinar si un individuo elegible para recibir una terapia basada en IL-2 puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2, en base a la caracterización de la producción de ciertos biomarcadores (como se describe anteriormente). También se describen aquí métodos para tratar a un paciente con IL-2.

Como se usa aquí, los eventos adversos potenciales asociados con una terapia basada en IL-2 están asociados con la senescencia celular, e incluyen eventos tales como angiogénesis, tumorigénesis, desarrollo vascular, crecimiento invasivo, metástasis, motilidad celular, migración, y similares. La invención permite la determinación de si un individuo puede experimentar, experimentará, o es probable que experimente un evento adverso asociado con una terapia basada en IL-2. En una variación, la descripción permite la determinación de una mayor probabilidad de experimentar un evento adverso en alrededor de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o incluso alrededor de 100%

En una variación, el individuo ha recibido al menos una dosis de una terapia basada en IL-2 antes de que se lleve a cabo el método en una muestra del individuo. En esta variación, el método para determinar si un individuo elegible para recibir una terapia basada en IL-2 puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2 comprende: medir los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores indicativos de senescencia de MSC descritos aquí (el panel de biomarcadores son antiapoptóticos, angiogénicos, tumorigénicos, conducen al desarrollo vascular, son responsables del crecimiento invasivo, metástasis, motilidad celular, migración, y similares) en una muestra del individuo, en el que el individuo ha recibido al menos una dosis de una terapia basada en IL-2; y comparar los niveles de los biomarcadores con los niveles de referencia, en el que un aumento en los niveles por encima de los niveles de referencia indica que el individuo puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2, y en el que una disminución o ningún cambio en los niveles en comparación con los niveles de referencia indica que es posible que el individuo no experimente un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2.

En otra variación, se obtiene una muestra del individuo y se expone a (incubada con, combinada con, etc.) IL-2 in vitro. En esta variación, el método para determinar si un individuo elegible para recibir una terapia basada en IL-2 puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2 comprende: medir los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores indicativos de senescencia de MSC en una muestra del individuo, en el que el individuo ha recibido al menos una dosis de una terapia basada en IL-2; y comparar los niveles de los biomarcadores con los niveles de referencia, en el que un aumento en los niveles por encima de los niveles de referencia indica que el individuo puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2, y en el que una disminución o ningún cambio en los niveles en comparación con los niveles de referencia indica que es posible que el individuo no experimente un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2.

En otra variación, el método está dirigido a tratar a un individuo para cáncer con una terapia basada en IL-2, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de la terapia basada en IL-2 al individuo cuando los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores aumentan en comparación con los niveles de referencia en una muestra del individuo, en el que (1) el individuo ha recibido al menos una dosis de una terapia basada en IL-2 o (2) la muestra se combina con IL-2 in vitro, y en el que el panel de biomarcadores comprende biomarcadores de senescencia celular.

Los biomarcadores, si están presentes en niveles elevados, son indicativos de la presencia de las MSC SEN, e indican la probabilidad de que un tratamiento adicional con IL-2 pueda provocar efectos adversos, tales como la promoción de la tumorigénesis, la invasión, o la metástasis en el individuo. En base a esto, se puede determinar que el individuo no debe recibir una terapia basada en IL-2. Alternativamente, si al practicar estos métodos se determina que el uso de una terapia basada en IL-2 probablemente no produciría efectos adversos (por ejemplo, es probable que no promueva la tumorigénesis, la invasión, o la metástasis), en base a la expresión de un determinado conjunto de biomarcadores, entonces podría determinarse que es aceptable administrar una terapia basada en IL-2, y opcionalmente se administraría la terapia basada en IL-2.

Como se usa aquí, una “terapia basada en IL-2” es aquella que implica la administración de IL-2 sola, o IL-2 en combinación con otro agente. La administración de IL-2 contempla la administración de una porción activa de IL-2, sola o fusionada con otros motivos. Una terapia basada en IL-2 puede administrarse mediante cualquier forma de inyección, incluyendo inyección intravenosa (IV), intramuscular (IM), o transdérmica o subcutánea (SC); por vía oral o nasal; o por administración tópica (crema, gotitas, etc.). En una variación particular de la descripción, la IL-2 se usa como una formulación de liberación sostenida, o una formulación que se administra usando un dispositivo de liberación sostenida. Dichos dispositivos son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, parches transdérmicos y bombas implantables en miniatura que pueden proporcionar la administración de fármacos a lo largo del tiempo de manera continua y constante en una variedad de dosis para lograr un efecto de liberación sostenida. También se pueden contemplar formulaciones sublinguales o de colirios.

Como se proporciona aquí, la muestra usada para el análisis de expresión puede ser cualquier muestra, incluyendo, pero sin limitarse a, un tejido, biopsia, sangre, plasma, suero, orina, saliva, LCR, heces, linfa, semen, y sudor. En variaciones particulares, la muestra es una muestra de sangre, plasma, o suero; en una variación ejemplar, la muestra es sangre. Sin estar ligado a ninguna teoría, debido a que las MSC están situadas en compartimentos perivasculares, los factores producidos por las MSC en respuesta a la administración de IL-2 pueden ser sistémicos/circulatorios, y podrían medirse fácilmente en una muestra de sangre.

En las variaciones proporcionadas aquí, los niveles de expresión de la muestra se pueden medir en cualquier momento después de la administración de la terapia basada en IL-2 al individuo, o en cualquier momento después de mezclar in vitro IL-2 (mezcla de una porción activa de IL-2, sola o fusionada con otros motivos, con la muestra), por ejemplo 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2, 3, 4, 6, 12, 15, 24, 36, 48, 72, o incluso 96 horas después.

En algunas variaciones, a un individuo se le administran múltiples dosis de la terapia basada en IL-2 antes de la medida. En algunas variaciones, al individuo se le administra una dosis única de la terapia basada en IL-2 antes de la medida. Normalmente, la dosis de IL-2 depende de la selección específica del producto de IL-2. Se pueden administrar aproximadamente 0,001 a 0,1 mg/kg de peso corporal del paciente; en algunas variaciones, se pueden administrar alrededor de 0,005, 0,01, 0,05 mg/kg. En algunas variaciones, se administran 600.000 UI/kg (las UI pueden determinarse mediante un bioensayo de proliferación de linfocitos, y se expresan en Unidades Internacionales (UI) según lo establecido por el primer estándar internacional de la Organización Mundial de la Salud para la IL-2 humana. En algunas variaciones, la dosis de IL-2 oscila de 0,01 MUI/día a 3,0 MUI/día/paciente (MUI son millones de unidades internacionales). Las terapias basadas en IL-2 se pueden administrar una o más veces por día a una o más veces por semana, incluyendo una vez cada dos días. El experto apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el tiempo requerido para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de IL-2 puede incluir un solo tratamiento, o puede incluir una serie de tratamientos. En una variación, las composiciones se administran cada 8 horas durante cinco días, seguido de un período de descanso de 2 a 14 días, por ejemplo 9 días, seguido de cinco días adicionales de administración cada 8 horas.

Los métodos complementarios para el tratamiento con IL-2 proporcionados aquí pueden ser particularmente adecuados como método complementario para el cáncer, dado el uso generalizado de agentes terapéuticos basados en IL-2 para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, los métodos descritos no se limitan a la terapia del cáncer, y son aplicables a cualquier enfermedad para la que una IL-2 sea un tratamiento aprobado o candidato. Sin embargo, en algunas variaciones, el individuo ha recibido la terapia basada en IL-2 para el tratamiento de un cáncer. En algunas variaciones, el cáncer se selecciona de entre carcinoma de células renales, melanoma, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma in situ (ISC), carcinoma de células escamosas (SCC), cáncer de tiroides, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, hepatoma, melanoma, glioma, retinoblastoma, mesotelioma, mieloma, linfoma, y leucemia. En algunos ejemplos, el cáncer es un cáncer en etapa tardía, un cáncer metastático, o un cáncer recidivante. En otras variaciones, el tratamiento con IL-2 es para cualquier afección asociada o causada por una respuesta inmunitaria indeseable, por ejemplo para enfermedades inflamatorias, relacionadas con el sistema inmunitario, o autoinmunes, incluyendo, pero sin limitación, vasculitis relacionada con VHC, uveítis, miositis, diabetes tipo I, lupus eritematoso sistémico, vasculitis sistémica, psoriasis, alergia, asma, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, aterosclerosis, enfermedad tiroidea autoinmune, enfermedades neurodegenerativas, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de injerto frente a hospedante, aborto espontáneo, y rechazo de aloinjertos.

Cuando se determine que el individuo es adecuado para recibir una terapia basada en IL-2, el tratamiento puede modificarse en función de los niveles determinados de biomarcadores detectados en la muestra, con respecto a la muestra de referencia. Los métodos se pueden usar para modificar el régimen de tratamiento (por ejemplo, aumentando la dosis o el programa de dosificación), en función de los niveles determinados de biomarcadores en la muestra con respecto a la muestra de referencia.

En una variación particular, si se determina que es probable que el individuo (por ejemplo, puede que no) experimente efectos adversos de una terapia basada en IL-2, y después se le administra la terapia basada en IL-2, el individuo puede ser evaluado posteriormente de nuevo para monitorizar los efectos adversos. De este modo, en esta variación, se evalúa a un individuo para determinar la probabilidad de posibles efectos adversos tanto antes del tratamiento como una vez que ha comenzado el tratamiento. La dosis y el programa de administración se pueden ajustar en consecuencia. Por ejemplo, se pueden implementar clínicamente regímenes de dosis bajas para tratamientos con IL-2. Además de los métodos complementarios descritos aquí, el efecto del tratamiento con IL-2 se puede monitorizar mediante medidas adicionales, por ejemplo los efectos de las terapias basadas en IL-2 en la diferenciación de las células T in vivo.

La FIG. 1B ilustra un método ejemplar para tratar un paciente con IL-2 consultando el estado de senescencia replicativa de MSC. En este ejemplo, el paciente se trata con una o más dosis de IL-2 101, y dentro de un período de tiempo predeterminado (por ejemplo, entre un tiempo de inicio de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, etc., y un tiempo de parada de 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 42 horas, 48 horas, 72 horas, o 96 horas, etc.), tomando una muestra del paciente 103. La muestra puede ser cualquier fluido o tejido apropiado como se proporciona aquí (por ejemplo, sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina, etc.). Esta muestra puede examinarse entonces para detectar la presencia/ausencia y/o el nivel de un panel de biomarcadores 105.

6. Control de calidad de las MSC antes del uso en terapias basadas en células

Las MSC se administran (trasplantan) para una variedad de indicaciones. Un aspecto importante de la descripción es la determinación de qué MSC serían adecuadas para la administración, antes de la administración. Específicamente, los métodos proporcionados permiten la selección de poblaciones de MSC adecuadas para la administración, después del ensayo, para evitar o reducir la probabilidad de actividades antiapoptóticas, angiogénicas, y tumorigénicas asociadas con las MSC trasplantadas en el entorno in vivo que puede ser proinflamatorio o de otro modo no propicio.

De este modo, en otro aspecto, se proporcionan aquí métodos para evaluar la calidad y el potencial de las células madre en una muestra. Dichos métodos y kits son útiles para ayudar a garantizar la seguridad y la calidad de una población de MSC antes de que se utilice en un individuo.

En una variación, un método para determinar si una población de MSC es adecuada para la administración a un individuo para una terapia basada en células madre comprende (a) incubar la población de MSC con IL-2 (incubar con una porción activa de IL-2, ya sea sola o fusionada con otros motivos); (b) medir los niveles de expresión en las células de un panel de biomarcadores asociados con la senescencia celular, en el que el panel de biomarcadores son antiapoptóticos, angiogénicos, tumorigénicos, conducen al desarrollo vascular, son responsables del crecimiento invasivo, metástasis, motilidad celular, migración, y similares; (c) comparar los niveles de los biomarcadores con los niveles de referencia, en el que un aumento en los niveles por encima de los niveles de referencia indica que las células madre no son óptimas para la administración a un individuo y podrían conducir a efectos adversos si se administran. Sin embargo, ningún cambio o una disminución en los niveles por debajo de los niveles de referencia podría indicar que las células madre son adecuadas para la administración a un individuo. Generalmente, por adecuado, se pretende transmitir que las células provocarían pocos o ningún evento adverso, tales como tumorigénicos, promotores de metástasis, antiapoptóticos, y similares.

En algunas variaciones, la población de células está destinada para uso autólogo. En otras variaciones, la población de células está destinada a uso alogénico. En algunas variaciones, la población de células comprende células de origen homogéneo, por ejemplo de un solo individuo. En algunas variaciones, las poblaciones de células comprenden células de origen heterogéneo, por ejemplo compuestas de células procedentes de una variedad de fuentes.

En las variaciones proporcionadas aquí, los niveles de expresión de la muestra se pueden medir en cualquier momento después de la incubación de la IL-2, por ejemplo 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2, 3, 4, 6, 12, 15, 24, 36, 48, 72, o incluso 96 horas después de la incubación con IL-2.

II. Kits y artículos de fabricación

La presente solicitud también proporciona kits para medir los niveles de biomarcadores en una muestra.

En una variación, los kits son para evaluar la idoneidad de una población de MSC para trasplante.

En otra variación, los kits son para determinar si se debe administrar una terapia basada en IL-2 a un individuo que la necesite.

En una variación, un kit comprende reactivos para medir el nivel de expresión de ARN de al menos dos biomarcadores en una muestra. Por ejemplo, el kit puede comprender sondas o cebadores, por ejemplo cebadores de Q-PCR, específicos para al menos dos biomarcadores seleccionados de cualquiera de los biomarcadores descritos aquí.

En una variación particular, el kit comprende al menos dos reactivos específicos para medir un biomarcador seleccionado de TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, FGF11, FGF14, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGF|31, IL17D, SDF2, TGFBRAP1, TNFSF13B, IL1B, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, PLEKHA1, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, y SIVA1, y VEGFA. En algunas variaciones, el cebador comprende un marcador, por ejemplo un marcador fluorescente. En algunas variaciones, el kit comprende al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o incluso al menos 20 reactivos, por ejemplo sondas o cebadores, para medir el nivel de expresión de ARN de biomarcadores en una muestra.

En otras variaciones, un kit comprende reactivos para medir el nivel de expresión de proteína de al menos dos biomarcadores en la muestra. Por ejemplo, el kit puede comprender anticuerpos específicos para al menos dos biomarcadores seleccionados de TIE-1, TIE-2, TIMP-4, FGF1, FGF11, FGF14, LIF, TGFBR2, CSF1, TGFa, TGFP1JL17D, SDF2, TGFBRAP1, TNFSF13B, IL1B, IL-11, IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, PLAU, GNB2L1, PLEKHA6, PLEKHA1, CTSB, FERMT1, CRMP1, VeGf B, y SIVA1, y VEGFA. En algunas variaciones, el anticuerpo comprende un marcador, por ejemplo un marcador fluorescente. En algunas variaciones, el kit comprende una matriz o placa de ELISA que comprende al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o incluso al menos 20 reactivos, por ejemplo anticuerpos, para medir el nivel de expresión de proteína de biomarcadores en una muestra.

En algunas variaciones, los kits comprenden además una composición de IL-2 (una composición que comprende IL-2 de longitud completa, o una porción de IL-2, sola o fusionada con otros motivos, con la muestra). Esta composición de IL-2 se puede usar para analizar una muestra in vitro o para la administración a un individuo, para la práctica de los métodos de la descripción.

En algunas variaciones, el kit comprende además un patrón de referencia para uso en el ensayo (una muestra que se analizará al lado para determinar que los niveles de referencia se generan en las mismas condiciones). En algunas variaciones, el kit comprende además una lista escrita de valores que sirven como niveles de referencia, por ejemplo niveles de referencia de una población de individuos sanos, o de individuos no tratados con IL-2, que proporcionan una referencia frente a la cual se pueden comprobar los resultados del ensayo.

En algunas variaciones, como se contempla aquí, los kits proporcionan múltiples ensayos para la medida de los niveles de expresión de biomarcadores particulares que se pueden usar en paralelo o en serie. Por ejemplo, un kit puede comprender tres placas de ensayo, con cebadores de Q-PCR o con anticuerpos, una dirigida a la detección de biomarcadores de factores de crecimiento, otra dirigida a la detección de biomarcadores antiapoptóticos, y otra dirigida a la detección de factores implicados en la motilidad y migración celulares. En otra variación, el kit puede comprender tres placas de ensayo, útiles para evaluar la muestra ensayada en tres momentos diferentes. Se entiende que el kit puede comprender cuatro, cinco, o más de tales placas para los fines de detección en serie o en paralelo de biomarcadores.

La presente solicitud también proporciona artículos de fabricación que comprenden uno cualquiera de los kits descritos aquí.

Debe entenderse que la terminología empleada aquí se usa únicamente con el fin de describir variaciones particulares, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas. Los siguientes ejemplos son para fines ilustrativos. Están destinados a mostrar ciertos aspectos y variaciones de la presente invención, pero no pretenden limitar la invención de ninguna manera.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Materiales y métodos

Este ejemplo proporciona métodos ejemplares de la invención, y proporciona los materiales y métodos usados posteriormente en los Ejemplos 2-10.

Aislamiento, cultivo y caracterización de las MSC

Las MSC usadas en esta investigación se aislaron de tejidos adiposos humanos obtenidos de donantes femeninas adultas sanas de 32 y 49 años que se sometieron a procedimientos de liposucción de rutina en el centro médico UCSD, San Diego, CA. El protocolo de aislamiento de las MSC fue aprobado por el comité de ética local, y se realizó como se describió anteriormente. Las líneas de células madre derivadas de tejido adiposo aisladas se cultivaron en medio DMEM/F12 (Life Technologies). De acuerdo con los criterios de definición mínima de MSC establecidos por la International Society for Cellular Therapy, el análisis de citometría de flujo mostró que las hADSC expresan CD29, CD73, CD90 y c D105, pero no expresan CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD80, CD86 (anticuerpos de eBiosciense, USA). El análisis morfológico mostró que las células presentan una morfología similar a la de los fibroblastos, eran adherentes al plástico, y eran capaces de diferenciarse adipogénica, condrogénica y osteogénicamente bajo condiciones in vitro usando medios de diferenciación disponibles comercialmente (Invitrogen, USA). Las duplicaciones acumulativas de la población (PD) se calcularon como PD = log(N/NO) x 3,33 a lo largo de las múltiples pasadas en función del número de días de crecimiento en cultivo, en la que NO es el número de células sembradas en el matraz, y N es el número de células recolectadas en esta pasada. En todos los experimentos se usaron poblaciones hADSC PD 4 o PD 6 SR y PD 41 y 45 para poblaciones SEN. El tratamiento con IL-2 recombinante (Peprotech, USA) se realizó como se describe (Deenick EK, Gett AV, Hodgkin PD (2003). J Immunol 170: 4963-4972). Se añadieron 20 U/ml de IL-2 a los medios de cultivo durante 24 horas a 37°C.

Ensayo de p-galactosidasa asociada a la senescencia (SA)

El ensayo para monitorizar la expresión de la actividad de 3-galactosidasa asociada a la senescencia dependiente del pH (SA-pGal) se realizó como se describe en el kit del fabricante (BioVision) y como se publicó previamente en Wang J, Geesman GJ, Hostikka SL, Atallah M, Blackwell B, et al. (2011) Inhibition of activated pericentromeric SINE/Alu repeat transcription in senescent human adult stem cells reinstates self-renewal. Cell cycle 10: 3016-3030. Las hADSC cultivadas se lavaron con PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con PBS, y se tiñeron con suplemento que contenía X-Gal, durante la noche a 37°C. Las células se lavaron dos veces con PBS, y las imágenes se capturaron con un microscopio (Nikons, TE300, DXM1200 Digital Camera, Japón).

Ensayo de migración e invasión

Los filtros Transwell procedían de Corning Incorporated (Acton, MA, USA), y todas las citocinas en uso se obtuvieron de Peprotech Inc. (Rocky Hill, NJ, USA). El ensayo de migración se realizó como se describe en Perez LM, Bernal A, San Martin N, Galvez b G (2013), Arch Physiol Biochem 119: 195-201, usando cámaras Transwell de 8 mm de grosor. Para el ensayo de migración de Transwell, 1,0 x 104 células se suspendieron en 80 ul de alfa-MEM sin suero, y se sembraron en la cámara superior de placas Transwell de 24 pocillos que contenían filtros de tamaño de poro de 8 mm (Corning, Costar, USA). En la cámara inferior, se añadieron 600 ul de DMEM o medio que contenía citocinas: IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, HMGp1. Las concentraciones usadas fueron: 50 ng/ml de IL-2, IL-6, IL-8 y HMGp1; 30 ng/ml de TNF-a como se describe en (Perez et al., 2013, Arch Physiol Biochem 119: 195-201). Las hADSC se incubaron a 37°C durante 16 h. Las células retenidas en la cámara superior se retiraron con mediante un hisopo, y aquellas que habían migrado a través del filtro se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente, y se tiñeron durante la noche con azul de toluidina al 5%. Las células se contaron en el lado inferior, en cinco campos diferentes 10x seleccionados al azar usando un microscopio de campo brillante (Nikons, TE300, DXM1200 Digital Camera, Japón). Estos experimentos se realizaron con las hADSC de dos donantes de 32 y 41 años de edad, poblaciones tanto SR o SEN, con cada donante muestreado más de tres veces.

Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA)

Se sembraron hADSC (SR o SEN) a una densidad de 105 células por placa de 10 cm2, y se trataron con 20 U/ml de IL-2 durante 24 horas, con controles no tratados como se describió previamente en Deenick EK, Gett AV, Hodgkin PD (2003) Stochastic model of T cell proliferation: a calculus revealing IL-2 regulation of precursor frequencies, cell cycle time, y survival. J Immunol 170: 4963-4972. Después, las fracciones de proteínas asociadas a la membrana celular se prepararon usando Mem-PER Plus #89842 (ThermoFisher Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. Las medidas de las concentraciones de receptores alfa y beta de IL-2 se obtuvieron usando los kits ELISA para IL-2R alfa humano y para IL-2R beta humano, #ELH-IL-2Ra y #ELH-IL-2Rb (RayBiotech, Inc) respectivamente. Las densidades ópticas para los patrones (receptores alfa y beta de IL-2 recombinante), así como las muestras experimentales, se midieron a 450 nm mediante SPECTRA Max Plus (Molecular Devices), y las concentraciones se calcularon según lo descrito en el protocolo del fabricante.

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real

El ARN total se aisló de las hADSC usando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemania). A continuación, se sintetizó ADNc usando el cDNA RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, USA). La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (Q-PCR) se realizó usando el instrumento TaqMan. Los niveles de expresión se calcularon como 2-AACt, en los que la expresión relativa se determinó mediante la normalización con respecto a la expresión del gen de beta-actina. Todos los ensayos se realizaron por triplicado, y se usaron muestras de control negativo sin ADNc. Los cebadores para la Q-PCR fueron los siguientes:

Cadena alfa del receptor de IL-2 (IL-2Ra) Dir: 5’-CTGCCACTCGGAACACAAC-3’ e Inv: 5’-TGGTCCACTGGCTGCATT-3’.

Cadena beta del receptor de IL-2 (IL-2Rp) Dir: 5’-ACTCGAGAGCCAACATCTCC-3’ e Inv: 5’-TCCGAGGATCAGGTTGCAG-3’

Cadena Gamma 1 del receptor de IL-2 (IL-2Rg1) Dir: 5’-TGGATGGGCAGAAACGCTA-3’ e Inv: 5’-GGCTTCCAATGCAAACAGGA-3’.

STAT 5A Dir: 5’-ACGCAGGACACAGAGAATGA-3’ e Inv: 5’-CTGGGCAAACTGAGCTTGG-3’.

STAT 5B Dir: 5’-ACACAGCTCCAGAACACGT-3’ e Inv: 5’-TGTTGGCTTCTCGGACCAA-3’.

VEGF A Dir: 5’-GGAGGAGGGCAGAATCATCA-3’ e Inv: 5’-ATCAGGGGCACACAGGATG-3’.

Análisis transcriptómico

El análisis transcriptómico se realizó con las hADSC SR y SEN tratadas con IL-2 y no tratadas (grupo de control), como se describió previamente en Deenick EK, Gett AV, Hodgkin PD (2003) Stochastic model of T cell proliferation: a calculus revealing IL-2 regulation of precursor frequencies, cell cycle time, y survival. J Immunol 170: 4963-4972. Los dos genotipos mostrados en la FIG. 3a se usaron para el análisis de cuatro condiciones diferentes: células SR o SEN, con o sin estimulación con IL-2, respectivamente. La misma cantidad (106) de células se sembró en medio DMEM F12 para cada condición experimental, y el tratamiento con IL-2 se realizó añadiendo 20 U/ml de IL-2 recombinante (Peprotech, USA) directamente en el medio durante 24 horas como se describió previamente en Deernick et al. 2003. El ARN total se aisló de las muestras usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, USA) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de dos pacientes diferentes se combinaron para las condiciones relevantes, y las concentraciones de ARN se midieron con el fluorímetro Qubit 2.0 usando el RNA HS Assay kit (Invitrogen, Life technologies, USA).

Se usaron 100 ng de ARN total de cada muestra para construir las bibliotecas para la secuenciación en el sistema Ion Proton™ (Life Technologies, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Antes del agotamiento del ARNr y de la construcción de la biblioteca RNA-seq, se añadió la mezcla de control ERCC RNA Spike-In (Ambion, Life Technologies) al ARN total para el análisis de control de calidad. La mezcla de control ERCC RNA Spike-In contiene 92 transcritos de 250-2000 nt de longitud que imitan los ARNm eucariotas naturales. Según el protocolo proporcionado por el fabricante, se añadieron 100 ng de ARN total a 2 ul de Mixl en una dilución 1:1000 de agregado. Posteriormente, el agotamiento de ARNr se realizó con el Low Input Ribominus Eukaryote System v2 (Ambion, Life technologies, USA). Las bibliotecas de ADNc se construyeron con Ion total RNA-seq kit v2 (Ambion, Life technologies, USA), y se codificaron con el código de barras Ion Xpress RNA-seq (Ambion, Life technologies). La distribución de tamaños y la cuantificación de las bibliotecas se realizaron en un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, USA). La secuenciación de la biblioteca se realizó en el sistema Ion Proton™ con chip PI, y cada biblioteca se secuenció 3 veces.

Análisis de datos de RNA-seq

Las lecturas de RNA-seq de los experimentos de secuenciación individuales del sistema Ion Proton™ se combinaron para cada una de las cuatro condiciones. Las lecturas de secuencia se asignaron al ensamblaje del genoma humano de referencia hgl9 (GRCh37) usando el Torrent Mapping Alignment Program (TMAP, Life technologies). La calidad de los cuatro experimentos de RNA-seq combinados específicos de la condición se evaluó comparando los recuentos esperados de secuencias de ARN de inserción de agregados de ERCC, obtenidos del sitio web del fabricante, con los recuentos observados de etiquetas de RNA-seq que se asignan a las mismas secuencias. Los niveles iniciales de expresión génica se tomaron como la suma de las lecturas asignadas a los exones para los modelos de genes NCBI RefSeq individuales (c), y los genes poco expresados (recuentos de lectura por millón <1) se eliminaron de los análisis posteriores. Para cada biblioteca, los niveles de expresión de genes individuales se normalizaron usando los niveles de expresión de beta-actina (ACTB) (cACTB) y la longitud total del exón l de cada gen. Para la biblioteca j, el factor de normalización de beta-actina sj se calculó como

y el valor final de expresión normalizada para el gen i en la biblioteca j se calculó como

El análisis de expresión génica diferencial entre pares de bibliotecas se realizó usando el programa GFOLD v1.1.3, ^{Feng J, Meyer}Ca, ^{Wang Q, Liu JS, Shirley Liu X, et al. (2012) GFOLD: a generalized fold change for ranking}differentially expressed genes from RNA-seq data. Bioinformatics 28: 2782-2788. GFOLD se escogió en base a su comportamiento superior demostrado a la hora de caracterizar genes expresados diferencialmente en ausencia de conjuntos de datos replicados. El análisis GFOLD produce una puntuación que mide el grado de expresión génica diferencial entre condiciones; aquí se utilizó el punto de corte de la puntuación GFOLD recomendado de ±0,01 para definir los genes expresados diferencialmente. El análisis de enriquecimiento funcional para genes expresados diferencialmente entre pares de bibliotecas se realizó usando el programa GSEA v2.1.0. Específicamente, se identificaron de esta manera rutas individuales que contienen múltiples genes que se regulan al alza o a la baja con el tratamiento con IL-2 en SR, SEN, o ambas. Las rutas individuales para conjuntos específicos de genes regulados diferencialmente (IL-2+ regulado al alza en SR, y/o SEN e IL-2+ regulado a la baja en SR y/o SEN) se relacionaron mediante redes en las que los nodos corresponden a las rutas, y los bordes corresponden a la presencia de genes compartidos entre rutas.

La FIG. 9 muestra la respuesta a la dosis del Consorcio de Controles de ARN Externos (ERCC, un conjunto común de controles de ARN externos) usada para el control de calidad de los experimentos de RNA-seq. Para cada uno de los cuatro grupos de RNA-seq específicos de la condición, los recuentos esperados de secuencias de ARN de agregado de ERCC se compararon con los recuentos observados de etiquetas de RNA-seq que se asignan a las mismas secuencias. Los recuentos observados frente a los esperados estaban altamente correlacionados, como lo indica la forma de la regresión y los valores r de correlación de Pearson, consistente con los resultados de RNA-seq de alta calidad.

Ejemplo 2: Caracterización del fenotipo senescente de MSC

En este ejemplo se describe un estudio que se realizó para evaluar el impacto de la senescencia replicativa en la actividad transcripcional de las MSC derivadas de tejido adiposo humano (hADSC) en respuesta a la señalización de IL-2.

IL-2 señaliza a través de receptores específicos, con tres clases de receptores de superficie celular formadas por diversas combinaciones de tres subunidades de IL-2R: IL-2Ra (CD25), IL-2RP (CD 122) e IL-2Rg (CD 132). Los resultados experimentales indican que las hADSC expresan transcripcionalmente los tres receptores; sin embargo, la expresión de proteína del IL-2Ra (IL-2Ra) en las hADSC es menor que la observada para IL-2RP. Estas observaciones indican que una composición de receptor de IL-2 que consiste en las isoformas IL-2RP e IL-2Rg podría mediar en la forma predominante de reconocimiento de la citocina IL-2 por parte de las hADSC. La composición del receptor cambia solo ligeramente con el envejecimiento replicativo de las hADSC, lo que indica que la capacidad de respuesta de las hADSC a IL-2 no cambia con su senescencia.

Las hADSC se aislaron y cultivaron como se describe anteriormente. La senescencia replicativa ex vivo condujo a una disminución de la proliferación, acumulación de daños en el ADN, y cambios morfológicos: las hADSC se volvieron mucho más grandes, con una forma irregular y plana, y los núcleos se volvieron más circunscritos en microscopía de contraste de fase, con la aparición en el citoplasma granular de muchas inclusiones y ampliaciones. La curva de crecimiento de las hADSC obtenidas de dos pacientes diferentes se muestra en la FIG. 3A. La tinción típica para la actividad de P galactosidasa asociada a la senescencia SA para las hADSC en tasa de crecimiento lineal, SR, o cuando las líneas celulares cesan su proliferación, SEN, se muestra en la FIG. 3B.

Ejemplo 3: Las SEN-MSC demuestran una mayor propensión a la migración

Este ejemplo muestra que la senescencia replicativa afecta el potencial migratorio de las hADSC. Se realizaron ensayos de migración usando un conjunto de citocinas y factores de crecimiento usando el sistema Transwell como se describe en la sección de Materiales y Métodos, a continuación. Se observó que las MSC derivadas de tejido adiposo que experimentaban senescencia replicativa demostraron una mayor propensión a la migración. Se observó que las hADSC SEN mostraban una capacidad de migración basal significativamente mayor que sus equivalentes SR (FIG. 3C). La FIG. 3C muestra ensayos de migración ex vivo para las hADSC que se autorrenuevan (SR, a la izquierda) y senescentes (SEN, a la derecha). Las líneas negras indican los valores medianos, y los bigotes indican el intervalo de valores. Las diferencias estadísticas se evaluaron mediante una prueba de la t con el valor de p (p) como se muestra.

Además, se midió la respuesta de las hADSC SEN a diferentes quimioatrayentes de citocinas. Se observó que las hADSC tienen una mayor capacidad para migrar para pasadas tardías en comparación con pasadas tempranas (FIG.

3D), lo que indica que la senescencia replicativa aumenta las propiedades migratorias de las hADSC en respuesta a los quimioatrayentes ensayados. IL-2 fue el estimulante de quimiotaxis más potente en las SEN-MSC, mientras que TNF-a fue menos potente entre los quimioatrayentes ensayados en estos experimentos (FIG. 3D). La FIG. 3D muestra la migración de las hADSC que se autorrenuevan SR (a la izquierda) y de senescencia SEN (derecha). Se indujo la migración de las hADSC en presencia de diferentes citocinas (50 ng/ml de IL-2, IL-6, IL-8, HMGB1; 30 ng/ml de TNF). El gráfico representa la media de diez experimentos independientes (n=10). Los valores de p (p) relacionados con las medidas experimentales se enumeran debajo de los gráficos.

Estos datos indicaron que la senescencia replicativa modifica las propiedades migratorias de las hADSC, y puede influir en la respuesta de las MSC al entorno inflamatorio e influir en su resultado de inmunomodulación.

Ejemplo 4: Respuesta diferencial a la estimulación con IL-2 en las MSC derivadas de tejido adiposo humano tras la senescencia replicativa

La evaluación de la expresión de las isoformas del receptor de IL-2, mediante Q-PCR, demostró cambios significativos en la expresión de la isoforma IL-2Ra en comparación con IL-2Rg e IL-2RP tras la senescencia replicativa ex vivo (FIG.

4B). La FIG. 4B muestra los receptores a, P y g de IL-2, evaluados mediante PCR cuantitativa (Q-PCR), en células SR no estimuladas (IL-2-) (primera barra) y células SEN (tercera barra), y tras estimulación con 20 ug/ml de IL-2 recombinante (IL-2+) (células SR, segunda barra; células SEN, cuarta barra). Datos mostrados como número de veces de cambio (AACT). Se muestra la media ± SD de tres experimentos independientes. En particular, el aumento de la acumulación de los transcritos de IL-2RP e IL-2Ra se registró después del tratamiento con IL-2 en las hADSC tanto SR como SEN, mientras que la expresión de IL-2Ra se anuló cuando las células senescentes se sometieron a tratamientos similares (FIG. 4B).

Sin embargo, los datos indicaron que la expresión del nivel de proteína del receptor de IL-2Ra asociado a la membrana celular mostró el patrón opuesto (FIG. 4C). La FIG. 4C muestra los niveles asociados a la membrana celular de IL-2Ra e IL-2RP. Los niveles se cuantificaron mediante ELISA en las hADSC no estimuladas (IL-2-) SEN (tercera barra) y SR (primera barra), y tras la estimulación con 20 ug/ml de IL-2 recombinante (IL-2+) SEN (cuarta barra) y SR (segunda barra). Los datos se expresan como picogramo por mililitro. Los resultados son la media de tres experimentos independientes (media ± SD). La significancia estadística se estimó mediante una prueba de la t, en la que ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05.

Aunque el estado transcripcional de las isoformas del receptor de IL-2 varía entre los dos estados celulares diferentes (SR y SEN), no parece depender de la exposición a IL-2 (inducción) según lo medido por el ensayo ELISA (descrito en Materiales y Métodos, más arriba). Los datos también demostraron que la proteína que codifica la cadena del receptor de IL-2a es menos abundante que la isoforma de IL-2RP (compárese 120 pg/ml de IL-2Ra con 350 pg/ml de IL-2RP con 150 pg/ml de IL-2Ra y 440 pg/ml de IL-2RP tras la senescencia replicativa ex vivo) como se muestra en la FIG. 4C. Estos datos indican que la respuesta de las hADSC a la estimulación con IL-2 se produce a través del dímero del receptor de afinidad intermedia compuesto por IL-2RP (CD 122) y la IL-2Rg común (CD 132).

IL-2 señaliza a través de JAK1 y JAK3 para activar STAT5A y STAT5B, y además usa rutas de señalización dependientes de Ras-MAP cinasa y fosfoinositol 3-cinasa. La expresión de la diana aguas abajo de IL-2, STAT5, se muestra en las FIGS. 5, 7A y 7B, y en la tabla de las FIGS. 10A y 10B. En las hADSC, la transcripción tanto del gen STAT5A como STAT5B sigue el eje de señalización IL-2/STAT5.

La FIG. 5 ilustra el efecto de la estimulación de las hADSC SR y SEN con IL-2. IL-2 regula al alza el ARNm de un mediador de IL-2 que señaliza al gen STAT5. La expresión de ARNm de STAT5A y STAT5B se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa en células SR (primera barra) y SEN (tercera barra) no estimuladas (IL-2-), y tras la estimulación con 20 ug/ml de IL-2 recombinante (IL-2+) (SR IL-2, segunda barra; SEN IL-2, tercera barra). Los datos se muestran como número de veces de cambio (AACT). Se muestra la media ± SD de tres experimentos independientes. La posición de los cebadores de Q-PCR se representa gráficamente. La significancia estadística se estimó mediante la prueba de la t, en la que ***p<0,001, **p<0,01.

A continuación, se investigó cómo IL-2 y su diana aguas abajo STAT5 afectan los resultados transcripcionales en las hADSC tras su senescencia replicativa ex vivo.

La exposición a IL-2 dio como resultado una expresión génica alterada en las MSC humanas tras la senescencia replicativa. Para abordar cómo la respuesta transcripcional al eje IL-2/STAT5 cambia con el envejecimiento replicativo de las hADSC ex vivo, se realizó un análisis del transcriptoma RNA-seq, usando el sistema Ion Proton™ como se describe en el Ejemplo 1 y como se muestra en la FIG. 8A. Se compararon los niveles de expresión génica en las hADSC en cuatro condiciones (bibliotecas): autorrenovación tras cultivo ex vivo normal (SR IL-2-), autorrenovación tras 24 horas de estimulación con IL-2 recombinante (SR IL-2+), senescencia replicativa tras cultivo ex vivo normal (SEN IL-2-), y senescencia replicativa tras 24 horas de estimulación con IL-2 recombinante (SEN IL-2+). Las distribuciones de los recuentos de lectura totales para las cuatro condiciones que representan cada condición se muestran en la FIG. 8B.

Los niveles de expresión de beta-actina se usaron para normalizar los niveles de expresión génica entre condiciones (como se describe en el Ejemplo 1). Este enfoque se tomó para tener en cuenta el hecho de que los niveles globales de expresión génica pueden cambiar con el tratamiento con IL-2. Las distribuciones de expresión génica normalizadas a beta-actina revelan una regulación al alza general de la expresión génica tras el tratamiento con IL-2 en los estados tanto SR como SEN (FIG. 8D). Sin embargo, la comparación de los niveles de expresión de genes individuales entre las cuatro condiciones indica que el tratamiento con IL-2 afecta más significativamente a las hADSC SEN en comparación con las hADSC SR (FIG. 6A). La FIG. 6A muestra un agrupamiento jerárquico que muestra la distancia por pares entre condiciones en base a la comparación de perfiles de expresión génica específicos de la condición. Las condiciones SR IL-2- y SR IL-2+ se agrupan estrechamente cuando se comparan los niveles de expresión de genes individuales seguidos por la condición SEN IL-2-. La condición SEN IL-2+ es un valor atípico entre las cuatro condiciones que muestra un patrón sustancialmente divergente de los niveles de expresión de genes individuales. Esto indica que la respuesta biológica al tratamiento con IL-2 en las hADSC tras la senescencia puede impedir significativamente la función de las MSC a través de la desregulación transcripcional global en respuesta a IL-2.

Los niveles de expresión se compararon adicionalmente entre condiciones para identificar genes individuales que se expresan diferencialmente, regulados al alza y a la baja, en respuesta al tratamiento con IL-2 en estados tanto SR como SEN (FIG. 6B). La FIG. 6B es un diagrama de Venn que muestra los números de genes que están regulados al alza y regulados a la baja tras el tratamiento con IL-2. Hay varios genes más que están regulados al alza (8.866) en comparación con los regulados a la baja (2.296) tras el tratamiento con IL-2 en las hADSC tanto SR como SEN. También hay una proporción sustancialmente mayor de genes que están regulados al alza en las hADSC tanto SR como SEN (35%) en comparación con los genes que están regulados a la baja en ambos estados (4%). La mayor asimetría se observa para genes que están regulados a la baja en las hADSC SEN tras el tratamiento con IL-2 (1.739); hay muchos más genes de este tipo que los observados para la condición SR IL-2+ (649). Esta diferencia indica que la divergencia global de la condición SEN IL-2+ se atribuye en gran medida a los genes que se regulan a la baja con el tratamiento con IL-2, lo cual es un resultado inesperado dada la regulación al alza global tanto en SR como en SEN tras el tratamiento con IL-2 (FIG. 6B y FIG. 8D).

Las FIGS. 6C-6D muestran mapas de calor que muestran los niveles de expresión de genes que están regulados al alza (FIG. 6C) y regulados a la baja (FIG. 6D) tras el tratamiento con IL-2. Los niveles de expresión génica normalizados se muestran como mapas de calor en escala de grises. Los grupos corresponden a genes que están regulados al alza o a la baja en SR solo, en SEN solo, o en ambas condiciones.

Tomados en conjunto, estos datos indican que las hADSC SEN han perdido la capacidad de generar cambios regulatorios coordinados en respuesta al tratamiento con IL-2 en la misma medida que existe para las células SR que proliferan de forma activa. El mayor número de genes regulados al alza observados para SR IL-2+, en comparación con SEN IL-2-, es consistente con esta interpretación.

Se proporcionan aquí rutas enriquecidas con el tratamiento con IL. La FIG. 10A muestra una tabla (FIG. 10A) que indica rutas biológicas enriquecidas para genes regulados al alza tras el tratamiento con IL-2 en las hADSC SR y SEN. En la FIG. 10A, las rutas enriquecidas se muestran junto con los genes regulados al alza de IL-2+ individuales que pertenecen a la ruta y los niveles de significancia del enriquecimiento de la ruta. Las rutas con miembros de genes regulados al alza en SR se muestran en la columna de la izquierda, y las rutas con miembros de genes regulados al alza en SEN se muestran en la columna de la derecha. Las rutas con miembros de genes regulados al alza tanto en SR como en SEN se muestran en la fila superior, seguidas de rutas con miembros de genes regulados al alza solo en SEN, y finalmente rutas con miembros de genes regulados al alza solo en SR. Se muestran redes que relacionan rutas que están reguladas al alza en SR (columna izquierda) y rutas que están reguladas al alza en SEN (columna derecha). Los nodos de la red representan rutas, y los tamaños de los nodos corresponden al número de genes regulados al alza en esa ruta. Los nodos de la ruta están conectados por bordes si las rutas comparten genes regulados al alza, y los pesos de los bordes corresponden al número de genes regulados al alza compartidos entre las rutas.

La FIG. 10B es una tabla (FIG. 10B) que ilustra rutas biológicas enriquecidas para genes regulados a la baja tras el tratamiento con IL-2 en las hADSC SR y SEN. Las rutas enriquecidas se muestran junto con los genes regulados a la baja de IL-2+ individuales que pertenecen a la ruta y los niveles de importancia del enriquecimiento de la ruta. Las rutas con miembros de genes regulados a la baja en SR se muestran en la columna de la izquierda, y las rutas con miembros de genes regulados a la baja en SEN se muestran en la columna de la derecha. Las rutas con miembros de genes regulados a la baja tanto en SR como en SEN se muestran en la fila superior, seguidas de rutas con miembros de genes regulados a la baja solo en SEN, y finalmente rutas con miembros de genes regulados a la baja solo en SR. Se muestra una red que relaciona rutas que están reguladas a la baja en SEN (columna izquierda). Los nodos de la red representan rutas, y los tamaños de los nodos corresponden al número de genes regulados a la baja en SEN en esa ruta. Los nodos de la ruta están conectados por bordes si las rutas comparten genes regulados a la baja en SEN, y los pesos de los bordes corresponden al número de genes regulados a la baja compartidos entre las rutas.

Ejemplo 5: Las propiedades tróficas de las hADSC después de la estimulación con IL-2 son susceptibles al envejecimiento replicativo ex vivo

Las FIGS. 7A-7D ilustran los niveles de expresión génica para células SR y SEN tras el tratamiento con IL-2 entre conjuntos de genes funcionalmente coherentes. Los niveles de expresión se muestran para conjuntos de genes caracterizados como (en la FIG. 7A) factores tróficos, (en la FIG. 7B) antiinflamatorios e inmunomoduladores, (como se muestra en la FIG. 7C) antiapoptóticos y promotores de metástasis, y (como se muestra en la FIG. 7D) promotores de la migración y la angiogénesis. Los niveles de expresión génica normalizados se muestran como mapas de calor en escala de grises.

Las propiedades tróficas de las MSC después de la exposición a IL-2 son susceptibles al envejecimiento replicativo ex vivo (por ejemplo, FIG. 7A, Tabla 1). Se cree que la secreción de una amplia gama de moléculas bioactivas es el principal mecanismo por el cual las MSC logran sus efectos terapéuticos. Las MSC segregan un conjunto de factores de crecimiento y proteínas antiinflamatorias con mecanismos de retroalimentación complejos entre los muchos tipos de células inmunitarias.

La Tabla 1 muestra la expresión diferencial de factores tróficos tras el tratamiento con IL-2 en células SEN y SR. Los valores GFOLD de SR representan la diferencia en veces en las células SR tratadas con IL-2, con respecto a las células SR no tratadas con IL-2; los valores GFOLD de SEN representan la diferencia en veces en las células SEN tratadas con IL-2, con respecto a las células SEN no tratadas con IL-2.

T a b la 1: E x p re s ió n d ife re n c ia l d e fa c to re s t ró f ic o s t ra s e l t ra ta m ie n to c o n IL -2

Los datos indicaron que la expresión de factores de crecimiento en las hADSC tras la estimulación con IL-2 está sujeta a cambios significativos tras la senescencia replicativa ex vivo. Mientras que la exposición de las hADSC de proliferación activa (SR) a IL-2 dio como resultado una mayor expresión de proteínas mitógenas, tales como el factor 2 derivado de células estromales (SDF2) y SDFL2, y la prostaglandina E sintetasa 2 (PTGES2), las hADSC tanto SR como SEN se caracterizan por aumentos significativos de los factores de crecimiento transformante alfa y beta (TGFa, TGFp1 y TGFp2), el receptor del factor de crecimiento transformante beta TGFBR2, y la proteína asociada al receptor del factor de crecimiento transformante beta TGFBRAP1, así como la proteína inducida por el factor de crecimiento transformante beta (TGFBI), que se sabe que aumentan la división de fibroblastos, células epiteliales y endoteliales cuando se segregan en un medio sistémico (FIG. 7A y Tablas 5A-5D).

Además, las hADSC estimuladas con IL-2 tanto SR como SEN se caracterizaron por una regulación al alza del factor estimulante de colonias 1 (CSF-1), LIF, IL-11, IL-17D, IL-1 p, y la superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando) TNFSF13B, un gen que codifica una citocina que estimula la función de las células B y T (FIGS. 7A, 7B, y FIGS. 10A-10B).

Teniendo en cuenta que la IL-17D paracrina induce la expresión de los genes IL-6, IL-8 y GM-CSF en las células endoteliales, y que la IL-1 p estimula la actividad del factor de crecimiento de fibroblastos (los genes TGFa, TGFp1 y TGFp2 están notablemente sobrerregulados en las hADSC expuestas a IL-2) de forma autocrina y paracrina, junto con la proliferación y maduración de timocitos y células B al inducir la liberación de IL-2 de estas células, los datos indican que el estado transcripcional de las hADSC tanto SR como SEN puede apuntar a propiedades inmunomoduladoras mejoradas de estas células después de la exposición a IL-2 a través de un circuito de retroalimentación regulatorio complejo.

Las hADSC tanto SR como SEN expuestas a IL-2 se caracterizan por aumentos significativos en la expresión de los factores alfa y beta de crecimiento transformante (TGFa, TGFp1 y TGFp2), el receptor del factor beta de crecimiento transformante TGFBR2, y la proteína asociada al receptor del factor beta de crecimiento transformante TGFBRAP1, así como genes inducidos por el factor de crecimiento transformante beta (TGFBI) (FIG. 7A).

Se proporciona aquí un biomarcador TGFp. Se cree que el TGFp es importante en la regulación del sistema inmunitario al promover la diferenciación de las células T CD4+ e inhibir la vigilancia inmunitaria, imponiendo así la inmunosupresión. Sin embargo, el mayor nivel de expresión de TGFp en MSC humanas derivadas de tejido adiposo después de la exposición a IL-2 podría promover la carcinogénesis. Además, también se observaron diferencias en la expresión dependiente de IL-2 de factores de crecimiento tras la senescencia de hADSC que no se han observado en células SR. Esto incluye la regulación al alza de un subconjunto de miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF 1, FGF 11, FGF 14), acompañada de la regulación a la baja de otros miembros, tales como FGF2, FGF5, FGF7 (FIG. 7A, Tabla 1, y Tablas 5A-5D).

Las hADSC SEN expuestas a IL-2 se caracterizan por la regulación al alza del ARNm de EGF, pero por la regulación a la baja del ARNm a su receptor EGFR, junto con una disminución en la expresión del factor de respuesta sérica SRF y el modulador segregado de la señalización de WNT SFRP1. Curiosamente, la expresión tanto de un potente mitógeno para las células de origen mesenquimatoso que promueve la cicatrización de heridas, PDGFA, como de su receptor, PDGFRA, se suprime significativamente en las hADSC SEN en comparación con las células SR sometidas a exposición a IL-2 (FIG. 7a , FIG. 10A, Tabla 1, y Tablas 5A-5D).

Estos datos indican diferencias relacionadas con la senescencia en la naturaleza de la respuesta transcripcional mediada por IL-2 en las hADSC que podrían impedir las propiedades inmunomoduladoras de estas células ex vivo y, por último, in vivo.

Se muestra un panel de marcadores antiinflamatorios e inmunomoduladores para MSC humanas tratadas con IL-2, IL-2 en combinación con otros fármacos, y expuestas a IL-2 (Tabla 2).

La descripción también contempla la determinación de qué rutas se regulan en respuesta al tratamiento con IL-2. Se analizaron los genes designados como regulados al alza o a la baja en las hADSC SR y SEN tratadas con IL-2, usando un enriquecimiento integrado de conjuntos de genes y un enfoque de red de rutas para capturar la realidad biológica de las respuestas celulares coordinadas a la estimulación con IL-2. Para hacer esto, se identificaron rutas que se enriquecieron estadísticamente para genes regulados al alza o a la baja, y después se escogieron en base a los genes expresados diferencialmente que tienen en común (FIGS. 10A-10B). La representación de la red de rutas se ponderó en función del número de genes expresados diferencialmente en cada ruta y el grado en que las diferentes rutas comparten conjuntos de genes expresados diferencialmente. Este enfoque permitió la identificación de una estructura de red altamente conectada con numerosas rutas funcionalmente relacionadas, así como subestructuras de red funcionalmente relevantes.

Tras la senescencia de las hADSC, la IL-2 estimula menos las rutas genéticas que promueven la proliferación (ruta del ciclo celular, valor de q = 1,54e-5), lo que impone el punto de control G2 (ruta G2, valor de q = 5,94e-4), p53 (valor de q = 1,18e-2), la ruta principal de transducción de señales MAPK (MAPK, valor de q = 2,42e-4), y su ruta principal del subgrupo ERK (ERK, valor de q = 2,62e-2), que regulan una función celular importante tal como la supervivencia, la migración y la proliferación.

Los datos también proporcionan información sobre la funcionalidad de las MSC en entornos cancerígenos. Las hADSC tanto SR como SEN expuestas a IL-2 se caracterizan por aumentos significativos en la expresión de los factores alfa y beta de crecimiento transformante (TGFa, TGFP1 y TGFP2), el receptor del factor beta de crecimiento transformante TGFBR2, y la proteína asociada al receptor del factor beta de crecimiento transformante TGFBRAP1, así como genes inducidos por el factor de crecimiento transformante beta (TGFBI) (FIG. 7A).

Las hADSC SEN tratadas con IL-2 muestran que los genes regulados al alza prominentes están enriquecidos para las rutas asociadas con la inflamación (ruta de IL-6, valor de q = 5,55e-3) y la señalización de EGF (valor de q = 2,33e-4), que han demostrado proporcionar ventajas de supervivencia a las MSC. Las hADSC SEN expuestas a IL-2 también se caracterizan por una mayor expresión de IL-1R, IL-6 e IL-12 (FIG. 7B).

La conexión observada con la ruta del VEGF angiogénico (valor de q = 5,24e-3) (FIG. 10A, lado derecho, y FIG. 7D) y la capacidad mejorada de las hADSC SEN para la migración (FIGS. 3A, 3B) pueden indicar que las SEN-MSC expuestas a IL-2 podrían adquirir las propiedades necesarias para respaldar un entorno tumorigénico y metástasis. Además, la regulación al alza de los genes incluidos en la ruta de la óxido nítrico sintasa (iNOS), ruta NOS1 (valor de q = 8,32e-2), en hADSC tras la senescencia replicativa respalda una vez más que las MSC en proceso de senescencia pueden adquirir propiedades promotoras de metástasis a través de la inmunosupresión.

Las rutas importantes para apoyar la proliferación y la reparación del ADN están reguladas a la baja en las hADCS tras la senescencia: ruta del ciclo celular (valor de q = 2,52e-5), ruta de MCM (valor de q = 1,62e-8), ruta de RB (valor de q = 6,97e-5), ruta de ATM (valor de q = 3,28e-2), ruta de p53 (valor de q = 1,86e-2), mostradas en la FIG. 10B. En general, los datos indicaron que hay más rutas biológicas sujetas a la regulación a la baja desencadenada por IL-2 en la senescencia que en la autorrenovación, y estas rutas biológicas están interconectadas (FIG. 10B), vinculando aún más un deterioro fisiológico de la respuesta a IL-2 tras el envejecimiento replicativo de las hADSC, lo que indica que tal deterioro podría ser una parte integral de la función desviada de las células madre derivadas de tejido adiposo in vivo y en las aplicaciones clínicas.

Los datos proporcionan una lista de dianas de marcadores moleculares críticas para la evaluación de eventos inmunomoduladores y antiinflamatorios y para tomar decisiones informativas para priorizar el uso de MSC autólogas o alogénicas para aplicaciones clínicas, y/o usadas como un diagnóstico complementario para monitorizar el tratamiento del cáncer con un agente de IL-2 y/o IL-2 con terapias celulares en entornos clínicos (Tabla 2).

La Tabla 2 muestra la expresión diferencial de factores antiinflamatorios e inmunomoduladores tras el tratamiento con IL-2 en células SEN y SR. Los valores GFOLD de SR representan la diferencia en veces en las células SR tratadas con IL-2, con respecto a las células SR no tratadas con IL-2; los valores GFOLD de SEN representan la diferencia en veces en las células SEN tratadas con IL-2, con respecto a las células SEN no tratadas con IL-2.

T a b la 2 : E x p re s ió n d ife re n c ia l d e fa c to re s a n t iin f la m a to r io s e in m u n o m o d u la d o re s t ra s e l t ra ta m ie n to c o n IL -2

Ejemplo 6: Propiedades antiinflamatorias e inmunomoduladoras de MSC humanas expuestas a IL-2

A continuación, se investigó cómo la exposición al entorno proinflamatorio de IL-2, cuando se impone sobre el envejecimiento replicativo, afecta la expresión de los genes asignados para proporcionar propiedades inmunomoduladoras de las hADSC (por ejemplo, las propiedades antiinflamatorias e inmunomoduladoras de MSC humana expuesta a IL-2). Los datos demostraron que la capacidad de inmunomodulación se ve afectada por el envejecimiento replicativo de la MCS derivada de tejido adiposo humano durante la pasada ex vivo (FIG. 7B y Tabla 2).

La exposición a IL-2 en las hADSC SR activa un conjunto distinto de genes atribuidos a la regulación de células T. La exposición a IL-2 de las hADSC autorrenovables da como resultado la regulación al alza de genes, tales como TNFRSF21 (implicado en la diferenciación de células T), IL12A (activador de células T), ILF2 (potente regulador de la transcripción del gen IL-2 durante la activación de células T), IL33 (inductor paracrino de citocinas asociadas a células T auxiliares tipo 2), y regulación a la baja de CCL28 (factor quimiotáctico para células T CD4+, CD8+), CD320 (molécula receptora con función autocrina y paracrina para aumentar la proliferación de células plasmáticas), mostrado en la FIG. 7B, Tabla 2, y Tablas 5A-5D.

Contrariamente a eso, las hADSC SEN expuestas a IL-2 se caracterizaron por una regulación al alza transcripcional significativa de CD320, varias integrinas que podrían estar implicadas en la modulación de la función de las células T (ITG 11, ITGA V, ITFG 1), y genes que codifican moléculas reguladoras importantes tales como: el receptor de adhesión de células T (CD99), un factor atribuido al mantenimiento de células T vírgenes (CHST3), activadores de células T (HIVEP 1 e HIVEP2), un gen implicado en la ruta de señalización de células T (CMIP), y un factor autocrino/paracrino, PTGER1, implicado en la inhibición de la proliferación de células CD+ (FIG. 7B, Tabla 2, y Tablas 5A-5D).

Los datos también demostraron que las hADSC SR expuestas a IL-2 desencadenan la regulación a la baja de las actividades transcripcionales de los genes que codifican receptores de superficie que desempeñan un papel en la proliferación y diferenciación de células B (CD72) y los macrófagos de direccionamiento (CD68). Ambos genes están significativamente regulados al alza transcripcionalmente en células senescentes tras un tratamiento similar (FIG. 7B, Tabla 2, Tablas 5A-5D). Además, las hADSC SEN tratadas con IL-2 se distinguen de las células SR tratadas de manera similar por la regulación a la baja transcripcional de los genes necesarios para la transición pro-B a pre-B, los genes LRRC8A y PEARl, que regulan un número progenitores mieloides no adherentes. Por el contrario, los genes implicados en la activación y homeostasis de los linfocitos (CD83 y TNFRSF25), así como en la transmigración de leucocitos (CERCAM), y los genes responsables de la interacción entre células endoteliales y leucocitos (ESM1), y un gen importante para el control del proceso inmunológico mediado por monocitos/macrófagos (TNFSF 13), están regulados al alza en las hADSC SEN (FIG. 7B, Tabla 2, y Tablas 5A-5D).

La exposición a IL-2 da como resultado la expresión diferencial de una serie de citocinas y factores críticos para la quimiotaxis (mostrado en la FIG. 7B y la Tabla 2).

Las hADSC SR se caracterizan por la regulación al alza de los genes IL-33, IL-12A, IL10RB, IL1RAP, IL7R, ILF2 y NOS3, mientras que los genes IL-16 y CSF1R están regulados a la baja en estas células.

En las hADSC SEN tratadas en condiciones similares con IL-2, los genes que codifican las citocinas IL-32, IL-6, IL1RN, IL-20RB, IL-21R, y los inductores de inflamación TNFSF13 y TNFSF12, así como el gen que codifica el remodelador de la matriz extracelular PLAU, están regulados al alza.

Al mismo tiempo, varios factores esenciales para la citocinesis, tales como MYL9, KIF14, IRAC3, así como los genes que codifican el factor quimiotáctico que atrae monocitos y basófilos (CCL2), y el gen CLEC11A que regula la proliferación y diferenciación de células precursoras hematopoyéticas, están regulados a la baja (FIG. 7B).

También se encuentra una regulación a la baja similar para varios genes que codifican el receptor de interleucina IL7R, IL1R1, IL15RA, y los factores de unión potenciadores de interleucina ILF2 e ILF3.

Estas observaciones, junto con la expresión transcripcional diferencial dependiente de IL-2 de citocinas en las hADSC SEN (regulación al alza de los genes IL-32, IL-6, PLAU; regulación a la baja de los genes CCL2, CLEC11A, ILF3, IRAK3, KIF14, MYL9) y en las hADSC SR (regulación al alza de los genes IL12A, IL7R, IRAK1, NOS3; regulación a la baja de los genes IL-16, CSF1R), indican que las propiedades inmunomoduladoras de las hADSC son susceptibles a los cambios impuestos por la senescencia.

La conexión observada con la ruta de VEGF angiogénico (valor de q = 5,24e-3) (FIG. 10A, lado derecho, y FIG. 7D) y la capacidad mejorada de las hADSC SEN para la migración (FIGS. 4A, B) indica que las SEN-MSC expuestas a IL-2 podrían adquirir propiedades necesarias para apoyar un entorno tumorigénico y la metástasis. Además, la regulación al alza de los genes incluidos en la ruta de la óxido nítrico sintasa (iNOS), ruta NOS1 (valor de q = 8,32e-2), en las hADSC tras la senescencia replicativa también indica que las MSC en proceso de senescencia pueden adquirir propiedades promotoras de metástasis a través de la inmunosupresión.

Ejemplo 7: Propiedades antiapoptóticas y promotoras de la metástasis de las hADSC estimuladas con IL-2 tras la senescencia replicativa

Estos experimentos también se usaron para examinar las propiedades antiapoptóticas y promotoras de metástasis de las MSC expuestas a IL-2 tras la senescencia replicativa.

El panel de marcadores antiapoptóticos y promotores de metástasis para el tratamiento con IL-2, IL-2 en combinación con otros fármacos, o IL-2 en combinación con MSC, se muestra en la Tabla 3. Los datos proporcionan una lista de dianas de marcadores moleculares importantes para evaluación de eventos antiapoptóticos y que promueven la metástasis y la toma de decisiones informativas para priorizar el uso de MSC autólogas o alogénicas para aplicaciones clínicas, y/o usadas como un diagnóstico complementario de monitorización del tratamiento del cáncer con un agente IL-2 y/o IL-2 con terapias celulares en entornos clínicos (Tabla 3).

La Tabla 3 muestra la expresión diferencial de factores antiapoptóticos y de metástasis tras el tratamiento con IL-2 en células SEN y SR. Los valores GFOLD de SR representan la diferencia en veces en las células SR tratadas con IL-2, con respecto a las células SR no tratadas con IL-2; los valores GFOLD de SEN representan la diferencia en veces en las células SEN tratadas con IL-2, con respecto a las células SEN no tratadas con IL-2.

T a b la 3 : E x p re s ió n d ife re n c ia l d e fa c to re s a n t ia p o p tó t ic o s y d e m e tá s ta s is t ra s e l t ra ta m ie n to c o n IL -2

Por ejemplo, se ha demostrado que las MSC ayudan a revertir la apoptosis en los cardiomioblastos después de la isquemia, así como en las neuronas y los fibroblastos pulmonares dañados. La estanniocalcina 1 (STC 1) se ha identificado como un factor esencial capaz de una potente inversión apoptótica en fibroblastos dañados por los rayos UV y la acidez.

Los datos indican que la exposición a IL-2 regula al alza transcripcionalmente a los genes tanto STC1 como STC2, y dicha activación no depende del envejecimiento replicativo de las hADSC, al menos ex vivo (Tablas 5A-5D). Además, los efectores paracrinos tales como VEGF y TGFB1 se han visto implicados en la reversión de la apoptosis en las células endoteliales. La expresión de los genes que codifican estos dos factores está regulado al alza en las hADSC SR y SEN tras el tratamiento con IL-2 (FIG. 7C, FIG. 5, Tabla 3, y Tablas 5A-5D).

El tercer gráfico de la FIG. 5 muestra que IL-2 regula al alza la transcripción del gen VEGFA tras la senescencia replicativa de las hADSC. La expresión del gen VEGFA se evaluó mediante Q-PCR cuantitativa en hADSC senescentes (en negro) y autorrenovables (en blanco) no estimuladas (IL-2-), y tras la estimulación con 20 ug/ml de IL-2 recombinante (IL-2+). Datos mostrados como número de veces de cambio AACt. Se muestra la media ± SD de tres experimentos independientes. La posición de los cebadores de q-PCR se representa gráficamente. La significancia estadística se estimó mediante la prueba de la t, en la que ***p<0,001, **p<0,01.

Sin embargo, la actividad transcripcional de VEGFA es notablemente mayor en la senescencia que en las células que proliferan activamente, como se verifica adicionalmente mediante el análisis de Q-PCR que se muestra en la FIG. 7c . En particular, el gen SIVA1 que codifica un factor proapoptótico y un potente inductor de la apoptosis de los linfocitos T está significativamente regulado a la baja en las células senescentes tras el tratamiento con IL-2, en comparación con las hADSC que proliferan (FIG. 7C, Tabla 3, y Tablas 5A-5D). SIVA1 no es estrictamente un factor proapoptótico, sino también un potente supresor de la metástasis tumoral. Es importante destacar que varios de los factores responsables del crecimiento invasivo y la metástasis están significativamente regulados al alza en las hADSC SEN expuestas a IL-2, en comparación con las células SR tratadas de manera similar (FIG. 7C y Tabla 3). Esto incluye los genes RACKI, pLe KHAI, PLEKHA6, CTSB, CRMPl, FERMTl. Estos datos indicaron que el pretratamiento/exposición de las hADSC con IL-2 puede potenciar las propiedades antiapoptóticas de estas células en general, y que tal potenciación se efectúa por senescencia replicativa, al menos en cultivo.

Se demostró que en las hADSC SEN tratadas con IL-2, los genes regulados al alza prominentes están enriquecidos para las rutas asociadas con la inflamación (ruta de IL-6, valor de q = 5,55e-3) y la señalización de EGF (valor de q = 2,33e-4), que han demostrado proporcionar ventajas de supervivencia a las MSC. Las hADSC SEN expuestas a IL-2 también se caracterizan por una mayor expresión de IL-1 b, IL-6 e IL-12 (FIG. 7B), citocinas que se sabe que estimulan la IL-17 de los linfocitos.

Los datos también indicaron que los linfocitos son la única fuente de producción de IL-17, y esas MSC, particularmente en su senescencia, muestran una alta actividad transcripcional de IL-17 cuando se someten a un entorno proinflamatorio (FIG. 7A). La IL-17 derivada de MSC junto con CSF-1 derivada de MSC puede inducir la expansión de neutrófilos sistémica y la infiltración de macrófagos de manera similar a los estudios que indican un papel fundamental para estos factores en la promoción de la progresión del cáncer y la metástasis, así como en una serie de enfermedades inflamatorias, incluyendo la psoriasis.

Ejemplo 8: El perfil transcripcional indica dianas génicas que regulan la migración mejorada y la angiogénesis en hADSC estimuladas con IL-2 tras la senescencia replicativa

Se muestra el panel de los marcadores que indican migración mejorada y angiogénesis en tratamientos con IL-2 tras el envejecimiento (Tabla 4).

La lista de dianas de marcadores moleculares críticas para la evaluación de eventos que promueven la migración y la angiogénesis puede ayudar a tomar decisiones informativas para priorizar el uso de MSC autólogas o alogénicas para aplicaciones clínicas, y/o usadas como un diagnóstico complementario de monitorización del tratamiento del cáncer con un agente IL-2 y/o IL-2 con terapias celulares en entornos clínicos (Tabla 4). El perfil transcripcional indica dianas génicas que regulan la migración mejorada y la angiogénesis en ADSC estimuladas con IL-2 tras la senescencia replicativa. Un análisis adicional de la respuesta transcripcional indica que la estimulación con IL-2 de las hADSC SEN mejora la expresión de genes implicados en el desarrollo vascular y la remodelación relacionada con la angiogénesis. Se observó una regulación al alza significativa de los genes VEGFA, VEGFB, FBLNS, FBLN7, PGF, ANGPTl, ANGPT2, ANGPTL2, ANGPTL6, TNFSF12, PRKCA, PIK3CA, HRAS, así como un gen que codifica un potente modulador de la adhesión entre células endoteliales y leucocitos, ESM1 (FIG. 7D, FIGS. 10A-10B, Tabla 4, y Tablas 5A-5D).

La Tabla 4 muestra la expresión diferencial de los factores de migración y angiogénesis tras el tratamiento con IL-2 en células SEN y SR. Los valores GFOLD de SR representan la diferencia en veces en las células SR tratadas con IL-2, con respecto a las células SR no tratadas con IL-2; los valores GFOLD de SEN representan la diferencia en veces en las células SEN tratadas con IL-2, con respecto a las células SEN no tratadas con IL-2.

Tabla 4: Expresión diferencial de factores promotores de la migración y la angiogénesis tras el tratamiento con IL-2

El factor de crecimiento endotelial vascular, VEGF, liberado por las MSC, permite el reclutamiento de células de linaje endotelial y el inicio de la vascularización como se dio a conocer anteriormente. Se demostró además que la regulación al alza de la expresión del gen VEGFA en las hADSC SEN puede detectarse mediante un análisis cuantitativo de RT-PCR, y la exposición a IL-2 da como resultado un aumento estadísticamente significativo de la transcripción del gen VEGFA en las hADSC SR y SEN (FIG. 7D y Tabla 4).

En respuesta a la IL-2, un grupo de genes responsables de la motilidad celular, la migración y el crecimiento invasivo están regulados al alza significativamente solo en las hADSC que experimentan senescencia replicativa: CGNL1, CGREF 1, CRMP1, FGD6, TNK2, PTGS1, TNFAIP8, CTSB, CTSO, FAP, FERMT1, PLEKHA1, PLEKHA6, ROCK1, ROCK2. Un conjunto de genes que promueven la adhesión celular, tales como CHD24, CYR61, ILK, NEDD9, MYL9, PPAP2B, RELN y TLN2, estaban regulados a la baja (FIG. 7D, Tabla 4, y Tablas 5A-5D). Estos datos respaldan aún más la evidencia experimental de la capacidad de migración mejorada de las hADSC SEN mostrada en la FIG. 3B.

Ejemplo 9: Datos de matriz proteómica de anticuerpos

La Tabla 6 proporciona los valores brutos para todos los datos de la matriz proteómica.

Las MSC de un paciente de 38 años en medio StemPro MSC SFM Xeno-free que contiene 10% PRP se sembraron en placas sobre un sustrato. Las hADSC SR o SEN determinadas como se describe en el Ejemplo 1 se sembraron en placa a una densidad de 2500 células/cm2 en 700 ul/cm2 de medio StemPro MSC SFM Xeno-free que contiene 10% PRP. Las hADSC SEN y SR se estimularon con IL-2 durante 24 h o permanecieron sin estimulación con IL-2 (IL-2-), después de lo cual el medio se intercambió por el medio StemPro MSC SFM Xeno-free que contiene 10% PRP. Las células se mantuvieron a 37°C y 5% de CO2 durante 24, 48 y 72 h, después de lo cual el medio se recogió y se analizó. Se analizaron volúmenes iguales de medio en RayBio C-Series Human Cytokine Antibody Array AAH-CYT-2000 (RayBiotech, Inc). C-Series Human Cytokine Antibody Array AAH-CYT-2000 se basa en el principio de ensayo de quimioluminiscencia, y contiene anticuerpos contra 174 proteínas de interés. Los datos se extrajeron de las membranas usando el software de densitometría de Biosciences LI-COR (Li-COR). Los datos brutos se normalizaron tomando la relación entre la intensidad promedio de la señal de proteína dada y el control negativo de intensidad promedio, para tener en cuenta las diferencias en la exposición y la variación de matriz a matriz. Los datos se presentan en las FIGS. 11-90, y la Tabla 6 demuestra los factores proteicos segregados tras la exposición a IL-2. Estas proteínas incluyen, pero no se limitan a, los factores indicados en las tablas en las FIGS. 7A-7D, y los perfiles secretores recapitulan los datos transcripcionales.

Las FIGS. 11-17 muestran el aumento en la secreción de las proteínas nombradas más abajo (factores) de las SR-hADSC, 24 horas después de la incubación con medios que contienen 10% PRP (plasma rico en plaquetas) solo (sin estimulación con IL-2). Los niveles de secreción se muestran con respecto a la cantidad de la proteína correspondiente presente en los niveles basales en los medios que contienen 10% PRP, usados para el soporte de las hADSC. La FIG. 11 muestra el aumento en la secreción de interleucina 5 (IL5) e interleucina 6 (IL6). La FIG. 12 muestra el aumento en la secreción del receptor 4 de interleucina 1 (IL1R4). La FIG. 13 muestra el aumento en la secreción de neurotrofina 3 (NT3), factor A alfa de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF AA), factor A beta de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF AB), y proteína básica proplaquetaria (PPBP). La FIG. 14 muestra el aumento en la secreción de ligando 18 de quimiocina (motivo C-C) (CCL18), ligando 25 de quimiocina (motivo C-C) (CCL25), ligando 27 de quimiocina (motivo C-C) (CCL27), y ligando 11 de quimiocina CXC (CXCL11). La FIG. 15 muestra el aumento en la secreción de la molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM-1) y el inhibidor 2 de metaloproteinasa (TIMP-2). La FIG.

16 muestra el aumento en la secreción del inhibidor 1 de metaloproteinasa (TIMP-1). La FIG. 17 muestra el aumento en la secreción de cadherina del epitelio vascular (VE) (proteína de adhesión celular dependiente de calcio).

Las FIGS. 18-19 muestran el aumento en la secreción de las proteínas nombradas más abajo (factores) de las SR-hADSC, 24 horas después de la incubación con 10% PRP solo (sin estimulación con IL-2). Se encontró que estas proteínas no estaban presentes en el PRP. La FIG. 18 muestra el aumento en la secreción de interleucina 4 (IL4). La FIG. 19 muestra el aumento en la secreción de la proteína 1 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP1).

Las FIGS. 20-31 muestran un aumento en las proteínas nombradas más abajo (factores) de las SR-hADSC, 48 horas después de la incubación con 10% PRP solo (sin estimulación con IL-2). Los niveles de secreción se muestran con respecto a la cantidad de la proteína correspondiente presente en los niveles basales en los medios que contienen 10% PRP, usados para el soporte de las hADSC. La FIG. 20 muestra el aumento en la secreción de interleucina 9 (IL9) y proteína alfa de unión a interleucina 18 (IL18BPa). La FIG. 21 muestra el aumento en la secreción del receptor tipo II de interleucina 1 (IL1R2), receptor beta de interleucina 2 (IL-2Rb), receptor gamma de interleucina 2 (IL-2Rg), receptor alfa de interleucina 5 (IL5Ra), receptor beta de interleucina 10 (IL10Rb), proteína accesoria del receptor de interleucina 18 (IL18Rb), y receptor de interleucina 21 (IL-21R). La FIG. 22 muestra el aumento en la secreción de factor 2 de crecimiento similar a la insulina (IGF2), factor alfa de crecimiento transformante (TGFa), factor beta 1 de crecimiento transformante/péptido asociado a latencia (LAP) (TGFP1), y factor de beta 2 crecimiento transformante (TGFb2). La FIG. 23 muestra el aumento en la secreción de tirosina-proteína cinasa receptora ErbB-3 (ErbB3), ligando de Fas (Fas LG), factor inhibidor de la leucemia (LIF), factor de prolactina (PRL), receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRa), receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRP), receptor del kit del factor de células madre (SCFR), y lectina 5 similar a Ig que se une al ácido siálico (Siglec 5). La FIG. 24 muestra el aumento en la secreción del ligando 16 de quimiocina CXC (CXCL16). La FIG. 25 muestra el aumento en la secreción de molécula de adhesión celular leucocitaria activada (ALCAM), E selectina (glicoproteína de la superficie celular en inmunoadhesión), molécula 2 de adhesión intercelular (ICAM2), L selectina (molécula de adhesión de leucocitos), y molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias (PECAM 1). La FIG. 26 muestra el aumento en la secreción de activina A (INHBA), factor 2 de crecimiento similar a la insulina (IGF-2), y receptor de leptina (LEPR). La FIG. 27 muestra el aumento en la secreción de proteína 5 morfogenética ósea (BMP5), proteína 7 morfogenética ósea (BMP7), receptor del factor 1 estimulante de colonias de macrófagos (MCSFR), metaloproteinasa 1 la de matriz (MMP1), metaloproteinasa 3 de la matriz (MMP3), metaloproteinasa 9 de la matriz (MMP9), y metaloproteinasa 13 de la matriz (MMP13). La FIG. 28 muestra el aumento en la secreción de antígeno de diferenciación de monocitos (CD14), antígeno de diferenciación celular (CD80), cardiotrofina-1 (CT-1), y factor inhibidor de leucemia (LIF). La FIG. 29 muestra el aumento en la secreción de endoglina (ENG). La FIG. 30 muestra el aumento de la secreción de tirosina cinasa con dominios 1 similar a inmunoglobulina y similar a EGF (TIE-1), y tirosina cinasa con dominios 2 similar a inmunoglobulina y similar a EGF (TIE-2). La FIG. 31 muestra el aumento en la secreción de activina A (inhibina beta A, INHBA), receptor de leptina (leptina R), y factor beta 1 de crecimiento transformante (TGFP1).

La FIG. 32 muestra el aumento en la secreción del receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR) de las SR-MSC, 48 horas después de la incubación con 10% PRP solo (sin estimulación con IL-2). Se encontró que NGFR no estaba presente en PRP.

Las FIGS. 33-39 muestran el aumento en la secreción de las proteínas nombradas más abajo (factores) de las SR-hADSC, 72 horas después de la incubación con 10% PRP solo (sin estimulación con IL-2). Los niveles de secreción se muestran con respecto a la cantidad de la proteína correspondiente presente en los niveles basales en los medios que contienen 10% PRP, usados para el soporte de las hADSC. La FIG. 33 muestra el aumento en la secreción de interleucina 1 beta (IL1 b), interleucina 3 (IL3), subunidad alfa-2 del receptor de interleucina 13 (IL13Ra2), y receptor alfa de interleucina 1 (IL1Ra). La FIG. 34 muestra el aumento en la secreción de probetacelulina (BTC), factor estimulante de colonias (CSF1), factor 6 de crecimiento de fibroblastos (FGF6), factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales (GDNF), factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), leptina, y factor B beta de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF BB). La FIG. 35 muestra el aumento en la secreción de factor de células madre/ligando de c-kit (SCF), factor 1 alfa derivado de células estromales (SDF1a), factor 1 beta derivado de células estromales (SDF1b), factor beta 1 de crecimiento transformante (TGFP1), factor beta 3 de crecimiento transformante (TGFb3), y miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF14). La FIG. 36 muestra el aumento en la secreción del factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF1). La FIG. 37 muestra el aumento en la secreción del factor beta 1de crecimiento transformante (TGFP1) y factor B beta de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF BB). La FIG. 38 muestra el aumento en la secreción de ligando 2 de quimiocina (motivo CC) (CCL2), ligando 5 de quimiocina (motivo CC) (CCL5), ligando 7 de quimiocina (motivo CC) (CCL7), ligando 8 de quimiocina (motivo CC) (CCL8), y ligando 11 de quimiocina (motivo CC) (CCL11). La FIG. 39 muestra el aumento en la secreción de ligando 13 de quimiocina (motivo CC) (CCL13), ligando 22 de quimiocina (motivo CC) (CCL22), ligando 23 de quimiocina (motivo Cc ) (CCL23), ligando 24 de quimiocina (motivo CC) (CCL24), y ligando 10 de quimiocina CXC (CXCL10).

Las FIGS. 40-42 muestran el aumento en la secreción de las proteínas nombradas más abajo (factores) de las SR-hADSC, 72 horas después de la incubación con 10% PRP solo (sin estimulación con IL-2). Se encontró que estos factores no estaban presentes en el PRP. La FIG. 40 muestra el aumento en la secreción de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), proteína 4 morfogenética ósea (BMP4), proteína 6 morfogenética ósea (BMP6), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor 7 de crecimiento de fibroblastos (FGF7), y proteína 4 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP4). La FIG. 41 muestra el aumento en la secreción de ligando 13 de quimiocina (motivo CXC) (BLC), ligando 23 de quimiocina (motivo CC) (CCL23), ligando 28 de quimiocina (motivo CC) (CCL28), ligando 11 de quimiocina (motivo CC) (eotaxina 1), ligando 6 de quimiocina (motivo CXC) (GCP-2), FLT3LG (ligando de tirosina cinasa 3 relacionada con Fms), y fractalquina (CX3CL1). La FIG.

42 muestra el aumento de la secreción de angiotensina (ANG), y factor 2 estimulante de colonias (CSF2).

La FIG. 43 muestra el aumento en la secreción del ligando 27 de quimiocina (motivo C-C) (CCL27) y TNFRSF1B (superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 1B) de las SR-hADSC, 24 horas después de la estimulación con IL-2. Los niveles de secreción se muestran con respecto a la cantidad de la proteína correspondiente presente en los niveles basales en los medios que contienen 10% PRP, usados para el soporte de las hADSC.

Las FIGS. 44-53 muestran el aumento de las proteínas nombradas más abajo (factores) de las SR-hADSC, 48 horas después de la estimulación con IL-2. Los niveles de secreción se muestran con respecto a la cantidad de la proteína correspondiente presente en los niveles basales en los medios que contienen 10% PRP, usados para el soporte de las hADSC. La FIG. 44 muestra el aumento en la secreción de interleucina 9 (IL9), interleucina 11 (IL-11), interleucina 12 alfa (IL12a), interleucina 12 beta (IL12b), y proteína alfa de unión a interleucina 18 (IL18BPa). La FIG. 45 muestra el aumento en la secreción del receptor tipo I de interleucina 1 (IL1R1), receptor tipo II de interleucina 1 (IL1R2), receptor tipo IV de interleucina 1 (IL1R4), receptor beta de interleucina 2 (IL-2Rb), receptor gamma de interleucina 2 (IL-2Rg), receptor alfa de interleucina 5 (IL5Ra), receptor beta de interleucina 10 (IL10Rb), receptor beta de interleucina 18 (IL18Rb), y receptor de interleucina 21 (IL-21R). La FIG. 46 muestra el aumento en la secreción del factor 4 de crecimiento de fibroblastos (FGF4), FGF9, MSP alfa/factor similar a HGF (similar a HGF), factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF1), IGF2, proteína 6 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP6), LAP (familia TGF beta), y factor A alfa de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFAA). La FIG. 47 muestra el aumento en la secreción del factor A beta de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFAB), factor B beta de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFBB), factor 1 alfa derivado de células estromales (SDF1a), lectina 5 similar a Ig que se une al ácido siálico (Siglec 5), factor alfa de crecimiento transformante (TGFa), factor beta 2 de crecimiento transformante (TGFb2), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y factor D de crecimiento endotelial vascular (VEGFD). La FIG. 47 también muestra el aumento en la secreción de DR6, Dtk, EGFR, endoglina, ErbB3, Fas, Fas LG, e IGF1 sr. La FIG. 48 muestra el aumento de la secreción de leptina (LEP), receptor de leptina (LEPR), receptor del factor 1 estimulante de colonias de macrófagos (MCSFR), neurotrofina 4 (NT4), osteoprotegerina (OPG), receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRa), receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRb), y prolactina (PRL). La FIG. 49 muestra el aumento en la secreción del receptor del factor de células madre (SCFR), receptor de angiopoyetina 1 (TIE-1), receptor de angiopoyetina 1 (TIE-2), miembro 10C de la superfamilia de TNF (TNFSF10C), miembro 10D de la superfamilia de TNF (TNFSF10D), miembro 14 de la superfamilia de TNF (TNFSF14), receptor activador del plasminógeno de uroquinasa (uPAR), y receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2). La FIG. 50 muestra el aumento en la secreción del ligando 2 de quimiocina (motivo C-C) (CCL2), CCL3, CCL5, CCL8, CCL17, CCL20, CCL25, ligando 5 de quimiocina CXC (CXCL5), CXCL11, y CXCL16. La FIG. 51 muestra el aumento en la secreción de molécula de adhesión celular leucocitaria activada (ALCAM), proteína 5 morfogenética ósea (BMP5), BMP7, E selectina (molécula de adhesión de células endoteliales), molécula 2 de adhesión intercelular (ICAM2), ICAM3, L selectina (molécula de adhesión de leucocitos), y metaloproteinasa 1 de la matriz (MMP1). La FIG. 52 muestra el aumento en la secreción de metaloproteinasa 13 de la matriz (MMP13), MMP3, MMP9, molécula de adhesión de células endoteliales de plaquetas (PECAM 1), inhibidores de metaloproteinasa TIMP 1, TIMP 2, TIMP 4, y cadherina del epitelio vascular (VE) (proteína de adhesión celular dependiente de calcio). La FIG. 53 muestra el aumento en la secreción de antígeno de diferenciación de monocitos (CD14), antígeno de diferenciación celular (CD80), cardiotrofina-1 (CT-1), factor inhibidor de la leucemia (LIF), factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), trombopoyetina (THPO), y linfotactina (XCL1).

La FIG. 54 muestra el aumento en la secreción del receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR) de las SR-hADSC, 24 o 48 horas después de la estimulación con IL-2. La FIG. 54 también muestra el aumento en la secreción de IL8 y TNFRSF1A. En la FIG. 54 se encontró que estos factores no estaban presentes en PRP.

Las FIGS. 55-57 muestran el aumento en la secreción de las proteínas nombradas más abajo (factores) de las SR-hADSC, 72 horas después de la estimulación con IL-2. Los niveles de secreción se muestran con respecto a la cantidad de la proteína correspondiente presente en los niveles basales en los medios que contienen 10% PRP, usados para el soporte de las hADSC. La FIG. 55 muestra el aumento en la secreción del receptor alfa de interleucina 1 (IL1 Ra), interleucina 6 (IL6), y la subunidad alfa-2 del receptor de interleucina 13 (IL13Ra2). La FIG. 56 muestra el aumento en la secreción del factor 6 de crecimiento de fibroblastos (FGF6), proteína básica proplaquetaria (PPBP), factor de células madre (SCF), y receptor 3 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR3). La FIG. 57 muestra el aumento en la secreción del ligando 22 de quimiocina (motivo C-C) (CCL22), CCL23, CCL24, CCL26, y ligando 10 de quimiocina CXC (CXCL10).

La FIG. 58 muestra el aumento en la secreción de angiotensina (ANG), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), proteína 4 morfogenética ósea (BMP4), factor 2 estimulante de colonias (CSF2), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor 7 de crecimiento de fibroblastos (FGF-7), interferón gamma (IFNg), proteína 1 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP 1), e IGFBP 2 de las SR-hADSC, 72 horas después de la estimulación con IL-2. Se encontró que estos factores no estaban presentes en el PRP.

La FIG. 59 muestra el aumento en la secreción del factor 6 de crecimiento de fibroblastos (FGF6), ligando 16 de quimiocina CXC (CXCL16), y factor 1 alfa derivado de células estromales (SDF1a) de las SEN-hADSC, 24 horas después de la incubación con 10% PRP solo (sin estimulación con IL-2). Los niveles de secreción se muestran con respecto a la cantidad de la proteína correspondiente presente en los niveles basales en los medios que contienen 10% PRP, usados para el soporte de las hADSC.

La FIG. 60 muestra el aumento en la secreción del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), quimiocina de linfocitos B (CXCL13; BLC), ligando 1 de quimiocina (motivo CC) (CCL1), Flt-3 LG (ligando de tirosina cinasa 3 relacionada con Fms), fractalquina (quimiocina de células T CX3CL1), proteína 2 quimiotáctica de granulocitos (GCP-2)/CXCL6, interleucina 1 alfa (IL1a), interleucina 4 (IL4), IL15, e interferón gamma (IFNg) de las SEN-hADSC, 24 horas después incubación con 10% PRP solo (sin estimulación con IL-2). Se encontró que estos factores no estaban presentes en el PRP.

Las FIGS. 61-70 muestran el aumento en la secreción de las proteínas nombradas más abajo (factores) de las SEN-hADSC, 48 horas después de la incubación con 10% PRP solo (sin estimulación con IL-2). Los niveles de secreción se muestran con respecto a la cantidad de la proteína correspondiente presente en los niveles basales en los medios que contienen 10% PRP, usados para el soporte de las hADSC. La FIG. 61 muestra el aumento en la secreción de interleucina 2 beta (IL-2b), IL3, IL5, e IL6. La FIG. 62 muestra el aumento en la secreción del receptor tipo II de interleucina 1 (IL1R2), receptor gamma de interleucina 2 (IL-2Rg), receptor alfa de interleucina 5 (IL5Ra), receptor beta de interleucina 10 (IL10Rb), proteína alfa de unión al receptor de interleucina 18 (IL18BPa), receptor beta de interleucina 18 (IL18Rb), y receptor de interleucina 21 (IL-21R). La FIG. 63 muestra el aumento en la secreción del factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF1), IGF2, LAP (familia de TGF beta), leptina (LEP), receptor de leptina (LEPR), factor A alfa de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFAA), factor A beta de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFAB), y factor B beta de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFBB). La FIG. 64 muestra el aumento en la secreción del receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRa), factor de células madre (SCF), receptor del factor de células madre (SCFR), factor beta 1 de crecimiento transformante (TGF b1), factor beta 2 de crecimiento transformante (TGF b2), factor alfa de crecimiento transformante (TGFa), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), y VEGFR3. La FIG. 65 muestra el aumento en la secreción del receptor 6 de muerte (DR6; miembro 21 de la superfamilia del receptor de TNF), factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales (GDNF), neurotrofina 3 (NT3), tirosina cinasa con dominios 1 similar a inmunoglobulina y similar a EGF (TIE-1), TIE-2, y miembro 14 de la superfamilia de TNF (TNFSF14). La FIG. 66 muestra el aumento en la secreción del ligando 2 de quimiocina (motivo C-C) (CCL2), CCL5, CCL8, CCL17, CCL18, y CCL23. La FIG. 67 muestra el aumento en la secreción del ligando 24 de quimiocina (motivo C-C) (CCL24), CCL25, CCL26, CCL27, ligando 10 de quimiocina CXC (CXCL10), y CXCL11. La FIG. 68 muestra el aumento en la secreción de molécula de adhesión celular leucocitaria activada (ALCAM), proteína 5 morfogenética ósea (BMP5), BMP7, E selectina (molécula de adhesión de células endoteliales), molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM1), ICAM2, L selectina (molécula de adhesión de leucocitos), y metaloproteinasa 1 de la matriz (MMP1). La FIG. 69 muestra el aumento en la secreción de metaloproteinasa 3 de la matriz (MMP3), MMP9, MMP13, molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias (PECAM 1), inhibidores de metaloproteinasa TIMP 1, TIMP 2, y TIMP 4. La FIG. 70 muestra el aumento en la secreción del antígeno de diferenciación de monocitos (CD14), antígeno de diferenciación de monocitos (CD80), cardiotrofina-1 (CT-1), y factor inhibidor de leucemia (LIF).

Las FIGS. 71-72 muestran el aumento en la secreción de las proteínas (factores) nombradas más abajo de las SEN-hADSC, 48 horas después de la incubación con 10% PRP solo (sin estimulación con IL-2). Se encontró que estos factores no estaban presentes en el PRP. La FIG. 71 muestra el aumento en la secreción de proteína 4 morfogenética ósea (BMP4), ligando 11 de quimiocina (motivo CC) (CCL11), CCL23, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor 7 de crecimiento de fibroblastos (FGF7), proteína 1 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP1), IGFBP2, IGFBP4, y receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR). La FIG. 72 muestra el aumento en la secreción de interleucina 7 (IL7), IL10, IL13, e IL-16.

La FIG. 73 muestra el aumento en la secreción de probetacelulina (BTC), subunidad alfa 2 del receptor de interleucina 13 (IL13Ra2), y factor 1 beta derivado de células estromales (SDF1b) de las SEN-hADSC, 72 horas después de la incubación con 10% PRP solo (sin estimulación con IL-2). Los niveles de secreción se muestran con respecto a la cantidad de la proteína correspondiente presente en los niveles basales en los medios que contienen 10% PRP, usados para el soporte de las hADSC.

La FIG. 74 muestra el aumento en la secreción del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), interleucina 8 (IL8), y TNFRSF1A (superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 1A) de las SEN-hADSC, 72 horas después de la incubación con 10% PRP solo (sin estimulación con IL-2). Se encontró que estos factores no estaban presentes en el PRP.

La FIG. 75 muestra el aumento en la secreción del ligando 23 de quimiocina (motivo CC) (CCL23), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), CCL11 (eotaxina 1), IL4, y receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR) de la SEN-hADSC, 24 horas después de la estimulación con IL-2. Se encontró que estos factores no estaban presentes en el PRP.

La FIG. 75 también muestra el aumento en la secreción de CXCL16, HCC4, sgp130, y TNFRSF1B a las 24 h después de la estimulación con IL-2. Los niveles de secreción se muestran con respecto a la cantidad de la proteína correspondiente presente en los niveles basales en los medios que contienen 10% PRP.

Las FIGS. 76-86 muestran el aumento en la secreción de las proteínas nombradas más abajo (factores) de las SEN-hADSC, 48 horas después de la estimulación con IL-2. Los niveles de secreción se muestran con respecto a la cantidad de la proteína correspondiente presente en los niveles basales en los medios que contienen 10% PRP, usados para el soporte de las hADSC. La FIG. 76 muestra el aumento en la secreción de interleucina 1 beta (IL1 b), IL3, IL5, IL6, IL9, IL10, IL12b, y proteína alfa de unión a interleucina 18 (IL18BPa). La FIG. 77 muestra el aumento en la secreción del receptor alfa de interleucina 1 (IL1 Ra), IL1R4, IL10Rb, IL18Rb, IL1R2, IL-21R, IL-2RP, IL-2Ry, e IL5Ra. La FIG.

78 muestra el aumento en la secreción del factor 6 de crecimiento de fibroblastos (FGF6), factores de crecimiento similares a la insulina IGF1 e IGF2, LAP (familia de TGF beta), neurotrofina 3 (NT3), factor A alfa de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFAA), factor A beta de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFAB), y receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRa). La FIG. 79 muestra el aumento en la secreción del factor de células madre (SCF), factor de 2 crecimiento transformante (TGF2), TGFa, TGFP1, TGFb3, factor beta de necrosis tumoral (TNFb), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF R2), y VEGF R3. La FIG. 80 muestra el aumento en la secreción de DR6 (miembro 21 de la superfamilia de receptores de TNF), endoglina (ENG), tirosinaproteína cinasa receptora erbB-3 (ErbB3), ligando de Fas (Fas LG), factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales (GDNF), ligando de GITR (GITR LG), y receptor de leptina (LEPR). La FIG. 81 muestra el aumento en la secreción de prolactina (PRL), receptor del factor de células madre (SCFR), lectina 5 similar a Ig que se une al ácido siálico (Siglec 5), receptor de angiopoyetina 1 (TIE-1), y receptor de angiopoyetina 1 (TIE-2). La FIG. 82 muestra el aumento en la secreción del ligando 8 de quimiocina (motivo C-C) (CCL8), CCL13, CCL15, CCL17, CCL18, y CCL20. La FIG. 83 muestra el aumento en la secreción del ligando 22 de quimiocina (motivo C-C) (CCL22), CCL24, CCL26, ligando 9 de quimiocina CXC (CXCL9), y CXCL11. La FIG. 84 muestra el aumento en la secreción de activina A (INHBA), proteína 5 morfogenética ósea (BMP5), E selectina (molécula de adhesión de células endoteliales), molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM 1), ICAM 2, L selectina (molécula de adhesión de leucocitos), y factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF). La FIG. 85 muestra el aumento en la secreción de metaloproteinasa 1 de la matriz (MMP1), MMP13, MMP3, MMP9, molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias (PECAM 1), e inhibidor 4 de metaloproteinasa (TIMP-4). La FIG. 86 muestra el aumento en la secreción del antígeno de diferenciación de monocitos (CD14), linfotactina (XCL1), cardiotrofina-1 (CT-1), factor inhibidor de la leucemia (LIF), factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), y proteína básica proplaquetaria (PPBP).

La FIG. 87 muestra el aumento en la secreción del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), proteína 4 morfogenética ósea (BMP4), factor 7 de crecimiento de fibroblastos (FGF7), proteína 2 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP2), IL-2, IL-16, e interferón gamma (INF gamma) de las SEN-hADSC, 48 horas después de la estimulación con IL-2. Se encontró que estos factores no estaban presentes en el PRP.

Las FIGS. 88-89 muestran el aumento en la secreción de las proteínas nombradas más abajo (factores) de las SEN-hADSC, 72 horas después de la estimulación con IL-2. Los niveles de secreción se muestran con respecto a la cantidad de la proteína correspondiente presente en los niveles basales en los medios que contienen 10% PRP, usados para el soporte de las hADSC. La FIG. 88 muestra el aumento en la secreción de adiponectina (Acrp30), proteína relacionada con Agouti (AgRP), ANGPT2 (angiopoyetina 2), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), probetacelulina (BTC), subunidad alfa 2 del receptor de interleucina 13 (IL13Ra2), leptina (LEP), neurotrofina 4 (NT4), y factor 1 alfa derivado de células estromales (SDF1a). La FIG. 89 muestra el aumento en la secreción del ligando 2 de quimiocina (motivo C-C) (CCL2), CCL4, CCL5, CCL23, CCL25, CCL27, ligando 10 de quimiocina CXC (CXCL10), factor 1 beta derivado de células estromales (SDF1b), inhibidores de metaloproteinasa 1 (TIMP1), TIMP2, y miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF14).

La FIG. 90 muestra el aumento en la secreción del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e IL13 de las SEN-hADSC, 72 horas después de la estimulación con IL-2. Se encontró que estos factores no estaban presentes en el PRP.

Tabla 5A: Genes regulados al alza diferencialmente en SR IL-2

Tabla 5B: Genes regulados al alza diferencialmente en SEN IL-2

Tabla 5C: Genes re ulados a la baa diferencialmente en SR IL-2

T l D: n r l l if r n i lm n n EN IL-2

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar si un individuo elegible para recibir una terapia basada en IL-2 puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2, comprendiendo el método:

(a) medir los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores en una muestra de sangre, plasma o suero obtenida del individuo, en el que la muestra se combina con IL-2 in vitro antes de la terapia basada en IL-2, y en el que el panel de biomarcadores consiste en TGFP1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1; y

(b) comparar los niveles de los biomarcadores con los niveles de referencia, en el que un aumento en los niveles por encima de los niveles de referencia indica que el individuo puede experimentar un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2, y en el que una disminución o ningún cambio en los niveles comparados con los niveles de referencia indica que es posible que el individuo no experimente un evento adverso asociado con la terapia basada en IL-2.

2. Un agente terapéutico basado en IL-2 para uso en un método de tratamiento de un individuo para un cáncer, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz del agente terapéutico basado en IL-2 al individuo cuando los niveles de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores disminuyen, o no presentan cambio, en comparación con los niveles de referencia en una muestra de sangre, plasma o suero del individuo, en el que la muestra se combina con IL-2 in vitro antes de la terapia basada en IL-2, y en el que el panel de biomarcadores consiste en TGFP1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1.

3. El método de la reivindicación 1, o el agente terapéutico basado en IL-2 para uso según la reivindicación 2, en el que la muestra se combina con IL-2 durante 24 horas; o los niveles de expresión se miden 24, 48 o 72 horas después de la eliminación de IL-2 de la muestra in vitro.

4. Un método in vitro para determinar si una población de células madre mesenquimales (MSC) es adecuada para la administración a un individuo para una terapia basada en MSC, que comprende:

(a) incubar IL-2 con la población de las MSC;

(b) medir los niveles de expresión en las MSC de al menos dos biomarcadores seleccionados de un panel de biomarcadores, en el que el panel de biomarcadores consiste en TGFP1, PLEKHA6, CTSB, FERMT1, CRMP1, VEGFB, VEGFA, y PLEKHA1; y

(c) comparar los niveles de los biomarcadores con los niveles de referencia, en el que un aumento en los niveles por encima de los niveles de referencia indica que las MSC no son adecuadas para la administración a un individuo, y ningún cambio o una disminución en los niveles por debajo de los niveles de referencia indica que las MSC son adecuadas para la administración a un individuo.

5. El método de las reivindicaciones 1 o 4, o el agente terapéutico basado en IL-2 para uso según la reivindicación 2, en el que el método comprende medir los niveles de expresión de al menos tres biomarcadores, al menos cuatro biomarcadores, o al menos cinco biomarcadores del panel de biomarcadores.

6. El método de las reivindicaciones 1 o 4, o el agente terapéutico basado en IL-2 para uso según la reivindicación 2, en el que el método comprende:

(i) medir los niveles de proteína de los biomarcadores; opcionalmente en el que la medida es con un ensayo ELISA, una matriz proteómica de anticuerpos, inmunohistoquímica, o espectrometría de masas; o

(ii) medir los niveles de ARN de los biomarcadores; opcionalmente en el que la medida es con un ensayo de Q-PCR o RNA-seq.

7. El método de la reivindicación 4, en el que las células se incuban con la IL-2 durante 24 horas; o en el que la medida se lleva a cabo 24, 48 o 72 horas después de la eliminación de la IL-2.

8. Una población de células madre mesenquimales (MSC) para uso en un método de tratamiento, comprendiendo el método el método de la reivindicación 4, y comprendiendo además administrar la población de células al individuo.