KR20190126899A - 누공을 치료하기 위한 방법 및 물질 - Google Patents
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Abstract
본 문서는 누공(예, 불응성 항문 누공과 같은 불응성 누공)을 치료하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들어, PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 무작위로 배열된 섬유를 포함하고 무작위로 배열된 섬유 사이의 공간에 위치된 중간엽 줄기 세포(예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)가 시딩되는 합성 스캐폴드(예를 들어, 누공 플러그)를 포유동물(예를 들어, 인간)의 누공(예를 들어, 불응성 항문 누공)에 이식하기 위한 방법 및 물질이 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017 년 3 월 21 일에 출원된 미국 출원 일련 번호 62/474,483을 우선권으로 주장한다. 이전 출원의 개시는 본 출원의 개시의 일부로 간주되며, 그 전체가 본 출원에 통합된다.
1. 기술 분야
본 문서는 일반적으로 의료 디바이스, 특히 누공(fistula)(예, 불응성 항문 누공 및 불응성 기관지흉막 누공과 같은 불응성 누공) 치료를 위한 디바이스, 시스템 및 방법에 관한 것이다.
2. 배경 정보
해결되지 않은 치유는 의학에서 중요한 문제이다. 치유에 실패하면 궤양(환경에 개방된 상처)과 농양이 생길 수 있다. 농양은 감염된 해부학적 공동이다. 누공은 두 개의 중공 장기 사이 또는 중공 장기와 피부 표면 사이에 작용하는 터널을 특징으로 하는 농양강(abscess cavity)의 일종이다. 예를 들어, 항문 누공은 항문주변의 피부와 직장 사이에서 발생하는 감염된 터널이다. 일부 항문 누공은 피부에 퍼지는 항문샘 감염의 결과이다. 크론병과 같은 염증성 장 질환은 또한 소화관과 관련된 누공의 형성에 실질적으로 기여한다. 항문 누공의 치료 양식은 누공의 위치와 복잡성에 따라 다르다. 누공 치료의 일반적인 목표는 완전한 누공 폐쇄를 달성하고 재발을 방지하며 변실금을 유발할 수 있는 괄약근의 손상을 피하는 것이다. 농양강을 치유하는 것은 중요한 도전이다.
본 문서는 누공(예, 항문 누공, 항문선와 누공, 기관지흉막 누공, 직장 질 누공, 및 불응성 누공, 예컨대 불응성 직장 누공, 불응성 항문선와 누공, 불응성 기관지흉막 누공 및 불응성 직장 질 누공)을 치료하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들어, 본 문서는 폴리글리콜산(PGA) 및 트리메틸렌 카보네이트(TMC)의 중합체를 포함한 무작위로 배열된 섬유를 포함하고 무작위로 배열된 섬유 사이의 공간에 위치된 중간엽 줄기 세포(예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)가 시딩되는 합성 스캐폴드(예를 들어, 누공 플러그)를 포유동물(예를 들어, 인간)의 누공(예를 들어, 불응성 항문 누공)에 이식하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 이러한 합성 스캐폴드의 일례는 무작위로 배열된 섬유 사이의 공간에 위치된 중간엽 줄기 세포(예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)가 시딩되는 GORE® BIO-A® Fistula Plug이다.
누공을 치료하기 위한 많은 상이한 합성 물질과 많은 상이한 천연 생물학적 물질의 개발에도 불구하고, 누공, 특히 불응성 항문 누공과 같은 불응성 누공의 성공적인 치료를 향상시키는 능력은 임상의와 환자에게 중요한 요구로 남아 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 많은 상이한 합성 물질 및 천연 생물학적 물질이 얻어지고 지방 유래 중간엽 줄기 세포가 시딩되었다. 불응성 항문 누공을 성공적으로 치료할 수 있는 능력에 대해 상기 조합 각각을 시험관내에서 평가하고, 리드 후보 매트릭스를 생체 내에서 추가로 연구하였다. 본원에 기술된 바와 같이 지방 유래 중간엽 줄기 세포가 시딩되는 테스트된 물질의 대부분은 시험관내에서 평가된 바와 같이 불량한 세포 시딩을 초래하였다. 그러나, 본원에 기술된 바와 같이 시딩될 때 하나의 물질은 다른 모든 테스트된 물질을 현저히 수행하여, 시험관내에서 평가된 바와 같이 예상치 못하게 높은 수준의 세포 시딩 및 증식을 유도하고, 12 개의 이전의 불응성 항문 누공 중 10 개의 매우 효과적인 완전 치유를 유도하였다. 이 물질은 GORE® BIO-A® Fistula Plug로, PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 무작위로 배열된 섬유를 포함하는 합성 스캐폴드이다. GORE® BIO-A® Fistula Plug 제조업체는 침지 또는 스트레칭 등 작업 준비없이 쉽게 사용할 수 있다고 설명하고 있다(GORE® BIO-A® Fistula Plug, Frequently Asked Questions, September 2010).
본원에 기술된 바와 같이 물질을 선택한 후 선택된 그 물질에 지방 유래 중간엽 줄기 세포를 시딩하여 미래의 누공 재발없이 불응성 누공(예를 들어, 불응성 항문 누공)을 80% 넘게 성공적으로 치료하는 데 사용될 수 있는 임플란트를 생성하는 능력을 갖는 것은 임상의와 환자 모두에게 이러한 심각한 의학적 병태에 대해 오랫동안 기다려온 치료 옵션을 제공한다.
본 문서는 또한 상처(예를 들어, 치유되지 않은 상처 또는 농양)를 치료하는 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들어, 본 문서는 PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 섬유를 포함하고 섬유 사이의 공간에 위치된 중간엽 줄기 세포(예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)가 시딩된 합성 스캐폴드를 포유동물(예를 들어, 인간)의 상처에 적용하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 일부 경우에, 본원에 제공된 합성 스캐폴드는 상처(예를 들어, 치유되지 않은 상처 또는 농양)를 치료하는데 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 문서의 한 측면은 포유동물에서 누공을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 스캐폴드를 누공에 이식하는 단계를 포함하고 (또는 본질적으로 구성하거나 또는 구성하고), 여기서 스캐폴드는 섬유(예를 들어, 무작위로 배열된 섬유) 및 섬유 사이에 위치된 중간엽 줄기 세포를 포함하며, 섬유는 폴리글리콜산 및 트리메틸렌 카보네이트의 중합체를 포함한다. 포유동물은 인간일 수 있다. 누공은 항문 누공일 수 있다. 누공은 불응성 항문 누공일 수 있다. 누공의 최대 직경은 25 mm 미만일 수 있다. 중간엽 줄기 세포는 지방 유래 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 폴리글리콜산은 섬유의 약 60% 내지 약 70%일 수 있다. 폴리글리콜산은 섬유의 약 67%일 수 있다. 트리메틸렌 카보네이트는 섬유의 약 30% 내지 약 40%일 수 있다. 트리메틸렌 카보네이트는 섬유의 약 33%일 수 있다. 스캐폴드는 혈소판 유도체 물질을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 문서는 누공 치료용 임플란트를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 폴리프로필렌 용기 내에서 중간엽 줄기 세포와 섬유(예를 들어, 무작위로 배열된 섬유)를 포함한 스캐폴드를 접촉시키는 단계를 포함하고 (또는 본질적으로 구성하거나 또는 구성하고), 여기서 섬유는 폴리글리콜산 및 트리메틸렌 카보네이트의 중합체를 포함한다. 중간엽 줄기 세포는 지방 유래 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 폴리프로필렌 용기 내에서의 접촉은 3일 이상 동안 일어날 수 있다. 폴리프로필렌 용기 내에서의 접촉은 약 3일 내지 약 10일 동안 일어날 수 있다. 폴리프로필렌 용기 내에서의 접촉은 약 4일 내지 약 6일 동안 일어날 수 있다. 폴리글리콜산은 섬유의 약 60% 내지 약 70%일 수 있다. 폴리글리콜산은 섬유의 약 67%일 수 있다. 트리메틸렌 카보네이트는 섬유의 약 30% 내지 약 40%일 수 있다. 트리메틸렌 카보네이트는 섬유의 약 33%일 수 있다. 상기 방법은 용기 내에서 혈소판 유도체 물질과 스캐폴드를 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 문서는 섬유 및 섬유 사이에 위치된 중간엽 줄기 세포를 포함하는 (또는 본질적으로 구성하거나 또는 구성하는) 스캐폴드를 특징으로 하며, 여기서 섬유는 폴리글리콜산 및 트리메틸렌 카보네이트의 중합체를 포함하고 (또는 본질적으로 구성하거나 또는 구성하고), 중간엽 줄기 세포는 섬유의 부재하에 배양된 유사한 중간엽 줄기 세포보다 더 많은 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF-2) 폴리펩티드, 에오탁신 폴리펩티드, FMS 유사 티로신 키나제 3 리간드 (FLT3L) 폴리펩티드, 성장 조절 단백질 (GRO) 폴리펩티드 및 인터루킨 10 (IL-10) 폴리펩티드를 발현하고, 중간엽 줄기 세포는 유사한 중간엽 줄기 세포보다 더 적은 프렉탈카인 폴리펩티드를 발현한다. 중간엽 줄기 세포는 지방 유래 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 폴리글리콜산은 섬유의 약 60% 내지 약 70%일 수 있다. 폴리글리콜산은 섬유의 약 67%일 수 있다. 트리메틸렌 카보네이트는 섬유의 약 30% 내지 약 40%일 수 있다. 트리메틸렌 카보네이트는 섬유의 약 33%일 수 있다. 스캐폴드는 혈소판 유도체 물질을 포함할 수 있다. 섬유는 무작위로 배열된 섬유일 수 있다. 중간엽 줄기 세포는 유사한 중간엽 줄기 세포보다 더 많은 단핵구-화학주성 단백질 3 (MCP-3) 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 중간엽 줄기 세포는 유사한 중간엽 줄기 세포보다 더 적은 인터루킨 12 (IL-12) p40 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 중간엽 줄기 세포는 유사한 중간엽 줄기 세포보다 더 많은 인터루킨 12 (IL-12) p70 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 아래에 설명된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전문이 참고로 포함된다. 충돌이 있을 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부 사항은 첨부 도면 및 이하의 설명에서 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면으로부터 그리고 청구 범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 다양한 유형의 항문 누공을 묘사한 해부도이다.
도 2는 누공의 치료를 위한 예시적인 고체 매트릭스 스캐폴드 디바이스의 예시이다.
도 3은 본원에 제공된 스캐폴드를 제조하고 이식하는데 사용될 수 있는 예시적인 단계의 흐름도이다.
도 4는 지방 유래 중간엽 줄기 세포를 스캐폴드에 시딩하기 위한 배양 시스템의 사진이다.
도 5는 지방 유래 중간엽 줄기 세포를 스캐폴드에 시딩한 후의 시간에 대한 배지의 pH를 플롯팅한 그래프이다. "B"는 생물학적 물질을 나타낸다. 대조군은 스캐폴드에 부착되지 않은 자유 부유성 지방 유래 중간엽 줄기 세포이다.
도 6은 지방 유래 중간엽 줄기 세포를 스캐폴드에 시딩한 후의 시간에 대한 배지의 pH를 플롯팅한 그래프이다. "S"는 합성 물질을 나타낸다. 대조군은 스캐폴드에 부착되지 않은 자유 부유성 지방 유래 중간엽 줄기 세포이다.
도 7은 표시된 스캐폴드 물질에 대해 72시간째에 스캐폴드의 세포수를 플롯팅한 그래프이다. "B"는 생물학적 물질을 나타내고; "S"는 합성 물질을 나타낸다. 대조군은 스캐폴드에 부착되지 않은 자유 부유성 지방 유래 중간엽 줄기 세포이다. 파선 수평선은 0 시간에 각 물질에 시딩된 세포수(즉, 250,000개)이다. 시딩 후 72시간째에, 스캐폴드를 수집하고, 정량적 DNA 분석을 수행하여 각 스캐폴드에서의 세포수를 결정하였다.
도 8은 표시된 스캐폴드에 시딩된 세포로부터의 VEGF에 대한 신호 강도를 플롯팅한 그래프이다.
도 9는 표시된 스캐폴드에 시딩된 세포로부터 MIP-1a에 대한 신호 강도를 플롯팅한 그래프이다.
도 10은 표시된 스캐폴드에 시딩된 세포로부터의 MCP-1에 대한 신호 강도를 플롯팅한 그래프이다.
도 11은 표시된 스캐폴드에 시딩된 세포로부터 EGF에 대한 신호 강도를 플롯팅한 그래프이다.
도 12A-B. MSC 결합 매트릭스에 의한 치료 후 누공형성 질환의 임상적 개선. 연구 중인 모범 환자에서 치료전 및 치료후(플러그 배치 7개월후) 이미지 (A). 화살표는 플러그 배치(상단)시 항문주변 검사 및 추적 MRI로부터의 이미지와 함께 치료 전 및 치료 후 6개월된 39세 여성 크론 환자에서의 MR 이미지에서의 세톤(seton)이 설치된 괄약근 누공을 나타낸다. (B) Van Aasche 규모, 관 길이 및 누공 직경의 변화에 대한 누적 결과. P 값은 플러그를 배치하기 전과 6 개월 후 대응표본 T 검정을 나타낸다. 누공 직경의 경우, 상단의 P 값은 모든 샘플을 나타내고 하단의 P 값은 시작 직경이 20 mm 미만인 11개의 샘플에 대한 것이다.
도 13A-B. 인간 중간엽 기질 세포를 폴리글리콜산 트리메틸렌 카보네이트 매트릭스에 결합한 후 변경되고 일관된 유전자 발현 변화. 누공형성 크론병 환자의 6개의 인간 지방 샘플을 사용하여 중간엽 기질 세포를 증식시켰다. 세포를 증식시켜 직접 사용하거나 또는 폴리글리콜산 트리메틸렌 카보네이트 기반 인공 매트릭스에 결합하여 사용하였다. (A) RNA-SEQ 데이터로부터의 대표적인 유전자의 발현 값. (B) 매트릭스에 부착된 후 세포의 전이와 관련된 변화를 확인하는데 사용될 수 있는 대표적인 유전자.
도 14A-B. 매트릭스 감소된 증식 및 세포 주기에 결합된 MSC는 분비된 단백질을 유지하고 매트릭스 유전자 발현 프로파일을 증가시킨다. 매트릭스 상에서 배양된 MSC에 대한 MSC에서 상위 25개의 가장 차등 발현된 유전자 (A) 및 매트릭스에 대한 부착 후 가장 높은 차등 발현을 갖는 유전자 (B). 확인된 유전자의 분포 및 성질은 매트릭스 상의 세포가 증식 후 상태에 도달하여 단백질 합성 기구 매트릭스 발현에 필요한 유전자의 발현 증가를 나타내는 것을 시사한다. 후자는 콜라겐이 풍부한 세포 외 매트릭스(ECM)의 생산을 지원하는 단백질 동화작용 상태를 촉진한다. 본 발명자들의 mRNA 분석에 기초하여, 이 ECM은 풍부도 순서로 콜라겐 유형 I, III, VI 및 V로 각각 구성될 것으로 예측된다.
도 15A-D. 크론 환자의 누공형성 질환 치료를 위한 MSC 결합된 누공 플러그의 제조 및 특성화. 크론 환자의 지방 조직을 사용하여 MSC를 단리하고 제조하였다. 환자로부터의 세포(n = 7)는 급속하게 성장하고, 냉동 저장으로부터 회수하고, 고효율로 매트릭스에 결합시켰다 (A). 환자 MSC의 대표적인 표현형 (B). 수집시 세포 모폴로지 및 투여 전 제조된 세포/매트릭스 조합의 예 (C). (D) MSC (좌상단; Syto13 양성 에티디움 브로마이드 음성)에 결합한 후 생육 세포(녹색)의 입증, Goldner Trichrome 염색(우상단) 및 세포 결합 전(좌하단)과 세포 결합 후(우하단) 매트릭스의 SEM에 의해 입증된 콜라겐 침착.
도 16A-D는 배양 배지에서 대조군 세포와 비교하여 표시된 바와 같이 GORE 합성 스캐폴드 또는 다른 합성 물질에 위치된 세포로부터의 폴리펩티드 피분석물의 차등 분비를 보여주는 표이다.
도 17A-D는 배양 배지에서 대조군 세포와 비교하여 표시된 바와 같이 GORE 합성 스캐폴드 또는 다른 합성 물질에 위치된 세포로부터의 폴리펩티드 피분석물의 차등 분비를 보여주는 표이다.
도 2는 누공의 치료를 위한 예시적인 고체 매트릭스 스캐폴드 디바이스의 예시이다.
도 3은 본원에 제공된 스캐폴드를 제조하고 이식하는데 사용될 수 있는 예시적인 단계의 흐름도이다.
도 4는 지방 유래 중간엽 줄기 세포를 스캐폴드에 시딩하기 위한 배양 시스템의 사진이다.
도 5는 지방 유래 중간엽 줄기 세포를 스캐폴드에 시딩한 후의 시간에 대한 배지의 pH를 플롯팅한 그래프이다. "B"는 생물학적 물질을 나타낸다. 대조군은 스캐폴드에 부착되지 않은 자유 부유성 지방 유래 중간엽 줄기 세포이다.
도 6은 지방 유래 중간엽 줄기 세포를 스캐폴드에 시딩한 후의 시간에 대한 배지의 pH를 플롯팅한 그래프이다. "S"는 합성 물질을 나타낸다. 대조군은 스캐폴드에 부착되지 않은 자유 부유성 지방 유래 중간엽 줄기 세포이다.
도 7은 표시된 스캐폴드 물질에 대해 72시간째에 스캐폴드의 세포수를 플롯팅한 그래프이다. "B"는 생물학적 물질을 나타내고; "S"는 합성 물질을 나타낸다. 대조군은 스캐폴드에 부착되지 않은 자유 부유성 지방 유래 중간엽 줄기 세포이다. 파선 수평선은 0 시간에 각 물질에 시딩된 세포수(즉, 250,000개)이다. 시딩 후 72시간째에, 스캐폴드를 수집하고, 정량적 DNA 분석을 수행하여 각 스캐폴드에서의 세포수를 결정하였다.
도 8은 표시된 스캐폴드에 시딩된 세포로부터의 VEGF에 대한 신호 강도를 플롯팅한 그래프이다.
도 9는 표시된 스캐폴드에 시딩된 세포로부터 MIP-1a에 대한 신호 강도를 플롯팅한 그래프이다.
도 10은 표시된 스캐폴드에 시딩된 세포로부터의 MCP-1에 대한 신호 강도를 플롯팅한 그래프이다.
도 11은 표시된 스캐폴드에 시딩된 세포로부터 EGF에 대한 신호 강도를 플롯팅한 그래프이다.
도 12A-B. MSC 결합 매트릭스에 의한 치료 후 누공형성 질환의 임상적 개선. 연구 중인 모범 환자에서 치료전 및 치료후(플러그 배치 7개월후) 이미지 (A). 화살표는 플러그 배치(상단)시 항문주변 검사 및 추적 MRI로부터의 이미지와 함께 치료 전 및 치료 후 6개월된 39세 여성 크론 환자에서의 MR 이미지에서의 세톤(seton)이 설치된 괄약근 누공을 나타낸다. (B) Van Aasche 규모, 관 길이 및 누공 직경의 변화에 대한 누적 결과. P 값은 플러그를 배치하기 전과 6 개월 후 대응표본 T 검정을 나타낸다. 누공 직경의 경우, 상단의 P 값은 모든 샘플을 나타내고 하단의 P 값은 시작 직경이 20 mm 미만인 11개의 샘플에 대한 것이다.
도 13A-B. 인간 중간엽 기질 세포를 폴리글리콜산 트리메틸렌 카보네이트 매트릭스에 결합한 후 변경되고 일관된 유전자 발현 변화. 누공형성 크론병 환자의 6개의 인간 지방 샘플을 사용하여 중간엽 기질 세포를 증식시켰다. 세포를 증식시켜 직접 사용하거나 또는 폴리글리콜산 트리메틸렌 카보네이트 기반 인공 매트릭스에 결합하여 사용하였다. (A) RNA-SEQ 데이터로부터의 대표적인 유전자의 발현 값. (B) 매트릭스에 부착된 후 세포의 전이와 관련된 변화를 확인하는데 사용될 수 있는 대표적인 유전자.
도 14A-B. 매트릭스 감소된 증식 및 세포 주기에 결합된 MSC는 분비된 단백질을 유지하고 매트릭스 유전자 발현 프로파일을 증가시킨다. 매트릭스 상에서 배양된 MSC에 대한 MSC에서 상위 25개의 가장 차등 발현된 유전자 (A) 및 매트릭스에 대한 부착 후 가장 높은 차등 발현을 갖는 유전자 (B). 확인된 유전자의 분포 및 성질은 매트릭스 상의 세포가 증식 후 상태에 도달하여 단백질 합성 기구 매트릭스 발현에 필요한 유전자의 발현 증가를 나타내는 것을 시사한다. 후자는 콜라겐이 풍부한 세포 외 매트릭스(ECM)의 생산을 지원하는 단백질 동화작용 상태를 촉진한다. 본 발명자들의 mRNA 분석에 기초하여, 이 ECM은 풍부도 순서로 콜라겐 유형 I, III, VI 및 V로 각각 구성될 것으로 예측된다.
도 15A-D. 크론 환자의 누공형성 질환 치료를 위한 MSC 결합된 누공 플러그의 제조 및 특성화. 크론 환자의 지방 조직을 사용하여 MSC를 단리하고 제조하였다. 환자로부터의 세포(n = 7)는 급속하게 성장하고, 냉동 저장으로부터 회수하고, 고효율로 매트릭스에 결합시켰다 (A). 환자 MSC의 대표적인 표현형 (B). 수집시 세포 모폴로지 및 투여 전 제조된 세포/매트릭스 조합의 예 (C). (D) MSC (좌상단; Syto13 양성 에티디움 브로마이드 음성)에 결합한 후 생육 세포(녹색)의 입증, Goldner Trichrome 염색(우상단) 및 세포 결합 전(좌하단)과 세포 결합 후(우하단) 매트릭스의 SEM에 의해 입증된 콜라겐 침착.
도 16A-D는 배양 배지에서 대조군 세포와 비교하여 표시된 바와 같이 GORE 합성 스캐폴드 또는 다른 합성 물질에 위치된 세포로부터의 폴리펩티드 피분석물의 차등 분비를 보여주는 표이다.
도 17A-D는 배양 배지에서 대조군 세포와 비교하여 표시된 바와 같이 GORE 합성 스캐폴드 또는 다른 합성 물질에 위치된 세포로부터의 폴리펩티드 피분석물의 차등 분비를 보여주는 표이다.
본 문서는 누공(예: 불응성 항문 누공과 같은 불응성 누공)을 치료하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들어, 본 문서는 PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 무작위로 배열된 섬유를 포함하고 무작위로 배열된 섬유 사이의 공간에 위치된 중간엽 줄기 세포(예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)가 시딩된 합성 스캐폴드(예를 들어, 누공 플러그)를 포유동물(예를 들어, 인간)의 누공(예를 들어, 불응성 항문 누공)에 이식하기 위한 방법 및 물질을 제공한다.
본원에 제공된 합성 스캐폴드는 임의의 적절한 형상 및 치수로 설계되거나 성형된 PGA 및 TMC의 중합체를 포함하는 섬유를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 합성 스캐폴드는 치유되지 않은 상처 또는 누공에 부합하는 형상 및 치수로 설계되거나 성형될 수 있다. 적절한 형상의 예는 패치, 시트, 튜브, 플러그 또는 컬럼을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일례에서, 시트는 상처의 표면에 적용될 수 있다. 다른 예에서, 시트는 롤링되어 튜브형 구조를 형성함으로써 튜브형 구조 주위를 감싸거나 루멘을 지지할 수 있다. 일부 경우에는 시트 형식의 합성 스캐폴드를 사용하여 기관지흉막 누공을 치료할 수 있다.
누공은 두 개의 중공 장기 사이 또는 중공 장기와 피부 표면 사이의 터널이다. 임의의 적절한 누공은 본원에 기술된 바와 같이 치료될 수 있다. 예를 들어, 항문 누공, 장피 누공, 기관지흉막 누공 및 방광피 누공은 본원에 기술된 바와 같이 치료될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법 및 물질은 불응성 누공을 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 누공과 관련하여 사용된 용어 "불응성"은 의학적 및 외과적 치료를 포함하는 현재의 최선의 방법에도 불구하고 치유되지 않은 누공을 지칭한다. 본원에 기술된 바와 같이 치료될 수 있는 불응성 누공의 예는 불응성 항문 누공 및 불응성 장피 누공을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
도 1은 인간의 하부 결장 영역 (10)의 해부학적 개략도를 제공한다. 하부 결장 영역 (10)은 직장 (20), 항문 괄약근 근육 (30) 및 피부 표면 (40)을 포함한다. 항문 누공 (50)도 도시되어 있다. 항문 누공의 유형은 관의 경로와 괄약근 근육과의 거리에 따라 분류된다. 예를 들어, 항문 누공 (50)은 괄약근관통 누공이다. 그러나, 본원에 제공된 예시적인 디바이스, 시스템 및 방법은 다른 유형의 항문 누공 및 일반적으로 누공에 적용될 수 있다. 항문 누공 (50)은 내부 개구부 (60) (직장 (20)), 외부 개구부 (70) (피부 표면 (40)) 및 누관 (80)을 포함한다. 누관 (80)은 내부 개구부 (60)를 외부 개구부 (70)에 연결하는 터널이다. 누관 (80)은 농양강 유형의 일례이다. 누관 (80)은 본원에 제공된 디바이스, 시스템 및 방법에 의해 치료될 수 있다. 다른 유형의 누공도 유사하게 치료할 수 있다.
도 2는 도 1의 항문 누공 (50)과 같은 항문 누공을 치료하기 위한 누공 수복 디바이스 (200) (예를 들어, 누공 플러그)의 예시적인 실시양태를 도시한다. 누공 수복 디바이스 (200)는 조직 성장을 지지하기 위해 고체 매트릭스 스캐폴드를 제공하는 이식가능한 생체흡수성 디바이스의 예이다. 고체 매트릭스 스캐폴드를 갖는 누공 수복 디바이스 (200)와 같은 디바이스는 누공에 이식되어 공동의 조직 재생 및 치유를 촉진할 수 있다. 예를 들어, 세포는 고체 매트릭스 스캐폴드로 이동할 수 있고, 신체가 고체 매트릭스 스캐폴드 물질을 점차적으로 흡수함에 따라 조직이 생성될 수 있다.
누공 수복 디바이스 (200)와 같은 본원에 제공된 합성 스캐폴드 (예를 들어, 누공 플러그)는 PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 무작위로 배열된 섬유를 포함할 수 있다. 이러한 합성 스캐폴드를 제조하기 위해 임의의 적절한 양의 PGA 및 TMC가 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 합성 스캐폴드 (예를 들어, 누공 플러그)는 약 50% 내지 약 80% (약 55% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 또는 약 65% 내지 약 70%)의 PGA, 및 약 20% 내지 약 50% (약 25% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 또는 약 30% 내지 약 35%)의 TMC를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 합성 스캐폴드 (예를 들어, 누공 플러그)는 약 67%의 PGA 및 약 33%의 TMC를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있는 합성 스캐폴드의 일례는 GORE® BIO-A® Fistula Plug이다.
본원에 기재된 바와 같이, 예컨대 누공 수복 디바이스 (200)로서의 고체 매트릭스 스캐폴드 디바이스는, 중간엽 줄기 세포 (예, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)와 함침되어 개선된 이식가능한 디바이스를 생성함으로써 80% 초과의 성공률로 누공 (예를 들면, 불응성 항문 누공)을 치료할 수 있다. 예를 들어, PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 무작위로 배열된 섬유를 갖는 누공 수복 디바이스 (200)와 같은 본원에 제공된 합성 스캐폴드 (예를 들어, 누공 플러그)에는 무작위로 배열된 섬유 사이의 공간에 위치된 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)를 시딩할 수 있다.
일부 경우에, PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 섬유 (예를 들어, 무작위로 배열된 섬유)를 포함하는 합성 스캐폴드는 섬유 사이의 공간에 위치된 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)를 포함하도록 설계될 수 있고, 여기서 세포는 고유한 폴리펩티드 발현 프로파일을 갖는다. 예를 들어, 합성 스캐폴드의 세포는, "ctrl" (대조군) 컬럼과 비교하여, "매트릭스" 컬럼 하에서, 도 13A 또는 도 13B에 도시된 방식으로 도 13A 또는 도 13B에 열거된, 또는 도 16 또는 도 17에 도시된 방식으로 도 16 또는 도 17에 열거된, 하나 이상 (예를 들어, 1 내지 10, 1 내지 15, 5 내지 10, 5 내지 15, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25, 25 내지 30, 또는 30 내지 35)의 폴리펩티드를 발현할 수 있으며, 이는 배양 배지에서 대조군 세포와 비교하여 GORE 합성 스캐폴드 상에 위치된 세포로부터 피분석물의 차등 분비를 입증하였다. 일부 경우에, PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 섬유 (예를 들어, 무작위로 배열된 섬유)를 포함하는 합성 스캐폴드는 섬유 (예를 들어, 무작위로 배열된 섬유) 사이의 공간에 위치된 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)를 포함하도록 설계될 수 있으며, 여기서 세포는 합성 스캐폴드와 접촉하지 않은 대조군 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)의 무작위 수집에서 관찰된 것보다 더 많은 CD44, CD105/ENG, AKT1, CD140B/PDGFRB, GAPDH 및/또는 COL3A1 폴리펩티드 (및/또는 더 적은 CD90/THY1, CD248, ACTB, Nestin, CyclinB2, MKI67 및/또는 HPRT1 폴리펩티드)를 발현한다. 일부 경우에, PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 섬유 (예를 들어, 무작위로 배열된 섬유)를 포함하는 합성 스캐폴드는 섬유 (예를 들어, 무작위로 배열된 섬유) 사이의 공간에 위치된 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)를 포함하도록 설계될 수 있으며, 여기서 세포는 합성 스캐폴드와 접촉하지 않은 대조군 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)의 무작위 수집에서 관찰된 것보다 COL1A1, COL1A2, VIM, CD140B/PDGFRB 및/또는 COL3A1의 더 높은 RNA 발현을 나타낸다 (및/또는 CD90/THY1, CD73, CD248, ACTB, Nestin, CyclinB2, MKI67 및/또는 HPRT1의 더 낮은 RNA 발현을 나타낸다). 일부 경우에, PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 섬유를 포함하는 합성 스캐폴드는 섬유 사이의 공간에 위치된 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)를 포함하도록 설계될 수 있으며, 여기서 세포는 합성 스캐폴드 상에 있지 않은 대조군 세포보다 높은 속도로 하기 폴리펩티드를 분비하였다: FGF2, 에오탁신, G-CSG, GRO, IL-1ra 및/또는 IL-10 (및/또는 Fractalkine 또는 sIL-2ra에 대해서는 더 낮은 분비율).
일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이 이식가능한 디바이스를 제조하는데 사용되는 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)는 치료될 포유동물 (예를 들어, 인간)에 자가유래할 수 있다. 예를 들어, 지방 조직 샘플은 치료될 포유동물 (예를 들어, 인간)로부터 얻을 수 있다. 얻어진 지방 조직 샘플은 다른 곳에 기술된 바와 같이 처리될 수 있고(Bartunek et al., Cell Transplantation, 20(6):797-811 (2011) and Chen et al., Transfusion, 55(5):1013-1020 (2015)), 생성된 물질은 배양으로 증식되어 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)의 배양물을 수득한다. 일부 경우에, 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)는 약 3일 내지 약 30일 (예를 들어, 약 3일 내지 약 25일, 약 3일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 30일, 약 10일 내지 약 30일, 약 5일 내지 약 21일, 또는 약 8일 내지 약 15일) 배양으로 증식될 수 있다. 일부 경우에, 동종 또는 이종 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)는 자가유래 세포 대신에 사용될 수 있다.
중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)를, PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 무작위로 배열된 섬유를 갖는 스캐폴드에 시딩하기 위해 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 무작위로 배열된 섬유를 갖는 스캐폴드 (예를 들어, GORE® BIO-A® Fistula Plug)는 일정 시간 동안 적절한 배지와 함께 폴리프로필렌 또는 폴리프로필렌 코팅 용기에서 적절한 수의 생육 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 생육 지방 유래 중간엽 줄기 세포)와 조합될 수 있다. 폴리프로필렌 코팅 튜브, 폴리프로필렌 코팅 접시 또는 폴리프로필렌 코팅 플레이트와 같은 임의의 적절한 폴리프로필렌 또는 폴리프로필렌 코팅 용기가 사용될 수 있다. 일반적으로, 스캐폴드 물질의 cm2 당 약 50,000 내지 약 4,000,000개 (예를 들어, 약 100,000 내지 약 4,000,000개, 약 200,000 내지 약 4,000,000개, 약 250,000 내지 약 4,000,000개, 약 200,000 내지 약 3,500,000개, 약 200,000 내지 약 3,000,000개, 약 200,000 내지 약 2,500,000개, 또는 약 250,000 내지 약 3,000,000개)의 생육 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 생육 지방 유래 중간엽 줄기 세포)가 스캐폴드에 시딩되는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 스캐폴드에 시딩되는데 사용될 수 있는 배지의 예는 aMEM, DMEM, RPMI, Eagles MEM, ADSC, MSCGM 및 특수 MSC 배지 성장 제품을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이들 배지는 PLTMax® (Mill Creek Life Sciences, LLC; 미국 미네소타주 로체스터 소재)와 같은 인간 혈소판 용해물의 유도체로 구성된 배지 보충제를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 일반적으로, 시딩 공정은 약 1일 내지 약 10일 (예를 들어, 약 2일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 6일, 또는 약 4일 내지 약 6일)일 수 있다. 스캐폴드에 세포를 시딩하기 위해 스캐폴드와 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 생육 지방 유래 중간엽 줄기 세포)를 배양한 후, 시딩된 스캐폴드를 포유동물 (예를 들어, 인간)에 이식하여 누공을 치료할 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 치료제는 예를 들어 적절한 공유 또는 비공유 결합을 통해 본원에 제공된 스캐폴드와 조합될 수 있다. 본원에 제공된 스캐폴드와 조합될 수 있는 치료제의 예는 PDGF, FGF 또는 VEGF와 같은 성장 인자 및 풀링된 인간 혈소판 유도체 또는 혈소판 용해물 물질과 같은 혈소판 물질을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 제공된 고체 매트릭스 스캐폴드에 치료제를 결합시키는 공정은, 일부 실시양태에서, 치료제와 스캐폴드 물질을 흡수시키기 위해 스캐폴드 물질과 조합될 수 있는 다양한 유형의 용액 또는 물질에 치료제를 현탁시킴으로써 수행될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 치료제는 세포 시딩 공정 동안 스캐폴드 물질에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 일부 경우에, 누공 수복 디바이스 (200)와 같은 스캐폴드는 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)를 단독으로 함유하는 용액 또는 현탁액 중 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포) 및 혈소판 용해물 물질을 함유하는 용액에 침지시킬 수 있다.
도 2를 참조하면, 일반적으로, 예시적인 누공 수복 디바이스 (200) (예를 들어, 누공 플러그 디바이스)는 디스크 부분 (210) 및 복수의 다리 (220)를 포함할 수 있다. 복수의 다리 (220)는 근위 단부의 디스크 부분 (210)에 부착될 수 있고, 원위 단부 (230)는 부착되지 않고 개별적으로 자유롭게 될 수 있다. 복수의 다리 (220)는 다양한 크기의 누관에 맞도록 맞춤화될 수 있는 누공 수복 디바이스 (200)를 제공할 수 있다. 즉, 누공 수복 디바이스 (200)의 단면 크기를 감소시켜 치료될 특정 누관의 크기와 상관시키기 위해 하나 이상의 복수의 레그 (220)가 디스크 부분 (210)으로부터 트리밍될 수 있다.
본원에 제공된 누공 수복 디바이스의 다른 실시양태는 다양한 상이한 물리적 구성을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 누공 수복 디바이스는 긴 원뿔형 형상을 갖는 단일 세장형 요소일 수 있다. 또한, 일부 경우에, 누공 수복 디바이스는 긴 원통형 형상을 갖는 단일 요소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 누공 수복 디바이스는 디바이스의 길이를 따라 가변 프로파일을 가질 수 있다. 일반적으로, 누공 수복 디바이스는 공동을 채우고 단단히 이식된 상태를 유지하도록 성형될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 누공 수복 디바이스는 누공의 한쪽 또는 양쪽 단부에 배치된 시트일 수 있다. 본원에 기재된 누공 수복 디바이스는 PGA 및 TMC의 합성 중합체 또는 이러한 물질의 복합 구성물로부터 제조될 수 있다.
중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포) (및/또는 혈소판 용해물 물질)가 시딩된 예시적인 누공 수복 디바이스 (200)는 다음의 일반적인 예시적인 공정에 따라 누관에 이식될 수 있다. 먼저, 원위 단부 (230)는 함께 봉합될 수 있다. 적절한 당김(pulling) 디바이스는 누관 (80)을 통해 완전히 삽입될 수 있다 (도 1 참조). 당김 디바이스는 치료될 누공의 특정 해부학 및 유형에 따라 봉합사, 가이드와이어, 지혈기 등일 수 있다. 내부 개구부 (60)에서 당김 디바이스의 단부는 누공 수복 디바이스 (200)의 원위 단부 (230)에 부착될 수 있다. 예를 들어, 봉합사 당김 디바이스의 경우, 봉합사 당김 디바이스는 원위 단부 (230)에 스티칭 및/또는 묶일 수 있다. 또는, 지혈기 당김 디바이스의 경우, 지혈기는 원위 단부 (230)에 클램핑될 수 있다. 다음으로, 외부 개구부 (70)에서 당김 디바이스의 다른 단부는 원위 단부 (230)를 내부 개구부 (60)쪽으로 끌어 당기도록 조심스럽게 당길 수 있다. 원위 단부 (230)는 내부 개구부 (60)에 접근하고, 원위 단부 (230)는 내부 개구부 (60)를 통해 누관 (80) 내로 조심스럽게 안내될 수 있다. 디스크 부분 (210)이 내부 개구부 (60)와 플러싱될 때까지 누공 수복 디바이스 (200)는 누공 (50) 내로 완전히 당겨질 수 있다. 디스크 부분 (210)은 이어서 내부 개구부 (60)에서 제자리에 고정되도록 봉합 또는 클램핑될 수 있다. 원위 단부 (230)가 외부 개구부 (70)로부터 돌출되면, 피부 표면 (40)에 대해 트림 플러싱될 수 있다.
중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)가 시딩된 이식된 누공 수복 디바이스 (200)는 연조직 수복을 위해 스캐폴드를 제공하여 누공의 치유 및 폐쇄를 촉진할 수 있다. PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 무작위로 배열된 섬유를 포함하고 무작위로 배열된 섬유들 사이의 공간에 위치하게 되는 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)가 시딩된 스캐폴드를 조합하면, PGA 및 TMC의 중합체 이외의 물질로부터 제조된 다른 디바이스와 비교할 때, 개선된 누공 치료 성공을 달성할 수 있는 디바이스가 될 수 있다. 불응성 항문 누공과 같은 불응성 누공을 치료할 때 개선된 누공 치료 성공은 80% 초과일 수 있다.
도 3은 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)를 함유하는 스캐폴드를 포함하는 시스템을 사용하여 누공을 치료하기 위한 예시적인 공정 (300)을 도시한 흐름도이다. 일반적으로, 예시적인 공정 (300)의 기술은 PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 무작위로 배열된 섬유 및 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)를 포함하는 스캐폴드로 누공을 채우는 것을 포함한다.
단계 310에서, PGA 및 TMC의 중합체를 포함한 무작위로 배열된 섬유를 포함하는 스캐폴드가 수득된다. 스캐폴드는 GORE® BIO-A® Fistula Plug일 수 있다. 단계 320 이전에, 줄기 세포가 얻어질 수 있다. 예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포는 치료될 포유동물 (예를 들어, 인간)로부터 얻을 수 있다. 단계 320에서, 단계 310에서 얻어진 스캐폴드는 스캐폴드에 세포를 시딩하기 위해 지방 유래 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)와 접촉할 수 있다. 일부 경우에, 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)는 자가유래, 즉 스캐폴드로 치료될 환자로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 중간엽 줄기 세포에는 공정의 제어를 제공하기 위해 확립된 프로토콜에 따라 배양 및 처리가 요구될 수 있다. 예를 들어, 임상용 중간엽 줄기 세포는 우태 혈청 또는 대안적으로 인간 혈소판 유도체 또는 인간 혈소판 용해물 물질과 같은 보충제를 함유하는 배지에서 중간엽 줄기 세포의 생체 외 증식을 요구할 수 있다. 단계 320에서, 세포를 처리하고 배양하기 위한 기술이 수행될 수 있거나, 그렇지 않으면 세포가 획득될 수 있다.
일부 경우에, 스캐폴드에 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)를 시딩하기 위한 용액은 혈소판 유도체 (예를 들어, 인간 혈소판 유도체), 혈소판 용해물 물질 (예를 들어, 인간 혈소판 용해물 물질), 염, 완충제, 성장 인자, 세포 신호전달제 또는 소분자 조절제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 성분을 포함하도록 (세포에 추가하여) 설계될 수 있다. 이러한 경우에, 스캐폴드 물질은 용액에 침지시키거나 다른 적절한 기술을 사용하여 용액에 침윤시킬 수 있다.
일례에서, 혈소판 유도체 (예를 들어, 인간 혈소판 유도체) 또는 혈소판 용해물 물질 (예를 들어, 인간 혈소판 용해물 물질)을 사용할 때, 스캐폴드 물질은 혈소판 유도체 (예를 들어, 인간 혈소판 유도체) 또는 혈소판 용해물 물질 (예를 들어, 인간 혈소판 용해물 물질)을 함유하는 용액에 약 3분 내지 약 5일 (예를 들어, 약 5분 내지 약 5일, 약 15분 내지 약 5일, 약 1시간 내지 약 5일, 약 3시간 내지 약 5일, 약 6시간 내지 약 5일, 약 18시간 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 5일, 또는 약 4일 내지 약 5일)의 시간 범위 동안 침지시킬 수 있다. 일부 경우에, 약 3분 내지 약 4일 (예를 들어, 약 3분 내지 약 3일, 약 3분 내지 약 2일, 약 3분 내지 약 1일, 약 3분 내지 약 12시간, 약 3분 내지 약 6시간, 약 3분 내지 약 4시간, 또는 약 3분 내지 약 2시간)의 시간 범위가 사용될 수 있거나, 또는 약 1시간 내지 약 3일 (예를 들어, 약 2시간 내지 약 2일, 약 2시간 내지 약 1일, 또는 약 1일 내지 약 3일)의 시간 범위가 사용될 수 있다.
침지 단계는 임의의 적절한 온도에서 수행될 수 있다. 일례에서, 침지 단계는 약 2℃ 내지 약 45℃ (예를 들어, 약 10℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 37℃, 또는 약 30℃ 내지 약 40℃)의 온도 범위에서 수행될 수 있다. 다른 예에서, 침지 단계는 약 18℃ 내지 약 26℃ (예를 들어, 약 20℃ 내지 약 24℃, 또는 약 21℃ 내지 약 23℃)의 온도 범위에서 수행될 수 있다. 다른 예에서, 침지 단계는 약 30℃ 내지 약 44℃ (예를 들어, 약 33℃ 내지 약 41℃, 또는 약 36℃ 내지 약 38℃)의 온도 범위에서 수행될 수 있다. 다른 예에서, 침지 단계는 약 1℃ 내지 약 7℃ (예를 들어, 약 3℃ 내지 약 5℃)의 온도 범위에서 수행될 수 있다.
다른 예에서, 고체 매트릭스 스캐폴드 물질은 약 37℃에서 약 24시간 동안 용액 (예를 들어, 혈소판 용해물 물질 함유 용액)에 침지될 수 있다.
단계 330에서, 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기 세포)가 시딩된 고체 매트릭스 스캐폴드는 치료될 누공 (예를 들어, 불응성 항문 누공과 같은 불응성 누공)에 이식된다. 누공에 시스템이 설치되면, 고체 매트릭스 스캐폴드는 누공의 조직 성장 및 치유를 촉진할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명될 것이며, 이는 청구 범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1 - 스캐폴드 평가
FDA에서 승인한 10개의 물질을 시판되는 매트릭스에서 선택하고 시험관 내에서 테스트하였다: FlexHD (생물학적 물질; 탈세포화된 인간 진피; Musculoskeletal Transplant Foundation), PuraCol (생물학적 물질; 정제된 유형 1 소 힘줄 콜라겐; Medline Industries Inc.), EZ Derm (생물학적 물질; 알데히드 가교된 탈세포화된 돼지 진피; Molnlycke Inc.), Cook SIS (생물학적 물질), Gore Bio-A (합성 물질), Osteopore (합성 물질; 3D 인쇄된 폴리카폴락톤; Osteopore International Pte Ltd.), Gore TRM (합성 물질), Tepha-P4HB (합성 물질; 폴리-4 히드록시부티레이트; Bacterial Bioplastic; Tepha Corporation), TIGR 매트릭스 (합성 물질; 폴리글리콜산, 폴리락트산, 및 트리메틸렌 카보네이트 메쉬; Novus Scientific), 및 Vicryl 910 (합성 물질; PLGA; Ethicon Inc.)
Gore Bio-A Plug는 PGA : TMC의 중합체로 제조된 전기방사 합성 플러그였다 (도 15D, 좌하단 SEM). 플러그는 다공성이 높으며 섬유는 무작위로 정렬된다. Gore TRM은 PGA : TMC의 중합체로 제조된 전기방사 합성 시트였다. 구조적으로 이 물질은 Gore 플러그보다 섬유에 더 조밀하게 패킹된다. 또한 플러그보다 훨씬 두껍고, 임상적으로 복부 강화에 사용된다. Tepha P4HB는 폴리-4-히드록시부티레이트 (P4HB)로 제조된 플라스틱 메쉬이다. 섬유는 함께 직조되어 큰 공극을 형성한다. P4HB는 수개월에 걸쳐 생체 흡수 가능하다. 원래 박테리아에서 유래된 이 플라스틱은 생분해성 신용 카드에 사용되었지만 물질의 특성으로 인해 의료 용도로 재사용되었다. 이는 Gore TRM과 유사한 강화 응용 분야에 임상적으로 사용된다. Osteopore는 폴리카폴락톤 (PCL)으로 제조된 3D 프린트 스캐폴드로 주로 관절/연골 수복에 사용된다. TIGR 매트릭스는 PGA, 폴리락트산 (PLA) 및 TMC의 조합으로 제조된 복부 강화 메쉬이다. 이 물질은 함께 직조되어 거대다공성 메쉬를 형성한다. 생체 내에서 더 얇은 섬유는 몇 주에 걸쳐 용해되고, 더 두꺼운 섬유는 수개월에 걸쳐 용해된다. Vicryl 910은 폴리글리콜-코-락트산 (PLGA)으로 제조된 복부 강화 메쉬이다. 이 물질은 보강에 광범위하게 사용된다. Vicryl-910은 직조되며 Tepha-P4HB, Osteopore 및 TIGR 매트릭스에 비해 공극 크기가 훨씬 작다. PLGA는 생체 내에서 수주 내지 수개월에 걸쳐 가수 분해에 의해 흡수된다.
각각의 물질의 1 cm x 1 cm 스캐폴드 8 개를 250,000 개의 지방 유래 중간엽 줄기 세포 및 배양 배지 (5% 혈소판 용해물을 갖는 a-MEM)와 함께 15 cc 폴리에틸렌 배양 튜브에 넣었다. 스캐폴드는 인큐베이터에서 72 시간 동안 자유롭게 부유하고 회전하여 역동적인 세포 시딩을 허용했다(도 4). 배양 배지에 대한 스캐폴드 효과, 스캐폴드 세포 부착, 및 부착후 세포 사이토카인 방출에 기초하여 동물 모델에서 사용될 최고 성능의 매트릭스를 결정하기 위해 데이터를 수집하였다.
배지 pH의 약간의 차이가 관찰되었다(도 5 및 6). Gore TRM, PuraCol 및 FlexHD는 지방 유래 중간엽 줄기 세포의 다소 효과적인 시딩을 보여 주었지만, Gore BioA 플러그는 지방 유래 중간엽 줄기 세포의 실질적인 시딩 및 증식을 나타냈다 (도 7). 실제로, 지방 유래 중간엽 줄기 세포의 시작량(즉, 250,000개)보다 약 5배 더 많은 생육 세포가 Gore BioA 플러그 내에 존재하였다. FlexHD, Gore TRM 및 Tepha P4HB 스캐폴드의 세포는 강력한 혈관신생 케모카인 방출 효과를 나타냈다 (도 8-11).
실시예 2 - 매트릭스 플러그 상의 줄기 세포가 크론 관련 항문주변 누공을 치유시킴
제품 제조 및 시험 등록
자기 공명 (MR) 평가에 대한 금기 없이, 의료 요법에도 불구하고 적어도 3 개월 동안 단일 배농(draining) 누공을 가진 18-65 세 크론병 환자 및 항-TNF 요법을 포함한 표준 요법에 실패한 환자가 적절하였다. MSC 수확 6 개월 이내에 임상적으로 유의한 공병이 있거나 암, 간염 또는 HIV의 병력이 있거나 임신 또는 수유중인 환자는 제외되었다. 모든 환자에 대해 사전 동의를 얻었다.
환자는 기준선 일반 검사를 받았으며, 차등, C 반응성 단백질 (CRP), 적혈구 침강 속도 (ESR) 및 전해질이 포함된 완전 혈구 수 (CBC)를 포함한 혈청학적 연구를 받았다. 누관 및 누공 구조를 확인하고 패혈증이 있을 경우 누액을 배출하고 세톤을 배치하기 위해 환자들은 마취 (EUA) 하 검사가 예정되었다. 이 수술시, 복벽에서 2 cm 횡단 절개를 수행하여 무균 조건 하에서 수집된 최대 4 그램의 지방 조직을 수득하였다. 매트릭스를 수확하고 로딩하기에 충분한 세포를 수득한 후, 세포를 동결 보존하고, 표현형 (CD44, CD73, CD105, 클래스 I, CD14, CD45 및 클래스 II), 미코플라스마, 배양 무균성 (호기성 및 혐기성), 및 세포유전학적 분석으로 이루어진 방출 테스트를 위해 샘플을 사용하였다(도 15A-B). 환자의 플러그 배치가 예정되었을 때, 방출 기준에 부합하는 MSC를 해동하고 폴리프로필렌 코팅된 생물반응기에서 Gore® Bio-A® Fistula Plug의 존재하에 3-6일 동안 배양으로 되돌렸다. 트립판 블루 배제를 사용하여 해동후 생존율을 계산하였다. 플러그로의 세포 투여 후 세포 보유는 상청액의 샘플을 제거하고, 세포를 계수하고, 배지의 부피를 곱한 다음, 생물반응기에 전달된 세포의 백분율로 표시함으로써 계산되었다 (도 15A).
환자에게 투여하기 전에, 세포/플러그 조합을 배양하기 위해 사용된 배지를 그람 염색으로 평가하고, 추가 무균 테스트를 위해 샘플을 보냈다. 플러그를 세척하여 비결합된 세포 및 배지를 제거하고, 이후 투여를 위해 전달될 때까지 수유된 링거에서 유지시켰다.
환자는 MSC 수확 후 대략 6 주간 줄기 세포-로딩 플러그 (MSC-MATRIX)를 수술중 배치하였다. 수술에는 이전에 놓인 세톤을 제거하고 누관을 소파하고 MSC-MATRIX 누공 플러그를 배치하는 작업이 포함되었다. 플러그를 관에 통과시키고 4 내지 6 개의 봉합사를 사용하여 내부 개구부에 고정시켰다. 적절한 배수가 가능하도록 외부 개구부를 적절히 넓혔다. 환자는 병원에서 퇴원하기 전에 6 시간 동안 급성 이상 반응이 관찰되었고, 그 다음날 병원에서 다시 관찰되었다. 후속 방문은 2 주차 및 (a) 누관의 개봉을 평가하고 (b) 누관으로부터 임의의 유체가 심각하게 촉진되도록 시도하기 위해 임상 시험을 수행한 MSC-MATRIX 배치 후 1, 2, 3 및 6 개월에 실시하였다. MRI는 수술 전 그리고 3 및 6 개월에 수행되었다.
토르소 위상 배열 코일을 사용하는 기존의 다중 평면, 다중 서열 골반 MRI는 항문주변 누공 탐지 및 특성 분석에 사용되었다. 골반 MRI 해석에 경험이 있는 GI 방사선 전문의는 MRI 이미지를 해석하고 Park 및 St. James 분류 시스템에 따라 누공을 분류하였다. 누공 활성은 복잡도, 확장, T2 고강도부(hyperintensity) 및 기타 합병증에 따라 누공 활성의 등급을 매기는 Van Assche 점수를 사용하여 특성화되었다(Van Assche et al., Am. J. Gastroent., 98:332-339 (2003)). 최대 누공 직경 및 고강도 T2 관의 길이를 포함하여 누공 활성의 대리 정량적 마커가 또한 측정되었다. 누관 내 T2 가중 고강도부의 길이와 직경은, 누공 내 T2 가중 고강도부가 체액과 과립 조직을 반영하고 누공 크기가 감소하고 감소는 누공 치유와 관련이 있기 때문에 측정을 위해 선택되었다.
치료에 대한 반응의 평가
1차 종점(안전성):
이 연구의 1차 종점은 불응성 항문주변 누공 치료를 위해 Gore® Bio-A® Fistula Plug에 결합된 지방 유래의 자가 중간엽 기질 세포 (MSC)를 사용하는 것의 안전성과 실행가능성을 결정하는 것이었다. 대상자는 다음과 같은 부작용을 모니터링하였다:
1. 연구 시점에 존재하는 크론병의 악화 (성질, 중증도 또는 빈도의 변화).
2. 병발 질환
3. 비정상적인 실험 수치 (연구자가 임상적으로 유의하다고 생각하는 정상 범위 내에서 기준선으로부터의 임상적으로 유의한 변화가 포함됨).
4. 신체 검사, 활력 징후, 체중, 항문주변 누공의 배액에서의 임상적으로 유의한 이상.
2차 종점(효능):
24 주 (6 개월) 방문시 신체 검사에서 배액의 임상 평가를 수행하였다. 누공 폐쇄는 배액 부재로 정의되었다; 자발적이거나 부드러운 압축. 존재 및 활성의 평가를 위한 금 표준 테스트인 MRI에 의한 방사선 반응 (Gecse et al., Gut, 63:1381-1392 (2014))을 수행하였다.
이 연구의 목적 상, 누공 활성은 임상적 및 방사선학적으로 두 가지 방식으로 정의되었다. 임상적으로, 부분 반응은 배액 감소 및 증상 감소로 정의되었고, 완전 반응은 배액의 완전 중단으로 정의되었다 (일부 환자는 "완전 폐쇄"라는 용어의 사용을 막는 지속적인 피부 결함이 있었음). 방사선학적 반응은, 치료된 누공에서 농양이나 추가적인 파생물이 발생하지 않고 Van Aasche MRI 항문주변 누공 심각도 점수의 변화없이, (기준선으로부터의 백분율 변화로 표시되는) T2 가중 신속 스핀 에코 이미지에서 T2 가중 고강도 누관의 직경과 길이의 감소로 정의되었다. Van Aasche 점수의 감소는, 누공 크기의 현저한 감소가 Van Aasche 점수의 변화없이 볼 수 있기 때문에 치료 반응에 필요하지 않았지만; Van Aasche 점수의 증가는, 누공 파생물 또는 농양의 증가가 점수 성분을 증가시키기 때문에 반응의 실패로 간주되었다.
높은 처리량의 RNA 시퀀싱 및 생체정보 분석
임상 프로토콜을 위한 MSC를 생성하는데 사용된 표준 작업 절차와 동일한 프로토콜을 사용하여 등록된 처음 6 명의 환자로부터의 세포 샘플을 증식시켰다. 간략하게, 수술시에 수득된 지방 조직을 cGMP 제조 시설로 옮겼다. 지방 조직의 기질 혈관 분획으로부터 MSC를 수확하였다. 생성된 MSC는 cGMP 조건 하에서 승인된 프로토콜을 사용하여 생체 외에서 증식되었다. 간단히, 지방 조직을 D-PBS에서 세척하고, 원심 분리하고, 분쇄하고, D-PBS 용액 중 0.075% 콜라게나제에서 30-90분 동안 배양하였다. 이 용액을, Advanced MEM (Gibco/Life Technologies, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재), GlutaMAX (Gibco/Life Technologies), PLTMax (Mill Creek Life Sciences, 미네소타주 로체스터 소재), 및 헤파린을 함유하는 MSC 배지로 중화시켰다. MSC 배지 중 BD 팔콘 세포 배양 플라스크에서 세포를 배양 및 증식시켰다. 샘플을 직접 수집하고 (대조군 MSC), 등가물을 GORE® BIO-A® Fistula plug (매트릭스)에 첨가하고 수집 전 추가 4일에 배양하였다.
다른 곳에 기술된 바와 같이 올리고 dT 자성 비드를 사용하여 정제된 고품질 RNA를 사용하여 TruSeq 플랫폼 (Illumina, 캘리포니아주 샌디에고 소재) 상에서 차세대 RNA-seq를 수행하였다(Dudakovic et al., J. Biol. Chem., 288:28783-28791 (2013)). 폴리 A mRNA가 농후한 생성된 분획에 무작위 프라이머를 사용하여 제1 및 제2 가닥 cDNA 합성을 수행한 후, 유동 세포 다중화를 위해 독특한 바코드 (세트 A 및 B)(Illumina)를 갖는 페어드 엔드(paired-end) DNA 어댑터에 결찰시켰다. Illumina HiSeq 2000을 사용하여 얻은 페어드 엔드 판독은 베이스 콜링(base-calling)을 위한 표준 바이오인포매틱 파이프라인(Illumina의 RTA 버전 1.17.21.3)과 판독 정렬(TopHat 2.0.6)을 포함하는 원시 RNA 시퀀싱 데이터 분석 시스템 (MAPRSeq v.1.2.1)을 거치고, edgeR 2.6.2를 사용하여 유전자 카운팅(HTSeq 소프트웨어) 및 발현 분석을 수행하였다. 플라스틱 또는 GORE® BIO-A® Fistula plug에서 성장시킨 6 명의 다른 환자로부터의 MSC에 대해 RPKM(reads per kilobasepair per million) 맵핑 판독을 비교하였다. 유전자 발현의 차이는 대응표본 스튜던트 t 검정뿐만 아니라 P값을 위한 순위, RPKM 및 GORE® BIO-A® Fistula plug에서 성장한 MSC와 대조 MSC의 배수 변화를 사용하여 결정되었다. Excel (Microsoft Office)을 사용하여 표와 그래프를 준비하고 GENE-E (Broad Institute, 메사추세츠주 보스턴 소재)로 계층적 군집화를 수행하였다. 유전자 온톨로지(ontology) 분석은 DAVID6.7, FunRich, Reactome 및 GeneMania와 불완전하게 주석이 달린 유전자에 대한 집중된 PubMed 검색을 사용하여 수행되었다.
결과
치료에 사용되는 세포의 성장 동역학, 표현형 및 특성
이 프로토콜은 생육 임상 생성물을 생성할 수 있는 모든 환자 생검에서 매우 실현가능한 것으로 입증되었다. 한 환자는 오염으로 인해 지방 조직의 재수집이 필요하였다. 세포는 (제2 플레이팅 후) 하루 평균 1.5의 배증으로 빠르게 성장하였다. 프로토콜은 최근 결합된 생세포를 매트릭스에 투여하였다. 동결보존시 방출 테스트를 수행하였다. 해동후 생존율은 일반적으로 95%를 초과하였다. 매트릭스상의 세포의 용량을 적절하게 이해하기 위해 세포 결합 동안 상청액에서 세포를 계수하였다. 모든 샘플에 대해, 배양 완료시 세포의 5% 미만이 상청액에 남아 저장 후 회복 및 성장하는 능력을 확인하였다. 환자 MSC는 CD44, CD73, CD105 및 클래스 I 양성, 및 CD14, CD45 및 클래스 II 음성을 갖는 전형적인 MSC 표현형을 보편적으로 입증 하였다.
효능과 안전성
연구 등록을 위해 20 명의 환자를 선별하였고 그 중 12 명이 치료를 받았다. 등록된 환자는 지속적인 불응성 질환을 가졌다(항문주변 질환 평균 5년, 및 치료를 위해 마취하에 검사 이전 평균 5.5). 모든 환자는 연구 등록 시점에 생물학적 요법을 받았으며, MSC-매트릭스 배치 후 6 개월째에 모두 동일한 생물학적 요법을 유지하였다.
크론병이나 MSC-매트릭스의 배치와 관련이 없었으며, 철회 연구로 이어지지 않은 세 가지 심각한 부작용이 있었다. 지방 수집 부위에서 혈청종과 관련된 두 가지 심각하지 않은 부작용이 발생했다. 추가로 15 개의 심각하지 않은 사건이 있었으며, 그 중 9 건은 근본적인 크론병과 관련된 심각하지 않은 부작용이고, 6 건은 근본적인 크론병이나 연구 중재와 관련되지 않은 심각하지 않은 부작용이었다.
12 명의 환자 중 9 명은 3 개월까지 완전한 임상적 치유가 되었으며, 12 명의 환자 중 10 명 (83%)은 6 개월째에 완전한 임상적 치유가 되었다. 임상적 치유가 되지않은 두 환자 중 한 명은 3 개월째에 배액과 세톤 배치가 필요한 농양이 생겼고, 다른 한 명은 원래 누공에서 새로운 파생물로 인해 지속적으로 배액이 발생하여 순형항문(anolabial) 누공이 발생했다. 6 개월까지 요실금 또는 누출을 위해 패드를 착용해야하는 환자는 없었다. MRI 연구 간격에 새로운 증상이나 소견으로 인해 총 4 명의 환자 (33%)가 30 일 미만 과정의 항생제 치료를 받았다. 크론병의 의료 관리에 변화가 있는 환자는 없었다.
MRI는 기준선 및 6 개월째에 처리된 누관의 특성을 명확하게 정의하는 데 사용되었다. 치료 반응에 대한 방사선학적 기준은 12 명의 환자 중 10 명 (83%)에서 입증되었다. 전체적으로, 누관 내에서 T2 가중 고강도부의 길이가 현저히 감소하였고 (중앙값 감소 22%, 범위 -5 내지 100%, p = 0.01), 직경은 유의하지 않게 감소하였고 (중앙값 감소 57%, 범위 -36 내지 100%, p = 0.27), 음의 값은 두 치료 실패에서 누공 크기의 증가를 나타내었다. Van Assche 항문주변 심각도 점수는 또한 환자의 악화없이 유의하게 감소하였다(중앙값 13에서 중앙값 9, p = 0.0008): 하나의 치료 실패는 기준선에서의 작은 농양 및 상항문거근(supralevator) 확장으로 인한 변하지 않은 점수 21(치료 후 확장의 비변화 및 또다른 작은 농양)을 갖고, 다른 실패로는 12의 변하지 않은 점수로서, 농양은 해결되었지만 고강도 누관의 크기는 증가하였다.
기준선 및 6 개월 추적 조사 MR에서의 누관 및 Van Assche 점수 내에서 T2 가중 고강도부의 길이 및 직경의 변화의 산점도를 도 12A-B에 도시한다. 10 명의 반응 환자에서, 9 명이 Van Assche 점수가 감소하였고, Van Assche 점수에 변화가없는 단일 환자는 분지형 괄약근관통 누공의 T2 고강도부의 길이 및 직경의 실질적 감소로 반응을 나타냈다. 또한, 누관의 길이 및 직경에 대한 평균 절대 변화는 반응 환자에서 각각 23.5 및 5.0 mm 감소하였고, 두 치료 실패에서 각각 0.2 및 10 mm 증가하였다. 하나의 치료 실패는 시술 전 MRI에서 직장 염증 및 12 mm 농양을 나타내었고, 6 개월째 MRI는 분지형 파생물 크기가 증가함에 따라 지속적인 농양을 보여주었다. 두 번째 치료 실패는 후속 MRI에서 특허 내부 개방을 보여주고 누공의 직경을 증가시켜 잠재적으로 MSC 누공 플러그의 변위를 나타냈다.
매트릭스 결합 MSC는 변경된 유전자 발현 시그니처를 나타냄
Gore® Bio-A® Fistula Plug에 결합된 MSC 효과의 생물학적 특성을 이해하기 위해, RNA-seq 분석을 수행하여 일반 폴리스티렌 조직 배양 플라스틱 ('대조군'; n = 6) 대 Gore® Bio-A® Fistula Plug ('매트릭스'; n = 6) 상에서 성장한 MSC에서 모든 주석이 달린 유전자 (n = 23,338)에 대한 단백질 코딩 mRNA의 발현 수준을 결정하였다. 도트-플롯 분석은 대조군 및 매트릭스 샘플 둘 다에서의 전체 RNA 발현 패턴이 두 실험 조건에서 비교될 수 있음을 나타내었다. 그러나, (RPKM 발현 값 > 0.3에 대해 여과된) 12 개의 모든 샘플에 대한 전체 RNA-seq 데이터세트의 계층적 군집화는 대조군 및 매트릭스 MSC가 대조군 및 매트릭스 MSC에 특이적인 특징적인 유전자 발현 패턴을 갖는 2 개의 별개의 생물학적 분기군(clade)을 형성함을 보여주었다 (도 13A-B).
이들 특이적 유전자 시그니처를 정의하기 위해, 생물학적 조건 (RPKM > 0.3)에서 강하게 발현되고 대조군과 매트릭스 MSC 사이에서 통계적으로 다른(p < 0.05) 모든 유전자의 목록이 교차되었다. 대조군 및 매트릭스 MSC에서 각각 898 개 및 165 개의 유전자가 독특하게 검출되었다. 두 조건에서 일반적으로 발현된 11,548 개의 유전자 중 절반 이상 (n = 6,131)이 발현에서 통계적 차이를 나타냈다 (도 13A-B). 따라서, 생물학적 물질 매트릭스 (즉, Gore® Bio-A® Fistula Plug)에서 MSC를 배양하면 유전자 발현에서 현저한 조절이 발생하였다. GSEA는 이어서 매트릭스 부착과 관련되고 최적화된 기능과 생리학적으로 관련된 상향 조절된 유전자 네트워크에 초점을 맞추기 위해 수행되었다.
대조군 및 매트릭스 MSC 둘 다에서의 유전자의 검사는 가장 고도로 발현된 mRNA가 세포질 및/또는 세포 골격 단백질을 코딩한다는 것을 밝혀냈다 (도 14A). 누공 수복을 위한 세포화된 임플란트를 생성하는 데 있어서 MSC의 기능과 더 밀접한 관련이 있는 ECM 단백질이 잘 알려져 있다. 이 세트에는 비콜라겐성 단백질 피브로넥틴 (FN) 및 오스테오넥틴 (SPARC)과, 콜라겐 유형 I, III, VI 및 V (COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL6A1, COL6A2, COL5A1, COL5A2)가 포함되었다 (도 14A 및 14B). 콜라겐 I, III, VI 및 V가 매트릭스 MSC에서 가장 높게 발현되었지만 (RPKM > 100), COL15A1, COL10A1, COL8A2 및 COL9A2에 대한 mRNA는 MSC가 누공 매트릭스에서 성장할 때 가장 큰 배수 변화를 나타냈다(> 10 배). 후자의 비섬유성 콜라겐은 중간 수준 (5 내지 70의 RPKM)으로만 발현되었다 (도 14B). 중요하게도, 다른 모든 주석이 달린 유전자 (n = 23,338)에 대한 모든 콜라겐 유전자 (n = 43)의 상대적 발현 분석은 콜라겐이 모든 유전자의 0.18%만을 나타내지만, MSC에서 발현된 모든 mRNA의 대략 6%를 차지한다는 것을 보여주었다 (도 14B).
MSC가 ECM 리모델링 가능성을 갖는지 여부를 평가하기 위해, 누공 매트릭스(즉, Gore® Bio-A® Fistula Plug) 상에서 성장한 MSC에서 매트릭스 메탈로프로테이나제 유전자 (MMP)의 발현을 조사하였다. 발현 값의 수치 분류 및 히트 맵 분석은 매트릭스 MSC가 MMP1, -2, -3, -13 및 -14와 같이 여러 고도로 발현된 MMP의 상승된 발현을 나타냄을 보여주었다. 이들 및 다른 ECM 리모델링 효소의 발현은 콜라겐-매립 및 MSC-강화 임플란트를 누공 수복 환자에게 통합시키는 것을 촉진할 수 있다.
매트릭스 MSC는 정지 및 단백질 동화 세포 표현형을 갖는다. 매트릭스 MSC의 생물학적 활성 및 표현형 분자 시그니처를 정의하기 위해 유전자 온톨로지 분석을 수행하였다 (도 15). 대조군 MSC에서 발현된 가장 풍부한 단백질 코딩 전사체는 일반적으로 세포 주기, 유사분열, 증식 및/또는 원발암성 경로와 관련된 유전자였다 (상위 25 내의 n = 23). 대조적으로, 매트릭스 MSC에서 선택적으로 농축된 가장 풍부한 유전자는 당단백질 및/또는 일체형 막 단백질을 코딩하는 유전자였다 (상위 25 내의 n = 21). 대조군 및 매트릭스 MSC에서 선택적으로 발현되고 통계적으로 상이한 모든 유전자의 더 넓은 분석은 단백질 번역을 지지하는 유전자가 매트릭스 MSC에서 풍부해진 반면, 세포 주기에 연결된 유전자는 고갈되었음을 나타내었다.
매트릭스 상의 MSC의 성장이 그들의 분비 특성을 변경시키는지 여부를 이해하기 위해, 기지의 사이토카인, 성장 인자, 모르포겐, 리간드 억제제 및 다른 단백질 리간드를 코딩하는 285 개의 유전자 목록에 대한 발현 데이터가 선택되었다. 유전자 목록은 유전자 온톨로지 용어 및 집중된 문헌 조사에 기초하여 생성되었다. 이 유전자 세트 중에는 전혀 검출되지 않은 52 개의 유전자 (예, CCL3, IL2, BMP15, FGF4, WNT3A)(RPKM=0)와 두 샘플 모두에서 임의의 역치 (RPKM < 0.3) 미만으로 표시된 113 개의 유전자 (예, CCL1, IL3, BMP3, FGF3, WNT4)가 있었다. 분비된 단백질에 대한 나머지 120 개의 유전자 중에서, 적어도 2 배까지 선택적으로 상향 조절된 12 개의 단백질만이 검출되었다 (RPKM > 0.3; P < 0.05, 대응표본 T 검정에 기초).
또한, MSC가 매트릭스 상에서 성장할 때 2 배까지 하향 조절된 분비 인자를 코딩하는 15 개의 유전자가 있었다 (RPKM > 0.3; P < 0.05, 대응표본 T 검정에 기초). 가장 두드러진 단백질은 결합 조직 성장 인자를 코딩하는 TGFβ 표적 유전자 CTGF였다.
이들 결과는 본원에 제공된 방법 및 물질이 배양 동안 첨가된 세포와 구별되는 생물학적 물질을 생성할 수 있고, 이 새로운 생물학적 물질이 누공을 수복할 수 있는 강력한 치료제를 가짐을 입증한다.
실시예 3 - 매트릭스 플러그 상의 줄기 세포
다른 실험에서, MSC를 상이한 유형의 매트릭스 상에서 성장시키고, 다양한 폴리펩티드의 발현을 평가하고 배지 단독에서 성장한 MSC에 의해 나타나는 발현 수준과 비교하였다. 결과는 도 16A-D 및 도 17A-D에 제공되었다.
다른 실시양태
본 발명은 그 상세한 설명과 관련하여 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의된 본 발명의 범위를 예시하려는 것이며 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 다른 측면들, 장점들 및 수정들은 하기 청구범위의 범위 내에 있다.
Claims (34)
- 포유동물에서 누공을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 누공에 스캐폴드를 이식하는 단계를 포함하고, 상기 스캐폴드는 섬유와 상기 섬유 사이에 위치된 중간엽 줄기 세포를 포함하고, 상기 섬유는 폴리글리콜산 및 트리메틸렌 카보네이트의 중합체를 포함하는 것인 포유동물에서 누공을 치료하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 누공이 항문 누공인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 누공이 불응성 항문 누공인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 누공의 최대 직경이 25 mm 미만인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 지방 유래 중간엽 줄기 세포인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리글리콜산이 상기 섬유의 약 60% 내지 약 70%인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리글리콜산이 상기 섬유의 약 67%인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트리메틸렌 카보네이트가 상기 섬유의 약 30% 내지 약 40%인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트리메틸렌 카보네이트가 상기 섬유의 약 33%인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 혈소판 유도체 물질을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유가 무작위로 배열된 섬유인 방법.
- 누공 치료용 임플란트를 제조하는 방법에 있어서, 폴리프로필렌 용기 내에서 중간엽 줄기 세포와 섬유를 포함하는 스캐폴드를 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 섬유는 폴리글리콜산 및 트리메틸렌 카보네이트의 중합체를 포함하는 것인 누공 치료용 임플란트의 제조 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 지방 유래 중간엽 줄기 세포인 제조 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 폴리프로필렌 용기 내에서의 접촉이 3일 이상 동안 일어나는 것인 제조 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리프로필렌 용기 내에서의 접촉이 약 3일 내지 약 10일 동안 일어나는 것인 제조 방법.
- 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리프로필렌 용기 내에서의 접촉이 약 4일 내지 약 6일 동안 일어나는 것인 제조 방법.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리글리콜산이 상기 섬유의 약 60% 내지 약 70%인 제조 방법.
- 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리글리콜산이 상기 섬유의 약 67%인 제조 방법.
- 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트리메틸렌 카보네이트가 상기 섬유의 약 30% 내지 약 40%인 제조 방법.
- 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트리메틸렌 카보네이트가 상기 섬유의 약 33%인 제조 방법.
- 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용기 내에서 혈소판 유도체 물질과 상기 스캐폴드를 접촉시키는 단계를 포함하는 제조 방법.
- 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유가 무작위로 배열된 섬유인 제조 방법.
- 섬유 및 상기 섬유 사이에 위치된 중간엽 줄기 세포를 포함하는 스캐폴드로서, 상기 섬유는 폴리글리콜산 및 트리메틸렌 카보네이트의 중합체를 포함하고, 상기 중간엽 줄기 세포는 상기 섬유의 부재 하에서 배양된 유사한 중간엽 줄기 세포보다 더 많은 섬유아세포 성장 인자 2(FGF-2) 폴리펩티드, 에오탁신 폴리펩티드, FMS 유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L) 폴리펩티드, 성장 조절 단백질(GRO) 폴리펩티드 및 인터루킨 10(IL-10) 폴리펩티드를 발현하고, 상기 중간엽 줄기 세포는 상기 유사한 중간엽 줄기 세포보다 더 적은 프렉탈카인 폴리펩티드를 발현하는 것인 스캐폴드.
- 제24항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 지방 유래 중간엽 줄기 세포인 스캐폴드.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 폴리글리콜산이 상기 섬유의 약 60% 내지 약 70%인 스캐폴드.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리글리콜산이 상기 섬유의 약 67%인 스캐폴드.
- 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트리메틸렌 카보네이트가 상기 섬유의 약 30% 내지 약 40%인 스캐폴드.
- 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트리메틸렌 카보네이트가 상기 섬유의 약 33%인 스캐폴드.
- 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 혈소판 유도체 물질을 포함하는 스캐폴드.
- 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유가 무작위로 배열된 섬유인 스캐폴드.
- 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 상기 유사한 중간엽 줄기 세포보다 더 많은 단핵구-화학주성 단백질 3(MCP-3) 폴리펩티드를 발현하는 것인 스캐폴드.
- 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 상기 유사한 중간엽 줄기 세포보다 더 적은 인터루킨 12(IL-12) p40 폴리펩티드를 발현하는 것인 스캐폴드.
- 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 상기 유사한 중간엽 줄기 세포보다 더 많은 인터루킨 12(IL-12) p70 폴리펩티드를 발현하는 것인 스캐폴드.
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