CN110551688A - 一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞且促进造血干/祖细胞体外扩增的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞和/或促进造血干/祖细胞体外扩增的小分子化合物组合，所述的小分子化合物组合包含HDACs抑制剂、GSK‑3抑制剂和TGF‑β信号通路抑制剂。本发明还涉及上述小分子化合物组合的应用及诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞和/或促进造血干/祖细胞体外扩增的方法。本发明将HDACs抑制剂、GSK‑3抑制剂、TGF‑β信号通路抑制剂这三类化合物联合应用于体细胞，使体细胞进入重编程并转分化为与造血干/祖细胞外形、性能特征极其相似的造血干/祖细胞。使用小分子化合物诱导成体细胞不经过多能干细胞阶段直接变成造血干/祖细胞，可以为本领域的临床应用带来良好的前景。

Description

一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞且促进造血干/祖细 胞体外扩增的组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞且促进造血干/祖细胞体外扩增的组合物及其应用。
背景技术
造血干/祖细胞(Hematopoietic Stem/Progenitor Cells，HSPC)，造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。造血祖细胞由造血干细胞分化而来，可以进一步分化为为形态可辨认的各种幼稚血细胞。造血祖细胞的增殖能力有限，它们依靠造血干细胞的增殖来补充。造血祖细胞可用体外培养的细胞集落法鉴定。在不同的集落刺激因子(colony stimulatingfactor，CSF)作用下，可分别出现不同的血细胞集落，如红系集落(CFU-E)，粒系和巨噬粒系集落(CFU-GM)，巨噬细胞集落(CFU-M)和粒系集落(CFU-G)。造血干细胞是体内所有血细胞的祖先。造血干细胞移植是很多造血系统疾病，如白血病、淋巴瘤、再生障碍性贫血等的终末甚至唯一治疗手段。而异体造血干细胞移植极大的依赖于配型，并存在产生移植物抗宿主病的风险，对患者的恢复带来极大的挑战。而通过转分化诱导自己健康细胞成为造血干细胞的方式，可以有效的解决移植来源的问题。
2017年，George Daley组将诱导获得的多能干细胞(iPSC)作为起始细胞，诱导获得造血前体细胞(HE)后，过表达预先插入基因组的7个转录因子，可以获得具有一定移植能力的人类造血干细胞。然而iPSC的使用有致肿瘤的风险，导致后续应用存在安全问题。同年，Shahin Rafii课题组将小鼠血管内皮细胞作为起始细胞，在不经过iPSC状态的情况下，通过过表达4个转录因子获得了可长程移植的小鼠造血干细胞。此方法虽规避了多能干细胞的潜在安全问题，仍然需要通过病毒载体过表达转录因子，病毒载体对基因组进行的随机插入可能导致致肿瘤的风险，转录因子过表达也存在不能很好控制表达量高低程度的问题，给后续临床转化带来安全隐患。
组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一类蛋白酶，对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡，并由组蛋白乙酰化转移酶和组蛋白去乙酰化酶共同调控。组蛋白去乙酰化酶抑制剂则可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化程度来改变染色质结构，从而调控细胞凋亡及分化相关蛋白的表达和稳定性。糖原合成酶激酶(GSK-3)是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，不仅参与肝糖代谢过程，而且还参与Wnt和Hedgehog信号通路，通过磷酸化多种底物蛋白来调节细胞的生理过程。糖原合成酶激酶抑制剂作为目前备受关注的小分子抑制剂，对治疗神经退化性疾病、癌症、Ⅱ型糖尿病具有潜在的疗效。转化生长因子β(TGF-β)属于一类促进细胞生长和转化的细胞因子超家族，目前共发现5种亚型，其胞浆内信号传导通路主要包括膜受体丝氨酸/苏氨酸激酶系统和Smad蛋白信号传递系统。TGF-β抑制剂研究主要包括抑制TGF-β及其受体的表达(如曲尼司特等)，阻断TGF-β和受体的结合(如SB-431542、LY2157299等)，干扰受体激酶信号传递(如SIS3等)。
小分子化合物具有不整合进基因组，易控制浓度，价格低廉，应用简单等优点。使用小分子化合物诱导成体细胞不经过多能干细胞阶段直接变成造血干/祖细胞，可以为本领域的临床应用带来良好的前景。
中国专利文献CN 201410170829.6公开了一种利用三维诱导体系高效获得造血干细胞的方法，是利用三维细胞培养基质或细胞培养支架，如水凝胶、海藻等材料制成的三维细胞培养系统，和/或联合基质细胞如骨髓细胞、小鼠骨髓细胞系OP9、OP9DL1等，和/或联合多种因子包括中胚层诱导因子、造血生长因子等诱导多能干细胞分化为造血干细胞。该发明建立了一种新的获得造血干细胞的方法，首次建立了利用三维诱导体系和/或联合骨髓细胞等基质细胞和/或多种因子等高效诱导多能干细胞分化为造血干细胞的系统，为获得临床可用的造血干细胞提供了理论基础和技术平台，并为多能干细胞来源的造血细胞在疾病机理探索、药物筛选等领域的应用开拓了新的方法和新的思路。
但是关于本发明将组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂、糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂、转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂这三类化合物联合应用于体细胞，使体细胞进入重编程并转分化为与造血干/祖细胞外形、性能特征(如良好的多能分化性)极其相似的造血干/祖细胞，从而摆脱了只有引入外源基因才能够诱导体细胞分化为造血干/祖细胞的方法，目前还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞和/或促进造血干/祖细胞体外扩增的小分子化合物组合。
本发明的第二个目的是，提供一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞和/或促进造血干/祖细胞体外扩增的方法。
本发明的第三个目的是，提供一种上述小分子化合物组合的用途。
本发明的第四个目的是，提供一种造血干/祖细胞。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞和/或促进造血干/祖细胞体外扩增的小分子化合物组合，所述的小分子化合物组合包含HDACs抑制剂、GSK-3抑制剂和TGF-β信号通路抑制剂。
作为本发明的一个优选实施例，所述HDACs抑制剂为VPA，所述GSK-3抑制剂包括CHIR99021，所述TGF-β信号通路抑制剂包括Repsox。
进一步地，所述的小分子化合物组合为VPA、CHIR99021和Repsox。
本发明的一些实施方案，具体小分子化合物的有效浓度如下，以下给出的浓度范围只是参考，可在此基础上做适应性修改，如果其他小分子替代以下小分子，浓度也可以做适应性调整。
HDACs抑制剂：VPA：0.2-1mM，较佳地0.3-0.8mM，更佳地，0.4-0.6mM；
GSK-3抑制剂：CHIR99021：1-50μM，较佳地20-40μM；
TGF-β抑制剂信号通路：Repsox：0.2-20μM，较佳地，5-15μM。
作为本发明的一个优选实施方案，所述VPA的浓度为500μM，所述CHIR99021的浓度为30μM，所述Repsox的浓度为10μM。
作为本发明的一个优选实施例，所述体细胞包括成纤维细胞、骨髓细胞、脾脏细胞和血细胞。此外，也可利用本发明方法或者在本发明方法的基础上做适应性调整，诱导其他体细胞制备造血干/祖细胞。如果利用本发明提供的小分子化合物组合诱导其他体细胞制备造血干/祖细胞，可以根据实际需要进行调整相应小分子化合物的浓度，以及在小分子化合物组合上作调整。
作为本发明的一个优选实施例，所述小分子化合物组合还包含药学上可接受的载体。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，其本身及其用量不应诱导接受该组合物的个体产生有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。药学上可接受的载体通常包括无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包裹材料或任何常规类型的制剂辅助物。合适的载体包括但不仅限于水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇或其组合。所述载体还包含有其他试剂如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强制剂效力的佐剂。其他材料如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂和类似试剂可根据需要添加。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
术语“包含”指“含有”和“由……构成”，例如“包含”X的组合物可以完全由X构成，或者可以含有X之外的物质，例如X-Y。本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果例如可通过化学标记或抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减轻。对于某一对象的精确有效剂量取决于该对象的体型和健康状况，病症的性质或程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的症状而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞和/或促进造血干/祖细胞体外扩增的方法，所述方法为利用如上任一所述的小分子化合物组合诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞。
进一步地，所述方法为使用含有如上任一所述小分子化合物组合的培养基对体细胞进行培养。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的小分子化合物组合在制备诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞和/或提高造血干/祖细胞的增殖水平药物中的应用。
进一步地，所述应用包含所述小分子化合物组合在制备诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞和/或提高造血干/祖细胞的增殖水平的试剂盒或培养液/基的应用。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
一种造血干/祖细胞，所述造血干/祖细胞由体细胞经如上任一所述的小分子化合物组合诱导得到。
本发明优点在于：
1、本发明将组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂、糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂、转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂这三类化合物联合应用于体细胞，使体细胞进入重编程并转分化为与造血干/祖细胞外形、性能特征(如良好的多能分化性)极其相似的造血干/祖细胞。
2、该化合物组合能促进HSPC在体外扩增。
3、小分子化合物具有不整合进基因组，易控制浓度，价格低廉，应用简单等优点。使用小分子化合物诱导成体细胞不经过多能干细胞阶段直接变成造血干/祖细胞，可以为本领域的临床应用带来良好的前景。
附图说明
图1是化合物组合诱导小鼠成纤维细胞成为造血前体细胞。其中，A为成纤维细胞经过化合物组合1以及化合物组合2的6天诱导后产生了Scl-GFP+细胞的流式结果统计图；B为不同时间点Scl-GFP+比例的流式结果的统计图。
图2是化合物组合诱导成纤维细胞获得Scl-GFP+细胞具有造血前体细胞的潜能。其中，A显示了通过小分子化合物组合1以及组合2诱导获得的Scl-GFP+细胞中相关基因的表达量；B显示了通过化合物组合1以及化合物组合2诱导11天获得的Scl-GFP+细胞进行成管实验的结果；C为经化合物组合1以及化合物组合2诱导11天获得的Scl-GFP+细胞在含有VEGF的培养基中进一步培养后，用DiIAcLDL染料(红色)染色，一些细胞获得可吞噬低密度脂蛋白的能力，该能力为内皮细胞的重要功能。
图3是骨髓细胞经分选获得的Scl-GFP-细胞在加入化合物组合1的造血培养基，化合物组合2的造血培养基，以及没有加入化合物的造血培养基(对照组)中经过7天的培养后，Scl-GFP+细胞检测的流式结果图。其中，左侧为流式细胞术示意图，右侧为统计图。
图4是脾脏细胞经分选获得的Scl-GFP-细胞在加入化合物组合1的造血培养基，化合物组合2的造血培养基，以及没有加入化合物的造血培养基(对照组)中经过7天的培养后，Scl-GFP+细胞检测的流式结果图。其中，左侧为流式细胞术示意图，右侧为统计图。
图5是CD11b+巨噬细胞，Gr1+中性粒细胞，CD3+T细胞，CD19+B细胞，在含有化合物组合1的造血培养基，以及无小分子药物造血培养基(对照组)的中培养3天后，通过流式检测LSK细胞的含量。
图6是骨髓分选获得的Scl-GFP-细胞通过化合物组合1，化合物组合2，仅有造血培养基(对照组)培养7天后产生的Scl-GFP+细胞在M3434中培养14天，检测生成造血集落的能力。其中，左侧是集落的统计图，右侧是集落的代表图片。
图7A为三个小分子化合物VCR单独处理，两两组合，以及3个小分子化合物组合在体外培养骨髓新鲜分选的LSK细胞7天后的流式结果图；图7B为为三个小分子化合物VCR单独处理，两两组合，以及3个小分子化合物组合在体外培养骨髓新鲜分选的LSK细胞七天后获得的LSK细胞比例的统计图(左)，细胞总数的统计图(中)，相同起始LSK细胞下最后获得LSK细胞数目的统计图(右)；图7C为三个小分子化合物VCR单独处理，两两组合，以及3个小分子化合物组合在体外培养骨髓新鲜分选的LSK细胞7天后吉姆萨染色的代表性数据。
图8为小分子组合1可以在体外扩增LSK细胞。其中，图8A左侧为加入化合物组合1的造血培养基和造血培养基(对照)体外培养7天后的流式检测LSK结果示意图；右侧为流式结果统计图，在每个孔有相同起始细胞的情况下，分别统计了LSK细胞的比例(左)，总细胞数目(中)，每个孔里LSK细胞的数目(右)；图8B为加入化合物组合2的造血培养基和造血培养基(对照)体外培养7天后的流式检测LSK的结果统计图。左图统计了总细胞数，右图统计了每个孔里LSK细胞的数目。
图9是骨髓新鲜分选的获得LSK细胞作为起始细胞，在造血培养基中培养7天后的获得的细胞(左)，在加入化合物组合1的造血培养基中培养7天的细胞(中)和新鲜分选的骨髓LSK细胞(右)进行吉姆萨染色的代表性数据。
图10是将骨髓新鲜分选的LSK细胞作为起始细胞。在造血培养基中培养7天后所的获得的细胞(对照)和在加入化合物组合1的造血培养基中培养7天的细胞中分别取出同样数目细胞，在M3434中培养14天，检测生成造血集落的能力的统计图。
图11是将来自CD45.2转基因小鼠的LSK细胞用化合物组合1处理7天后，移植到CD45.1小鼠中。通过流式检测移植后4周和6周小鼠外周血中CD45.2+造血细胞的含量。其中，左侧为示意图，右侧为统计图。*表示P<0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
如本文所用，术语“小分子化合物组合”指的是含有以下组分的组合：(a)组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂；(b)糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂；(c)转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂。此外，所述的小分子化合物组合还可以含有药学上可接受的载体，在这样的情况下，所述的小分子化合物组合即为具有诱导体细胞转分化为造血干/祖细胞活性的药物组合物。在本发明中，验证了小分子化合物组合(VPA、CHIR99021、Repsox)具有良好的诱导体细胞分化造血干/祖细胞的活性。当然，本领域技术人员也可以根据本发明的启示，对以上三类抑制剂进行任意的组合，开发新的具有诱导体细胞转分化神经干细胞活性小分子化合物组合。
LSK细胞
在小鼠骨髓里，造血干/组细胞的群体可以通过Lineage-，Sca1+，c-kit+三个表面标志物共同标记获得。
转录因子
转录因子(transcription factor)是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。文献报道，转录因子Scl在具有干性/祖性的内皮细胞和造血细胞中高表达，同时也是诱导成体细胞转分化为造血干/祖细胞的重要转录因子之一。可以作为造血干/组细胞的一个标志物。
CD45+细胞
CD45分子在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原。小鼠体内CD45+细胞可以等同于白细胞。
造血前体细胞
造血前体细胞是散布在血管中的一群特殊的内皮细胞，同时具有内皮的功能以及分化成造血干/祖细胞的能力。
实验材料
实验仪器
流式细胞仪BD LSKFortessa X-20
实施例1小分子化合物组合诱导小鼠胚胎成纤维细胞表达Scl
文献报道，转录因子Scl在具有干性/祖性的内皮细胞和造血细胞中高表达，同时也是诱导成体细胞转分化为造血干/祖细胞的重要转录因子之一。GFP表达受到Scl启动子调控，可以作为报告基因反映Scl的表达水平。
使用Scl-tTA×TetO-H2BGFP转基因小鼠杂交得到Scl-GFP双转基因小鼠。Scl-GFP-胚胎成纤维细胞取自E13.5小鼠胚胎。将去除头、四肢、内脏、生殖器官、椎骨等的胚胎组织剪碎并用胰酶消化。使用含10％FBS、1mM GlutaMAX，0.1mM non-essential aminoacid，100units/mL penicillin和100mg/mL streptomycin的DMEM培养基于37度5％CO2恒温培养箱中培养。使用流式分选去除CD45+细胞和GFP+细胞后，加入含有小分子化合物组合1(500μM VPA,30μM CHIR99021和10μM Repsox)或小分子化合物组合2(CHIR99021，LDN193189，A83-01，Hh-Ag1.5，Vitamin C，SMER28，RG108 and Parnate)的DMEM培养基培养2天，然后将培养基换成含有细胞因子cytokines stem cell factor(Scf)，FMS-liketyrosine kinase 3 ligand(Flt3l)，interleukin-3(IL-3)和interleukin-6(IL6)的M5300培养基继续培养4天。使用流式细胞仪BD LSKFortessa X-20检测GFP+细胞数目和比例，通过Flowjo_V10软件分析结果。
实验结果如图1所示，小分子化合物组合1和小分子化合物组合2均能诱导小鼠胚胎成纤维细胞表达GFP，表明Scl启动子被激活。
实施例2小分子化合物组合诱导小鼠胚胎成纤维细胞成造血前体细胞
造血前体细胞是散布在血管中的一群特殊的内皮细胞，同时具有内皮的功能以及分化成造血干/祖细胞的能力。
使用Trizol试剂(Sigma-Aldrich)从小鼠胚胎成纤维细胞诱导来的Scl-GFP+细胞中提取总RNA。通过MMLV逆转录酶和随机六聚体逆转录RNA为cDNA。将cDNA，2x3 PCR Mix和Eva Green混合并使用MX3000P Stratagene PCR机分析不同基因的表达水平。相对mRNA表达量通过内部对照(GAPDH)标准化。
实验结果如图2所示。诱导产生的Scl-GFP+细胞高表达造血相关基因如CD41，Sox17，PU.1，CEBPa，CEBPb和Tal1，以及内皮或内皮祖细胞相关基因，例如Flk1，CD31，Vecad和vWF。而在CD45-GFP-成纤维细胞高表达的相关的基因则出现下调，如Fbn1，Prrx1，Snail1和Col6a2(图2A)。获得的Scl-GFP+细胞做成管实验，发现这些诱导的Scl-GFP+细胞可以在体外形成血管样结构(图2B)。此外，诱导产生的Scl-GFP+细胞在含有VEGF的培养基中进一步培养，少数Scl-GFP+细胞获得了低密度脂蛋白摄取能力，该能力为内皮细胞的重要功能(图2C)。两种功能实验均显示诱导的Scl-GFP+细胞具有造血前体细胞样特性。
实施例3小分子化合物组合诱导小鼠Scl-GFP-骨髓细胞表达Scl
将新鲜分离的Scl-GFP-骨髓细胞用造血培养基(murine SCF(50ng/ml)、mFlt3L(50ng/ml)、mIL-3(20ng/ml)、mIL6(20ng/ml)、1×10-6M Hydrocortisone和1％Penicillin-Streptomycin的M5300培养基)，并按照5×105/ml的密度铺到96孔板中。逐一检查每孔，选择无GFP+的细胞在加入含有小分子化合物组合1、小分子化合物组合2或不含化合物组合(对照组)的造血培养基中继续培养7天。使用流式细胞仪BD LSKFortessa X-20检测GFP+细胞数目和比例，通过Flowjo_V10软件分析结果。
如图3所示，一周后，小分子化合物组合1和小分子化合物组合2两个药物组合均可诱导Scl-GFP+细胞的产生，对照组几乎没有Scl-GFP+细胞。并且小分子化合物组合2的诱导效率高于小分子化合物组合1。但因为小分子化合物组合1药物组合促进了造血细胞的扩增，最终获得Scl-GFP+细胞的细胞数相对小分子化合物组合2较多。
实施例4小分子化合物组合诱导小鼠Scl-GFP-脾脏细胞表达Scl
将新鲜分离的Scl-GFP-脾脏细胞用造血培养基(murine SCF(50ng/ml)、mFlt3L(50ng/ml)、mIL-3(20ng/ml)、mIL6(20ng/ml)、1×10-6M Hydrocortisone和1％Penicillin-Streptomycin的M5300培养基)，并按照7×105/ml的密度铺到96孔板中。逐一检查每孔，选择无GFP+的细胞在加入含有小分子化合物组合1、小分子化合物组合2或不含化合物组合(对照组)的造血培养基中继续培养7天。使用流式细胞仪BD LSKFortessa X-20检测GFP+细胞数目和比例，通过Flowjo_V10软件分析结果。
如图4所示，一周后，小分子化合物组合1和小分子化合物组合2两个药物组合均可诱导Scl-GFP+细胞的产生，对照组几乎没有Scl-GFP+细胞的产生。并且小分子化合物组合2的诱导效率高于小分子化合物组合1。
实施例5小分子化合物组合诱导已分化的血液细胞为造血干/祖组细胞
通过颈脱位法杀死8周的雄性C57小鼠。取小鼠长骨(股骨和胫骨)，用1ml针头冲出长骨中的骨髓细胞，经10分钟红细胞裂解液处理，裂去红细胞并重悬在PBS中。分别加入各谱系抗体Alexa700-Gr1(Biolegend)，APC-CD11b(Biolegend)，BV421-CD3(Biolegend)，或BV510-CD19(Biolegend)，在4度孵育30分钟。PBS再次洗涤残余抗体，细胞悬液通过100μm细胞过滤器去除团块后上FACSAria lll(BD)分选机器分选两次。将分选获得的细胞用5×105/ml的密度分别种在含小分子化合物组合1的造血培养基，以及不含化合物的造血培养基中，后者作为对照组。三天后进行流式细胞术检测。
HSPC的流式检测在BD LSKFortessa X-20进行。收培养细胞离心后重悬于PBS中，加入用APC-CD117(BD)，PE-Sca1(BD)，BV421-Lineage(BD)流式抗体，或c-kit-BV711(Biolegend)，PE-Sca1(BD)或BV421-Lineage(BD)流式抗体后在4度孵育30分钟。3ml PBS洗去残余抗体后在BD LSKFortessa X-20上进行检测，通过Flowjo_V10软件分析结果。
结果如图5所述。所有谱系起始细胞，经小分子化合物组合1处理过的细胞中通常代表干/祖细胞的谱系阴性细胞的百分比高于对照组。在淋巴细胞作为起始细胞的诱导中，T细胞可以获得LSK细胞，而B细胞不能。髓系起始细胞均可在小分子化合物组合1的诱导下获得LSK细胞。这些数据证明了不同谱系分化的造血细胞小分子化合物组合1的处理下重新获得了干/祖性。
实施例6小分子化合物组合诱导小鼠成HSPC细胞后体外功能鉴定
收集经过7天培养后的Scl-GFP-骨髓细胞，通过FACS分选出GFP+细胞，按2×104/ml的密度将细胞加入预先加入100units/mL青霉素和100mg/mL链霉素的M3434甲基纤维素(Stem cell Technologies)中，按照1ml/孔的体积接种到12孔板中。在第8天至第10天鉴定并计数克隆数。
结果如图6示，小分子化合物组合1诱导产生的Scl-GFP+细胞在甲基纤维素基半固体中的培养基中可以产生各系克隆，包括红系集落(CFU-E)，粒系和巨噬粒系集落(CFU-GM)，巨噬细胞集落(CFU-M)和粒系集落(CFU-G)，但在对照组中未观察到集落的产生。
实施例7 HSPC扩增小分子药物筛选表型检测
通过颈脱位法杀死8周的雄性C57小鼠。取小鼠长骨(股骨和胫骨)，用1ml针头冲出长骨中的骨髓细胞，经10分钟红细胞裂解液处理，裂去红细胞并重悬在PBS中。加入流式抗体APC-CD117(BD)，PE-Sca1(BD)，BV421-Lineage(BD)，在4度避光孵育30分钟。PBS再次洗涤残余抗体，细胞悬液通过100μm细胞过滤器去除团块后可上FACSAria ll(BD)分选机器分选出LSK细胞。LSK细胞经过记数后以5×104/ml的密度种在分别加入VPA，CHIR99021，Repsox以及VPA+CHIR99021，VPA+Repsox，CHIR99021+Repsox，以及小分子化合物组合1的造血培养基中。
经过7天的培养，收培养细胞离心后重悬于PBS中，加入用APC-CD117(BD)，PE-Sca1(BD)，BV421-Lineage(BD)流式抗体后在4度孵育30分钟。3ml PBS洗去残余抗体后在BDLSKFortessaX-20上进行检测，通过Flowjo_V10软件分析结果。
收集培养第7天的细胞，并在上计数，重悬细胞至密度为7.5×105/ml。取200μl细胞悬浮液在细胞甩片机上800rpm/min离心5分钟，制备细胞甩片。将载玻片晾干。首先将载玻片在未稀释的Giemsa染液中染色1分钟，然后以1:1比例将Giemsa染液和磷酸盐缓冲液混合后染色4分钟。将载玻片在水中彻底漂洗干净，在空气中自然干燥。
结果显示：单独使用VPA，或者与CHIR99021或Repsox连用可以增加LSK细胞的扩增效率。然而这三种处理扩增LSK细胞的效率都没有小分子化合物组合1高。扩增的LSK细胞的Giemsa染色也证实了这一点(图7)。
实施例8 HSPC扩增表型检测
通过颈脱位法杀死8周的雄性C57小鼠。取小鼠长骨(股骨和胫骨)，用1ml针头冲出长骨中的骨髓细胞，经10分钟红细胞裂解液处理，裂去红细胞并重悬在PBS中。加入流式抗体APC-CD117(BD)，PE-Sca1(BD)，BV421-Lineage(BD)，在4度避光孵育30分钟。PBS再次洗涤残余抗体，细胞悬液通过100μm细胞过滤器去除团块后可上FACSAria lll(BD)分选机器分选出LSK细胞。LSK细胞经过记数后以5×104/ml的密度种在含小分子化合物组合1，小分子化合物组合2，以及不含任何小分子化合物(对照组)的造血培养基中。
经过7天的培养，收培养细胞离心后重悬于PBS中，加入用APC-CD117(BD)，PE-Sca1(BD)，BV421-Lineage(BD)流式抗体后在4度孵育30分钟。3ml PBS洗去残余抗体后在BDLSKFortessaX-20上进行检测，通过Flowjo_V10软件分析结果。
结果如图8所述。经过7天的培养，小分子化合物组合1的LSK细胞数量比对照组高出约12倍，相比之下，小分子化合物组合2的扩增能力仅为对照的2～3倍。这主要是由于小分子化合物组合2抑制细胞生长，和造血细胞重编程的结果是一致的。
实施例9 HSPC细胞扩增后形态学鉴定
收培养第7天细胞并在上计数，重悬细胞至密度为7.5×105/ml。取200μl细胞悬浮液在细胞甩片机上800rpm/min离心5分钟，制备细胞甩片。将载玻片晾干。首先将载玻片在未稀释的Giemsa染液中染色1分钟，然后以1:1比例将Giemsa染液和磷酸盐缓冲液混合后染色4分钟。将载玻片在水中彻底漂洗干净，在空气中自然干燥。
结果如图9所示。在加入小分子化合物组合1的造血培养基中培养7天后的LSK在形态学上依然相对幼稚，和未经培养的LSK细胞相似。
实施例10 HSPC细胞扩增后的体外功能鉴定
收培养第7天细胞并在上计数，按2×104/ml的密度将细胞加入预先加入100units/mL青霉素和100mg/mL链霉素的M3434甲基纤维素(Stem cellTechnologies)中，按照1ml/孔的体积接种到12孔板中。在第8天至第10天鉴定并计数克隆数。
结果如图10所述，在加入小分子化合物组合1的造血培养基中培养7天后的LSK在在甲基纤维素基半固体中的培养基具有强大的集落形成能力，包括红系集落(CFU-E)，粒系和巨噬粒系集落(CFU-GM)，巨噬细胞集落(CFU-M)和粒系集落(CFU-G)。
实施例11 HSPC细胞体内移植实验
用于移植实验的所有小鼠均为8-10周龄的C57BL/6小鼠。取1000个来自CD45.2小鼠的LSK细胞用小分子化合物组合1处理7天。用7AAD染色，保留7AAD-细胞用于尾静脉注射。将CD45.27AAD-细胞与2×105CD45.1骨髓一起进行竞争性移植。未经小分子化合物组合处理的LSK细胞作为对照组。移植后第4周和第6周使用流式细胞仪BD LSKFortessa X-20监测受体小鼠外周血中CD45.2细胞的百分比，通过Flowjo_V10软件分析结果。
结果如图11所示。我们发现小分子化合物组合1处理的LSK细胞与对照细胞相比有显着增加的植入率，与未培养的原代LSK细胞相似。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞和/或促进造血干/祖细胞体外扩增的小分子化合物组合，其特征在于，所述的小分子化合物组合包含HDACs抑制剂、GSK-3抑制剂和TGF-β信号通路抑制剂。
2.根据权利要求1所述的小分子化合物组合，其特征在于，所述HDACs抑制剂为VPA，所述GSK-3抑制剂包括CHIR99021，所述TGF-β信号通路抑制剂包括Repsox。
3.根据权利要求1所述的小分子化合物组合，其特征在于，所述的小分子化合物组合为VPA、CHIR99021和Repsox。
4.根据权利要求3所述的小分子化合物组合，其特征在于，所述VPA的浓度为0.2～1mM，所述CHIR99021的浓度为1～50μM，所述Repsox的浓度为0.2～20μM。
5.根据权利要求3所述的小分子化合物组合，其特征在于，所述VPA的浓度为500μM，所述CHIR99021的浓度为30μM，所述Repsox的浓度为10μM。
6.根据权利要求1所述的小分子化合物组合，其特征在于，所述体细胞包括成纤维细胞、骨髓细胞、脾脏细胞和血细胞。
7.根据权利要求1～6任一所述的小分子化合物组合，其特征在于，所述小分子化合物组合还包含药学上可接受的载体。
8.一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞和/或促进造血干/祖细胞体外扩增的方法，其特征在于，利用权利要求1～6任一所述的小分子化合物组合诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞。
9.权利要求1～6任一所述的小分子化合物组合在制备诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞和/或提高造血干/祖细胞的增殖水平药物中的应用。
10.一种造血干/祖细胞，其特征在于，所述造血干/祖细胞由体细胞经权利要求1～6任一所述的小分子化合物组合诱导得到。
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