CN110075125A - 一种用于治疗系统性硬化症伴随肢端硬化的脐带间充质干细胞注射液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗系统性硬化症伴随肢端硬化的脐带间充质干细胞注射液，其包括活性成分脐带间充质干细胞和辅料；所述辅料包括乳酸钠林格注射液、ProFreeze细胞冻存液、二甲基亚砜和人血白蛋白；每1mL注射液中含有脐带间充质干细胞数量0.2×107。脐带间充质干细胞注射液中乳酸钠林格注射液的体积分数为45～55％，ProFreeze细胞冻存液的体积分数40～45％，二甲基亚砜的体积分数为5～10％，人血白蛋白的质量分数2.5～7.5％。动物试验和临床试验结果表明，本发明的脐带间充质干细胞注射液能够改善系统性硬化症疾病伴随肢端硬化症状，并且无干细胞相关的不良反应。该脐带间充质干细胞注射液制备工艺简便，质量控制严格，具有较好的临床应用前景。

Description

一种用于治疗系统性硬化症伴随肢端硬化的脐带间充质干细 胞注射液及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法，以及其在系统性硬化症中的应用。
背景技术
系统性硬化症(Systemic sclerosis，SSc)，是一种病因复杂、以血管病变和细胞外基质的过度沉积为特征，可引起皮肤和内脏的纤维化并最终导致多器官功能障碍的自身免疫性疾病。系统性硬化症俗称硬皮病，根据皮肤的受累程度可分为两个主要的亚型：局限性硬皮病和弥漫性硬皮病，其中弥漫性SSc患者5年生存率仅为35-45％。系统性硬化症是一种慢性疾病，发病隐蔽，病程较长，严重影响患者生活质量，给家庭和社会带来了巨大的经济负担。
系统性硬化症目前尚无特效疗法，常规治疗主要针对免疫、血管及胶原的异常，以调节免疫、改善血循环和减少纤维化为基础，但大部分患者的治疗反应差或无效。常规治疗药物包括糖皮质激素和免疫抑制剂，但上述药物不仅在抑制免疫细胞增殖及其活性等方面具有非特异性，而且可能出现骨髓抑制、感染、肝肾损害、肾危象等严重的并发症。现有的治疗手段远未能满足临床治疗的需要，缺乏针对性的特效药物。
干细胞治疗是一种革命性的技术，在临床前和临床研究中展现了较好的应用前景，特别对于那些常规治疗方式无效的患者，干细胞治疗带给了他们新的希望。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是不同于造血干细胞的一类干细胞，具有定向分化、免疫抑制、营养因子分泌等功能，在治疗自身免疫性疾病方面更具优势。间充质干细胞能够抑制炎症、促进血管新生、促进组织修复、抗纤维化，这些特性确定了其在治疗系统性硬化症中的重要应用。
近年来，国内外使用间充质干细胞治疗系统性硬化症的临床案例也有报道。Serena Guiducci等报道了静脉回输自体骨髓来源间充质干细胞能显著改善脚部缺血性坏死症状的案例。Brigitte Granel等使用自体脂肪基质血管组分(包含间充质干细胞)治疗系统性硬化症，改善患者指端雷诺现象、疼痛感、浮肿等症状。孙凌云教授也报道了间充质干细胞治疗难治性系统性硬化症的案例，其治疗效果有待于更大规模的临床研究证实。CN108451981A公布了一种使用皮肤间充质干细胞治疗系统性硬化症的应用，但皮肤间充质干细胞的制备和质量控制还不成熟，现阶段不适合临床应用。
发明内容
本发明的一目的是提供一种用于治疗系统性硬化症伴随肢端硬化的脐带间充质干细胞注射液。
本发明的另一目的是提供一种用于治疗系统性硬化症伴随肢端硬化的脐带间充质干细胞注射液的制备方法。
为了实现上述目的和其它优点，本发明提供了一种用于治疗系统性硬化症伴随肢端硬化的脐带间充质干细胞注射液，其包括活性成分脐带间充质干细胞和辅料，每1mL注射液中含有脐带间充质干细胞数量是0.2×107个。所述辅料包括乳酸钠林格注射液、ProFreeze细胞冻存液、二甲基亚砜和人血白蛋白。脐带间充质干细胞注射液中乳酸钠林格注射液的体积分数为45～55％，ProFreeze细胞冻存液的体积分数40～45％，二甲基亚砜的体积分数为5～10％，人血白蛋白的质量分数2.5～7.5％。
优选的是，脐带间充质干细胞注射液中乳酸钠林格注射液的体积分数为50％，ProFreeze细胞冻存液的体积分数42.5％，二甲基亚砜的体积分数为7.5％，人血白蛋白的质量分数5％。
优选的是，所述脐带间充质干细胞代次为第5代，细胞群体倍增水平为15～20。
脐带间充质干细胞注射液使用液氮，低于-150℃保存，有效期为24个月。在临床输注之前使用37℃水浴溶解，溶解后30min内使用；输注方式为静脉回输，剂量为1～2×106个/kg体重，疗程为每星期输注1次，共输注4次。
该脐带间充质干细胞冻存前活率大于98％，细胞复苏后活率大于90％。
本发明的脐带间充质干细胞注射液包括两种规格：15ml体积和20mL体积，其中细胞数量分别为3×107和4×107。
上述的脐带间充质干细胞注射液的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备脐带间充质干细胞，细胞扩增至P5代，收集细胞，进行质量检测；具体操作如下：
S11、采集脐带标本，48小时内进行细胞分离；
S12、使用组织块接种法进行原代细胞的分离和培养，原代细胞的培养和后续细胞扩增均使用无血清无异源培养基；
S13、收获原代细胞P0，并连续传代至P2；
S14、收获P2代细胞，进行质量检测，检测合格后进行细胞冻存，此为主细胞库；
S15、复苏主细胞库细胞，进行连续细胞传代；
S16、细胞扩增至P5代，收集细胞，进行质量检测，检测合格后备用；
S2、配制含二甲基亚砜的ProFreeze细胞冻存液；
S3、配制含人血白蛋白的乳酸钠林格注射液；
S4、将质量检测合格的脐带间充质干细胞重悬在含人血白蛋白的乳酸钠林格注射液中，制成单细胞悬液；
S5、将单细胞悬液与含二甲基亚砜的ProFreeze细胞冻存液按体积比1：1混合，得到细胞悬液；
S6、将细胞悬液装入CryoStore冻存袋中，使用液氮，低于-150℃保存。
本发明的脐带间充质干细胞注射液的质量检测结果：(1)细胞冻存前活率大于98％，细胞复苏后活率大于90％；(2)细胞表型鉴定CD73,CD90,CD105阳性率>96％；CD34,CD45,HLA-DR阳性率<1.8％；(3)具有成脂、成骨和软骨三向分化潜能；(4)无支原体、无菌、无病毒；(5)内毒素含量<0.5U/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)相较于皮肤间充质干细胞来说，本发明的脐带间充质干细胞注射液制备工艺成熟，质量控制严格，特别地本发明的干细胞培养体系采用的是无血清无异源培养体系，符合干细胞药品的要求。
(2)本发明提供的脐带间充质干细胞注射液可直接回输人体，使用简便；干细胞活率高，注射液具有较长的有效期，临床使用不受地域限制；
(3)本发明提供的脐带间充质干细胞注射液能够有效缓解系统性硬化症伴随的肢端硬化症状，并且没有明显副作用。通过使用此脐带间充质干细胞注射液治疗系统性硬化症的临床前研究和临床研究结果，证实了该方法的安全性和有效性。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1、台盼蓝染色测定不同时间点脐带间充质干细胞注射液中细胞活率。
图2、硬皮病小鼠造模流程图。
图3、小鼠受损皮肤变化。
图4、小鼠皮肤HE与Masson染色。
图5、真皮层厚度检测。
图6、基线至12周MRSS变化值。
图7、不同时间点(基线、6周和12周)的MRSS评分值。
图8、联合治疗组超声检查皮肤厚度和毛细血管显微镜检测微循环修复指标。A，B分别为基线和12周时的皮肤厚度指标；C，D分别为基线和12周时微循环修复指标。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
一种脐带间充质干细胞注射液的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备脐带间充质干细胞，具体操作如下：S11、采集脐带标本，48小时内进行细胞分离；
S12、使用组织块接种法进行原代细胞的分离和培养，原代细胞的培养和后续细胞扩增均使用无血清无异源培养基(StemMACSTMMSC Expansion Media Kit XF，MiltenyiBiotec)；
S13、收获原代细胞P0，传代扩增至P1，细胞传代密度为6000cell/cm2，3天左右收获细胞；继续传代扩增至P2，3天左右收获P2代细胞，进行质量检测，检测项目包括：细胞活率、细胞表型、细胞分化潜能、生物学功能、微生物、支原体、病毒和内毒素；检测合格后进行细胞冻存，此为主细胞库；
S14、复苏主细胞库细胞，进行连续细胞传代扩增至P5；
S15、细胞扩增至P5代，收集细胞，进行质量检测，进行质量检测，检测项目包括：细胞数量和活率、微生物和内毒素；检测合格的细胞备用；
S2、配制含体积分数15％二甲基亚砜的ProFreeze细胞冻存液(cat#12-769E，Lonza)；
S3、配制含质量百分数10％人血白蛋白的乳酸钠林格注射液；
S4、将质量检测合格的脐带间充质干细胞重悬在含人血白蛋白的乳酸钠林格注射液中，制成单细胞悬液；
S5、将单细胞悬液与含二甲基亚砜的ProFreeze细胞冻存液按体积比1：1混合，得到细胞悬液；
S6、将细胞悬液装入CryoStore冻存袋(CS25，Origen Biomedical)中，使用液氮，低于-150℃保存。采用的人血白蛋白和二甲基亚砜为临床使用级别。
所述脐带间充质干细胞注射液中，乳酸钠林格注射液体积分数为50％、ProFreeze细胞冻存液体积分数为42.5％，二甲基亚砜体积分数为7.5％，人血白蛋白质量分数5.0％。
该脐带间充质干细胞注射液可以是两种规格：15ml体积和20mL体积，其中细胞数量分别为3×107和4×107。
脐带间充质干细胞注射液的质量检测：
(1)细胞活率检测：对于冻存前的细胞，直接使用0.4％台盼蓝染液染色，使用血球计数板进行活率计算。对于复苏后的细胞，分别取冻存1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月的脐带间充质干细胞注射液，按照标准操作复苏并取样，再通过台盼蓝染色进行活率计算。检测结果如图1所示，冻存前细胞活率大于98％，复苏后的细胞活率与冻存时间有直接关系，冻存24个月内的细胞活率仍大于90％，超过24个月之后，细胞活率低于90％。由此确定本发明脐带间充质干细胞注射液的有效期确为24个月。
(2)细胞表型鉴定：收集细胞，并制成单细胞悬液；加入10mL的流式染色缓冲液重悬细胞，离心(350g，5min)；弃上清，加入适当体积的流式染色缓冲液，细胞密度为5×106cells/mL，并将细胞分装至1.5mLEP管中，每个样本体积为100μL；然后分别加入抗体CD73-FITC、CD90-PE、CD105-APC、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE和同型抗体IgG-FITC、IgG-PE、IgG-APC，以上抗体均购自于Biolegend公司。4摄氏度避光孵育30min；加入2mL流式染色缓冲液清洗两次，350g离心5min；使用200μL流式染色缓冲液重悬细胞，流式细胞仪进行检测和数据分析。检测结果如表1所示，细胞表型CD73，CD90，CD105阳性率>96％；CD34，CD45，HLA-DR阳性率<1.8％。
(3)细胞分化鉴定：分别使用成骨、成脂和软骨分化诱导试剂盒进行试验，试剂盒购自Cyagen公司。按照试剂盒操作说明进行，诱导3-4星期后收集样本，分别使用茜素红S染色进行成骨细胞鉴定，油红染色进行脂肪细胞鉴定，以及阿尔新蓝染色进行软骨细胞鉴定。结果如表1所示，细胞能够向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。
(4)细胞群体倍增水平：按6000cells/cm2的密度接种细胞，并记录起始细胞数量：N0＝细胞密度×培养瓶面积；待细胞融合度达到90％左右时，胰酶消化收集细胞，然后使用台盼蓝染色进行细胞计数，并记录终末细胞数量N＝细胞密度×细胞体积；计算群体倍增数(p)：p＝log10(N/N0)×3.33；细胞连续传代，并记录每一代次的群体倍增数和群体倍增时间；将P1-P5细胞的群体倍增数相加，即得到脐带间充质干细胞的群体倍增水平。结果如表1所示，细胞扩增至P5时，细胞群体倍增水平为15～20。
本发明的间充质干细胞注射液的内毒素检测、微生物检测、支原体检测和病毒检测主要使用药典的方法，如无药典方法则使用经验证的非药典方法。以上结果表明，该间充质干细胞注射液的质量符合要求。
表1、脐带间充质干细胞注射液质量控制体系
实施例2
脐带间充质干细胞治疗硬皮病小鼠模型的临床前研究，具体操作如下：
硬皮病小鼠模型建立：(1)将30只雌性6周龄BALB/c小鼠随机分为A、B、C三组，分别为SSc模型组、SSc模型+间充质干细胞治疗组、PBS对照组；(2)选取小鼠背部靠近尾根部皮肤，脱毛膏除去1.5cm×1.5cm局部毛发；A、B两组小鼠背部皮下注射100μL 1mg/ml博来霉素，C组小鼠背部皮下注射100μL PBS，每日一次连续4周；(3)观察注射部位皮肤变化，与PBS组小鼠相比，博来霉素组小鼠皮肤出现明显的增厚和硬化，可初步判定造模成功。
尾静脉注射脐带间充质干细胞治疗硬皮病小鼠模型：(1)造模成功后，将实施例1制备的脐带间充质干细胞重悬在PBS中，细胞浓度为1×107/mL(注：动物实验所用脐带间充质干细胞悬液和临床试验不一样)。B组小鼠经尾静脉注射100μL脐带间充质干细胞悬液；A组与C组经尾静脉注入等量PBS；(2)第35天，重复尾静脉干细胞输注治疗一次，A组与C组重复注射PBS；小鼠硬皮病造模方法和干细胞治疗方案如图2所示。
治疗效果观察：第42天，处死小鼠，切取局部皮肤，进行HE与Masson染色观察皮肤厚度，结果如图3-5所示。
上述研究表明，脐带间充质干细胞治疗可以明显改善皮肤的硬化情况、减少皮肤的厚度；在硬皮病小鼠模型中，脐带间充质干细胞治疗是有效的。
实施例3
脐带间充质干细胞注射液治疗系统性硬化症的临床研究，具体操作如下：
1.2015年5月至11月门诊及住院系统性硬化症患者42例；将入组志愿者随机分为两组：传统治疗组和联合治疗组。患者一般情况如下表2所示。其中MRSS：改良Rodnan评分；dcSSc：弥漫性硬皮病；lcSSc：局限性硬皮病；ESSG index：欧洲硬皮病研究组活动指。通过统计性别、年龄、病程、MRSS、dcSSC/lcSSc以及ESSG index等指标，结果显示传统治疗组和联合治疗组患者之间没有显著性差异。
2.入组标准：(1)理解并签署知情同意书的患者；(2)50天内没有使用过任何血制品(除外白蛋白)；(3)同意不参加其他任何临床研究；(4)符合ARA1980年SSc分类标准，或符合；ACR/EULAR2013年SSc分类标准；(5)患者伴随有肢端硬化症状；(6)年龄18-70岁。
3.排除标准：(1)有严重药物过敏史或过敏体质者；(2)有较严重感染或合并恶性肿瘤者；(3)终末期心、肾功能不全者；(4)有精神异常和严重认知功能障碍者；(5)血清HIV和其他致病性病原学检查阳性者；(6)有凝血功能严重障碍者；(7)合并妊娠或哺乳期患者。
表2、患者一般情况
基本情况 联合治疗组(n＝22) 传统治疗组(n＝20) P
女/男(例) 18/4 17/3 0.529
年龄(岁) 44.36 47.80 0.437
病程(年) 4 3 0.675
MRSS 22.59 19.89 0.349
dcSSc/lcSSc(例) 12/10 11/9 0.977
ESSGindex 4.77 4.23 0.409
4.治疗方案：(1)传统治疗组：使用常规剂量免疫抑制剂，可合并抗纤维化药物、血管扩张剂和糖皮质激素。(2)联合治疗组：使用实施例1制备的脐带间充质干细胞注射液，根据临床所需剂量两种规格(15ml和20mL)组合使用，细胞剂量为1～2×106个/kg体重，疗程为每星期输注1次，共输注4次；患者同时使用减低剂量的传统药物。脐带间充质干细胞注射液在临床输注之前使用37℃水浴溶解，溶解后30min内使用。
5.安全性评估：分别在治疗开始前1周内，治疗结束后第1、3、6月进行随访，评价脐带间充质干细胞注射液的安全性。观察干细胞治疗前后血常规、肝肾功能、凝血功能、输血前全套、心电图等可用于评价安全性的指标；观察干细胞输注时及输注后1周内有无一过性发热、寒战、皮肤瘙痒、面部潮红等情况发生；观察受试者在临床研究期间发生的任何不良事件，以及治疗后的病情变化。不良事件统计结果如表3所示。
表3、不良事件及病情变化
不良事件主要为：皮肤紧绷感加重、关节疼痛、肺炎等。其中联合治疗组中发现了4例不良反应，传统治疗组发现了3例不良反应。以上结果表明，联合治疗组患者输注脐带间充质干细胞注射液不会引起严重的不良反应，本发明的输注脐带间充质干细胞注射液是安全的。
6.疗效评估：分别在治疗开始前1周内，治疗结束后第1、3、6月进行随访，评价脐带间充质干细胞注射液的治疗效果，主要指标为MRSS、皮肤超声检查和甲周微循环检查。结果如图6-8所示。图6和7是通过测定改良Rodnan皮肤评分(MRSS)来评估脐带间充质干细胞注射液的临床治疗效果。联合治疗组患者的MRSS较传统治疗组有显著改善，并且随着时间的推移，改善效果也越来越明显。图6为基线至12周MRSS变化值；图7为不同时间点(基线、6周和12周)的MRSS评分值。并且，输注脐带间充质干细胞注射液12周后，患者的皮肤厚度变小，甲周微循环也得到改善。
以上临床研究结果表明，脐带间充质干细胞注射液能安全、有效地改善系统性硬化症的肢端硬化症状。
综上所述，通过临床前研究和临床研究结果表明，本发明提供的脐带间充质干细胞注射液能够有效缓解系统性硬化症伴随的肢端硬化症状，并且没有明显副作用，证实了该方法的安全性和有效性，治疗效果明显优于传统治疗方法。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种用于治疗系统性硬化症伴随肢端硬化的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，包括活性成分脐带间充质干细胞和辅料；所述辅料包括乳酸钠林格注射液、ProFreeze细胞冻存液、二甲基亚砜和人血白蛋白；每1mL注射液中含有脐带间充质干细胞数量0.2×107。
2.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，乳酸钠林格注射液的体积分数为45～55％，ProFreeze细胞冻存液的体积分数40～45％，二甲基亚砜的体积分数为5～10％，人血白蛋白的质量分数2.5～7.5％。
3.如权利要求2所述的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，乳酸钠林格注射液的体积分数为50％，ProFreeze细胞冻存液的体积分数42.5％，二甲基亚砜的体积分数为7.5％，人血白蛋白的质量分数5％。
4.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，所述脐带间充质干细胞代次为第5代，细胞群体倍增水平为15～20。
5.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，脐带间充质干细胞注射液使用液氮，低于-150℃保存，有效期为24个月。
6.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，在临床输注之前使用37℃水浴溶解，溶解后30min内使用；输注方式为静脉回输，剂量为1～2×106个/kg体重，疗程为每星期输注1次，共输注4次。
7.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，脐带间充质干细胞冻存前活率大于98％，细胞复苏后活率大于90％。
8.如权利要求7所述的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，所述脐带间充质干细胞注射液包括两种规格：15ml体积和20mL体积，其中细胞数量分别为3×107和4×107。
9.一种如权利要求1-8任意一项所述的脐带间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备脐带间充质干细胞，细胞扩增至P5代，收集细胞，进行质量检测；
S2、配制含二甲基亚砜的ProFreeze细胞冻存液；
S3、配制含人血白蛋白的乳酸钠林格注射液；
S4、将质量检测合格的脐带间充质干细胞重悬在含人血白蛋白的乳酸钠林格注射液中，制成单细胞悬液；
S5、将单细胞悬液与含二甲基亚砜的ProFreeze细胞冻存液按体积比1：1混合，得到细胞悬液；
S6、将细胞悬液装入CryoStore冻存袋中，使用液氮，低于-150℃保存。
10.如权利要求9所述的脐带间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的具体操作如下：
S11、采集脐带标本，48小时内进行细胞分离；
S12、使用组织块接种法进行原代细胞的分离和培养，原代细胞的培养和后续细胞扩增均使用无血清无异源培养基；
S13、收获原代细胞P0，并连续传代至P2；
S14、收获P2代细胞，进行质量检测，检测合格后进行细胞冻存，此为主细胞库；
S15、复苏主细胞库细胞，进行连续细胞传代；
S16、细胞扩增至P5代，收集细胞，进行质量检测，检测合格后备用。
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