KR20140106550A - 생물학적 모니터링을 위한 ｇｍ1 갱글리오사이드와 아넥신 ⅴ 마이크로입자 폴리펩타이드 비율 - Google Patents

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사이 키앙 림
콕 히안 탄
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에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
싱가포르 헬스 서비시즈 피티이. 엘티디.
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Abstract

본 발명은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태를 모니터링하기 위한 방법을 설명한다. 상기 방법은 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터의 마이크로입자 샘플의 비율을 통해 수립하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 콜레라 독소 B(CTB)에 결합하는 GM1 갱글리오사이드 내의 선별된 폴리펩타이드("GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드")와 Annexin V에 결합하는 노출된 포스파티딜세린 내의 선별된 폴리펩타이드("Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드")와의 비율이다. GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드의 비율은 세포, 조직, 기관 또는 생물체 상태의 지표로 수립될 수 있다.

Description

생물학적 모니터링을 위한 ＧＭ1 갱글리오사이드와 아넥신 Ⅴ 마이크로입자 폴리펩타이드 비율 {GM1 ganglioside to Annexin V microparticle polypeptide ratio for biological monitoring}
본 발명은 의학, 세포 생물학, 분자 생물학 및 유전학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 의학 분야에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 생리학적 또는 병리학적 상태를 모니터링할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 암과 같은 질병의 진단과 치료에 관한 것이다.
미국 특허출원 번호 60/713,992호, 12/065,549호, 12/065,551호, 60/878,222호, 12/377,398호, 61/066,671호, 61/227,865호 및 61/257,121호의 개시 사항은 참고문헌으로 사용된다. 또한 국제 특허 출원번호 PCT/GB2005/003206호, PCT/SG2006/000233호, PCT/SG2006/000232호, PCT/SG2007/000257호 및 PCT/SG2009/000062호의 개시 사항도 참고문헌으로 사용된다.
상기 선행 특허출원 및 현재 심사가 진행 중인 특허출원을 포함한 현재 및 선행 특허출원 내의 인용된 문헌 또는 참고문헌과 선행 특허출원 내에 언급된 제조자 사용 지침 또는 언급된 물품의 카탈로그와 언급된 문헌 논문 역시 참고문헌으로 본 명세서 내에 통합되어 있다. 또한 본 명세서 내에 언급된 모든 문헌과 본 명세서 내에 언급된 문헌 내에 언급된 모든 문헌, 본 명세서 내에 언급된 물품의 제조자 사용 지침 또는 카탈로그 역시 참고 문헌으로 본 명세서 내에 통합되어 있다. 본 명세서 내에 참고문헌으로 통합된 문헌의 가르침은 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본 명세서 내에 참고문헌으로 통합된 문헌은 선행기술로서 인정되는 것은 아니다.
마이크로입자가 다양한 종류의 세포에서 분비되고 세포 형태 및 세포의 병리학적 상태 또는 세포의 미세환경에 의존하여 달라질 수 있음은 이미 잘 알려져 있다. 이러한 세포의 조건과 미세환경은 알츠하이머 병, 결핵 감염, HIV 감염, 암, 저산소증, 방사선 조사, 산화 스트레스, 전단(shearing) 스트레스 및 활성화된 보체 콤플렉스의 노출 등을 들 수 있다. 마이크로입자는 멤브레인 비시클(vesicle)이다. 현재까지 엑소좀(exesome), 엑토좀(ectosome), 아폽토트 바디를 포함하는 다양한 형태의 마이크로입자가 알려져 있다. 이러한 마이크로입자는 단백질과 RNA를 모두 포함한다. 이러한 마이크로입자의 다수는 생물학적 활성 또는 병리학적 활성을 증진시키는 생물학적 활성을 나타내고 있다.
뇨, 혈액, 눈물, 타액, 기관지 폐포액, 종양 유출액, 정액, 양수 및 모유와 같은 체액은 다수의 멤브레인 비시클을 포함한다. 마이크로입자의 차단, 형태 및 생물학적 활성은 세포의 형태, 이들의 생리학적 상태 및 세포 미세환경에 의존하기 때문에 이러한 마이크로입자는 잠재적으로 진단 또는 예후의 표지로서 우수한 공급원이 될 수 있다. 그러나 체액 내의 이러한 마이크로입자의 다수는 그 기원과 아이덴티티가 알려져 있지 않고 오직 매우 이형성적인 것으로 예측되고 있다.
따라서 이러한 마이크로입자의 급격한 증가는 특정 기술의 도구로 사용할 수 있으며 지질 마이크로입자 기반 생물학적 표지 또는 치료용 적용의 예측 가능성과 견고성을 증진시킬 수 있을 것이다.
본 발명의 실행은 다르게 언급하지 않는 한 본 발명의 분야에 있어서 통상의 지식을 가진 자의 능력 하에 일반적인 화학, 분자생물학, 미생물학, DNA 재조합 및 면역학 기술을 응용할 수 있을 것이다. 이러한 기술은 문헌에 설명되어 있으며 그 예를 들면 J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization : Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology : DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); 및 Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3. 이들 일반적 문헌의 각각은 본 명세서 내에 참고문헌으로 통합되어 있다.
도 1은 혈청의 크기 분별화를 나타내는 다이어그램이다. 건강한 개체로부터의 혈청을 세파로즈 2B 크기 배제 스핀 컬럼을 통해 통과시켰다. 용출액을 PBS로 3회 세척하였다.
투입된 혈청으로부터 수득된 앨리쿼트를 통액시키고 SDS/PAGE로 분리시켰다. 겔은 은(상부 패널)으로 염색시키고 니트로셀룰로스 위에 전기영동시켜 항-CD9 항체(하부 패널)를 이용하여 웨스턴 블롯 혼성화시켰다.
도 2는 CTB 친화성 크로마토그래피를 나타낸 다이어그램이다. 혈청으로부터 크기배제 크로마토그래피를 통해 통액시키고 세척시킨 하나의 획분을 사용한다. CTB 친화성 크로마토그래피에 의해 GM1 갱글리오사이드의 존재를 확인하기 위한 시험을 행하였다.
획분은 비오틴화시킨 CTB로 인큐베이션 시켰으며 PBS로 3회 세척하기 전에 스트렙트아비딘에 자기 비드를 커플링시켰다. 투입된 혈청으로부터 얻어진 앨리쿼트를 통액시키고 SDS/PAGE로 분리시켰다. 겔은 은(상부 패널)으로 염색시키고 니트로셀룰로스 위에 전기영동시켜 항-CD9 항체(하부 패널)를 이용하여 웨스턴 블롯 혼성화시켰다.
도 3은 수크로스 밀도 구배 내에서 CD9+ 마이크로입자의 침강을 나타낸 다이어그램이다. 혈청을 수크로스 밀도 28%에서 60%까지 구배시킨 후 침강시켰다. 초원심분리 후 구배(gradient)를 동일한 양으로 분별화시켰다. 각각의 획분의 무게를 측정하고 밀도를 계산하였다.
상부 패널에는 밀도(g/ml)로 구분된 각각의 획분으로부터 수득된 앨리쿼트를 SDS/PAGE에 의해 분리시켰으며 겔은 은(상부 패널)으로 염색시키고 니트로셀룰로스 위에 전기영동시켜 항-CD9 항체(하부 패널)를 이용하여 웨스턴 블롯 혼성화시켰다.
도 4는 Annexin V 친화성 크로마토그래피를 나타낸 다이어그램이다. 혈청을 비오틴화된 Annexin V와 함께 인큐베이션시켰으며 PBS로 3회 세척 전에 스트렙트아비딘을 자기 비드에 커플링시켰다.
투입된 혈청으로부터 얻어진 동등량의 앨리쿼트를 통액시키고 SDS/PAGE로 분리시켰다. 겔은 니트로셀룰로스 위에 전기영동시켜 항-CD9 항체(하부 패널)를 이용하여 웨스턴 블롯 혼성화시켰다. 바운드(10x) 앨리쿼트는 다른 레인의 각각의 것보다 10배 이상의 것이다.
도 5는 Myc-형질전환된 ES-유래 MSC 라인(Myc-HuES9.El)에 의한 컨디션화 된 배양 배지와 혈장을 수크로스 밀도 구배 위에 로딩하였다. 밀도 구배는 23%로부터 60%(w/v) 까지의 농도로 된 14개의 수크로스 용액 층으로 준비되었다. 샘플을 로딩시킨 후 구배를 4℃에서 200,000g로 18시간 초원심분리 시켰다.
밀도 구배에서 상부 13개의 획분을 제거시켰다. 각각의 획분의 밀도는 각각의 획분 100㎕를 무게 측정함으로써 결정되었다. CD9+ annexin V-결합 바이크로 비시클과 CD9+ CTB-결합 바이크로비시클의 상대적 수준을 각각의 획분에서 결정하였다.
도 6a와 도 6b는 건강한 개체(H) 및 심장질환자(D)로부터의 혈장을 비오틴화된 Annexin V(도 6a) 또는 Cholera Toxin B(도 6b)와 함께 인큐베이션 시켰다. Annexin V 또는 Cholera Toxin B에 결합된 마이크로비시클을 스트렙트아비딘-콘쥬게이트된 자기 비드와 함께 추출시켰다. 이 분리된 마이크로비시클 내의 단백질을 ELISA 내에서 특이 항원을 사용하여 검출하였다.
도 7은 각각의 마이크로비시클 A 또는 B 내의 각각의 바이오 표지를 위해 심부전증 환자(CHF), 건강한 개체(Con) 및 AMI 환자(AMI)로부터 5 내지 10 마이크로리터의 혈장을 사용하였다. 마이크로비시클 A 또는 B 내의 BNP, Flt-1, TIMP-1, CD9 및 ANP의 상대수준을 친화성 크로마토그래피에 의해 마이크로비시클을 1차 분리시키고 리간드에 특이항체를 이용하여 ELISA에 의해 결정하였다. Flt-1과 CD9은 멤브레인 부착 단백질인 반면 BNP, TIMP-1 및 ANP는 루미날 단백질이었다.
서로 다른 환자 그룹 내에서 마이크로비시클 A 또는 B 내의 단백질 분포를 분석하였다. 심부전 환자와 AMI 환자는 정상 개체에 비해 마이크로비시클 B 내에서 매우 높은 BNP 레벨을 나타내었으나 마이크로비시클 B는 해당하지 않았다. 마이크로비시클 A 및 B 모두에서 Flt-1은 정상 개체에 비해 AMI 환자의 경우 더욱 높게 나타났다.
그러나 심부전 환자(CHF)의 경우 마이크로비시클 A 내의 Flt-1은 더욱 낮았으며 마이크로비시클 B 내의 Flt-1은 정상 개체와 비교하여 유의있는 차이를 나타내지 않았다. 3개의 환자군 내의 마이크로비시클의 경우 심부전 환자 내의 TIMP-1과 관련된 마이크로비시클 A에서만 유의적으로 높아지는 차이를 나타내었으며 마이크로비시클 A 내의 CD9의 경우 마이크로비시클 B와는 달리 심부전 환자와 AMI 환자에서 유의적으로 높아지는 차이를 나타냈다. 마이크로비시클 A 내의 ANP는 심부전 환자 및 AMI 환자에서 높아지는 차이를 나타내었다. 마이크로비시클 B 내에서는 오직 AMI 환자에서만 ANP가 유의적으로 증가하였다.
도 8은 식중독의 경우 혈장 CD9의 모니터링을 나타낸 것이다. 식중독인 개체로부터 혈장을 3주 후에 상기한 방법으로 분석하였다. 건강한 개체로부터 3주 후에 수득된 2개의 혈장 샘플이 대조군으로 사용되었다. 환자의 CTB 획분과 AnnV 획분 내의 평균 형광 물질을 식중독 전(A1)과 3주 후(A2)에 측정하였으며 건강한 개체로부터 수득된 B1 및 B2와 비교하였다. B1 및 B2는 건강한 대조군으로부터 3주 후에 수득된 샘플 혈장으로부터 나타난 결과이다.
도 9는 에세이의 전개 과정을 나타낸 것이다. 혈장은 우선 비오틴화 CTB로 인큐베이션 시키고 스트렙트아비딘-콘쥬게이트된 자기 비드에 흡착시킨다. 자기 비드는 마그넷으로 고착화시키고 PBS 또는 등장완충액으로 세척시킨다. 부착된 마이크로비시클을 일반적인 세정액 기반 세포 용해 완충액으로 용해시킨다.
마이크로비시클 성분은 예를 들면 술포-NHS-비오틴과 같은 활성화된 비오틴에 의해 비오틴화시킨다. 특정 단백질의 분석을 위해 단백질에 특이적 항체를 콘쥬게이트 시킨 자기 비드를 첨가한다. 항체-결합 단백질을 마그넷으로 고착화시킨 후 격렬히 세척한다. 단백질은 HRP 색상 분석 또는 형광 분석 기질과 함께 스트렙트아비딘-콘쥬게이트 된 HRP를 사용하여 정량화 시킨다.
도 10은 세 번째 트리메스터에서 임신중독증 진단을 받거나 받지 않은 임신부 내의 혈장으로부터 CTB-결합 마이크로비시클에 대한 아넥신 V 내의 단백질의 서로 다른 분포를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 혈장 내에서 발견되는 다양한 지질 마이크로입자를 신속히 분리하기 위한 기술을 설명한다. 이와 같은 기술은 일반인의 진단 예측 또는 치료 진단목적으로 다양한 마이크로입자를 바이오표지로 확인하거나 계층화 가능케 하는 것이다.
또한 본 발명자들은 테트라스파닌 막 단백질의 일종인 CD9을 2개의 혈장 마이크로비시클 획분으로 계층화하여 인간 혈장 내에 아넥신 V-결합 포스파티딜세린 또는 콜레라 독소 B 사슬(CTB)-결합 GM1 갱글리오사이드가 풍부한 2개의 획분으로 계층화시킨 것이다. 아넥신 V와 콜레라 독소 B 사슬의 친화성은 서로 배타적이다. 막 단백질과 지질간의 결합은 이 두 개의 획분이 지질 비시클임을 암시한다.
또한 본 발명자들은 혈장 내의 아넥신 V 및 CTB-결합 부분 획분 내의 상대적 단백질 수준 또는 단백질 조합이 개체의 건강 또는 병리적 상태와 관련 있음을 나타낸다.
또한 본 발명자들은 건강한 개체에 있어서 혈장 내의 아넥신 V 및 CTB-결합 부분 획분 내의 CD9의 상대적 수준은 유사하였다. 그러나 예를 들면 식중독 또는 관상동맥중재술(PCI) 또는 죽상제거술 치료를 받는 심장질환자에 있어서 이들 부분 획분 내의 CD9은 서로 다른 분포 수준을 나타내었다. 예를 들면 식중독 환자의 경우 건강 개체보다 CTB-결합 부분획분 내의 CD9이 더 높은 수준을 나타내었으며 반면 아넥신 V 결합 부분 획분에서는 유사한 수준을 나타내었다.
한편 관상동맥중재술(PCI) 또는 죽상제거술 치료를 받는 심장질환자의 경우 건강한 개체에서 발견되는 CTB-결합 부분획분 내의 CD9 수준과 유사한 수준을 나타내었으나 아넥신 V-결합 부분획분 내의 CD9은 더 높은 수준을 나타내었다.
혈장 내의 아넥신 V 및 CTB-결합 부분획분 내의 상대적 단백질의 수준을 측정함으로써 개체의 건강 또는 병리 상태를 진단할 수 있는 방법으로 사용할 수 있다.
상태 모니터링
본 발명자들은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태를 모니터링할 수 있는 방법을 제공한다.
상기 방법은 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터 마이크로입자 샘플을 통해 첫 번째 형태의 마이크로입자 내의 선별된 폴리펩타이드 양과 두 번째 형태의 마이크로입자 내의 선별된 폴리펩타이드 양의 비율을 수립함으로써 가능케 된다.
상기 비율은 두 번째 형태의 마이크로입자 내의 폴리펩타이드 양에 대한 첫 번째 형태의 마이크로입자 내의 폴리펩타이드 양의 비율 예를 들면 두가지 형태의 마이크로입자 간의 비율로 나타낼 수 있다.
첫 번째 형태의 마이크로입자는 GM1 갱글리오사이드를 포함하는 마이크로입자(본 명세서 내에서는 편의상 'GM1 갱글리오사이드 마이크로입자'라 칭함)일 수 있다. 첫 번째 형태의 마이크로입자는 콜레라 독소 B(CTB)에 결합될 수 있으며 본 명세서에서는 편의상 'CTB-마이크로비시클'이라 칭한다.
두 번째 형태의 마이크로입자는 노출된 포스파티딜세린을 포함하는 마이크로입자일 수 있다. 두 번째 형태의 마이크로입자는 Annexin V에 결합될 수 있으며 본 명세서 내에는 편의상 'Annexin V 마이크로입자' 또는 'AV-마이크로비시클'이라 칭한다.
편의를 위해 첫 번째 형태의 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 존재, 함량, 질량, 번호를 언급하기 위한 이러한 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자를 'GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드'라고 언급한다. 이와 유사하게 편의를 위해 두 번째 형태의 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 존재, 함량, 질량, 번호를 언급하기 위한 이러한 Annexin V 마이크로입자를 'Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드'라고 언급한다. 또한 편의를 위해 상기의 비율을 'GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드 대 Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드의 비율'이라 언급한다.
폴리펩타이드는 tetraspanin 단백질 (예를 들면 CD9, CD81, CD63) Rab GTPases (예를 들면 Rab 5a, Rab 5b 및 Rab 5c, Rab-27a 및 Rab-27b, Rab 35), LAMP (예를 들면 Lampl 및 Lamp2), 카베올린 (예를 들면, 카베올린 1 및 카베올린 2), 트랜스퍼린 수용체 (TRFC), Clathrin Light Chain A (CLTA), Clathrin Light Chain B (CLTB), Clathrin Heavy Chain 1 (CLTC), TsglOl, Alix, PAI-1, PLGF, Procalcitonin, S-lOOb, TGF beta 2 (TGFB2), TIMP1에서 선택된 것일 수 있다. 폴리펩타이드는 CD9을 포함한다.
본 발명의 방법은 CD9+ 마이크로입자를 포함하는 마이크로입자인 것이다. 또한 본 방법은 마이크로비시클, 엑소좀, 엑토좀 또는 아폽토트 바디를 포함하는 마이크로입자인 것이다.
특히 본 발명자들은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태를 모니터링하기 위한 방법을 제공하는 것으로 상기 방법은 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터 마이크로입자의 샘플을 통해 (a) 바람직하게는 콜레라 독소 B(CTB)에 결합하는 GM1 갱글리오사이드를 포함하는 마이크로입자 내의 선별된 폴리펩타이드(GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드);와 (b) 바람직하게는 Annexin V에 결합하는 노출된 포스파티딜세린을 포함하는 마이크로입자 내의 선별된 폴리펩타이드(Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드);의 비율을 수립하는 것으로, 이때 수립된 (a)와 (b)의 비율(GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드 비율)을 통해 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태의 표지로 사용하는 생물체의 상태를 모니터링하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
이때 상기 폴리펩타이드는 테트라스파닌 단백질 (예를 들면 CD9, CD81, CD63) Rab GTPases (예를 들면 Rab 5a, Rab 5b 및 Rab 5c, Rab-27a 및 Rab-27b, Rab 35), LAMP (예를 들면 Lampl 및 Lamp2), 카베올린 (예를 들면 카베올린 1 및 카베올린 2), 트랜스퍼린 수용체 (TRFC), Clathrin Light Chain A (CLTA), Clathrin Light Chain B (CLTB), Clathrin Heavy Chain 1 (CLTC), TsglOl , Alix, PAI-1, PLGF, 프로칼시토닌, S-lOOb, TGF 베타 2 (TGFB2), TIMP1에서 선택된 것이다. 바람직하게는 CD9을 포함하는 폴리펩타이드이다.
본 발명자들은 또한 세포, 조직, 기관 또는 생물체가 특정 상태에 있는지를 수립하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포, 기관, 조직 또는 생물체의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드의 비율(또는 이러한 비율을 포함하는 프로파일)과 특정 상태에 있는 것으로 알려진 세포, 기관, 조직 또는 생물체의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드의 비율(또는 이러한 비율을 포함하는 프로파일)을 비교하는 단계를 포함하는 것이다.
또한 단일 폴리펩타이드를 사용하는 대신에 선별된 폴리펩타이드의 조합을 사용하는 것도 가능하다. 따라서 본 발명자들이 폴리펩타이드(예를 들면 수립된 비율의 비교)를 언급하는 경우 이러한 언급은 폴리펩타이드의 조합을 포함하는 것으로 여겨지고 예를 들면 폴리펩타이드 조합의 비율을 비교하거나 수립하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 GM1 갱글리오사이드를 포함하는 샘플 내의 마이크로입자를 선별하는 단계를 포함한다. 이 단계는 예를 들면 콜레라 독소 서브유니트 B(CTB)에 결합되는 샘플 내의 마이크로입자를 선별함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 노출된 포스파티딜세린을 포함하는 샘플 내의 마이크로입자를 선별하는 단계를 포함한다. 이 단계는 예를 들면 Annexin V에 결합되는 샘플 내의 마이크로입자를 선별함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 크기에 의해 마이크로입자를 선별하는 단계를 포함한다. 크기 선별 단계는 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 이 경우 크기 선별 단계는 첫 번째 단계, 예를 들면 단계 (a) 이전에 수행될 수 있다.
폴리펩타이드의 '함량'의 결정이 언급되는 경우 이는 폴리펩타이드의 질량, 번호, 농도 등의 결정을 위해 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한 폴리펩타이드의 비율 또는 조합의 비율이 언급되는 경우 두 번째 상태보다 첫 번째 상태에서 '더 높은' 것인 경우 이는 첫 번째 상태를 두 번째 상태와 비교시 통계학적으로 다른 비율을 나타내는 것으로 p 값은 <0.01이다.
이러한 비율은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태의 표지로 사용하도록 수립될 수 있다.
본 발명의 방법은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태가 정상적인 생리 상태, 분화(differentiation) 상태, 발달 상태 또는 대사 상태 또는 병리 상태인지를 나타낼 수 있으며 이때 병리 상태인 경우 질환 상태, 인간 질환 상태, 식중독 상태, 당뇨병 상태, 면역 이상 상태, 신경퇴화 이상 상태, 암 발병 이전 상태, 암 발병 상태, 종양 발병 상태인 것을 포함한다.
예를 들면, 상기 병리 상태는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 전염 상태, 결핵(TB) 전염 상태, 광우병(BSE) 전염 상태 또는 환자가 치료 중인 치료 상태 등을 들 수 있다.
본 발명의 방법에서 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태는 질병 상태, 좋지 않은 예후 상태, 질병 회복 상태, 좋은 예후 상태 또는 건강한 상태를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 땀, 뇨, 혈액, 눈물, 타액, 기관지 폐포액, 종양 유출액, 정액, 양수 및 모유와 같은 체액으로부터 채취된 샘플을 사용할 수 있다.
샘플이 생물체인 경우 생물체는 동물과 식물을 포함하며 생물체는 사람과 같은 포유동물을 포함한다.
본 발명의 방법은 상기한 방법들의 조합을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드
폴리펩타이드는 그의 존재, 함량, 질량 또는 번호가 이미 결정된 적합한 폴리펩타이드일 수 있다.
상기한 결정은 단백질 또는 폴리펩타이드에 따라 공지의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 결정 방법의 예로서 질량분석법, 분광분석법, UV 흡광법 등을 들 수 있다.
콜레라 독소 B(CTB)는 GenBank 접근 번호 ABG56900.1호로 입수할 수 있다.
Annexin V는 GenBank 접근 번호 AAB40047.1 또는 AAB60648.1호로 입수할 수 있다.
폴리펩타이드는 테트라스파닌 단백질 (예를 들면 CD9, CD81, CD63) Rab GTPases (예를 들면 Rab 5a, Rab 5b 및 Rab 5c, Rab-27a 및 Rab-27b, Rab 35), LAMP (예를 들면 Lampl 및 Lamp2), 카베올린 (예를 들면 카베올린 1 및 카베올린 2), 트랜스퍼린 수용체 (TRFC), Clathrin Light Chain A (CLTA), Clathrin Light Chain B (CLTB), Clathrin Heavy Chain 1 (CLTC), TsglOl, Alix, PAI-1, PLGF, 프로칼시토닌, S-lOOb, TGF 베타 2 (TGFB2), TIMP1에서 선택된 것이다. 바람직하게는 CD9을 포함하는 폴리펩타이드이다.
CD9는 GenBank 접근 번호 NP_001760.1호의 폴리펩타이드를 포함한다 ; CD81은 GenBank 접근 번호 NP_004347.1호의 폴리펩타이드를 포함하고 ; CD63은 GenBank 접근 번호 NP_001771.1호의 폴리펩타이드를 포함하고; Rab5a는 GenBank 접근 번호 NP_004153.2호의 폴리펩타이드를 포함하고; Rab5b는 GenBank 접근 번호 NP_002859.1호의 폴리펩타이드를 포함하고 ; Rab5c는 GenBank 접근 번호 NP_004574.2호의 폴리펩타이드를 포함하고; Rab-27a는 GenBank 접근 번호 NP_004571.2호의 폴리펩타이드를 포함하고; Rab-27b는 GenBank 접근 번호 NP_004154.2호의 폴리펩타이드를 포함하고; Rab35는 GenBank 접근 번호 NP_006852.1호의 폴리펩타이드를 포함하고 ; Lampl은 GenBank 접근 번호 NP_005552.3호의 폴리펩타이드를 포함하고; Lamp2는 GenBank 접근 번호 NP_002285.1호의 폴리펩타이드를 포함하고; 카베올린1은 GenBank 접근 번호 NP_001744.2호의 폴리펩타이드를 포함하고; 카베올린2는 GenBank 접근 번호 NP_001224.1호의 폴리펩타이드를 포함하고 ; 트랜스퍼린 수용체(TFRC)는 GenBank 접근 번호 NP_001121620.1호의 폴리펩타이드를 포함하고 ; Clathrin Light Chain A (CLTA)는 GenBank 접근 번호 NP_001070145.1호의 폴리펩타이드를 포함하고 ; Clathrin Light Chain B (CLTB)는 GenBank 접근 번호 NP_001825.1호의 폴리펩타이드를 포함하고 ; Clathrin Heavy Chain 1 (CLTC)은 GenBank 접근 번호 NP_004850.1호의 폴리펩타이드를 포함하고 ; TsglOl은 GenBank 접근 번호 NP_006283.1호의 폴리펩타이드를 포함하고 ; Alix는 GenBank 접근 번호 NP_037506.2호의 폴리펩타이드를 포함하고; PAI-1은 GenBank 접근 번호 NP_000593.1호의 폴리펩타이드를 포함하고; PLGF는 GenBank 접근 번호 NP_002623.2호의 폴리펩타이드를 포함하고; 프로칼시토닌은 GenBank 접근 번호 NP_001029124.1호의 폴리펩타이드를 포함하고; S-100b는 GenBank 접근 번호 NP_006263.1호의 폴리펩타이드를 포함하고; TGF 베타2는 GenBank 접근 번호 NP_001129071.1호의 폴리펩타이드를 포함하고; 또한 TIMP1은 GenBank 접근 번호 NP_003245.1호의 폴리펩타이드를 포함한다.
따라서 본 발명자들은 마이크로입자 샘플 내에서 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 선별된 폴리펩타이드의 질량, 번호, 함량 등과 Annexin V 마이크로입자 내의 선별된 폴리펩타이드의 비교를 수행하는 단계를 포함하는 방법을 설명한다. 마이크로입자 샘플은 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내에서 또는 그로부터 입수할 수 있다.
폴리펩타이드의 조합
상기한 바와 같이, 단일 폴리펩타이드의 측정 대신에 둘 이상의 폴리펩타이드의 조합을 사용할 수 있다. 따라서 본 발명자들은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 샘플로부터 첫 번째 형태의 마이크로입자 내에서 검출된 폴리펩타이드의 질량, 번호, 함량과 두 번째 형태의 마이크로입자 내에서 검출된 폴리펩타이드의 질량, 번호, 함량을 비교하기 위해 둘 이상의 폴리펩타이드 조합을 선별하기 위한 방법을 설명하는 것이다. 이렇게 수립된 비율은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태의 표지로 사용할 수 있다.
예를 들면, PAI-1 , PLGF, 프로칼시토닌, S-100b, TGF 베타 2, TIMPl에서 선택된 둘 이상의 조합을 사용할 수 있다. 본 발명자들은 예를 들면 하기의 단백질 조합의 하나 또는 그 이상을 임신중독증 상태를 검출하기 위하여 사용할 수 있다; (a) PAI 1 및 PLGF; (b) PAI 1 및 프로칼시토닌; (c) PAI1 및 S100b; (d) PAI1 및 TGF 베타 2; (e) PAIl 및 TIMPl ; (f) PLGF 및 프로칼시토닌; (g) PLGF 및 S100b; (h) PLGF 및 TGF 베타 2; (i) PLGF 및 TIMPl ; (j) 프로칼시토닌 및 SlOOb; (k) 프로칼시토닌 및 TGF 베타 2; (1) 프로칼시토닌 및 TIMPl ; (m) S100b 및 TGF 베타 2; (n) S100b 및 TIMPl; 및 (o) TGF 베타 2 및 TIMPl.
폴리펩타이드 프로파일
본 발명의 방법은 선별된 다수의 폴리펩타이드 종에 따라 다수의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드의 비율을 포함하는 프로파일을 수립하는 단계를 포함할 수 있다. 프로파일 각각은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태의 표지가 될 수 있다. 다시 말하면 하나 이상의 폴리펩타이드 종을 사용할 수 있으며 예를 들면 하나 이상의 폴리펩타이드 종에서 수득된 비율을 들 수 있다.
GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드의 비율(또는 조합과 조합의 비율)이 참조되는 경우에 예를 들면 D9 폴리펩타이드는 첫 번째 상태에서 두 번째 상태보다 더욱 높을 수 있고 이는 첫 번째 상태가 두 번째 상태에 비해 통계학적으로 다른 비율을 지님을 의미하는 것으로 p 값은 <0.01인 경우이다. 이와 동일한 방법이 폴리펩타이드 조합의 양을 결정하는 경우에 적용될 수 있다.
일반화
본 발명의 방법은 일반화 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 단계는 서로 다른 샘플간에 하나 또는 그 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드의 함량 또는 농도를 동일하게 결정하거나 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
일반화 단계는 본 명세서 내에 설명된 방법 및 조성물에 적용하기 위하여 어느 두 개의 샘플간에 동일한 농도로 알려진 폴리펩타이드를 사용함으로써 완성될 수 있다.
따라서 본 명세서 내에서 설명하는 방법은 일반화 단계를 포함하는 것이다. 일반화 단계는 하나 또는 그 이상의 샘플 내에 특정 폴리펩타이드의 수준, 농도 또는 함량을 조정하는 단계를 포함한다. 일반화 단계는 일반화 단계 이전에 특정 폴리펩타이드의 수준, 농도 또는 함량이 실질적으로 서로 다른 둘 이상의 샘플 기반 위에서 수행될 수 있다. 일반화 단계는 따라서 둘 이상의 시료 내에서 특정 폴리펩타이드의 수준, 농도 또는 함량이 실질적으로 동일하게 하는 일반화 단계일 수 있는 것이다.
일반화 단계는 하나 또는 모든 샘플 내에 특정 폴리펩타이드의 수준, 농도 또는 함량을 증가시키거나 감소시키기 위해 하나 또는 둘 이상의 샘플을 희석시키거나 농축시키는 단계를 포함할 수 있다.
한편, 또는 덧붙여 일반화 단계는 둘 이상의 선별된 샘플을 위해 샘플간에 특정 폴리펩타이드의 수준, 농도 또는 함량의 비율을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 관심을 갖는 샘플 그룹 각각에 동일한 수준, 농도 또는 함량으로 알려진 폴리펩타이드를 참조 폴리펩타이드로 사용함으로써 성취될 수 있다. 참조 폴리펩타이드는 BNP, CD9 및 TIMP-l의 하나 이상을 포함할 수 있다.
일반화 단계는 이와 같은 비율의 결정, 샘플의 농축 또는 희석을 반드시 요구하지 않는 것임을 주의하기 바란다.
BNP 폴리펩타이드를 이용한 일반화
본 발명자들은 만성 심부전(CHF) 질환을 지닌 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 Annexin V 마이크로입자 내의 BNP 폴리펩타이드 수준은 만성 심부전을 지니지 않은 즉 건강한 개체의 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 BNP 폴리펩타이드 수준과 통계학적으로 차이가 없음을 확인하였다.
이와 유사하게 본 발명자들은 급성심근허혈(AMI) 질환을 지닌 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 Annexin V 마이크로입자 내의 BNP 폴리펩타이드 수준은 급성심근허혈을 지니지 않은 즉 건강한 개체의 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 BNP 폴리펩타이드 수준과 통계학적으로 차이가 없음을 확인하였다.
따라서 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 Annexin V 마이크로입자 내의 BNP 단백질 또는 폴리펩타이드의 수준, 농도 또는 함량은 예를 들면 CD9 수준과 같은 본 명세서 내의 방법에서 사용 가능한 다른 표지로 일반화하여 사용하여야 할 것이다. 이러한 일반화는 Annexin V 마이크로입자 또는 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 또는 이들 모두에 영향을 미칠 수 있다.
TIMP-1 및 CD9 폴리펩타이드를 사용한 일반화
본 발명자들은 만성 심부전(CHF) 질환을 지닌 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 TIMP-1 폴리펩타이드(GenBank 접근 번호 NP 003245.1호) 및 CD9 폴리펩타이드(GenBank 접근 번호 NP OO1760.1호) 수준은 만성 심부전을 지니지 않은 즉 건강한 개체의 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 TIMP-1 및 CD9 폴리펩타이드 수준과 통계학적으로 차이가 없음을 확인하였다.
이와 유사하게 본 발명자들은 급성심근허혈(AMI) 질환을 지닌 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 TIMP-1 폴리펩타이드(GenBank 접근 번호 NP 003245.1호) 및 CD9 폴리펩타이드(GenBank 접근 번호 NP OO1760.1호) 수준은 급성심근허혈을 지니지 않은 즉 건강한 개체의 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 TIMP-1 및 CD9 폴리펩타이드 수준과 통계학적으로 차이가 없음을 확인하였다.
따라서 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 TIMP-1 또는 CD9 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 이들 모두의 수준, 농도 또는 함량은 본 명세서 내의 방법에서 사용 가능한 다른 표지로 일반화하여 사용하여야 할 것이다. 이러한 일반화는 Annexin V 마이크로입자 또는 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 또는 이들 모두에 영향을 미칠 수 있다.
심혈관 질환 상태의 수립
본 발명자들은 심혈관 질환을 지니거나 심혈관 질환의 위험성이 있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율이 예를 들면 심혈관 질환을 지니지 않은 정상 또는 건강한 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 동일 기원의 CD9 비율, 예를 들면 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율 보다 더 높음을 확인하였다.
따라서 본 발명자들은 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체 더욱 바람직하게는 생물체의 심혈관 질환 상태를 수립하기 위한 방법을 설명한다. 따라서 상기 설명된 방법은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태를 건강한 상태와 심혈관 질환 상태로 구별할 수 있다. 이 경우 폴리펩타이드는 CD9을 포함한다. GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율은 건강한 상태에 비해 심혈관 질환 상태에 있어서 더 높게 나타나는 것이다. 상기 어떠한 조합도 가능하다.
본 발명의 방법은 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터 마이크로입자의 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9의 함량은 즉 GM1 갱글리오사이드를 포함하는 마이크로입자는 콜레라 독소 B(CTB)와의 결합성을 통해 수립될 수 있다. Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 함량은 즉 노출된 포스파티딜세린을 포함하는 마이크로입자는 Annexin V와의 결합성을 통해 수립될 수 있다. GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 함량과 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 함량간의 비율은 이때 확립할 수 있다. 이 비율을 심혈관 질환을 지니지 않는 건강한 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 함량과 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 함량간의 비율과 비교하는 것이다.
만약 정상 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터의 비율보다 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 비율이 더 높다면 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체는 심혈관 질환을 지니고 있거나 지닐 위험성이 매우 높은 것으로 판명되는 것이다.
만성 심부전(CHF) 상태의 수립
본 발명자들은 만성 심부전(CHF)을 지니거나 만성 심부전의 위험성이 있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율이 예를 들면 만성 심부전을 지니지 않은 정상 또는 건강한 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 동일 기원(cognate)의 CD9 비율, 예를 들면 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율 보다 더 높음을 확인하였다.
따라서 본 발명자들은 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체 더욱 바람직하게는 생물체의 만성 심부전 상태를 수립하기 위한 방법을 설명한다. 따라서 상기 설명된 방법은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태를 건강한 상태와 만성 심부전 상태로 구별할 수 있다. 이 경우 폴리펩타이드는 CD9을 포함한다. GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율은 건강한 상태에 비해 만성 심부전 상태에 있어서 더 높게 나타나는 것이다. 상기 어떠한 조합도 가능하다.
본 발명의 방법은 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터 마이크로입자의 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9의 함량은 즉 GM1 갱글리오사이드를 포함하는 마이크로입자는 콜레라 독소 B(CTB)와의 결합성을 통해 수립될 수 있다. Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 함량은 즉 노출된 포스파티딜세린을 포함하는 마이크로입자는 Annexin V와의 결합성을 통해 수립될 수 있다. GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 함량과 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 함량간의 비율은 이때 확립할 수 있다. 이 비율을 만성 심부전을 지니지 않는 건강한 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 함량과 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 함량간의 비율과 비교하는 것이다.
만약 정상 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터의 비율보다 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 비율이 더 높다면 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체는 만성 심부전(CHF)을 지니고 있거나 지닐 위험성이 매우 높은 것으로 판명되는 것이다.
급성심근허혈(AMI) 상태의 수립
본 발명자들은 급성심근허혈(AMI)을 지니거나 급성심근허혈의 위험성이 있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율이 예를 들면 급성심근허혈을 지니지 않은 정상 또는 건강한 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 동일 기원(cognate)의 CD9 비율, 예를 들면 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율 보다 더 높음을 확인하였다.
따라서 본 발명자들은 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체 더욱 바람직하게는 생물체의 급성심근허혈 상태를 수립하기 위한 방법을 설명한다. 따라서 상기 설명된 방법은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태를 건강한 상태와 급성심근허혈 상태로 구별할 수 있다. 이 경우 폴리펩타이드는 CD9을 포함한다. GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율은 건강한 상태에 비해 급성심근허혈 상태에 있어서 더 높게 나타나는 것이다. 상기 어떠한 조합도 가능하다.
본 발명의 방법은 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터 마이크로입자의 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9의 함량은 즉 GM1 갱글리오사이드를 포함하는 마이크로입자는 콜레라 독소 B(CTB)와의 결합성을 통해 수립될 수 있다. Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 함량은 즉 노출된 포스파티딜세린을 포함하는 마이크로입자는 Annexin V와의 결합성을 통해 수립될 수 있다. GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 함량과 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 함량간의 비율은 이때 확립할 수 있다. 이 비율을 급성심근허혈을 지니지 않는 건강한 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 함량과 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 함량간의 비율과 비교하는 것이다.
만약 정상 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터의 비율보다 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 비율이 더 높다면 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체는 급성심근허혈(AMI)을 지니고 있거나 지닐 위험성이 매우 높은 것으로 판명되는 것이다.
임신중독증 상태의 수립
본 발명자들은 임신중독증을 지니거나 임신중독증의 위험성이 있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율이 예를 들면 임신중독증을 지니지 않은 정상 또는 건강한 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 동일 기원(cognate)의 CD9 비율, 예를 들면 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율 보다 더 높음을 확인하였다.
따라서 본 발명자들은 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체 더욱 바람직하게는 생물체의 임신중독증 상태를 수립하기 위한 방법을 설명한다.
따라서 상기 설명된 방법은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태를 건강한 상태와 임신중독증 상태로 구별할 수 있다. 이 경우 폴리펩타이드는 PAI-1, PLGF, 프로-칼시토닌, S100b, TGF베타 또는 TIMP-1에서 선택된 것이다.
둘 이상의 상기 폴리펩타이드의 조합을 사용할 수 있다. 상기한 폴리펩타이드 조합은 PAI1 및 PLGF; PAI1 및 프로칼시토닌; PAI1 및 SlOOb; PAI1 및 TGF베타2; PAI1 및 TIMP1 ; PLGF 및 프로칼시토닌; PLGF 및 S100b; PLGF 및 TGF베타2; PLGF 및 TIMP1 ; 프로칼시토닌 및 SlOOb; 프로칼시토닌 및 TGF베타2; 프로칼시토닌 및 TIMP1 ; SlOOb 및 TGF베타2; 또는 SlOOb, TIMP1, TGF베타2 및 TIMP1에서 선택된 조합이다.
생물체는 예를 들면 임신한 사람과 같이 임신한 포유동물을 포함하는 임신한 생물체일 수 있다. 임신한 생물체는 첫 번째 트리메스터, 두 번째 트리메스터 또는 세 번째 트리메스터 일 수 있다.
GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율은 건강한 상태에 비해 임신중독증 상태에 있어서 더 높게 나타나는 것이다.
본 발명의 방법은 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터 마이크로입자의 샘플을 제공하는 단계를 포함한다.
GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 PAI-1, PLGF, 프로-칼시토닌, S100b, TGF베타 또는 TIMP-1의 함량 또는 이들의 조합인 PAI1 및 PLGF; PAI1 및 프로칼시토닌; PAI1 및 SlOOb; PAI1 및 TGF베타2; PAI1 및 TIMP1 ; PLGF 및 프로칼시토닌; PLGF 및 S100b; PLGF 및 TGF베타2; PLGF 및 TIMP1 ; 프로칼시토닌 및 SlOOb; 프로칼시토닌 및 TGF베타2; 프로칼시토닌 및 TIMP1 ; SlOOb 및 TGF베타2; 또는 SlOOb 및 TIMP1, TGF베타2 및 TIMP1의 함량은 즉 GM1 갱글리오사이드를 포함하는 마이크로입자는 콜레라 독소 B(CTB)와의 결합성을 통해 수립될 수 있다.
Annexin V 마이크로입자 내의 선별된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 조합의 함량은 즉 노출된 포스파티딜세린을 포함하는 마이크로입자는 바람직하게는 Annexin V와의 결합성을 통해 수립될 수 있다. GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 함량과 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 함량간의 비율은 이때 확립할 수 있다. 이 비율을 임신중독증을 지니지 않는 건강한 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 함량과 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 함량간의 비율과 비교하는 것이다.
만약 정상 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터의 비율보다 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 비율이 더 높다면 관심있는 세포, 조직, 기관 또는 생물체는 임신중독증을 지니고 있거나 지닐 위험성이 매우 높은 것으로 판명되는 것이다.
상태 변화의 모니터링
본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물에 따르면 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태의 다양한 변화를 모니터링하는데 사용할 수 있다.
따라서 본 발명자들은 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내에서 상태의 변화를 감지할 수 있는 방법을 설명한다. 상기 방법은 세포, 조직, 기관 또는 생물체 또는 이러한 비율을 포함하는 프로파일 내의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율의 변화를 감지하는 단계를 포함하는 것이다. 이와 같은 변화는 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태의 변화를 나타내는 표지로 사용할 수 있다.
이와 같은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태 변화는 생리학적 상태의 변화를 포함할 수 있다. 생리학적 상태는 분화(differentiation) 상태를 포함할 수 있으며, 다시 말하면 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율은 세포, 조직, 기관 또는 생물체가 분화 또는 비-분화 상태인지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 생리학적 상태는 발달 상태를 포함할 수 있다.
따라서 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율은 세포, 조직, 기관 또는 생물체가 배아 상태 또는 상태로부터 나온 것인지, 태아 상태로부터 나온 것인지, 신생아 상태로부터 나온 것인지, 유아 상태로부터 나온 것인지, 소아 상태로부터 나온 것인지, 토들러(toddler) 상태로부터 나온 것인지, 청소년 상태로부터 나온 것인지, 성인 상태로부터 나온 것인지 여부를 결정하는데 사용할 수 있다.
세포, 조직, 기관 또는 생물체의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율은 상태의 변화를 수립 모니터링 또는 감지하기 위해 적당한 시간 간격으로 모니터링하거나 트래킹될 수 있다.
세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태를 수립하거나 결정하기 위해 레퍼런스를 참조하는 경우 세포, 조직, 기관 또는 생물체가 위험성이 있는 전이 상태 또는 특정 상태로 진입하였는지 그 정도에 관계없이 그 자체로 상태를 수립하거나 결정할 수 있다는 것을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 다시 말하면 상태의 수립은 그 상태로 진입하는 가능성 또는 그 상태로 고통받는 경우를 포함하여야 한다.
병의 진단과 치료
본 발명자들은 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 병을 진단하는 방법을 설명한다. 상기 방법은 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터 샘플을 수득하는 단계를 포함하고, 상기한 바와 같이 샘플 위에서 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율과 이미 알려진 질병 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율을 비교하는 단계를 수행하는 것을 포함하는 것이다.
본 발명자들은 또한 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 치료 또는 예방 방법을 설명하며 상기 방법은 상기한 바와 같이 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 질병을 감지하는 단계를 포함하며 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 질병을 치료하기 위한 단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 방법은 뇨, 혈액, 눈물, 타액, 기관지 폐포액, 종양 유출액, 정액, 양수 및 모유와 같은 체액으로부터 채취된 샘플을 사용할 수 있다.
본 방법은 마이크로비시클, 엑소좀, 엑토좀 또는 아폽토트 바디를 포함하는 마이크로입자인 것이다.
마이크로입자
마이크로입자는 특히 마이크로비시클과 같은 비시클을 포함할 수 있다. 마이크로입자는 엑소좀을 포함할 수 있다.
마이크로입자는 비시클을 포함하거나 지질 이중층에 의해 제한되는 편평화된 스피어를 포함할 수 있다. 마이크로입자는 40∼100nm 직경을 지닌다. 마이크로입자는 엔도솜 막에 내부로 버딩(budding)한 형태일 수 있다. 마이크로입자는 1.13∼1.19 g/ml의 밀도를 지니고 수크로스 구배 위에 부유될 수 있다. 마이크로입자는 콜레스테롤과 스핑고마이에린이 풍부하고 GM1, GM3와 같은 지질 래프트 표지, 플로틸린(flotillin)과 src 단백질 키나제 Lyn을 포함할 수 있다.
마이크로입자를 분리하기 위한 방법은 이미 공지되어 있으며 상세하게는 하기 실시예에 기재되어 있다. 또한 국제 특허 공보 WO 2009/105044호에도 개시되어 있다.
본 발명자들은 특히 혈장에서 발견되는 서로 다른 지질 마이크로입자를 신속히 분리하기 위한 기술을 설명하며 이를 통해 진단, 예측 또는 치료용 목적을 증진시키기 위해 서로 다른 마이크로입자의 생물학적 표지를 확인하거나 결정하는데 사용할 수 있다.
따라서 본 발명자들은 마이크로입자를 포함하는 샘플을 처리하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) GM1 갱글리오사이드를 포함하는 샘플 내에서 마이크로입자를 선별하는 단계; 및/또는 (b) 노출된 포스파티딜세린을 포함하는 샘플 내에서 마이크로입자를 선별하는 단계;를 포함한다.
상기 방법은 단계(a)에서 콜레라 독소 서브유니트 B(CTB)에 결합된 샘플 내의 마이크로입자를 선별하는 단계를 포함할 수 있고, 단계 (b)에서 Annexin V에 결합하거나 또는 모두에 결합하는 마이크로입자를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들면 크기 배제 크로마토그래피에 의해 크기에 따라 마이크로입자를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 CD9+ 마이크로입자를 포함하는 마이크로입자일 수 있다.
더욱 상세하게는 본 발명자들은 마이크로입자-관련된 단백질의 검출을 위해 혈장으로부터 지질 마이크로입자의 Annexin V 및 CTB-결합 부분 획분을 신속히 분리하는 방법을 제공한다. 지질 마이크로입자에서 Annexin V와 CTB 결합 부분 획분을 신속히 분리하기 위한 방법은 알려진 질병의 생물학적 표지로 직접 사용할 수 있으며 더욱 분리된 혈장 부분 획분을 통해 질병의 진단, 예측 또는 치료 방법에 대한 수단으로 사용할 수 있다.
본 발명자들은 마이크로입자를 포함하는 샘플을 분획화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 Annexin V 마이크로입자 부분 획분 또는 CTB-결합 마이크로입자 부분 획분 또는 그들 모두로 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 상기한 방법을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 방법은 막 단백질 또는 루미널 단백질 또는 이들 모두를 마이크로입자의 분획화된 샘플 내에서 검출 또는 정량화하기 위한 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명자들은 마이크로입자의 정제된 샘플을 제공한다. 샘플 내에는 (a) 샘플 내의 모든 입자는 실질적으로 콜레라 독소 B(CTB)에 결합될 수 있으나 Annexin V에는 결합되지 않으며; 또는 (b) 샘플 내의 모든 마이크로입자는 실질적으로 Annexin V에 결합될 수 있으나 콜레라 독소 B(CTB)에는 결합되지 않을 수 있는 것이다.
병리적 상태의 모니터링
세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태는 질병 상태와 같은 병리적 상태를 포함할 수 있다. 따라서 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 병리적 상태 또는 정상 상태에서 병리적 상태로의 변화 등을 모니터링하는데 사용할 수 있다.
GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율은 세포, 조직, 기관 또는 생물체가 정상 상태(질병이 없는 상태) 또는 질병 상태 에 있는 지를 감지하는데 사용할 수 있다. 또한 이는 세포, 조직, 기관 또는 생물체가 정상 상태로부터 질병 상태로의 진전을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 이는 세포, 조직, 기관 또는 생물체가 질병 상태에 있음을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 질병은 세포, 조직, 기관 또는 생물체가 현재 고통받고 있는 다양한 질병 또는 고통받을 수 있는 다양한 질병을 포함한다.
일반적으로 비대심장근육병, 세균심내막염, 뇌이랑결여증(agyria), 근위축측삭경화증, 현기증, 팔로증후군, 심근염, 알코올중독, 빈혈, 팔신경얼기(brachial plexus), 신경장해, 치질, 선천성 심장병, 원형탈모증, 겸상 적혈구증, 승모판탈출증, 자율 신경 질환, 기형, 알츠하이머병, 협심증, 직장 질환 또는 우심실 심근병증 등을 들 수 있다.
질병 상태는 심실 이형증, 여드름장미증, 약시, 강직성 척추염, 심방세동, 심장압박증, 후천성 면역결핍 증후군, 아밀로이드증. 식욕부진, 불안, 자폐증, 뇌 종양, 중추신경계질환, 색맹, 동맥경화, 요통, 유방 질환, 중추신경계 감염증, 직장 종양, 관절염, 베체트증후군, 유방 종양, 뇌성마비, 감기, 천식, 조울증, 화상 또는 자궁암 등을 들 수 있다.
질병 상태는 언어 장애, 죽상동맥경화증, 실명, 칸디다증, 샤르코-마리-투스 병, 크론 병, 주의력결핍장애, 뇌손상, 백내장, 궤양성 대장염, 누적 트라우마, 낭포성 섬유증, 발달장애, 식이장애, 단독(erysipelas), 섬유근육통, 욕창, 당뇨병, 폐기종, 대장균 감염증, 모낭염, 연하장애(deglutition disorders), 당뇨성 족부 질환 또는 뇌염 등을 들 수 있다.
또한 질병 상태는 식도 질환, 음식 과민증, 치매, 다운 증후군, 일본 뇌염, 안구 종양, 식중독, 뎅기열, 난독증, 자궁 내막증, 파브리 병, 위장염, 우울증, 근육 긴장 이상, 간질, 만성 피로 증후군, 역류성 식도염, 고셔병 질환, 혈액 질환, 히르슈슈프룽병(hirschsprung disease), 뇌수종, 갑상선 기능 항진증, 치은염, 혈우병, 조직구 증식증, 다한증, 저혈당, 녹내장, 간염 및 에이즈 감염 등을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 질병 상태는 인간 HIV 바이러스에 감염된 상태, 결핵(TB) 감염 상태, 광우병(BSE) 감염 상태 또는 치료 상태일 수 있다. 또한 환자는 치료 중일 수 있다.
질병 상태는 고옥살산뇨증, 갑상선 기능 저하증, 글리코겐 저장 질환, 간렌즈핵변성(hepatolenticular degeneration), 호지킨 병, 과민성, 면역 결핍 증후군, 두통, 탈장, 홀트-오람 증후군, 고혈압, 발기 부전, 울혈성 심부전, 음부포진, 헌팅턴 병, 폐 고혈압, 요실금, 불임, 백혈병, 전신성 홍반성 루푸스, 마두라진균증(maduromycosis), 정신 지체, 염증, 간 종양, 라임 병, 말라리아 또는 선천성 대사 등을 들 수 있다.
질병 상태는 염증성 장 질환, 긴 QT 증후군, 림프관근종증, 홍역, 편두통, 유행성 감기, 요통, 부종, 흑색종, 구강 이상, 라텍스 알레르기, 폐쇄성 폐 질환, 림프종, 수막염, 뮤코다당질축적증 또는 나병 등을 들 수 있다.
질병 상태는 폐 종양, 황반 변성, 폐경, 다발성 경화증, 근 위축증, 근막 통증 증후군, 관절염, 췌장 종양, 소화성 궤양, 중증 근무력증, 메스꺼움, 골다공증, 공황 장애, 걸프전 증후군, 골수종, 청신경종, 중이염, 하반신 마비, 페닐 케톤뇨증, 골수 증식성 질환, 안진(nystagmus), 난소 종양 또는 파킨슨 질환 등을 들 수 있다.
질병 상태는 갈색 세포종, 심근 질환, 기회 감염, 통증, 주변부 포도막염, 공포증 질환, 심근 경색, 유전성 시신경 위축, 췌장 질환, 이 기생증(pediculosis), 흑사병, 옻 중독, 프리온 질환, 반사 교감신경 영양장애, 정신분열증, 수줍음, 소아마비, 전립선 질환, 호흡기 질환, 피부 경화증, 쇼그렌 증후군이나 류마티스성 다발성 근육통 등을 들 수 있다.
질병 상태는 전립선 종양, 불안, 척추 측만증, 피부 질환, 척수회백질염후성 증후군, 건선, 망막 질환, 괴혈병, 피부 종양, 전암 상태(precancerous conditions), 광견병, 망막 모세포종, 성기능 장애, 수면 장애, 임신, 희귀질환, 유육종증, 성병, 경련성 사경 또는 척수 상해 등을 들 수 있다.
또한 질병 상태는 말더듬, 고환 종양, 발모, 요로 감염, 척추후궁미봉증, 물질 관련 장애, 지중해 빈혈(thalassemia), 삼차 신경통, 비뇨생식기 질환, 척수 소뇌 변성, 유아 돌연사, 혈전증, 결핵, 혈관 질환, 사시, 자살, 이명, 결절성 경화증, 바이러스 질환, 외상후 스트레스 장애, 척수공동증, 뚜렛 증후군, 터너 증후군 또는 시력 장애 등을 들 수 있다.
또한 질병 상태는 심리적 스트레스, 악관절 장애 증후군, 트라코마, 요실금, 구토, 폰 빌레브란트 병, 신장 골이영양증, 세균 감염, 소화기계 질환, 악성신생물, 골수 종양, 외음부 질환, 자궁외 임신, 진드기 매개 질환, 마르팡 증후군, 노화, 윌리엄스 증후군, 혈관신생 인자, 두드러기, 패혈증, 흡수장애 증후군 또는 상처와 부상 등을 들 수 있다.
또한 질병 상태는 뇌혈관 사고, 화학물질 과민증, 현기증, 수신증, 황열, 신경성 관절염, 간실질세포 암, 다형성 선종, 바터 팽대부(vater's ampulla), 메켈 게실(diverticulum), 원추각막 피부증, 사마귀, 새집 증후군, 비뇨기계 질환, 허혈성 시신경병증, 담관 결석, 이비인후과 질환, 고도 대정맥 증후군, 정맥두염, 반경 골절, 변형성 골염, 융모성 종양, 연골 또는 리딩 및 경동맥 협착증 등을 들 수 있다.
또한 질병 상태는 정맥류, 크로이츠 펠트-야콥 증후군, 담낭 질환, 관절 이식, 백반증, 코 질환, 환경성 질병, 거대 결장증, 폐렴, 전정 질환, 크립토코쿠스증, 대상포진, 난관 종양, 감염, 부정맥, 포도당 불내성증, 신경 내분비계 종양, 옴 등을 들 수 있다.
또한 질병 상태는 알코올성 간염, 기생충 질환, 난관염, 효모균성 뇌막염, 두개골 내 동맥류, 슬픔, 결석, 색소 모반, 직장 신생물, 진균, 혈관종, 대장 종양, 석회화, 신장 종양, 비타민, 유암종, 만성소화장애, 뇌하수체 질환, 뇌사, 담도 질환이나 전립선염 등을 들 수 있다.
또한 질병 상태는 의원성 질환, 위장관 출혈, 선암, 독성 거대결장증, 수족절단 수술피험자(amputees), 지루성 각화증, 골수염, 바렛 식도, 출혈, 위장 종양, 수두, 담낭염 또는 척삭종 등을 들 수 있다.
또한 질병 상태는 세균 감염과 진균, 부갑상선 종양, 정삭염전증, 선종, 편평 태선, 항문선종양, 지방종, 족부 백선, 알코올성 간질환, 신경섬유종증, 림프 질환, 노인 학대, 습진, 게실염, 암, 췌장염, 아메바증, 임신 합병증 , 신우신염, 전염성 단핵구증 또는 동맥류 등을 들 수 있다.
질병 상태는 예를 들면 임신부와 같은 임신한 생물체 내의 임신중독증일 수 있다. 임신한 생물체는 첫 번째 트리메스터, 두 번째 트리메스터 또는 세 번째 트리메스터 일 수 있다. 샘플은 임신부의 세 번째 트리메스터에 채취하고 예를 들면 그녀가 임신중독증 상태인지 또는 임신중독증 위험성이 있는지 여부를 확립하기 위해 본 문헌에서 설명한 바와 같은 분석 방법을 행한다.
특히 질병 상태는 당뇨병, 면역 장애, 퇴화성 신경 장애 또는 암 또는 종양인 경우를 포함할 수 있다. 따라서 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율을 세포, 조직, 기관 또는 생물체가 고통받고 있는 질병, 또는 고통받을 가능성이 높은 상기 목록의 어느 하나의 질병 상태인지 여부를 모니터링하는데 사용할 수 있다.
회복 모니터링
CD9 혈장 수준을 포함하는 단백질 수준은 하나의 단일 개체에서 예를 들면 식중독과 같은 질환을 지닌 환자에서 환자의 상해, 회복 및 기저선을 모니터링하기 위해 두 개의 서로 다른 마이크로입자 빈도(예를 들면 Annexin V와 CTB 결합 부분 획분) 내에서 모니터링할 수 있다.
하나의 집단에서 CD9 수준은 조직의 손상을 나타낼 수 있다. 반면 다른 한편으로는 CD9의 수준은 조직의 재생을 나타낼 수 있다. 두 개의 집단 간의 상대적 수준을 측정함으로써 환자가 조직 손상 예를 들면 질병 또는 좋지 않은 예후 상태에 있는지 여부를 결정할 수 있으며 조직 재생 예를 들면 회복 또는 좋은 예후 상태가 시작되거나 이미 건강한 상태인지 여부도 결정할 수 있다.
GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율을 환자의 예후의 표지로 사용할 수 있다.
생물학적 샘플
본 명세서 내에서 설명하고 있는 방법과 조성물은 상태를 모니터링하기 위해 세포로부터 분비되는 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율을 포함할 수 있다. 편리하게는 상기 비율은 세포의 분비를 포함하는 생물학적 샘플에 의해 결정될 수 있다.
이때 세포는 생물체 내의 것일 수 있으며 샘플은 다수의 물건을 포함할 수 있고 이는 혈액, 코 분비물, 뇨, 혈청, 림프, 타액, 항문 및 질 분비액, 땀과 정액과 같은 체액을 포함할 수 있으며 이에 한정하는 것은 아니다.
마이크로입자의 제조
CTB 또는 Annexin V 결합 마이크로입자는 다음 프로토콜을 사용하여 혈장 또는 다른 체액으로부터 제조될 수 있다.
10㎕ 혈장을 100㎕의 PBS pH 7.4에 녹인 0.1㎍의 비오틴화 콜레라 독소 서브유니트 B(CTB)(SBL 백신 AB) 또는 0.1㎍의 비오틴화 Annexin V(AV)(비오비젼)와 함께 37℃에서 800rpm으로 한시간 교반하면서 인큐베이션 시켰다. 이때 100㎕의 Dynabeads® M-280 스트렙트아비딘(Invitrogen)을 100㎕의 PBS로 3회 세척시킨다. 마지막 세척 후에 혈장-CTB 또는 혈장-AV 반응 혼합물을 세척된 비드에 첨가하고 800rpm으로 30분간 교반하면서 인큐베이션 시켰다. 비드를 마그넷으로 고착화시킨 후 상등액을 제거하였다. 비드는 200㎕의 PBS로 3회 세척하고 마그넷으로 비드를 고착화시킨 후 세척액을 제거하였다.
GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율
GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율은 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드 함량과 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드 함량의 비율을 간단히 계산함으로써 수득한다.
한편으로는 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드 함량이 세포 상태의 변화에 따라 변화할 수 있기 때문에 세포 상태에 따라 변화하지 않는 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드 함량을 내부 대조군으로 사용할 수 있다.
따라서, GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율의 변화를 모니터링함으로써 즉 두 번째 비율에 대한 첫 번째 비율의 비율을 모니터링 목적으로 사용할 수 있는 것이다. 본 명세서 내에서는 첫 번째 비율을 세포의 상태에 따라 변화되는 결과로서의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율을 사용하고 두 번째 비율을 세포의 상태에 따라 변화되지 않는 알려진 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율로 사용한다.
GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율 프로파일
한편 덧붙여 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율을 결정하기 위해서 다수의 선별된 폴리펩타이드를 위해 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 다수의 비율을 포함하는 프로파일을 세포의 상태를 나타내는 각각의 표지로 수립할 수 있다. 이러한 프로파일의 변화는 세포의 상태를 모니터링하기 위한 수단으로 사용할 수 있다. 프로파일은 이미 알려진 공지의 방법으로 수립할 수 있으며 예를 들면 다수의 선별된 폴리펩타이드 종 간의 결합 및 구별 가능한 다수의 결합제를 포함하는 어레이를 통한 혼성화 방법과 같은 기술을 사용할 수 있다.
실시예
(실시예 1) 정상 개체의 혈청으로부터 CD9+ 마이크로입자의 채취
본 명세서 내에서 본 발명자들은 혈청 내의 CTB와 CD9+ 마이크로입자가 결합할지 여부를 우선 결정하였다. CTB-결합 CD9이 존재하지 않았기 때문에 본 발명자들은 수크로스 밀도 구배 내에서 혈청 CD9 마이크로입자의 침강 덴시티를 결정하고 혈청 내의 CD9은 엑소좀 내의 침강 덴시티보다 더 높은 침강 덴시티를 지님을 발견하였다.
CTB 결합의 결여 및 높은 침강 덴시티는 CD9+ 마이크로입자가 아폽토트 바디임을 암시한다. 이는 혈청 CD0이 Annexin V와 결합함을 통해 확인하였다.
(실시예 2) 재료 및 방법 - 크기 배제 크로마토그래피
2ml의 Sepharose ® 2B 수지(Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 2B300)를 스핀 컬럼(Bio-Rad, 카탈로그 번호 732-6008)에 피펫으로 충전시키고 800g에서 1분간 스핀시킨다. 상등액을 제거하고 1ml 인산염 완충액(PBS)을 가하여 세척시킨 후 800g에서 1분간 스핀시킨다. 1ml의 인간 혈청을 적하시키고 컬럼을 800g에서 1분간 스핀시킨다.
통과된 유체를 집적하고 이 단계를 1ml PBS를 각각 사용하여 3회 반복한다. 3개의 세척 분획을 수득하고 20㎕의 각각의 분획을 4∼12% SDS/폴리아크릴아미드 겔 상에 전개시킨다. 겔을 SilverQuest™ Silver Staining Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 염색시키거나 니트로셀룰로스 막 위에 전기 블로팅시킨다. 1:50 희석 마우스 항-인간 CD9 항체 또는 1:1250 희석 HRP-콘쥬게이트 당나귀 항-마우스 IgG 항체를 이용하여 멤브레인에 프로브를 부착시킨다.
모든 항체는 Santa Cruz로부터 구입하였으며 결합된 항체는 HRP-증진된 화학발광 기질(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)로 시각화하였으며 엑스레이 필름에 노출시켰다.
(실시예 3) 재료 및 방법 - 콜레라 독소 B 친화성 크로마토그래피
크기배제 크로마토그래피를 통과한 200㎕의 혈청액을 100㎕ PBS pH 7.4 내의 0.1㎍ 비오틴화 콜레라 독소 서브유니트 B(CTB)(Invitrogen)와 함께 실온에서 800rpm으로 흔들면서 한시간 인큐베이션시켰다. 100㎕의 Dynabeads® M-280 Streptavidin(Invitrogen)을 100㎕ PBS로 세차례 세척시킨 후 반응 혼합물을 첨가하고 800rpm으로 30분간 흔들면서 인큐베이션시켰다.
비드를 마그넷으로 고착화시킨 후 상등액 또는 결합되지 않은 획분을 제거한다. 비드를 100㎕ PBS로 세차례 세척시킨 후 비드와 마그넷이 고착화된 후에 세척액을 제거한다. 비드를 100㎕의 변성/환원 SDS-PAGE 로딩 완충액 내에서 보일링시킨 후 남아있는 결합단백질을 용출시킨다. 결합되지 않은 분획 세척물 용출액과 결합된 분획의 각각의 양을 4∼12% SDS-폴리아미드 겔 상에 전개시킨다.
겔을 염색시키거나 니트로셀룰로스 막 위에 전기 블로팅시킨다. 1:50 희석 마우스 항-인간 CD9 항체 또는 1:1250 희석 HRP-콘쥬게이트 당나귀 항-마우스 IgG 항체를 이용하여 멤브레인에 프로브를 부착시킨다. 모든 항체는 Santa Cruz로부터 구입하였으며 결합된 항체는 HRP-증진된 화학발광 기질(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)로 시각화하였으며 엑스레이 필름에 노출시켰다.
(실시예 4) 재료 및 방법 - 수크로스 구배
농도 22.8%로부터 60% 까지의 14개의 수크로스 용액을 준비하고 초원심분리 튜브(Beckman Coulter Inc., CA) 내에서 가장 농축된 용액으로부터 시작하여 연속적 층으로 제조하였다. 500㎕의 인간 혈청을 상부로부터 적가시킨 후 SW60Ti rotor (Beckman Coulter Inc.)를 이용하여 4℃에서 200,000g로 16.5시간 초원심분리 시켰다. 원심분리 후에 320㎕의 13개 분획을 구배의 상부로부터 수득한다.
각각의 분획의 밀도는 고정된 양을 측정함으로써 결정한다. 20㎕의 분획을 4∼12% SDS-폴리아미드 겔 상에 전개시킨다. 겔을 SilverQuest™ Silver Staining Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 염색시키거나 니트로셀룰로스 막 위에 전기 블로팅시킨다. 1:50 희석 마우스 항-인간 CD9 항체 또는 1:1250 희석 HRP-콘쥬게이트 당나귀 항-마우스 IgG 항체를 이용하여 멤브레인에 프로브를 부착시킨다. 모든 항체는 Santa Cruz로부터 구입하였다.
결합된 항체는 HRP-증진된 화학발광 기질(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)로 시각화하였으며 엑스레이 필름에 노출시켰다. 수크로스 구배로부터 수득된 획분 9 내지 13을 모으고 pH 7.4 PBS로 하룻밤 투석시킨다. 모은 획분의 20㎕로 농축시켰다.
(실시예 5) 재료 및 방법 - Annexin V 친화성 크로마토그래피
20㎕의 수크로스 구배로부터 수득된 모아진 획분을 20㎕의 5× Annexin V 결합 완충액(Calbiochem)과 혼합시킨 후 물에 녹여 최종 부피를 100㎕로 만들었다. 90㎕의 모아진 획분 샘플을 10㎕의 Annexin V와 함께 실온에서 800rpm으로 흔들면서 한시간 인큐베이션시켰다.
100㎕의 Dynabeads® M-280 Streptavidin(Invitrogen)을 100㎕ PBS로 세차례 세척시킨 후 반응 혼합물을 첨가하고 800rpm으로 30분간 흔들면서 인큐베이션시켰다. 비드를 마그넷으로 고착화시킨 후 상등액 또는 결합되지 않은 획분을 제거한다. 비드를 100㎕ PBS로 세차례 세척시킨 후 비드와 마그넷이 고착화된 후에 세척액을 제거한다.
비드를 100㎕의 변성/환원 SDS-PAGE 로딩 완충액 내에서 보일링시킨 후 남아있는 결합단백질을 용출시킨다. 결합되지 않은 분획 세척물 용출액과 결합된 분획의 각각의 양을 4∼12% SDS-폴리아미드 겔 상에 전개시킨다. 겔을 염색시키거나 니트로셀룰로스 막 위에 전기 블로팅시킨다.
1:50 희석 마우스 항-인간 CD9 항체 또는 1:1250 희석 HRP-콘쥬게이트 당나귀 항-마우스 IgG 항체를 이용하여 멤브레인에 프로브를 부착시킨다. 모든 항체는 Santa Cruz로부터 구입하였다.
결합된 항체는 HRP-증진된 화학발광 기질(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)로 시각화하였으며 엑스레이 필름에 노출시켰다.
(실시예 6) Annexin V에 결합하나 CTB에 결합하지 않는 건강한 개체의 혈청 내 CD9
건강한 개체의 혈청 내에 CD9+ 마이크로입자가 존재하는지 여부를 결정하기 위해 혈청을 우선 큰 입자를 풍부히 지닌 크기로 분획화하였으며 알부민과 같은 작은 혈청단백질은 제거하였다. 분획화된 혈청을 CTB로 인큐베이션시켜 혈청 내의 CD9이 Annexin V 또는 CTB와 결합되어 있는지를 결정한다.
(실시예 7) 결과 - 큰 CD9+ 마이크로입자가 CTB에 의해 건강한 개체의 혈청 내에 존재한다
결과를 도 1에 나타내었다. 혈청의 크기 분별화를 통해 유출액 내의 CD9이 풍부함을 확인하였으며 세척액 1 획분은 CD9의 작은 단백질이 큰 복합체와 관련되어 있음을 암시하는 것이다.
(실시예 8) 결과 - CD9+ 마이크로입자는 CTB와 결합하지 않는다
결과를 도 2의 상부 패널에 나타내었다. 대부분의 단백질은 CD9(하부 패널)에 포함된 CTB에 결합되지 않았다. 따라서 건강한 개체의 혈청 내의 CD9 마이크로입자는 CTB와 결합하지 않으며 GM1 갱글리오사이드를 지니지 않는다. 건강한 개체의 혈청 내의 CD9+ 마이크로입자는 엑소좀이 아니다.
(실시예 9) 결과 - CD9+ 마이크로입자는 높은 침강 덴시티를 지닌다
결과를 도 3에 나타내었다. 건강한 개체의 혈청 내의 CD9+ 마이크로입자의 형태를 확인하기 위하여 혈청을 수크로스 밀도 구배를 사용하여 분별하였으며 그 획분을 SDS/PAGE 및 웨스턴블롯 혼성화를 통해 분석하였다. CD9+ 마이크로입자는 1.181∼1.226 g/ml의 밀도 내에서 침강하였다. 이 밀도는 아폽토틱 바디의 예상되는 밀도이었으며 1.13∼1.19 g/ml인 엑소좀의 밀도는 아니었다(Thery, Ostrowski et al. 2009).
(실시예 10) 결과 - 건강한 개체의 혈청 내의 CD9+ 마이크로입자는 Annexin V와 결합한다
결과를 도 4에 나타내었다. CD9+ 마이크로입자의 일부가 아폽토틱 바디임을 확인하기 위하여 본 발명자들은 마이크로입자가 Annexin V와 결합하는지 여부를 측정하였다. 농후한 CD9+ 마이크로입자의 일부는 모두가 Annexin V에 결합하지는 않았으나 10배의 결합된 획분이 겔 위에 적가되었을 때 결합된 CD9을 검출할 수 있었다.
(실시예 11) 결론
건강한 개체의 혈청은 CD9+ 마이크로입자를 포함한다. 그러나 이 마이크로입자는 엑소좀으로부터의 것이 아니며 오직 극소량의 마이크로입자만이 엑소좀으로부터의 것이다. 이들 마이크로입자는 CTB와 결합하지 않으며 따라서 GM1 갱글리오사이드를 지니지 않거나 매우 소량 지니며 지질 래프트 내에 매우 풍부한 지질을 지니지 않는다. 이는 엑소좀 멤브레인의 홀마크특징이다.
더욱이 이 입자들은 수크로스 내 밀도1.181-1.226 g/ml에서 대부분 침강되었으며 엑소좀의 밀도인 1.13-1.19 g/ml에서는 침강되지 않았다. 이는 노출된 PS를 지닌 아폽토틱바디가 상당한 부분을 차지하는 것으로 여겨진다. 남은 마이크로입자는 아폽토틱바디일 수 있으나 확인되지 않았다. 건강한 개체로부터의 혈청 내 CTB-결합 CD9+ 마이크로입자는 낮은 수준을 나타내었으며 이러한 마이크로입자의 수준의 증가는 혈청 내 CTB-결합 CD9+ 마이크로입자로부터 유래된 질병 또는 질병의 감수성 증가에 대한 생물학적 표지로 사용할 수 있는 것이다.
엑소좀이 뉴런과 면역 세포 내에서 세포간 커뮤니케이션을 위해 전달물질을 분비한다(Smalheiser 2007; Thery, Ostrowski et al. 2009). 또한 단백질과 관련된 많은 질병이 엑소좀의 분비에 관련되어 있다고 보고되고 있으며 특히 알츠하이머 병의 베타아밀로이드 펩타이드를 예를 들 수 있다(Rajendran, Honsho et al. 2006). 결핵균에 감연된 J774 세포 내의 마이코박테리아 단백질(Giri, Kruh et al. 2010), 종양 항원(Taylor and Gercel-Taylor 2005), 건강한 개체의 혈청 내의 CTB-결합 CD9+ 마이크로입의 낮은 베이스라인의 관찰은 상대적으로 건강함을 나타내는 표지로 사용할 수 있는 것이며 상기 베이스라인의 증가는 질병, 손상된 질병 또는 조직 복구를 위한 세포 신호전달의 증가를 나타내는 표지로 사용할 수 있는 것이다.
입자의 대중화 분석은 병의 진단 또는 예후의 판단을 위한 생물학적 표지로 사용할 가능성을 증진시킨다.
(실시예 12) 혈장 내 지질 마이크로비시클과 MSC-조절화 배지간의 차이
재료 및 방법
Myc-형질전환된 ES-유래 MSC 라인 (Myc-HuES9.El)을 통해 조절화(conditioned)된 배양 배지와 혈장을 수크로스 밀도 구배 위에 적하시킨다. 구배는 23%로부터 60% (w/v)까지의 농도를 지닌 14개의 수크로스 용액 층으로 제조한다.
샘플을 적하시킨 후 구배를 4℃에서 200,000g로 18시간 초원심분리시킨다. 구배는 상부로부터 13개의 획분을 제거시킨다. 각각의 획분의 밀도는 각각 획분 100㎕를 채취한 후 무게를 측정함으로써 결정하였다. 각각의 획분 내의 Annexin V 결합 마이크로비시클내의 CD9+과 CTB-결합 마이크로비시클내의 CD9+ 상대 수준을 측정하였다.
결과
도 5를 참조하시오. 혈장 내의 CD9+ 마이크로비시클은 Annexin V 결합이 우세하였다. 반면 MSC-컨디션화 배지에서는 콜레라 독소 B-사슬(CTB) 결합이 우세하였다.
혈장 내 CTB-결합 마이크로비시클은 두 개의 서로 다른 수크로스 밀도 1.21-1.59 및 >1.173 g/ml에서 부유(float)하였으며 한편 CTB-결합 마이크로비시클은 예를 들면 1.065-1.191 g/ml의 하나의 밀도에서 부유하였다. 참조 : 혈장 및 MSC-컨디션화 배지 내의 CD81+ 마이크로비시클은 CD9+ 마이크로비시클과 동일한 분포 프로파일을 나타내었다.
(실시예 13) 심장질환 환자 및 건강한 개체의 혈장 내 Annexin V-결합 마이크로비시클과 CTB-결합 마이크로비시클의 단백질 분포
재료 및 방법
도 6a 및 도 6b를 참조하시오. 건강한 개체 (H)와 심장 질환자 (D)로부터의 혈장을 비오틴화 Annexin V(도 6a) 또는 콜레라 독소 B(도 6b)와 함께 인큐베이션시켰다. Annexin V 또는 콜레라 독소 B와 결합하는 마이크로비시클을 스트렙아비딘-콘쥬게이트 자기 비드와 함께 추출하였다. 분리된 마이크로비시클 내의 단백질을 ELISA 내에서 특이 항체를 이용하여 분석하였다.
결과
Annexin V-결합 및 CTb-결합 혈장 마이크로비시클 내의 약간의 단백질은 건강한 개체와 심장 질환자 간에 서로 다른 분포를 나타내었다.
CTB-결합이 아닌 Annexin V 결합 혈장 마이크로비시클 내의 CD9, CD81 및 TIMP 1은 건강한 개체보다 환자에게서 유의미하게 높게 나타났다.
Annexin V 결합이 아닌 CTB-결합 혈장 마이크로비시클 내의 ANP는 건강한 개체보다 환자에게서 유의미하게 높게 나타났다.
다른 단백질들은 만약 개체의 수가 더욱 커지고 질병이 더욱 좁게 한정된다면 환자와 건강한 개체간의 두 형태의 마이크로비시클의 분포는 유의미하도록 상이하게 나타났다.
심장 질환자와 건강한 개체간의 혈장 내에서 얻어진 사용 가능한 다른 생물학적 표지는 BNP, 엔도텔린, 레닌, 안지오텐신 II, 트로포닌, 마이오신, IL6, IL1, IL10, TNFα, TGFβ를 들 수 있다.
(실시예 14) 만성 심부전(CHF) 및 급성심근허혈(AMI) 환자 및 건강한 개체의 혈장 내 Annexin V-결합 마이크로비시클과 CTB-결합 마이크로비시클의 단백질 분포
획분화된 혈장 마이크로비시클을 생물학적 표지 분석을 위해 그 사용가능성 및 가치를 평가하기 위해 본 발명자들은 혈장 샘플로부터 이 기술을 더욱 세분화된 환자 집단에 적용하였다. 만성 심부전(CHF)과 급성심근허혈(AMI) 환자였다. 대조군은 건강한 개체로부터의 혈장을 사용하였다(도 7).
재료 및 방법
마이크로비시클 A 또는 B 내의 각각의 생물학적 표지를 위해 5 내지 10 마이크로리터의 심부전 환자(CHF), 건강한 개체(Con) 및 급성심근허혈(AMI) 환자로부터의 혈장을 사용하였다. 마이크로비시클 A 또는 B 내의 BNP, Fit- 1 , TIMP-1, CD9 및 ANP의 상대적 수준을 친화성 크로마토그래피에 의해 마이크로비시클을 우선 분리함으로써 측정하였다. 그 후 리간드를 위해 특이 항체를 사용하여 ELISA 분석을 행하였다. Flt-1 및 CD9은 막 결합 단백질인데 비해 BNP, TIMP-1 및 ANP는 루미널 단백질이었다.
서로 다른 환자 집단간의 마이크로비시클 A 또는 B 내의 이들 단백질 분포를 분석하였다. CHF 및 AMI 환자는 건강한 개체에 비해 마이크로비시클 B 내에서 더 높은 BNP 수준을 나타내었으나 마이크로비시클 A의 경우는 아니었다. 마이크로비시클 A 및 B 모두에서 Flt-1은 건강한 개체에 비해 AMI 환자 집단에서 더 높게 나타났다.
그러나 마이크로비시클 A 내의 Flt-1은 CHF 환자에 있어서 더 낮게 나타났으며 마이크로비시클 B 내에서는 건강한 개체에 비해 큰 차이를 나타내지 않았다. 3개의 환자 집단간의 마이크로비시클에 있어서 오직 CHF 환자군에서 TIMP-1과 관련된 마이크로비시클 A만이 유의미하게 높게 나타난 것이다.
마이크로비시클 B가 아닌 마이크로비시클 A는 CD9은 CHF 및 AMI 환자에서 더 높게 나타났다. 마이크로비시클 내의 ANP는 CHF 환자 및 AMI 환자에서 더 높게 나타났다. 마이크로비시클 B에서 ANP A는 오직 AMI 환자에서만 더 높게 나타났다.
결과
도 7을 참조하시오. 친화성 크로마토그래피로 분리한 마이크로비시클은 즉 CTB 또는 Annexin 결합 마이크로비시클은 도 7에 나타난 바와 같이 서로 다른 단백질 프로파일에 의해 서로 다른 양상을 나타내었다. 이러한 차이는 질병에 특이적인 것이다. 예를 들면 Annnexin V-결합 마이크로비시클의 경우 CHF, AMI 환자 및 건강한 개체인 모든 환자 집단에 있어서 BNP 수준의 현격한 차이는 나타나지 않았다.
그러나 CTB-결합 마이크로비시클의 경우 CHF 및 AMI 환자 집단에서 건강한 개체 집단에 비해 BNP 수준은 유의미하게 높게 나타났다. 한편 Annexin 획분 내의 ANP는 건강한 개체 집단에 비해 CHF 및 AMI 환자 집단에서 모두 유의미하게 높게 나타났다. 그러나 CTB 획분은 오직 AMI 환자 집단에서만 유의미하게 높게 나타났다.
(실시예 15) 식중독 경우의 혈장 CD9 모니터링
식중독된 개체의 혈장을 상기한 바와 같이 식중독 이후 3주간 분석하였다. 건강한 개체로부터 3주 후에 수득된 2개의 혈장 샘플을 대조군으로 사용하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다. 환자의 식중독 이전 CTB 및 Annexin V 분획(A1)과 식중독 후 3주 후 CTB 및 Annexin V 분획(A2)을 비교 측정하였다. 한편 건강한 개체로부터 수득된 혈장 샘플 B1과 3주 후에 채취된 혈장 샘플 B2를 대조군으로 사용하였다.
(실시예 16) CTB 또는 Annexin V 결합 마이크로비시클의 분리와 마이크로비시클 내의 막 및 형광 단백질의 정량을 위한 에세이 분석의 전개
재료 및 방법
도 9를 참조하시오. 혈장은 비오틴화 CTB와 함께 인큐베이션시킨다. 그 후 스트렙아비딘-콘쥬게이트된 자기 비드와 함께 인큐베이션시킨다. 자기 비드를 마그넷으로 고착화시킨 후 PBS 또는 등장염 용액으로 세척한다. 결합된 마이크로비시클을 일반적 세정제 기반 세포 용해완충액으로 용해시킨다.
마이크로비시클 함유물을 예를 들면 술포-NHS-비오틴과 같은 활성화된 비오틴으로 비오틴화시킨다. 특정 단백질의 분석을 위해 자기 비드 콘쥬게이트된 특정 단백질에 대한 특이 항체를 첨가한다. 항체-결합 단백질을 마그넷으로 고착화시킨 후 격렬히 세척한다.
단백질을 스트렙아비딘-콘쥬게이트된 HRP 및 HRP 색도계 또는 형광 기질을 사용하여 정량화한다.
(실시예 17) 결론
상기 기술은 분리된 마이크로비시클 내의 막과 형광 단백질 모두를 정량적으로 분석할 수 있는 기술이다. 본 발명자들은 막과 형광 단백질 모두를 검출하였다 (도 7). 막과 형광 단백질 모두를 검출하기 위한 방법을 도 9에 묘사하였다.
(실시예 18) 단일 폴리펩타이드에 의한 임신중독증 진단을 받거나 받지 않은 세 번째 트리메스터의 임산부 혈장 내의 Annexin V 및 CTB-결합 마이크로비시클 내의 단백질 분포
Annexin V(AV) 또는 콜레라 독소 B사슬(CTB)-결합 마이크로비시클 내의 각각의 생물학적 표지(표 1 및 표 2 하부 참조)를 위해 5 내지 10 마이크로리터의 혈장을 임신중독증을 지니지 않은 군(대조군) 임신중독증을 지니는 군(임신중독증) 간의 세 번째 트리메스터 임신부로부터 채취하였다.
Annexin V(AV)- 또는 콜레라 독소 B 사슬(CTB)-결합 마이크로비시클 내의 PAI-1 , PLGF, 프로-칼시토닌, S100b, TGFβ 및 TIMP-1의 상대적 수준을 상기한 바와 같이 측정하였다.
요약하면 AV- 또는 CTB-결합 마이크로비시클을 우선 친화성 크로마토그래피로 분리시킨 후 분리된 마이크로비시클을 마이크로비시클과 관련된 단백질을 용해 분리시키고 분리된 단백질을 비오틴화시켰다. 관심을 갖는 목표 단백질을 특정 항원이 콘쥬게이트된 HRP를 사용하거나 형광 HRP 기질을 사용하여 분석하였다.
도 10은 세 번째 트리메스터의 임신부 혈장으로부터 수득된 Annexin V- 및/또는 CTB- 결합 마이크로비시클 내의 PAI-1, PLGF, 프로-칼시토닌, S100b, TGFβ 및 TIMP-1이 임신중독증을 지니거나 지니지 않은 여성간에 현격한 정량적 차이(p<0.05)가 있음을 나타낸 것이다.
따라서 이러한 마이크로비시클로 캡슐화된 단백질을 임신중독증 진단을 위한 생물학적 표지로 사용할 수 있을 것이다.
(실시예 19) 폴리펩타이드 복합체에 의한 임신중독증 진단을 받거나 받지 않은 세 번째 트리메스터의 임산부 혈장 내의 Annexin V 및 CTB-결합 마이크로비시클 내의 단백질 분포
상기 표지를 사용한 진단 능력은 동일한 혈장 마이크로비시클 내에서 EH는 상이한 마이크로비시클 내에서 두 개의 단백질 복합체를 사용할 때 더욱 효과적일 것이다 (도 10).
로그 회귀모델(Moore et al, 2008)을 사용하여 리시버 오퍼레이터 특성(ROC) 커브를 구축하고 커브의 아래 면적을 CTB- 또는 AV- 결합 마이크로비시클의 각각의 표지 또는 두 개의 서로 다른 표지의 결합을 통해 계산하였다 (표 1 및 표 2 하부 참조). 예를 들면 PAI-1과 PLGF의 CTB-마이크로비시클에 대한 커브의 아래 면적은 각각 0.972 및 0.833이었다.
PAI-1과 PLGF가 결합되었을 때 커브의 아래 면적은 1.0으로 증가하였다 (표 1 하부).
커브 아래 면적
PAI-1 .972
PLGF .833
프로칼시토닌 1.000
S-100b .889
TGF 베2 .972
TIMP 1 .833
PAI1-PLGF 1.000
PAI1-프로칼시토닌 1.000
PAI1-S100b .972
PAI1-TGF베타2 1.000
PAI1-TIMP1 1.000
PLGF-프로칼시토닌 1.000
PLGF-S100b .889
PLGF-TGF베타2 1.000
PLGF-TIMP1 .917
프로칼시토닌-S100b 1.000
프로칼시토닌-TGF베타2 1.000
프로칼시토닌-TIMP1 1.000
S100b-TGF베타2 1.000
S100b-TIMP1 .917
TGF베타2-TIMP1 .972
표 1은 리시버 오퍼레이터 특성(ROC) 커브를 혈장 CTB-마이크로비시클 내의 생물학적 표지를 위해 구축한 것이며 각각의 표지 또는 두 개의 서로 다른 표지의 조합의 커브 아래 면적을 계산한 것이다.
이와 유사하게 AV-마이크로비시클 내의 PLGF 및 프로칼시토닌과 같은 두개의 표지를 결합시키면 각각의 커브 아래 면적은 0.889와 0.861로부터 각각 1.0으로 증가하게 된다 (표 2 하부 참조).
커브 아래 면적
PAI-1 1.000
PLGF .889
프로칼시토닌 .861
S-100b .972
TGF베타2 .972
TIMP 1 1.000
PAI1-PLGF 1.000
PAI1-프로칼시토닌 1.000
PAI1-S100b 1.000
PAI1-TGF베타2 1.000
PAI1-TIMP1 1.000
PLGF-프로칼시토닌 1.000
PLGF-S100b 1.000
PLGF-TGF베타2 1.000
PLGF-TIMP1 1.000
프로칼시토닌-S100b 1.000
프로칼시토닌-TGF베타2 1.000
프로칼시토닌-TIMP1 1.000
S100b-TGF베타2 1.000
S100b-TIMP1 1.000
TGF베타2-TIMP1 1.000
표 2는 리시버 오퍼레이터 특성(ROC) 커브를 혈장 AV-마이크로비시클 내의 생물학적 표지를 위해 구축한 것이며 각각의 표지 또는 두 개의 서로 다른 표지의 조합의 커브 아래 면적을 계산한 것이다.
상기 실시예들은 두 개 이상의 조합을 사용할 때 임신중독증 진단을 위한 생물학적 표지로 더욱 견고히 사용할 수 있음을 나타낸 것이다.
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본 발명의 방법과 시스템의 다양한 변형 및 변이가 당업자에게 본 발명의 정신과 범위를 벗어난 것이 아니면 명백히 인정될 수 있다. 본 발명이 특정 바람직한 실시 형태와 관련하여 설명되어있다 할지라도 본 발명은 특정 실시 형태에 의해 한정되는 것이 아니라 청구범위에 의해 이해되어야 한다. 따라서 본 발명의 수행을 위한 다양한 상기한 변형은 분자생물학 분야 또는 이와 관련된 분야의 당업자에게 본 청구범위의 보호범위 내에서 명백히 인식될 수 있을 것이다.

Claims (18)

  1. 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터 마이크로입자의 샘플을 통해
    (a) 콜레라 독소 B(CTB)에 결합하는 GM1 갱글리오사이드를 포함하는 마이크로입자 내의 선별된 폴리펩타이드(GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드);와
    (b) Annexin V에 결합하는 노출된 포스파티딜세린을 포함하는 마이크로입자 내의 선별된 폴리펩타이드(Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드);의 비율을 수립하는 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태를 모니터링하기 위한 방법에 있어서,
    상기 수립된 (a)와 (b)의 비율(GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드 비율)을 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태의 표지로 사용하는 생물체의 상태를 모니터링하기 위한 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 예를 들면 GenBank 접근 번호 NP_001760.1호의 CD9 폴리펩타이드, GenBank 접근 번호 NP_004347.1호의 CD81 폴리펩타이드, GenBank 접근 번호 NP_001771.1호의 CD63 폴리펩타이드와 같은 테트라스파닌 단백질;
    GenBank 접근 번호 NP_004153.2호의 Rab 5a 폴리펩타이드, GenBank 접근 번호 NP_002859.1호의 Rab 5b 폴리펩타이드, GenBank 접근 번호 NP_004574.2호의 Rab5c 폴리펩타이드, GenBank 접근 번호 NP_004571.2호의 Rab-27a 폴리펩타이드, GenBank 접근 번호 NP_004154.2호의 Rab-27b 폴리펩타이드, GenBank 접근 번호 NP_006852.1호의 Rab35 폴리펩타이드와 같은 Rab GTP아제;,
    GenBank 접근 번호 NP_005552.3호의 Lampl 폴리펩타이드, GenBank 접근 번호 NP_002285.1호의 Lamp2 폴리펩타이드와 같은 LAMP;
    GenBank 접근 번호 NP_001744.2호의 카베올린1 폴리펩타이드와 GenBank 접근 번호 NP_001224.1호의 카베올린2의 폴리펩타이드;
    GenBank 접근 번호 NP_001121620.1호의 트랜스퍼린 수용체(TFRC) 폴리펩타이드; GenBank 접근 번호 NP_001070145.1호의 Clathrin Light Chain A (CLTA) 폴리펩타이드; GenBank 접근 번호 NP_001825.1호의 Clathrin Light Chain B (CLTB) 폴리펩타이드; GenBank 접근 번호 NP_004850.1호의 Clathrin Heavy Chain 1 (CLTC) 폴리펩타이드; GenBank 접근 번호 NP_006283.1호의 TsglOl 폴리펩타이드; GenBank 접근 번호 NP_037506.2호의 Alix 폴리펩타이드; GenBank 접근 번호 NP_000593.1호의 PAI-1 폴리펩타이드; GenBank 접근 번호 NP_002623.2호의 PLGF 폴리펩타이드; GenBank 접근 번호 NP_001029124.1호의 프로칼시토닌 폴리펩타이드; GenBank 접근 번호 NP_006263.1호의 S-100b 폴리펩타이드; GenBank 접근 번호 NP_001129071.1호의 TGF 베타2 폴리펩타이드; 또한 GenBank 접근 번호 NP_003245.1호의 TIMP1 폴리펩타이드;에서 선택된 폴리펩타이드이며,
    바람직하게는 GenBank 접근 번호 NP_001760.1호의 CD9 폴리펩타이드임을 특징으로 하는 생물체의 상태를 모니터링하기 위한 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 방법은 콜레라 독소 서브유니트 B(CTB)에 결합되는 샘플 내의 마이크로입자를 선별하는 단계와 같은 GM1 갱글리오사이드를 포함하는 샘플 내의 마이크로입자를 선별하는 단계; 및
    Annexin V에 결합되는 샘플 내의 마이크로입자를 선별하는 단계와 같은 노출된 포스파티딜세린을 포함하는 샘플 내의 마이크로입자를 선별하는 단계;
    를 포함함을 특징으로 하는 모니터링 방법.
  4. 제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 방법은 크기 배제 크로마토그래피와 같은 크기에 의해 마이크로입자를 선별하는 단계를 단계 (a) 이전에 더욱 포함할 수 있으며,
    선별된 다수의 폴리펩타이드 종에 대한 다수의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 폴리펩타이드의 비율을 포함하는 프로파일을 수립하는 단계를 포함할 수 있고,
    프로파일 각각은 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태의 표지가 될 수 있음을 특징으로 하는 모니터링 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 심혈관 질환을 지닌 세포, 조직, 기관 또는 생물체는 CD9 폴리펩타이드를 포함하고, GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율이 건강한 상태의 것에 비해 심혈관 질환 상태에서 더욱 높아짐을 특징으로 하는 모니터링 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 만성 심부전(CHF)을 지닌 세포, 조직, 기관 또는 생물체는 CD9 폴리펩타이드를 포함하고, GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율이 건강한 상태의 것에 비해 만성 심부전(CHF) 상태에서 더욱 높아짐을 특징으로 하는 모니터링 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 급성심근허혈(AMI)을 지닌 세포, 조직, 기관 또는 생물체는 CD9 폴리펩타이드를 포함하고, GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 CD9 폴리펩타이드 비율이 건강한 상태의 것에 비해 급성심근허혈(AMI) 상태에서 더욱 높아짐을 특징으로 하는 모니터링 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 임신중독증을 지닌 세포, 조직, 기관 또는 생물체는 PAI-1, PLGF, 프로-칼시토닌, S100b, TGF베타 또는 TIMP-1에서 선택된 1종 이상의 폴리펩타이드를 지니며,
    PAI1 및 PLGF; PAI1 및 프로칼시토닌; PAI1 및 SlOOb; PAI1 및 TGF베타2; PAI1 및 TIMP1 ; PLGF 및 프로칼시토닌; PLGF 및 S100b; PLGF 및 TGF베타2; PLGF 및 TIMP1 ; 프로칼시토닌 및 SlOOb; 프로칼시토닌 및 TGF베타2; 프로칼시토닌 및 TIMP1 ; SlOOb 및 TGF베타2; 또는 SlOOb, TIMP1, TGF베타2 및 TIMP1에서 선택된 펩타이드의 조합을 지니고,
    GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 상기 폴리펩타이드/폴리펩타이드 조합과 Annexin V 마이크로입자 내의 상기 폴리펩타이드/폴리펩타이드 조합의 비율이 건강한 상태의 것에 비해 임신중독증 상태에서 더욱 높아짐을 특징으로 하는 모니터링 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
    (a) 마이크로 입자는 CD9+ 마이크로입자를 포함하는 단계;
    (b) 마이크로입자는 마이크로비시클, 엑소좀, 엑토좀 또는 아폽토트 바디를 포함하는 단계;
    (c) 세포, 조직, 기관 또는 생물체가 정상적인 생리 상태, 분화 상태, 발달 또는 대사 상태이거나 질병 상태, 인간 질병 상태, 식중독 상태, 당뇨병 상태, 면역 이상 상태, 신경퇴화 이상 상태, 암 발병 이전 상태, 암 발병 상태 또는 종양 상태와 같은 병리 상태를 포함하는 단계;
    (d) 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태는 질병 상태, 좋지 않은 예후 상태, 질병 회복 상태, 좋은 예후 상태 또는 건강한 상태를 포함하는 단계;
    (e) 뇨, 혈액, 눈물, 타액, 기관지 폐포액, 종양 유출액, 정액, 양수 또는 모유로부터 선택된 샘플을 사용하는 단계; 또는
    (f) 상기 단계를 조합시키는 단계;
    로 이루어짐을 특징으로 하는 모니터링 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 둘 이상의 샘플간에 선별된 폴리펩타이드의 수준, 농도 또는 함량을 일반화하는 단계를 더욱 포함하고, 상기 일반화 단계는 BNP, CD9 및/또는 TIMP-1 폴리펩타이드를 참조로 하여 수행됨을 특징으로 하는 모니터링 방법.
  11. (a) 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태 변화를 감지하기 위해 세포, 조직, 기관 또는 생물체 내의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율을 측정하는 단계로서 이러한 변화는 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 상태 변화를 의미하는 단계;
    (b) 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 특정 상태를 수립하기 위해 세포, 조직, 기관 또는 생물체(또는 이와 같은 비율을 지니는 프로파일) 내의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율과 특정 상태인 것으로 알려진 세포, 조직, 기관 또는 생물체(또는 이와 같은 비율을 지니는 프로파일) 내의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율을 비교하는 단계;
    (c) 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 질병을 감지하기 위해 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터 샘플을 수득하는 단계, 샘플을 사용하여 선행 청구항에 따른 방법을 수행하는 단계, GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율과 질병 상태의 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터 알려진 샘플의 GM1 갱글리오사이드 마이크로입자 내의 폴리펩타이드와 Annexin V 마이크로입자 내의 폴리펩타이드의 비율을 비교하여 질병 여부를 감지하는 단계; 또는
    (d) 상기 단계 (c)의 방법에 따라 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 질병을 감지하는 단계를 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 생물체의 질병을 치료하기 위한 단계를 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 생물체 질병을 치료 또는 예방하는 단계;
    로 이루어진 방법.
  12. (a) GM1 갱글리오사이드를 포함하는 샘플 내의 마이크로입자를 선별하는 단계; 및/또는
    (b) 노출된 포스파티딜세린을 포함하는 샘플 내의 마이크로입자를 선별하는 단계;
    를 포함하는 마이크로입자를 포함하는 샘플의 처리 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 단계 (a)는 콜레라 독소 서브유니트 B(CTB)에 결합하는 샘플 내의 마이크로입자를 선별하는 단계이거나; 상기 단계 (b)는 Annexin V에 결합하는 샘플 내의 마이크로입자를 선별하는 단계, 또는 이들 모두를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 방법은
    (a) 크기 배제 크로마토그래피와 같은 크기에 따라 마이크로입자를 선별하는 단계를 더욱 포함하는 단계;
    (b) 마이크로입자는 CD9+ 마이크로입자를 포함하는 단계;
    (c) 뇨, 혈액, 눈물, 타액, 기관지 폐포액, 종양 유출액, 정액, 양수 또는 모유로부터 샘플을 선택하는 단계; 또는
    (d) 마이크로비시클, 엑소좀, 엑토좀 또는 아폽토트 바디를 포함하는 단계;
    로 이루어진 방법.
  15. 마이크로입자를 포함하는 샘플을 분별화시키는 방법에 있어서, 상기 분별화 방법은 (a) 마이크로입자의 Annexin V-서브 획분 또는 마이크로입자의 CTB-결합 서브-획분 또는 이들 모두를 선별하는 단계; 또는 (b) 상기 선행 항에 따른 방법을 수행하는 단계;로 이루어짐을 특징으로 하는 분별화 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 분별화 방법은 막 단백질 또는 형광 단백질 또는 이들 모두를 마이크로입자의 분획화된 샘플 내에서 검출하거나 정량화하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 분별화 방법.
  17. (a) 샘플 내의 거의 모든 마이크로입자가 콜레라 독소 B(CTB)에는 결합하나 Annexin V에는 결합하지 않거나;
    (b) 샘플 내의 거의 모든 마이크로입자가 Annexin V에는 결합하나 콜레라 독소 B(CTB)에는 결합하지 않는
    마이크로 입자의 정제된 샘플.
  18. 첨부하는 도면의 도 1 내지 도 10에 나타난 바와 같이 본 명세서 내에 기재된 실질적인 정제된 샘플 또는 방법.
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