CN111929133A - 用于生物学检测的gm1神经节苷脂与膜联蛋白v的微粒多肽比例 - Google Patents

用于生物学检测的gm1神经节苷脂与膜联蛋白v的微粒多肽比例 Download PDF

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Abstract

本发明人描述了一种检测细胞、组织、器官或生物体状态的方法。所述方法包括为来自于所述细胞、组织、器官或生物体的微粒样本建立比例。所述比例是包含GM1神经节苷脂的微粒(其优选地结合至霍乱毒素B(CTB))中的选定多肽(“GM1神经节苷脂微粒多肽”)与包含暴露的磷脂酰丝氨酸的微粒(其优选地结合至膜联蛋白V)中的选定多肽(“膜联蛋白V微粒多肽”)的比例。由此得到的GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例可以指示所述细胞、组织、器官和生物体的状态。

Description

用于生物学检测的GM1神经节苷脂与膜联蛋白V的微粒多肽 比例
本申请为分案申请，其原申请的申请日为2012年11月30日，申请号为201280066933.X，名称为“用于生物学检测的GM1神经节苷脂与膜联蛋白V的微粒多肽比例”。
技术领域
本发明涉及医药、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本发明涉及医药领域。
具体地，本发明涉及检测细胞、组织、器官或生物体的生理和病理状态的方法。本发明也涉及疾病如癌症的诊断和治疗。
参考美国专利申请60/713,992、12/065,549、12/065,551、60/878,222、12/377,398、6I/066,671、61/227,865和61/257,121。还参考国际专利申请PCT/GB2005/003206、PCT/SG2006/000233、PCT/SG2006/000232、PCT/SG2007/000257和PCT/SG2009/000062。
前述申请，本申请和前述申请中每篇所引用或参考的每篇文献(包括每篇前述申请的审查过程中)(“申请和文章引用的文献”)，以及在前述申请和文章中的每篇中及所述申请和文章引用的文献中所引用或提及的任何产品的任何生产商说明书或目录，均通过引用的方式纳入本申请。另外，本文所引用的所有文献，本文所引用的文献中所引用或参考的所有文献，以及本文中或任何通过引用方式纳入本文的文献中所引用或提及的任何产品的任何生产商的说明书或目录，均通过引用的方式纳入本申请。通过引用纳入本文的文献或其中的任何教导均可用于本发明的实施。通过引用纳入本文的文献不应被认为是现有技术。
背景技术
现在普遍认为，微粒是由不同种类的细胞分泌的，并根据所述细胞的细胞类型和病理生理状态或细胞微环境而不同，如阿尔茨海默病、TB感染、HIV感染、癌症、缺氧、辐射、氧化应激、切变应力和暴露激活的补体复合体1。微粒是膜囊(membrane vesicle)。迄今为止，存在数种微粒类型，包括外来体(exosome)、核外粒体(ectosome)和凋亡小体2。这些微粒含有蛋白质和RNA。许多这类微粒已被证明具有提高生物学活性或发疾的生物学活性。
体液如尿液、血液、眼泪、唾液、支气管肺泡液(bronchoaveolar fluid)、肿瘤渗出液、附睾液、羊水和乳含有许多膜囊。当脱落时，微粒的类型和生物活性取决于所述细胞种类、它们的生理状态及它们的细胞微环境，这些微粒是潜在的诊断或预后标志物的良好来源。耗尽这些微粒也是潜在地治疗性的。然而，体液中许多这类微粒的种类和来源还是未知的，并且据推测是高度异源的。
因此，本领域中需要可以快速富集这些微粒并且提高基于脂质微粒的生物标记物或治疗应用的可预测性和稳定性。
发明内容
除非另有说明，本发明的实施采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常用技术，这些均在本领域普通技术人员的能力范围内。上述技术在文献中有说明。参见，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Ausubel，F.M.et al.(1995and periodic supplements；Current Protocols inMolecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley&Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley&Sons；J.M.Polak and James O′D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide Synthesis：APractical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley andJ.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press；UsingAntibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO.I by Edward Harlow，DavidLane，Ed Harlow(1999，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor)，David Lane(Editor)(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-314-2)，1855.Handbook of DrugScreening，edited by Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes(2001，NewYork，NY，Marcel Dekker，ISBN0-8247-0562-9)；及Lab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use at the Bench.Edited Jane Roskamsand Linda Rodgers，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN0-87969-630-3。上述普通教科书(general texts)通过引用的方式纳入本说明书。
附图说明
图1为示出血清的按大小分级分离的图。使获自健康个体的血清通过Sepharose2B分子筛离心柱。将所述柱用PBS冲洗3次。
将获自输入血清、穿过液(flow through)和洗出液(wash)的等分试样通过SDS/PAGE分离，所得凝胶用银染色(上图)或者电转染到硝酸纤维素上以用抗CD9抗体进行蛋白质印迹(下图)。
图2为示出CTB亲和色谱法的图。将血清的分子筛色谱法后的穿过液和洗出液级分合并起来并通过CTB亲和色谱法测试GM1神经节苷脂的存在情况。
将所述级分用生物素化的CTB孵育，然后链霉亲和素-偶联到磁珠上，然后用PBS洗涤三次。将获自输入血清、穿过液(或未结合的级分)和洗出液的等分试样通过SDS/PAGE分离，所得凝胶用银染色(上图)或者电转染到硝酸纤维素上以用抗CD9抗体进行蛋白质印迹(下图)。
图3为示出CD9+微粒在蔗糖密度梯度中的沉降的图。在22.8％～60％w/v的蔗糖浓度密度梯度中沉积血清。超速离心后，将所述梯度等体积分级分离。对每种级分称重并计算其密度。
上图顶部处通过密度(g/m1)指示的每种级分的等分试样是通过SDS/PAGE分离，并且将所得凝胶用银染色(上图)或者电转染到硝酸纤维素上以用抗CD9抗体进行蛋白质印迹(下图)。
图4为示出膜联蛋白V亲和色谱法的图。将血清用生物素化的膜联蛋白V孵育，然后链霉亲和素-偶联至磁珠，然后用PBS洗涤三次。
获自血清、穿过液(或未结合的级分)和洗出液的等价等分试样是通过SDS/PAGE分离，并电转染到硝酸纤维素上以用抗CD9抗体进行蛋白质印迹。结合的(10×)等分试样为其他泳道中每一个所用的10倍。
图5为将用Myc-转化ES-衍生的MSC系(Myc-HuES9.E1)条件化的培养基(culturemedium)和血浆上样至蔗糖密度梯度上。该梯度是通过将14种浓度为从23％至60％(w/v)的蔗糖溶液分层而制备。上样所述样本后，将所述梯度在4℃下于200000g下超速离心18h。
在13个级分的顶部移除所述梯度。通过称重100μl的每种级分确定每种级分的密度。确定每种级分中CD9+膜联蛋白V-结合微泡和CD9+CTB-结合微泡的相对水平。
图6A和6B为将获自健康个体(H)和心脏病患者(D)的血浆用生物素化的膜联蛋白V(图6A)或霍乱毒素B(图6B)孵育。将结合膜联蛋白V或霍乱毒素B的微泡用链霉亲和素-缀合的磁珠提取。在ELISA中使用特异性抗体测定这些分离的微泡中的蛋白质。
图7为针对微泡A或微泡B中的每一种生物标记物，使用5至10微升获自心力衰竭患者(CHF)、健康个体(Con)和AMI患者(AMI)的血浆。微泡A或B中BNP、Flt-1、TIMP-1、CD9和ANP的相对水平是通过以下方法测定：首先通过亲和色谱法分离所述微泡，随后使用针对所述配体的特异性抗体的测定。Flt-1和CD9为膜结合蛋白，而BNP、TIMP-1和ANP为腔蛋白(luminal protein)。
分析不同患者组的微泡A或B中这些蛋白质的分布。与Con个体相比，CHF和AMI患者的微泡B而非微泡A中BNP水平显著较高。与Con个体相比，AMI患者的微泡A和微泡B中Flt-1的水平较高。
但是，CHF患者的微泡A中Flt-1较低，而其微泡B中Flt-1与Con个体无显著区别。在三个患者组的微泡中，只有CHF患者中的微泡A相关TIMP-1显著不同，即较高。在CHF和AMI患者中，微泡A而非微泡B中CD9显著较高。CHF和AMI患者的微泡A中ANP显著较高。在微泡B中，仅AMI患者的ANP A显著较高。
图8为在一例食物中毒中检测血浆CD9。在食物中毒期间和三周后，如上所述分析获自食物中毒个体的血浆。将获自健康个体的两份相隔三周的血浆样本作为对照。将患者食物中毒前(A1)及食物中毒后三周(A2)的CTB级分和AnnV级分中的平均荧光相对于B1和B2的CTB级分和AnnV级分中的平均荧光进行作图。B1和B2为获自健康对照的相隔三周的血浆样本。
图9为测定法的发展。先将血浆用生物素化的CTB孵育，随后用链霉亲和素-缀合的磁珠孵育。之后，将所述磁珠用磁铁固定，并用PBS或等张盐溶液洗涤。用通用的基于去垢剂的细胞裂解缓冲液裂解结合的微泡。
随后，将微泡的内容物用活化的生物素(例如sulfo-NHS-生物素)进行生物素化。然后，为测定特定的蛋白质，加入缀合有特异性针对目的蛋白的抗体的磁珠。然后将所述抗体结合的蛋白质用磁铁固定，并充分洗涤。利用链霉亲和素-缀合的HRP及HRP色度或荧光底物来定量所述蛋白质。
图10为示出不具有或具有先兆子痫的临床诊断的孕妇(妊娠晚期)的血浆中，膜联蛋白V微泡与CTB-结合微泡中蛋白质的差异分布。
具体实施方式
本发明人描述了一种快速分离血浆中存在的不同脂质微粒的技术，所述技术可用于鉴别和/或分类不同微粒亚群体中的生物标记物，用于提高其诊断、预后或治疗诊断学上的价值。
本发明人证明了，CD9——一种四次跨膜蛋白(tetraspanin)可以分成两个血浆微泡级分，这两个级分在人血浆的膜联蛋白V-结合的磷脂酰丝氨酸或霍乱毒素B链(CTB)结合的GM1神经节苷脂中差异地富集。对膜联蛋白V和霍乱毒素B链的亲和力是相互排斥的。膜蛋白与脂质的结合表明这两个级分是脂质囊泡。
本发明人同样证明了，血浆的膜联蛋白V-和CTB-结合的亚级分中蛋白质或蛋白质组合的相对水平取决于所述个体的健康或病理状态。
本发明人观察到，健康个体的膜联蛋白V-和CTB-结合亚级分中CD9的相对水平是相似的。患病的(或处于患病风险的)个体(如食物中毒或正在经历PCI或经皮腔内斑块旋切术(atherectomy)的心脏病患者)在这些亚级分中具有不同的CD9分布水平。例如，与健康个体相比，食物中毒个体的CTB结合亚级分中CD9水平较高，而保持相似的膜联蛋白V-结合亚级分的水平。
另一方面，与健康个体相比，正在经历PCI或经皮腔内斑块旋切术的心脏病患者的CTB-结合亚级分中CD9水平相似，而膜联蛋白V-结合亚级分中CD9水平较高。
因此，测定血浆中膜联蛋白V-和CTB-结合亚级分中的蛋白质相对水平，可以用于评估个体的健康或病理状况。
状态的检测
本发明人提供一种检测细胞、组织、器官或生物体状态的方法。
所述方法可能包括，为例如获自所述细胞、组织、器官或生物体的微粒样本，建立以下的比例：第一种微粒类型中的选定多肽的量与第二种微粒类型中的选定多肽的量的比例。
这一比例可以是所述第一种微粒类型中所述多肽的量与所述第二种微粒类型中所述多肽的量的比例，即在所述两种微粒类型之间。
所述第一种微粒类型可以是包括GM1神经节苷脂的微粒(方便起见，称为“GM1神经节苷脂微粒”)。所述第一种微粒类型可能会结合至霍乱毒素B(CTB)，方便起见称之为CTB-微泡。
所述第二种微粒类型可以是包括暴露的磷脂酰丝氨酸(exposedphosphotidylserine)的微粒。所述第二种微粒类型可能会具有结合至膜联蛋白V(方便起见，称为“膜联蛋白V微粒”或“AV-微粒”)。
为方便起见，本发明人把所述第一种微粒类型(这些为GM1神经节苷脂微粒)中的多肽的存在情况、数量、质量或数目等称为“GM1神经节苷脂微粒多肽”。相似的，为方便起见，本发明人把所述第二种微粒类型(这些为膜联蛋白V微粒)中的多肽的存在情况、数量、质量或数目等称为“膜联蛋白V微粒多肽”。另外，为方便起见，本发明人将上述二者的比例称为“GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例”。
多肽可能选自：四次跨膜蛋白(例如CD9、CD81、CD63)、Rab GTP酶(例如Rab 5a、Rab5b和Rab 5c，Rab-27a和Rab-27b，Rab 35)、LAMP(例如Lamp 1和Lamp 2)、小窝蛋白(caveolin)(如小窝蛋白1和小窝蛋白2)、运铁蛋白受体(TRFC)、网格蛋白轻链A(CLTA)、网格蛋白轻链B(CLTB)、网格蛋白重链1(CLTC)、Tsg 101、Alix、PAI-1、PLGF、原降钙素(Procalcitonin)、S-100b、TGF β2(TGFB2)、TIMP1。该多肽可能包括CD9。
所述方法可以使得所述微粒含有CD9+微粒。所述方法可以使得所述微粒包括微泡、外来体、核外粒体或凋亡小体。
具体地，本发明人提供一种检测细胞、组织、器官或生物体的状态的方法，所述方法包括为获自于所述细胞、组织、器官或个体的微粒样本建立以下比例：(a)含有GM1神经节苷脂的微粒中的选定多肽，所述微粒优选地结合至霍乱毒素B(CTB)(“GM1神经节苷脂微粒多肽”)；与(b)含有暴露的磷脂酰丝氨酸的微粒中的选定多肽，所述微粒优选地结合至膜联蛋白V(“膜联蛋白V微粒多肽”)之间的比例；其中如此建立的(a)与(b)的比例(“GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例”)可以指示所述细胞、组织、器官和生物体的状态；并且其中所述多肽选自：四次跨膜蛋白(如CD9、CD81、CD63)、Rab GTP酶(如Rab 5a、Rab5b和Rab 5c，Rab-27a和Rab-27b，Rab35)、LAMP(如Lamp 1和Lamp 2)、小窝蛋白(如小窝蛋白1和小窝蛋白2)、运铁蛋白受体(TRFC)、网格蛋白轻链A(CLTA)，网格蛋白轻链B(CLTB)、网格蛋白重链1(CLTC)、Tsg 101、Alix、PAI-1、PLGF、原降钙素、S-100b、TGF β2(TGFB2)、TIMP1；优选地，其中所述多肽包括CD9。
本发明人进一步提供一种用于确定细胞、组织、器官或生物体处于特定状态的方法。此方法可能包括比较所述细胞、组织、器官和生物体的GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例(或包括该比例的图谱)与已知处在该特定状态中的所述细胞、组织、器官和生物体的GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例。
额外地或替代地，除利用单个多肽，还可以使用选定多肽的组合。因此，当本发明人提及多肽(如通过比较其量以确立比例)时，这一提及应该被认为指多肽的组合，例如确立或比较多肽组合的量。
所述方法可能包括选择所述样本中包含GM1神经节苷脂的微粒。这可以通过例如选择所述样本结合至霍乱毒素亚单位B(CTB)的微粒做到。
所述方法可能包括选择所述样本中包含暴露的磷脂酰丝氨酸的微粒。这可以通过例如选择所述样本中结合至膜联蛋白V的微粒做到。
所述方法可能进一步包括根据尺寸选择微粒的步骤。所述尺寸选择步骤可能包括分子筛色谱法。当采用此步骤时，在第一步例如上述步骤(a)之前实施所述尺寸选择步骤。
当提及确定多肽的“量”时，应理解其扩展到确定或建立所述多肽的质量、数目、浓度等。当提及多肽的比例(或组合的比例)时，第一状态下比第二状态下“更高”时，可认为这是指与所述第二状态相比，所述第一状态下的比例具有统计学差异，p值小于0.01。
按此方法确立的比例可以用于指示所述细胞、组织、器官或生物体的状态。
所述方法可以为使得所述细胞、组织、器官或生物体的状态包括：生理状态、分化水平、发育状况或代谢状态或病理状态，例如疾病状态、人疾病状况、食物中毒状态、糖尿病状态、免疫障碍状态、神经变性障碍状态、致癌状态、生癌状态或肿瘤状态。
例如，该状态可能是人免疫病毒(HIV)感染状态、结核病(TB)感染状态、疯牛病(BSE)感染状态或治疗状态，例如正在经历治疗的患者。
所述方法可以为使得所述细胞、组织、器官或生物体的状态包括生病的状态、预后不良的状态、从疾病中恢复的状态、预后良好的状态或健康状态。
所述方法可以为使得所述样本选自：汗液、尿液、血液、泪液、唾液、支气管肺泡液、肿瘤渗出液、附睾液、羊水和乳。
当所述样本为生物体时，所述生物体可能包括任何动物或植物。所述生物体可能包括哺乳动物，如人类。
所述方法可以为使得其包括上述的任一组合。
多肽
所述多肽可以是任何其存在情况、数量、质量或数目等可以被确定的合适多肽。
根据所述蛋白质或多肽，所述确定方法可以通过本领域中已知的任何适当方法进行。这类确定方法的实例包括质谱法、分光光度法、紫外吸收等。
霍乱毒素B(CTB)可具有GenBank登记号ABG56900.1。
膜联蛋白V可具有GenBank登记号AAB40047.1或AAB60648.1。
所述多肽可选自：四次跨膜蛋白(如CD9、CD81、CD63)、Rab GTP酶(如Rab 5a、Rab5b和Rab 5c、Rab-27a和Rab-27b、Rab 35)、LAMP(如Lamp 1和Lamp 2)、小窝蛋白(如小窝蛋白1和小窝蛋白2)、运铁蛋白受体(TRFC)、网格蛋白轻链A(CLTA)、网格蛋白轻链B(CLTB)、网格蛋白重链1(CLTC)、Tsg101、Alix、PAI-1、PLGF、原降钙素、S-100b、TGF β2(TGFB2)、TIMP1。该多肽可能包括CD9。
CD9可包括GenBank登记号为NP_001760.1的多肽；CD81可包括GenBank登记号为NP_004347.1的多肽；CD63可包括GenBank登记号为NP_001771.1的多肽；Rab5a可包括GenBank登记号为NP_004153.2的多肽；Rab5b可包括GenBank登记号为NP_002859.1的多肽；Rab5c可包括GenBank登记号为NP_004574.2的多肽；Rab-27a可包括GenBank登记号为NP_004571.2的多肽；Rab-27b可包括GenBank登记号为NP_004154.2的多肽；Rab35可包括GenBank登记号为NP_006852.1的多肽；Lamp1可包括GenBank登记号为NP_005552.3的多肽；Lamp2可包括GenBank登记号为NP_002285.1的多肽；小窝蛋白1可包括GenBank登记号为NP_001744.2的多肽；小窝蛋白2可包括GenBank登记号为NP_001224.1的多肽；运铁蛋白受体(TFRC)可包括GenBank登记号为NP_001121620.1的多肽；网格蛋白轻链A(CLTA)可包括GenBank登记号为NP_001070145.1的多肽；网格蛋白轻链B(CLTB)可包括GenBank登记号为NP_001825.1的多肽；网格蛋白重链1(CLTC)可包括GenBank登记号为NP_004850.1的多肽；Tsg101可包括GenBank登记号为NP_006283.1的多肽；Alix可包括GenBank登记号为NP_037506.2的多肽；PAI1可包括GenBank登记号为NP_000593.1的多肽；PLGF可包括GenBank登记号为NP_002623.2的多肽；原降钙素可包括GenBank登记号为NP_001029124.1的多肽；S100b可包括GenBank登记号为NP_006263.1的多肽；TGFB2可包括GenBank登记号为NP_001129071-1的多肽；及TIMP1可包括GenBank登记号为NP_003245.1的多肽。
因此，本发明人描述了一种方法，其包括在微粒样本中选择多肽，并确立GM1神经节苷脂微粒中所述选定多肽与膜联蛋白V微粒中所述选定多肽的质量、数目、数量等的比例。所述微粒的样本在细胞、组织、器官或生物体中，由细胞、组织、器官或生物体构成，或获自细胞、组织、器官或生物体。
多肽的组合
如上所述，替代地或额外地，除检测单一的多肽，还可以使用任意两种或多种多肽的组合。因此，本发明人描述一种方法，其中包括在由细胞、组织、器官或生物体构成的样本中或获自细胞、组织、器官或生物体的样本中选择两种或多种多肽的组合，检测第一种微粒类型和第二种微粒类型中多肽的质量、数量、总量等，并进行比较。由此确立的比例可以指示细胞、组织、器官或生物体的状态。
例如，可以使用PAI-1、PLGF、原降钙素、S100b、TGF β2和TIMP1中的任意两种或两种以上的组合。本发明人描述了，例如，在检测包括例如先兆子痫(pre-eclampsia)的状态时采用以下任意一种或多种：(a)PAI1和PLGF；(b)PAI1和原降钙素；(c)PAI1和S100b；(d)PAI1和TGF β2；(e)PAI1和TIMP1；(f)PLGF和原降钙素；(g)PLGF和S100b；(h)PLGF和TGF β2；(i)PLGF和TIMPl；(j)原降钙素和S100b；(k)原降钙素和TGF β2；(l)原降钙素和TIMP1；(m)S100b和TGF β2；(n)S100b和TIMPl，及(o)TGF β2和TIMP1。
多肽的图谱
所述方法可能包括建立图谱，该图谱包括多个GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例以用于多个选定的多肽种类。上述每个图谱可指示所述细胞、组织、器官或生物体的状态。换言之，可使用一个以上的多肽种类(即，获得一个以上多肽种类的比例)。
当提及GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例(或组合与组合的比例)时，例如CD9多肽，当第一状态下比第二状态下“更高”时，可认为这是指与所述第二状态相比，所述第一状态下的比例具有统计学上差异，p值＜0.01。
标准化
所述方法可能进一步包括标准化步骤。该步骤包括确定或确保任何一种或几种蛋白质或多肽的量或浓度在不同样本中是一样的。
标准化步骤，当应用于本文所述的方法和混合物时，可能利用一种已知在任意两个样本中具有相同浓度的多肽。
因此，本文所述的方法可能包括标准化步骤。该标准化步骤可能包括调节一个或多个样本中特定多肽的水平、浓度或数量。该标准化步骤可以在两个或多个样本上进行，其中特定多肽(在标准化之前)的水平、浓度或数量明显彼此不同。此标准化步骤可以使得，在标准化之后，两个或多个样本中特定多肽的水平、浓度或数量基本上相同。
该标准化步骤可能包括稀释或浓缩所述两个样本中一个或另一个，以增加或降低一个或两个样本中特定多肽的水平、浓度或数量。
替代地或额外地，该标准化步骤可能包括为选定的两个或多个样本确定所述样本间特定多肽的水平、浓度或数量的比例。这可以通过参照参考多肽实现，所述参考多肽已知在每个目的样本组中均具有相同的水平、浓度或数量。所述参考多肽可能包括BNP、CD9和TIMP-1中的一种或几种。
还应当认识到，当所述标准化步骤包括这类比例的步骤时，可能不需要浓缩或稀释样本。
使用BNP多肽的标准化
本发明人已经确定，患有慢性心力衰竭(CHF)疾病(或处于患病风险)的细胞、组织、器官或生物体的膜联蛋白V微粒中BNP多肽的水平与未患慢性心力衰竭(CHF)疾病(或未处于患病风险)的细胞、组织、器官或生物体(如健康个体)中的BNP多肽水平不具有统计学的差异。
相似的，本发明人已经确定，患有急性心肌缺血(AMI)疾病(或处于患病风险)的细胞、组织、器官或生物体的膜联蛋白V微粒中BNP多肽水平与未患急性心肌缺血(AMI)疾病(或未处于患病风险)的细胞、组织、器官或生物体(如健康个体)中的BNP多肽水平不具有统计学的差异。
因此，细胞、组织、器官或生物体的膜联蛋白V微粒中BNP蛋白或多肽的水平、浓度或数量可用于标准化本文所述方法中可用的任何其它标记物，如CD9水平。这类标准化可以在膜联蛋白V微粒或GM1神经节苷脂微粒或两者中实现。
使用TIMP-1和CD9多肽的标准化
本发明人已经确定，患有慢性心力衰竭(CHF)疾病(或处于患病风险)的细胞、组织、器官或生物体的GM1神经节苷脂微粒中的TIMP-1多肽(GenBank登记号NP_003245.1)和CD9多肽(Gen Bank登记号NP_001760.1)的水平与未患慢性心力衰竭(CHF)疾病(或未处于患病风险)的细胞、组织、器官或生物体(如健康个体)中的TIMP-1和CD9水平不具有统计学的差异。
相似的，本发明人已经确定，患急性心肌缺血(AMI)疾病(或处于患病风险)的细胞、组织、器官或生物体的GM1神经节苷脂微粒中的TIMP-1多肽(GenBank登记号NP_003245.1)和CD9多肽(GenBank登记号NP_001760.1)的水平与未患急性心肌缺血(AMI)疾病(或未处于患病风险)的细胞、组织、器官或生物体(如健康个体)中的TIMP-1和CD9水平不具有统计学的差异。
因此，细胞、组织、器官或生物体的GM1神经节苷脂微粒中的TIMP-1或CD9多肽或蛋白(或二者)的水平或浓度或数量可用于标准化本文所述方法中可用的任何其它标记物。这一标准化过程可在膜联蛋白V微粒或GM1神经节苷脂微粒或两者中实现。
心血管疾病状态的确定
本发明人证明了，患有心血管疾病(或处于患病风险)的细胞、组织、器官或生物体的GM1神经节苷脂微粒CD9多肽与膜联蛋白V微粒多肽CD9的比例高于正常或健康细胞、组织、器官或生物体(即未患心血管疾病的那些)中的同类(cognate)CD9比例(即GM1神经节苷脂微粒CD9多肽与膜联蛋白V微粒多肽CD9的比例)。
因此，本发明人描述了一种确定目的细胞、组织、器官或生物体(优选生物体)的心血管疾病状态的方法。因此，上述方法可以使得所述细胞、组织、器官或生物体的状态包括心血管疾病状态和健康状态。这一情况下，所述多肽可能包括CD9。与健康状态相比，心血管疾病状态下的GM1神经节苷脂微粒CD9多肽与膜联蛋白V CD9微粒多肽的比例较高。可以采用以上任意组合。
所述方法可能包括提供由目的细胞、组织、器官或生物体构成的微粒样本，或者获自目的细胞、组织、器官或生物体的微粒样本。确定GM1神经节苷脂微粒(即，包括GM1神经节苷脂的微粒，所述微粒优选地结合至霍乱毒素B(CTB))中的CD9数量。确定膜联蛋白V微粒(即，包括暴露的磷脂酰丝氨酸的微粒，所述微粒优选地结合至膜联蛋白V)中的CD9数量。随后确定GM1神经节苷脂微粒中CD9数量与膜联蛋白V微粒中CD9数量的比例。将该比例与正常或健康(即未患心血管疾病)的细胞、组织、器官或生物体的CD9 GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例进行比较。
当目的细胞、组织、器官或生物体的比例高于“正常的”目的细胞、组织、器官或生物体的比例时，则所述目的细胞、组织、器官或生物体被确定患有心血管疾病或处于患病风险中。
慢性心力衰竭(CHF)状态的确定
本发明人证明了，患有慢性心力衰竭(CHF)疾病(或处于患病风险)的细胞、组织、器官或生物体的GM1神经节苷脂微粒CD9多肽与膜联蛋白V微粒CD9多肽的比例高于正常或健康细胞、组织、器官或生物体(即未患慢性心力衰竭(CHF)疾病的那些)中的同类CD9比例(即GM1神经节苷脂微粒CD9多肽与膜联蛋白V微粒多肽CD9的比例)。
因此，本发明人描述了一种确定目的细胞、组织、器官或生物体(优选生物体)的慢性心力衰竭(CHF)疾病状态的方法。因此，上述方法可以使得所述细胞、组织、器官或生物体的状态包括慢性心力衰竭(CHF)疾病状态和健康状态。所述多肽可能包括CD9。与健康状态相比，慢性心力衰竭(CHF)状态下的GM1神经节苷脂微粒CD9多肽与膜联蛋白V CD9微粒多肽的比例较高。可以采用以上任意组合。
所述方法可能包括提供由目的细胞、组织、器官或生物体构成的微粒样本，或获自目的细胞、组织、器官或生物体的微粒样本。确定GM1神经节苷脂微粒(即，包括GM1神经节苷脂微粒，所述微粒优选地结合至霍乱毒素B(CTB))中的CD9数量。确定膜联蛋白V微粒(即，包括暴露的磷脂酰丝氨酸的微粒，所述微粒优选地结合至膜联蛋白V)中的CD9数量。随后确定GM1神经节苷脂微粒中CD9数量与膜联蛋白V微粒中CD9数量的比例。将这一比例与正常或健康的(如未患慢性心力衰竭(CHF)疾病的)细胞、组织、器官或生物体的CD9 GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例进行比较。
当所述目的细胞、组织、器官或生物体的比例高于“正常的”目的细胞、组织、器官或生物体的比例时，则所述目的细胞、组织、器官或生物体被确定患有慢性心力衰竭(CHF)疾病或处于患病风险中。
急性心肌缺血(AMI)状态的确定
本发明人证明了，患有急性心肌缺血(AMI)疾病(或处于患病风险)的细胞、组织、器官或生物体的GM1神经节苷脂微粒CD9多肽与膜联蛋白V微粒CD9多肽的比例高于正常或健康细胞、组织、器官或生物体(即未患急性心肌缺血(AMI)疾病的那些)中的同类CD9比例(即GM1神经节苷脂微粒CD9多肽与膜联蛋白V微粒多肽CD9的比例)。
因此，本发明人描述了一种确定目的细胞、组织、器官或生物体(优选生物体)的急性心肌缺血(AMI)状态的方法。因此，所述方法可以使得所述细胞、组织、器官或生物体的状态包括急性心肌缺血(AMI)疾病状态和健康状态。所述多肽可能包括CD9。与健康状态相比，急性心肌缺血(AMI)疾病状态下的GM1神经节苷脂微粒CD9多肽与膜联蛋白V CD9微粒多肽的比例较高。可以采用以上任意组合。
所述方法可能包括提供由目的细胞、组织、器官或生物体构成的微粒样本，或获自目的细胞、组织、器官或生物体的微粒样本。确定GM1神经节苷脂微粒(即，包括GM1神经节苷脂微粒，所述微粒优选地结合至霍乱毒素B(CTB))中的CD9数量。确定膜联蛋白V微粒(即，包括暴露的磷脂酰丝氨酸的微粒，所述微粒优选地结合至膜联蛋白V)中的CD9数量。随后确定GM1神经节苷脂微粒中CD9数量与膜联蛋白V微粒中CD9数量的比例。将所述比例与正常或健康的(如未患急性心肌缺血(AMI)疾病的)细胞、组织、器官或生物体的CD9 GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例进行比较。
当所述目的细胞、组织、器官或生物体的比例高于“正常的”目的细胞、组织、器官或生物体的比例时，则所述目的细胞、组织、器官或生物体被确定患有急性心肌缺血(AMI)疾病或处于患病风险中。
先兆子痫状态的确定
本发明人证明了，患有先兆子痫(或处于患病风险)的细胞、组织、器官或生物体的GM1神经节苷脂微粒与膜联蛋白V微粒中多肽数量或多肽组合数量的比例高于正常或健康细胞、组织、器官或生物体(即未患先兆子痫的那些)中的同类多肽/组合的比例(即GM1神经节苷脂微粒中多肽数量或多肽组合数量与膜联蛋白V微粒中多肽数量或多肽组合数量的比例)。
因此，本发明人描述了一种确定目的细胞、组织、器官或生物体(优选生物体)的先兆子痫状态的方法。
因此，上文所述方法可以使得所述细胞、组织、器官或生物体的状态包括先兆子痫状态和健康状态。所述多肽可能选自：PAI-1、PLGF、原降钙素、S100b、TGFβ和TIMP-1。
可是使用上述多肽中两种或多种的任意组合。这样的组合可能选自：PAI1和PLGF；PAI1和原降钙素；PAI1和S100b；PAI1和TGF β2；PAI1和TIMP1；PLGF和原降钙素；PLGF和S100b；PLGF和TGF β2；PLGF和TIMP1；原降钙素和S100b；原降钙素和TGF β2；原降钙素和TIMP1；S100b和TGF β2；S100b和TIMP1；以及TGF β2和TIMP1。
该生物体可能包括妊娠的生物体，如妊娠的哺乳动物，例如妊娠的人类。所述妊娠的生物体可以处于早期妊娠、中期妊娠或晚期妊娠。
与健康状态相比，在先兆子痫状态下，GM1神经节苷脂微粒多肽/组合与膜联蛋白VCD9微粒多肽/组合的比例较高。
所述方法可能包括提供由所述目的细胞、组织、器官或生物体构成的微粒样本，或获自目的细胞、组织、器官或生物体的微粒样本。确定GM1神经节苷脂微粒(即，包括GM1神经节苷脂的微粒，所述微粒优选地结合至霍乱毒素B(CTB))中PAI-1、PLGF、原降钙素、S100b、TGFβ或TIMP1的数量，或以下组合的数量：PAI1和PLGF、PAI1和原降钙素、PAI1和S100b、PAI1和TGF β2、PAI1和TIMP1、PLGF和原降钙素、PLGF和S100b、PLGF和TGF β2、PLGF和TIMP1、原降钙素和S100b、原降钙素和TGF β2、原降钙素和TIMP1、S100b和TGF β2、S100b和TIMP1或TGFβ2和TIMP1。
还确定了膜联蛋白V微粒(即，包括暴露的磷脂酰丝氨酸的微粒，所述微粒优选地结合至膜联蛋白V)中所述选定的多肽或多肽组合的数量。随即确定GM1神经节苷脂微粒中所述多肽或组合的数量与膜联蛋白V微粒中所述CD9多肽或组合的数量的比例。将所述比例与正常或健康的(如未患先兆子痫的)细胞、组织、器官或生物体中GM1神经节苷脂微粒多肽或组合数量与膜联蛋白V微粒多肽或组合数量的比例进行比较。
当所述目的细胞、组织、器官或生物体的比例高于“正常的”目的细胞、组织、器官或生物体的比例时，则所述目的细胞、组织、器官或生物体被确定患有先兆子痫或处于患病风险中。
状态变化的监测
根据本文所述的方法和组合，GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例可用于监测细胞、组织、器官或生物体状态的变化。
因此，本发明人描述一种用于检测细胞、组织、器官或生物体的状态变化的方法。所述方法可能包括检测所述细胞、组织、器官或生物体中GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例(或包括这一比例的图谱)的变化。这一变化指示所述细胞、组织、器官或生物体的状态的变化。
这类细胞、组织、器官或生物体的状态变化可能包括生理状态的变化。所述生理状态可包括分化状态；也就是说，GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例可用于确定细胞、组织、器官或生物体是分化的还是未分化的。所述生理状态可以包括发育状态或发育阶段。
因此，GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例可用于确定细胞、组织、器官或生物体是否处于或来自胚胎状态或阶段、胎儿状态或阶段、新生儿状态或阶段、婴儿状态或阶段、幼年状态或阶段、学步婴儿(toddler)的状态或阶段、青春期状态或阶段、成年状态或阶段等。
可以在随时间间隔监测或追踪细胞、组织、器官或生物体的GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例，以确定或监测或检测状态的变化。
应理解，当提及建立或确定细胞、组织、器官或生物体的状态时，其包含建立或确定所述状态本身，以及建立或确定细胞、组织、器官或生物体是否处于过渡至或进入至该状态的风险(以及细胞、组织、器官或生物体处于过渡至或进入至该状态的风险的程度)。即，状态的确定包括确定进入或患有该状态的风险。
检测和治疗疾病
本发明人描述了一种用于检测细胞、组织、器官或生物体中疾病的方法，该方法包括获得由该细胞、组织、器官或生物体构成的样本或获自该细胞、组织、器官或生物体的样本，对所述样本实施上文所述的方法，并将由此获得的GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例与已知由患病细胞、组织、器官或生物体构成的样本或已知获自患病细胞、组织、器官或生物体样本的GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例进行比较。
本发明人进一步描述一种用于治疗或预防细胞、组织、器官或生物体中的疾病的方法，所述方法包括如上文所述检测细胞、组织、器官或生物体的疾病，并且将用于该病的治疗给予所述细胞、组织、器官或生物体。
所述方法可以使得所述样本选自：尿液、血液、泪液、唾液、支气管肺泡液、肿瘤渗出液、附睾液、羊水和乳。
所述方法可以使得所述微粒包括微泡、外来体、核外粒体或凋亡小体。
微粒
具体地，所述微粒包括囊泡，如微泡。所述微粒可能包括外来体。
所述微粒可能包括由脂质双层限定囊泡或扁平的球体。所述微粒的直径可为40-100nm。所述微粒可由核内体膜向内出芽形成。所述微粒的密度可为约1.13-1.19g/ml，并可漂浮在蔗糖梯度上。所述微粒可富集胆固醇和神经鞘磷脂，以及脂伐标记物(如GM1、GM3、浮舰蛋白(flotillin)及src蛋白激酶Lyn)。
分离微粒的方法是本领域中已知的，并且详细记载在下述实施例及如国际专利公开WO 2009/105044中。
具体地，本发明人描述了一种快速分离血浆中存在的不同脂质微粒的技术，这些微粒可用于识别和/或分类不同微粒亚群体中的生物标记物，以提高其诊断、预后或治疗诊断学上的价值。
因此，本发明人提供一种处理含有微粒的样本的方法，所述方法包括：(a)选择所述样本中包括GM1神经节苷脂的微粒；和/或(b)选择所述样本中包括暴露的磷脂酰丝氨酸的微粒。
所述方法可以使得步骤(a)包括选择所述样本中结合至霍乱毒素亚基B(CTB)的微粒；或其中步骤(b)包括选择所述样本中结合至膜联蛋白V的微粒，或二者。
所述方法可以使得其进一步包括通过尺寸(例如通过分子筛色谱法)选择微粒的步骤。
所述方法可以使得所述微粒包括CD9+微粒。
特别地，本发明人提供一种快速地从血浆中分离脂质微粒的膜联蛋白V-和CTB-结合的亚级分的方法，用于检测微粒相关的蛋白。对脂质微粒亚群中膜联蛋白V-和CTB-结合的亚级分的快速分离可以提供一种将已知疾病生物标记物进一步分类为更具体的血浆亚级分并且提高它们的诊断、预后和治疗诊断学的价值的方法。
本发明人提供一种方法，用于分级分离包含微粒的样本。所述方法包括选择微粒中的膜联蛋白V-亚级分或CTB-结合的亚级分，或二者。所述方法包括进行上文描述的方法。
所述方法可进一步包括对已分级分离的微粒样本中的膜蛋白和/或腔蛋白进行检测和/或定量的步骤。
本发明人提供一个纯化的微粒样本，其中：(a)实质上所述样本中的所有微粒都能够结合至霍乱毒素B(CTB)但不能结合至膜联蛋白V；或(b)实质上所述样本中的所有微粒都能结合至膜联蛋白V结合但不能结合至霍乱毒素B(CTB)。
病理学状态的监测
所述细胞、组织、器官或生物体的状态可能包括病理学状态，如疾病状态。因此，所述GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例可以用于检测细胞、组织、器官或生物体的病理学状态，或从正常状态至病理学状态的改变。
所述GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例可用于检测所述细胞、组织、器官或生物体是否处在正常(未患病)状态或患病状态。其可用于监测细胞、组织、器官或生物体从正常的未患病准港台至患病状态的进展。其可用于监测所述细胞、组织、器官或生物体的患病阶段。所述疾病可包括细胞、组织、器官或生物体所患有的或可能患有的任何疾病。
总的说来，所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy)、细菌性心内膜炎、无脑回畸形、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、头晕、法洛四联症、心肌炎、酒精中毒、贫血、臂丛(brachial plexus)、神经疾病、痔疮、先天性心脏缺损、斑秃、镰状细胞贫血、二尖瓣脱垂、自主神经系统疾病、畸形(abnormality)、阿尔茨海默病(alzheimer disease)、心绞痛、直肠疾病或致心律失常(arrhythmogenic right)。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：心室发育不良、红斑痤疮、弱视、强直性脊柱炎、心房颤动、心脏压塞、获得性免疫缺陷综合征、淀粉样变、食欲缺乏、焦虑、自闭症、脑肿瘤(brain neoplasm)、中枢神经系统疾病、色觉缺陷(color vision defects)、动脉硬化、背痛、乳房疾病、中枢神经系统感染、结直肠癌、关节炎、贝赫切特综合征、乳房肿瘤、大脑性瘫痪(cerebral palsy)、普通感冒、哮喘、双相型障碍(bipolar disorder)、烧伤或宫颈肿瘤。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：交流障碍、动脉粥样硬化、失明、念珠菌病、腓骨肌萎缩症(charcot-marie disease)、克罗恩病、注意力缺陷障碍、脑损伤、白内障、溃疡性结肠炎、累积性创伤疾病(cumulative trauma disorder)、囊性纤维化病、发育性残疾、进食障碍疾患、丹毒、纤维肌痛、褥疮、糖尿病、肺气肿、大肠杆菌感染、毛囊炎、吞咽功能障碍、糖尿病性足溃疡(diabetic foot)或脑炎。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：食道疾病、食物超敏反应、痴呆、唐氏综合征、日本脑炎、眼部肿瘤、食物中毒、登革热、诵读困难、子宫内膜异位、法布里氏病、肠胃炎、抑郁症、张力失常、癫痫症、慢性疲劳综合征、胃食管反流、戈谢病、血液病、先天性巨结肠、脑积水、甲状腺机能亢进、齿龈炎、血友病、组织细胞增多病、多汗症、低血糖症、青光眼、肝炎和HIV感染。例如，所述状态可能为人免疫病毒(HIV)感染状态、结核病(TB)感染状态或疯牛病(BSE)感染状态，或治疗状态，例如正接受治疗的患者。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：高草酸尿症、甲状腺功能减退、糖原积累症、肝豆状核变性、霍奇金病(hodgkin disease)、超敏反应、免疫缺陷综合征、头疼、疝气、霍-奥二氏综合征(holt-oram syndrome)、高血压、阳痿、充血性心力衰竭、生殖器疱疹、亨廷顿病、肺动脉高血压、失禁、不育、白血病、全身性红斑狼疮、足分支菌病、智力迟钝、炎症、肝肿瘤、莱姆病、疟疾或先天性代谢缺陷。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：炎性肠病、QT间期延长综合征、淋巴管肌瘤病、麻疹、偏头痛、流感、下腰痛、淋巴水肿、黑色素瘤、口腔异常(mouth abnormality)、乳胶过敏、阻塞性肺病、淋巴瘤、脑膜炎、粘多糖贮积症(mucopolysaccharidoses)或麻风病。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：肺肿瘤、黄斑变性、绝经期、多发性硬化、肌肉萎缩症、肌筋膜痛综合征、骨关节炎、胰腺肿瘤、消化性溃疡、重症肌无力、恶心、骨质疏松、惊恐性障碍、海湾战争综合征(persian gulf syndrome)、骨髓瘤、听神经瘤、中耳炎、截瘫、苯丙酮尿症、骨髓增生障碍、眼球震颤、卵巢肿瘤或帕金森病。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：嗜铬细胞瘤、心肌病、机会性感染、疼痛、睫状体平坦部炎(pars planitis)、恐怖性障碍、心肌梗塞、遗传性视神经萎缩、胰腺疾病、虱病、瘟疫(plague)、毒漆藤皮炎、朊病毒疾病、反射性交感神经萎缩症(reflexsymphathetic dystrophy)、精神分裂症、羞怯、小儿麻痹症、前列腺疾病、呼吸道疾病、硬皮病、干燥综合征或风湿性多肌痛。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：前列腺肿瘤，多动腿、脊柱侧凸、皮肤疾病，脊髓灰质炎后综合征(post-poliomyelitis syndrome)、牛皮癣、视网膜疾病、坏血病、皮肤肿瘤、癌前状态(precancerous conditions)、狂犬病、成视网膜细胞瘤、性别异常(sex disorders)、睡眠障碍、怀孕、罕见病、结节病、性传播疾病、痉挛性斜颈或脊髓损伤。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：口吃、睾丸肿瘤、拔毛狂、尿路感染、脊柱裂病(spinal dystaphism)、物质相关性障碍(substance related disorder)、地中海贫血、三叉神经痛、泌尿生殖器疾病、脊髓小脑的退化，婴儿猝死、血栓形成、结核病、血管疾病、斜视、自杀、耳鸣、结节性硬化症、病毒疾病、创伤后应激障碍、脊髓空洞症、图雷特多综合征，特纳综合征或视觉障碍。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：心理应激、颞下颌关节功能紊乱综合征、沙眼、尿失禁、呕吐、冯·威利布兰德病、肾骨营养不良、细菌感染、消化系统肿瘤、骨肿瘤、外阴疾病、异位妊娠、蜱传播的疾病、马方综合征、衰老、威廉斯综合征、血管生成因子、荨麻疹，脓毒病、吸收不良综合征或创伤和伤害。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：脑血管意外、多种化学物质过敏症(multiple chemical sensitivity)、头晕、肾盂积水、黄热病、神经源性关节病、肝细胞癌、多形性腺瘤、法特壶腹(vater′s ampulla)、梅克尔憩室、圆锥角膜、皮肤疣、有害建筑综合征、泌尿系统疾病、缺血性视神经病变、胆总管结石、耳鼻喉科疾病、上腔静脉综合征、鼻窦炎、桡骨骨折、畸形性骨炎、滋养层肿瘤、软骨肉瘤或阅读(reading)和颈动脉狭窄。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：静脉曲张、克雅二氏综合征(creutzfeldt jakob syndrome)、胆囊疾病、关节替换、白癜风、鼻疾病、环境性疾病、巨结肠、肺炎、前庭疾病、隐球菌病、带状疱疹、输卵管肿瘤、感染、心律失常、葡萄糖耐受不良、神经内分泌肿瘤、疥疮。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：酒精性肝炎、寄生虫病、输卵管炎、隐球菌脑膜炎、颅内动脉瘤、悲伤、结石、色素痣、直肠肿瘤、霉菌病、血管瘤、结肠肿瘤、维生素A过多症、肾钙质沉着症、肾肿瘤、维生素、类癌肿瘤、乳糜泻、脑下垂体疾病、脑死亡、胆道疾病或前列腺炎。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：医源性疾病、胃肠出血、腺癌、中毒性巨结肠、截肢、脂溢性角化病、骨髓炎、巴雷特食管、出血、胃肿瘤、水痘、胆囊炎或软骨瘤。
所述疾病状态可包括以下的任一种或多种：细菌感染和霉菌病、甲状旁腺肿瘤、精索扭转、腺瘤、扁平苔癣、肛门腺肿瘤、脂肪瘤、脚癣、酒精性肝疾病、神经纤维瘤病、淋巴疾病、老人虐待、湿疹、憩室炎、癌、胰腺炎、阿米巴病、妊娠并发症、肾盂肾炎、传染性单核细胞增多症或动脉瘤。
所述疾病状态可包括先兆子痫，如在妊娠生物体例如孕妇中。所述妊娠生物体可处于早期妊娠、中期妊娠或晚期妊娠。例如，可从处于晚期妊娠的孕妇处获得样本，并如本文所述进行分析，以确定其是否患有先兆子痫或处于患病风险中。
具体地，所述患病状态可包括糖尿病、免疫障碍、神经变性障碍或癌症或肿瘤。因此，所述GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例可用于检测细胞、组织、器官或生物体的状态，所述细胞、组织、器官或生物体患有或倾向于患有任意上述疾病。
恢复情况的监测
可在同一个体的两种不同微粒群体(膜联蛋白V-和CTB-结合的亚级分)中监测蛋白质水平(包括血浆CD9水平)——例如，在食物中毒过程中——以监测患者中的损伤、恢复和基线水平(baseline)。
CD9在一个群体中的水平可指示组织损伤，而CD9在另一群体中的水平可指示组织修复。通过测定这两个群体中的相对值，可以确定患者是否具有更多的组织损伤(例如生病、预后不良)、已经开始组织修复(例如恢复、预后良好)或处于良好健康状态。
GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例也可用于指示所述患者的预后。
生物样本
本文所述的方法和组合包含由细胞分泌的GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例，用于检测其状态。方便地，可通过提取包括所述细胞分泌物的生物样本来确定所述比例。
当所述细胞被包含于生物体中时，所述样本可包括实际上任何生物体的任何数目的事物，所述食物包括但不限于体液(包括但不限于血液、鼻咽分泌物、尿液、血清、淋巴、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液和精液)。
微粒的制备
CTB或膜联蛋白V结合微粒可通过以下方案由血浆(或其他液体)制备：
将10μL血浆用0.1μg生物素化的霍乱毒素亚基B(CTB)(SBL Vaccin AB)或0.1μg生物素化的膜联蛋白V(AV)(BioVision)在100μL、pH7.4的PBS中于37℃下孵育1小时，并在800rpm下震荡。同时，将100μL
Figure BDA0002635715030000231
M-280链霉亲和素(Invitrogen)用100μL PBS洗涤三次。最后一次洗涤后，将血浆-CTB或血浆-AV反应混合物加入清洗后的珠中，并在800rpm的震荡条件下孵育30分钟。将所述珠用磁铁固定，并将上清液移除。随后用200μlPBS洗涤所述珠三次，每次用磁铁固定所述珠后将洗出液移除。
GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例
GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例可以简单地计算为GM1神经节苷脂微粒中多肽的量与膜联蛋白V微粒中多肽的含量的比例。
替代地或额外地，GM1神经节苷脂微粒中另一种多肽的量与该肽在膜联蛋白V微粒中的量的比例可用作内部控制(internal control)，已知该多肽的量不会因细胞状态的改变而变化。
因此，替代地或额外地，检测所述GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例，第一比例与第二比例的比例可用于监测目的。本文中，第一比例是GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例，已知该比例会因细胞状态的变化而改变；第二比例是GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例，已知该比例不会因细胞状态的变化而改变。
GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例的图谱
替代地或额外地，除确定GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例，还可建立包括GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例的图谱，用于多个选定的多肽种类，每种均指示所述细胞的状态。对该图谱的变化的监测可作为检测细胞状态的手段。该图谱可通过本领域中已知的任何手段建立，如通过与包括多种结合剂的阵列进行杂交，所述结合剂能够结合至并且区分多种选定多肽种类中的每一种。
实施例
实施例1：从正常个体的血清富集CD9+微粒
在此项研究中，本发明人第一次确定，CTB是否会结合血清中CD9+微粒。由于缺乏CTB-结合的CD9，本发明人确定血清CD9+微粒在蔗糖密度梯度中的沉降密度，并发现血清中的CD9的沉降密度高于外来体。
缺乏CTB结合和高沉降密度表明CD9+微粒是凋亡小体。这随后由血清CD9与膜联蛋白V的结合证实。
实施例2：材料和方法——分子筛色谱法
将2mL
Figure BDA0002635715030000241
2B树脂(Sigma Aldrich，Cat no.2B300)装填到离心柱(Bio-Rad，Cat n0.732-6008)中，并在800g下离心1分钟。除去上清液，并通过以下方式冲洗：加入1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)，随后在800g下离心1分钟。随后，上样1mL人血清，并在800g下离心1分钟。
收集穿过液，并将此过程重复三次，每次使用1mL PBS。收集三个洗出液级分。每一级分各取20μl，在4～12％SDS/聚丙烯酰胺凝胶上分离。所得凝胶用SilverQuestTM SilverStaining Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA)染色，或电转染到硝酸纤维素膜上。所述膜用1∶50稀释的小鼠抗-人CD9抗体标记，随后用1∶1250稀释的HRP-缀合的驴抗-小鼠IgG抗体标记。
所有抗体从Santa Cruz购得。结合的抗体是使用HRP-增强的化学发光底物(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA)显色，并暴露于X-射线胶片。
实施例3：材料和方法——霍乱毒素B亲和色谱法
将分子筛色谱所得的200μL穿过液用0.1μg生物素化的霍乱毒素亚基B(CTB)(Invitrogen)在室温下于100μl pH7.4的PBS中孵育1小时，并于800rpm下震荡。在用100μlPBS洗涤了三次100μl
Figure BDA0002635715030000242
M-280链霉亲和素(Invitrogen)后，加入反应混合物，并在800rpm下震荡孵育30min。
所述珠用磁铁固定，将上清液或未结合的级分移除。随后用100μl PBS清洗所述珠两次，每次将所述珠用磁铁固定后，将洗出液移除。将所述珠在100μl变性/还原性SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸，以洗脱残留的结合蛋白。将等体积的未结合级分、洗出液、洗脱的级分和结合的级分在4-12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离。
所述凝胶用银染色，或电转染到硝酸纤维素膜上。所述膜用1∶50稀释的小鼠抗-人CD9抗体标记。第二抗体为1∶1250稀释的HRP-缀合的驴抗-小鼠IgG抗体。所有抗体从SantaCruz购买。结合的抗体是使用HRP-增强的化学发光底物(Thermo Fisher ScientificInc.，Waltham，MA)显色，并暴露于X-射线胶片。
实施例4：材料与方法——蔗糖梯度
制备14个浓度从22.8％至60％的蔗糖溶液，并从浓度最大的溶液开始将其依次分层于超速离心管(Beckman Coulter Inc.，CA)中。将500μL人血清上样在顶部，随后在SW60Ti转子(Beckman Coulter Inc.)中于4℃下以200000g下超高速离心16.5h。离心后，从梯度顶部开始，收集320μL的13个级分。
通过称重固定的体积确定每个级分的密度。将每20μL的每个级分在4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。所得凝胶用SilverQuestTM Silver Staining Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA)染色，或电转染到硝酸纤维素膜上。所述膜用1∶50稀释的小鼠抗-人CD9抗体标记，随后用1∶1250稀释的HRP-缀合的驴抗-小鼠IgG抗体标记。所有抗体从Santa Cruz购买。
结合的抗体是通过HRP-增强化学发光底物(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA)显色，并暴露于X-射线胶片。将获自蔗糖梯度的级分9～13合并，并相对于pH7.4的PBS透析过夜。将合并的级分浓缩至20μL。
实施例5：材料和方法——膜联蛋白V亲和色谱法
将获自蔗糖梯度的20μL合并的级分与20μL 5×膜联蛋白V结合缓冲液(Calbiochem)混合，并用水将补充至100μL的终体积。将90μL所述合并的级分样本用10μL膜联蛋白V在室温下孵育1h，并于800rpm下震荡。
在用100μl PBS将100μl
Figure BDA0002635715030000251
M-280链霉亲和素(Invitrogen)清洗三次后，加入反应混合物并在800rpm下震荡孵育30min。用磁铁固定所述珠，将上清液或未结合的级分移除。随后用100μl PBS清洗所述珠四次，每次将所述珠用磁铁固定后，将洗出液移除。
将所述珠在100μl变性/还原性SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸，以洗脱残留的结合蛋白。将等体积的未结合级分、洗出液、洗脱的级分和结合的级分在4-12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离。所述凝胶电转染到硝酸纤维素膜上。
所述膜用1∶50稀释的小鼠抗-人CD9抗体标记。第二抗体为1∶1250稀释的HRP-缀合的驴抗-小鼠IgG抗体。所有抗体从Santa Cruz购买。
结合的抗体是使用HRP-增强的化学发光底物(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA)显色，并暴露于X-射线胶片。
实施例6：健康个体血清中的CD9结合膜联蛋白V而非CTB
为确定存在于健康个体血清中的CD9+微粒，先将血清按照通过尺寸分级分离，以富集大颗粒并除去大量小血清蛋白如白蛋白。随后，将分级分离的血清与CTB孵育，以确定血清中CD9是否与膜联蛋白结合。
实施例7：结果——大CD9+微粒存在于健康个体血清中(通过CTB)
所述结果示于图1中。
对血清的尺寸分级分离使得CD9在穿过液和洗出液1级分中富集，表明CD9——一个小蛋白——必定与大的复合物相结合。
实施例8：结果——CD9+微粒不与CTB结合
所述结果示出于图2的上图。
大部分蛋白(包括CD9)不与CTB结合(下图)。因此，健康个体血清中的CD9+微粒不与CTB结合，且不具有GM1神经节苷脂。健康个体血清中的CD9+微粒不是外来体。
实施例9：结果——CD9+微粒具有高沉降密度
所述结果示于图3中。
为鉴别健康个体血清中CD9+微粒的种类，将所述血清在蔗糖密度梯度上分级分离，并用SDS/PAGE和蛋白质印迹对级分进行分析。CD9+微粒在1.181-1.226g/ml的密度沉降。该密度为凋亡小体的预期密度，而非外来体的预期密度(为1.13-1.19g/ml)(Thery，Ostrowski et al.2009)。
实施例10：结果——健康人血清中CD9+微粒与膜联蛋白V结合所述结果示于图4中。
为确认部分CD9+微粒为凋亡小体，本发明人确定了这些微粒能否与膜联蛋白V结合。由于在将10种以上结合的级分上样到凝胶上时仅检测到CD9，因此一部分高密度(dense)的CD9+微粒而非全部CD9+微粒可与膜联蛋白V结合。
实施例11：结论
健康个体的血清含有CD9+微粒。但是，这些微粒并非外来体，或这些微粒中极小一部分为外来体。这些微粒不与CTB结合，因此几乎不具有或不具有高度富集于脂伐中的GM1神经节苷脂或脂质——外来体膜的标志性特征。
另外，大多数微粒，如果不是全部，为高密度的微粒，其在蔗糖中的沉降密度为1.181-1.226g/ml，而非外来体的1.13-1.19g/ml。相反，较大的比例为含有暴露的PS的高密度的凋亡小体。其余的微粒也可为凋亡小体，但这一点需要证实。健康个体血清中CTB-结合的CD9+微粒的低水平可提高疾病的任何生物标记物的可预测性或者血浆中CTB-结合的CD9+微粒衍生的疾病的易感性。
考虑到外来体是作为神经元和免疫细胞中细胞间通讯的载体分泌(Smalheiser2007；Thery，Ostrowski et al.2009)，且许多疾病相关的蛋白被报道以外来体的形式分泌，如阿尔茨海默病的β-淀粉样多肽(Rajendran，Honsho et a1.2006)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的J774细胞中的分枝杆菌蛋白(Giri，Kruh et al.2010)和肿瘤抗原(Taylor and Gercel-Taylor 2005)，本发明人观察到在健康个体的血清中CTB-结合的CD9+微粒的低基线水平可能是相对良好健康状态的指示物，其提高可能是疾病、疾病损伤或组织修复的细胞通讯增加的标记(sentinel)。
因此，对这一微粒群体的分析可能产生更多预测性生物标记物，用于对疾病进行诊断和预后。
实施例12：血浆中和MSC-条件化培养基中脂质微泡间的差异
材料和方法
将用Myc-转化的ES-衍生MSC系(Myc-HuES9.E1)条件化的培养基和血浆上样到蔗糖密度梯度上。所述梯度是通过将14个浓度为23％至60％(w/v)的蔗糖溶液分层而制备。
上样所述样本后，将所述梯度在4℃下于200000g下离心18h。从顶部移除梯度得到13个级分。通过称重100μL每种级分来确定每种级分的密度。确定每种级分中CD9+膜联蛋白V-结合的微泡和CD9+CTB-结合的微泡的相对水平。
结果：
请参见图5。
血浆中CD9+微泡主要为膜联蛋白V-结合的，而MSC-条件化的培养基主要是霍乱毒素B-链(CTB)结合的。
血浆中，CTB-结合的微泡漂浮于两种不同的蔗糖密度：1.21-1.59和＞1.173g/ml，而CTB-结合的微泡漂浮于一个密度，即1.065-1.191g/ml。
注意：在血浆和MSC-条件化的培养基中的CD81+微泡表现出与CD9+微泡相同的分布特征。
实施例13：心脏病患者和健康个体的血浆中膜联蛋白V-结合的微泡与CTB-结合的微泡中蛋白的分布
材料与方法
请参见图6A和图6B。
将健康个体(H)和心脏病患者(D)的血浆用生物素化的膜联蛋白V(图6A)或霍乱毒素B(图6B)孵育。用链霉亲和素-缀合的磁珠提取结合膜联蛋白V或霍乱毒素B的微泡。这些被分离的微泡中的蛋白质是在ELISA中用特定抗体测定。
结果
在健康个体和心脏病患者之间，膜联蛋白V-和CTB-结合的血浆微泡中一些蛋白为差异分布的，例如
与健康个体相比，在患者中膜联蛋白V-结合的而非CTB-结合的血浆微泡中CD9、CD81和TIMP1明显较高；
与健康个体相比，在患者中CTB-结合的而非膜联蛋白V-结合的血浆微泡中ANP明显较高。
其他蛋白质可在患者与健康个体的两种微泡类型中表现出显著不同的分布特性，如果群体更大和/或疾病被限定的更窄。
其他可用于评价心脏病患者和健康个体的血浆微泡的区别的生物标记物为BNP、内皮素、凝乳酶、血管紧张素II、肌钙蛋白、肌球蛋白、IL 6、IL1、IL10、TNFα和TGFβ。
实施例14：慢性心力衰竭(CHF)患者和急性心肌缺血(AMI)患者的血浆中膜联蛋白V-与CTB-结合微泡中的蛋白质分布
为评价分级分离血浆微泡对于生物标记物测定法的可行性和价值，本发明人将该技术应用于获自更具体的患者群体的血浆样本：慢性心力衰竭(CHF)患者及急性心肌缺血(AMI)患者。对照组为来自健康个体的血浆(con)(图7)。
材料和方法
针对微泡A或B中的每一种生物标记物，使用5-10μl心力衰竭患者(CHF)、健康个体(Con)和AMI患者(AMI)的血浆。通过以下方法确定微泡A或B中BNP、Flt-1、TIMP-1、CD9和ANP的相对水平：首先利用亲和色谱法分离所述微泡，随后利用配体特异性的抗体进行ELISA。Flt-1和CD9是膜结合蛋白，而BNP、TIMP-1和ANP是腔蛋白。
分析不同患者组的微泡A或微泡B中这些蛋白的分布。相对于Con个体，CHF和AMI患者在微泡B而非微泡A中具有显著较高的BNP水平。AMI患者的微泡A和微泡B中的Flt-1均高于Con个体。
但是，CHF患者的微泡A中的Flt-1较低，并且其微泡B中的Flt-1与Con个体无明显区别。在这三个患者组的微泡中，只有CHF患者中与微泡A-相关的TIMP-1显著不同，即较高。
在CHF和AMI患者中，CD9在微泡A而非微泡B中显著较高。在CHF和AMI患者中，ANP在微泡A中显著较高。在微泡B中，仅AMI患者的ANP A显著较高。
结果
请参见图7。
通过其与CTB或膜联蛋白的亲和力分离的微泡(图7)彼此不同，这是通过它们的不同蛋白质图谱所示(图7)。这些差异同样是疾病特异性的。例如，CHF、AMI和con的膜联蛋白V-结合的微泡中BNP水平在所有这三个患者组中未有明显区别。
但是，CHF和AMI的CTB-结合微泡级分中的BNP水平明显高于对照。另一方面，与con组相比，CHF和AMI组中膜联蛋白级分中ANP(图7)明显较高，而CTB级分中的ANP仅在AMI组中明显较高。
实施例15：在一例食物中毒中监测血浆CD9
在所述事件期间和三周后，用上述方法分析从食物中毒个体获得的血浆。将相隔三周从健康个体获得的两个血浆样本用作对照。
所述结果示于图8中。将在食物中毒前(A1)和食物中毒三周后(A2)的CTB级分和AnnV级分的平均荧光相对于B1和B2中的平均荧光作图。B1和B2为相隔三周从健康对照获得的血浆样本。
实施例16：开发将CTB或膜联蛋白V结合微泡的分离与微泡中膜蛋白和腔蛋白的定量偶联的测定法
材料和方法
请参见图9。
首先，将血浆用生物素化的CTB孵育，随后用链霉亲和素-缀合的磁珠孵育。之后，用磁铁固定所述磁珠，并用PBS或等张盐溶液清洗。将结合的微泡用基于去垢剂的通用细胞裂解缓冲液裂解。
随后，将所述微泡的内容物用活化的生物素(例如sulfo-NHS-生物素)进行生物素化。随后，为测定特定蛋白质，加入缀合有特异性针对目的蛋白的抗体的磁珠。然后，将所述抗体结合的蛋白质通过磁铁固定并且进行彻底清洗。
该蛋白质是通过利用链霉亲和素-缀合的HRP和HRP比色法或荧光底物定量。
实施例17：结论
本技术可以定量测定分离的微泡中膜蛋白和腔蛋白——本发明人可以检测膜蛋白和腔蛋白(图7)。用于检测膜蛋白和腔蛋白的方法在图8中图解示出。
实施例18：具有/不具有先兆子痫的临床诊断的孕妇(晚期妊娠)血浆中膜联蛋白V-和CTB-结合微泡中蛋白的差异分布——单一多肽
针对膜联蛋白V(AV)-或霍乱毒素B链(CTB)-结合的微泡中每一种生物标记物(见下表E1和E2)，5-10μl获自未患先兆子痫的晚期妊娠孕妇(对照组)和具有临床诊断的先兆子痫的晚期妊娠孕妇(先兆子痫)的血浆。
膜联蛋白V(AV)-或霍乱毒素B链(CTB)-结合的微泡中PAI-1、PLGF、原降钙素、S100b、TGFβ和TIMP-1的相对水平是如下文所述测量。
简单地说，首先通过亲和色谱法分离AV-或CTB-结合的微泡，人后裂解将该分离的微泡，以释放与所述微泡相关的蛋白质，然后将释放的蛋白质生物素化。之后使用缀合至HRP的特异性抗体和荧光HRP底物测定目的靶蛋白。
图10表明，具有和不具有先兆子痫的临床诊断的孕妇(晚期妊娠)血浆中，膜联蛋白V-和/或CTB-结合微泡中PAI-1、PLGF、原降钙素、S100b、TGFβ和TIMP-1表现出显著的数量差异(p＜0.05)。
因此，这些微泡-包裹的蛋白质可用作诊断先兆子痫的生物标记物。
实施例19：具有/不具有先兆子痫的临床诊断的孕妇(晚期妊娠)血浆中膜联蛋白V-和CTB-结合微泡中蛋白的差异分布——多肽的组合
当以两种蛋白的组合的形式使用时，无论是相同的血浆微泡或不同微泡中，这些标记物的诊断能力均得到显著提高(图10)。
利用逻辑回归模型(logistic regression model)(Moore et al，2008)，建立接受者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲线，并且计算CTB-或AV-结合的微泡中每种标记物或两种不同标记物组合的曲线下面积(下表E1和表E2)。例如，曲线下CTB-微泡中PAI-1和PLGF的面积分别为0.972和0.833。
当组合PAI-1和PLGF时，曲线下面积增加至1.0(下表E1)。
曲线下面积
PAI-1 .972
PLGF .833
原降钙素 1.000
S-100b 0.889
TGF β2 0.972
TIMP1 0.833
PAI1-PLGF 1.000
PAI1-原降钙素 1.000
PAI1-S100b .972
PAl1-TGF β2 1.000
PAI1-TIMP1 1.000
PLGF-原降钙素 1.000
PLGF-S100b .889
PLGF-TGF β2 1.000
PLGF-TIMP1 .917
原降钙素-S 100b 1.000
原降钙素-TGF β2 1.000
原降钙素-TIMP1 1.000
S100b-TGF β2 1.000
S100b-TIMPl .917
TGFβ2-TIMP1 .972
表E1：为血浆CTB-微泡中的每一生物标记物建立接受者工作特征(ROC)曲线，并计算每种标记物或两种不同标记物的组合的曲线下面积。
相似的，组合AV-微泡中两种或多种标记物(例如PLGF和原降钙素)同样提高了它们各自的曲线下面积，分别从0.889和0.861到1.0(下表E2)。
曲线下面积
PAI-1 1.000
PLGF .889
原降钙素 .861
S-100b .972
TGF β2 .972
TIMP1 1.000
PAI1-PLGF 1.000
PAI1-原降钙素 1.000
PAI1-S100b 1.000
PAI1-TGF β2 1.000
PAI1-TIMP1 1.000
PLGF-原降钙素 1.000
PLGF-S100b 1.000
PLGF-TGF β2 1.000
PLGF-TIMP1 1.000
原降钙素-S 100b 1.000
原降钙素-TGF β2 1.000
原降钙素-TIMP1 1.000
S100b-TGF β2 1.000
S100b-TIMPl 1.000
TGFβ2-TIMP1 1.000
表E2：为血浆AV-微泡中的每种生物标记物建立接受者工作特征(ROC)曲线，并计算每种标记物或两种不同标记物的组合的曲线下面积。
以上实施例说明当以两个或多个生物标记物的组合形式使用时，这些生物标记物具有诊断先兆子痫的稳定性。
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本文中提及的每篇申请和专利，以及每篇上述申请和专利中所引用或参考的每篇文献(包括每篇所述申请和专利的审查过程中)(“申请引用的文献”)，以及每篇所述申请和文章中及任何所述申请引用的文献中所引用或参考的任何产品的任何生产商说明书或目录，均通过引用的方式纳入本申请。另外，本文所引用的所有文献，本文所引用的文献中所引用或参考的所有文献，以及本文中所引用或参考的任何产品的任何生产商的说明书或目录，均通过引用的方式纳入本申请。
对于本领域技术人员来说，对本发明所述方法和系统的各种改变和修改是明显的，而不偏离本发明的范围和精神。尽管已经参照具体优选的实施方案描述了本发明，但是应理解所要求保护的本发明不应被不恰当地限于这些具体的实施方案。事实上，对于分子生物学和相关领域的普通技术人员来说明显的多种对所述用于实施本发明的模式的改变意欲被包括在权利要求的范围内。

Claims (6)

1.一种处理包含微粒的样本的方法，所述方法包括：
(a)选择所述样本中包括GM1神经节苷脂的微粒；和/或
(b)选择所述样本中包括暴露的磷脂酰丝氨酸的微粒。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)包括选择所述样本中结合至霍乱毒素亚基B(CTB)的微粒；或其中步骤(b)包括选择所述样本中结合至膜联蛋白V的微粒，或者二者。
3.根据权利要求1或2的方法：
(a)其进一步包括通过尺寸选择微粒的步骤，例如通过分子筛色谱法；
(b)其中所述微粒包括CD9+微粒；
(c)其中所述样本选自：尿液、血液、泪液、唾液、支气管肺泡液、肿瘤渗出液、附睾液、羊水和乳；或者
(d)其中所述微粒包括微泡、外来体、核外粒体或凋亡小体。
4.一种用于分级分离含有微粒的样本的方法，所述方法包括：(a)选择微粒的膜联蛋白V-亚级分或微粒的CTB-结合亚级分，或者二者；或(b)实施根据前述权利要求任一项的方法。
5.根据权利要求4的方法，其还包括在微粒的分级分离样本中检测和/或定量膜蛋白或腔蛋白或二者的步骤。
6.一种微粒的经纯化的样本，其中：
(a)实质上所述样本中所有微粒都能够结合至霍乱毒素B(CTB)但不能够结合至膜联蛋白V；或
(b)实质上所述样本中的所有微粒都能够结合至膜联蛋白V但不结合至霍乱毒素B(CTB)。
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