JP2015504310A - 生物学的モニタリングのためのアネキシンvのマイクロ粒子ポリペプチドに対するgm1ガングリオシドの比 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願人らは、細胞、組織、器官または生物の状態をモニタリングする方法を提供する。
ポリペプチドは、その存在、量、質量または数等が決定され得る任意の適したポリペプチドであってもよい。
上に記す通り、単一のポリペプチドの検出の代わりに、あるいはまたはそれに加えて、2種以上のポリペプチドのいずれかの組み合わせを用いることができる。よって、本出願人らは、2種以上のポリペプチドの組み合わせが選択され、細胞、組織、器官もしくは生物に由来する試料、または細胞、組織、器官もしくは生物の試料中における、第2の種類のマイクロ粒子において検出されたそれらの質量、数、量等と比較した、第1の種類のマイクロ粒子において検出されたそれらの質量、数、量等が、第2の種類のマイクロ粒子において検出されたそれらの質量、数、量等と比較される方法について記載する。このように確定された比は、細胞、組織、器官または生物の状態を示す。
方法は、複数の選択されたポリペプチド種のための、アネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比を複数含むプロファイルを確定するステップを含み得る。プロファイルのそれぞれは、細胞、組織、器官または生物の状態を示すことができる。即ち、2種以上のポリペプチド種を用いることができる(即ち、2種以上のポリペプチド種について得られる比)。
方法は、正規化のステップをさらに含み得る。係るステップは、いずれか1種以上のタンパク質またはポリペプチドの含量または濃度が、異なる試料にわたって同一であることを決定または確実にするステップを含み得る。
本出願人らは、慢性心不全(CHF)疾患を患っている(または患うリスクがある)細胞、組織、器官または生物におけるアネキシンVマイクロ粒子におけるBNPポリペプチドのレベルが、慢性心不全(CHF)疾患を患っていない(または患うリスクがない)細胞、組織、器官または生物、例えば、健常個体におけるBNPポリペプチドのレベルと統計学的に有意差がないことを確定した。
本出願人らは、慢性心不全(CHF)疾患を患っている(患うリスクがある)細胞、組織、器官または生物におけるGM1ガングリオシドマイクロ粒子におけるTIMP−1ポリペプチド(GenBank受託番号NP_003245.1)およびCD9ポリペプチド(GenBank受託番号NP_001760.1)のレベルが、慢性心不全(CHF)疾患を患っていない(患うリスクがない)細胞、組織、器官または生物、例えば、健常個体におけるTIMP−1およびCD9ポリペプチドのレベルと統計学的に異ならないことを確定した。
本出願人らは、心血管疾患を患っている(患うリスクがある)細胞、組織、器官または生物のGM1ガングリオシドマイクロ粒子CD9ポリペプチドのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドCD9に対する比が、正常または健常な細胞、組織、器官または生物、即ち、心血管疾患を患っていない細胞、組織、器官または生物における同系のCD9比(即ち、GM1ガングリオシドマイクロ粒子CD9ポリペプチドのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドCD9に対する比)よりも高いことを実証する。
本出願人らは、慢性心不全(CHF)疾患を患っている(患うリスクがある)細胞、組織、器官または生物のGM1ガングリオシドマイクロ粒子CD9ポリペプチドのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドCD9に対する比が、正常または健常な細胞、組織、器官または生物、即ち、慢性心不全(CHF)疾患を患っていない細胞、組織、器官または生物における同系CD9比(即ち、GM1ガングリオシドマイクロ粒子CD9ポリペプチドのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドCD9に対する比)よりも高いことを実証する。
本出願人らは、急性心筋虚血(AMI)疾患を患っている(患うリスクがある)細胞、組織、器官または生物のGM1ガングリオシドマイクロ粒子CD9ポリペプチドのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドCD9に対する比は、正常または健常な細胞、組織、器官または生物、即ち、急性心筋虚血(AMI)疾患を患っていない細胞、組織、器官または生物における同系CD9比(即ち、GM1ガングリオシドマイクロ粒子CD9ポリペプチドのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドCD9に対する比)よりも高いことを実証する。
本出願人らは、子癇前症を患っている(患うリスクがある)細胞、組織、器官または生物の、アネキシンVマイクロ粒子に対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子におけるポリペプチドの量またはポリペプチドの組み合わせの量の比が、正常または健常な細胞、組織、器官または生物、即ち、子癇前症を患っていない細胞、組織、器官または生物における同系のポリペプチド/組み合わせ比(即ち、アネキシンVマイクロ粒子におけるポリペプチドの量またはポリペプチドの組み合わせの量に対する、GM1ガングリオシドマイクロ粒子におけるポリペプチドの量またはポリペプチドの組み合わせの量の比)よりも高いことを実証する。
本明細書に記載されている方法および組成物に従って、GM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、細胞、組織、器官または生物の状態の様々な変化のモニターに用いることができる。
本出願人らは、細胞、組織、器官または生物における疾患を検出する方法であって、その細胞、組織、器官または生物からまたはそれらの試料を得るステップと、上に記す方法を試料について行うステップと、これにより得られたGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対する比を、罹患した細胞、組織、器官または生物のものであることまたはこれらに由来することが分かっている試料のGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対する比と比較するステップとを含む方法について記載する。
マイクロ粒子は、微小胞等、小胞を特に含み得る。マイクロ粒子は、エキソソームを含み得る。
細胞、組織、器官または生物の状態は、疾患状態等の病理学的状態を含み得る。よって、GM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、細胞、組織、器官もしくは生物の病理学的状態または正常状態から病理学的状態への変化のモニターに用いることができる。
血漿CD9レベルなどのタンパク質レベルは、例えば、食中毒の発症中に、単一の個体における2種の異なるマイクロ粒子集団(即ち、アネキシンV結合細画分およびCTB結合細画分)においてモニターして、患者における損傷、回復およびベースラインをモニターすることができる。
本明細書に記載されている方法および組成物は、その状態をモニターするための、細胞により分泌されたGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの、アネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対する比に関与する。好都合には、比は、細胞の分泌物を含む生物試料を採取することにより決定することができる。
CTB結合マイクロ粒子またはアネキシンV結合マイクロ粒子は、次のプロトコールを用いて血漿(または他の体液)から調製することができる。
GM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対する比は、GM1ガングリオシドマイクロ粒子におけるポリペプチドの含量の、アネキシンVマイクロ粒子におけるポリペプチドの含量に対する比として単純に計算することができる。
GM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの、アネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対する比の決定に代えて、またはこれに加えて、それぞれが細胞の状態を示す、複数の選択されたポリペプチド種についてのGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対する比を複数含むプロファイルを確定することもできる。このようなプロファイルの変化は、細胞の状態をモニターする手段としてモニターすることができる。プロファイルは、複数の選択されたポリペプチド種それぞれに結合し、それらの間を区別することのできる複数の結合剤を含むアレイとのハイブリダイゼーション等の、当技術分野において公知の任意の手段により確定することができる。
この試験において、本出願人らは先ず、CTBが、血清におけるCD9+マイクロ粒子と結合するか決定した。CTBと結合したCD9が存在しなかったため、本出願人らは、ショ糖密度勾配における血清CD9+マイクロ粒子の沈降密度を決定し、血清におけるCD9が、エキソソームよりも高い沈降密度を有することを見出した。
2mLのセファロース(登録商標)2B樹脂(Sigma Aldrich、Cat no.2B300)を、ピペットを用いてスピンカラム(Bio−Rad、Cat no.732−6008)に入れ、800gで1分間スピンした。上清を除去し、1mLのリン酸緩衝食塩水(PBS)を添加し、続いて800gで1分間スピンすることにより洗浄した。次に、1mLのヒト血清をロードし、カラムを800gで1分間スピンした。
分子ふるいから得られた200μLの血清フロースルーを、100μLのPBS、pH7.4における0.1μgのビオチン化コレラ毒素サブユニットB(CTB)(Invitrogen)と1時間、室温にて800rpmで振盪しつつインキュベートした。100μlのDynabeads(登録商標)M−280ストレプトアビジン(Invitrogen)を100μlのPBSで3回洗浄した後、反応ミックスを添加し、800rpmで振盪しつつ30分間インキュベートした。
22.8%から60%の濃度を有する14種のショ糖溶液を調製し、最も濃縮された溶液から始めて、超遠心チューブ(Beckman Coulter Inc.、CA)において順次重層した。500μLのヒト血清をその上にロードし、続いて16.5時間、200000g、4℃で、SW60Tiローター(Beckman Coulter Inc.)において超遠心した。遠心分離後に、勾配の上層から始めて320μLの13画分を収集した。
ショ糖勾配から得られたプール画分のうち20μLを、20μLの5×アネキシンV結合バッファー(Calbiochem)と混合し、水により最終容量100μLとした。このプール画分試料のうち90μLを、10μLのアネキシンVと1時間、室温にて800rpmで振盪しつつインキュベートした。
健常個体CTBの血清においてCD9+マイクロ粒子が存在するか決定するため、血清を先ずサイズ分画して、大型の粒子を濃縮し、アルブミン等の豊富な小型の血清タンパク質を除去した。次に、分画された血清をCTBとインキュベートして、血清におけるCD9が、アネキシンVとまたはアネキシンVに結合するか決定した。
結果を図1に示す。
結果を図2の上パネルに示す。
結果を図3に示す。
結果を図4に示す。
健常個体の血清は、CD9+マイクロ粒子を含有する。しかし、このようなマイクロ粒子は、エキソソームではないか、このようなマイクロ粒子のごく僅かな比率がエキソソームである。これらは、CTBと結合せず、したがって、エキソソーム膜の顕著な特色である、脂質ラフトに高度に濃縮されたGM1ガングリオシドまたは脂質が殆どないか、全くない。
(材料と方法)
Myc形質転換ES由来MSC株(Myc−HuES9.E1)により馴化した培養培地および血漿を、ショ糖密度勾配上にロードした。勾配は、23%から60%(w/v)濃度の14種のショ糖溶液を重層することにより調製した。
図5を参照されたい。
(材料と方法)
図6Aおよび図6Bを参照されたい。
アネキシンVおよびCTB結合血漿微小胞における数種のタンパク質は、健常個体および例えば心臓関連の診療所における患者の間で差次的に分布する。
バイオマーカーアッセイのために血漿微小胞を分画することができる実行可能性および値を評価するため、本出願人らは、より限定的な患者群:慢性心不全(CHF)患者および急性心筋虚血(AMI)患者に由来する血漿試料に本技術を適用した。対照は、健常個体(con)由来の血漿である(図7)。
微小胞Aまたは微小胞Bのいずれかにおけるバイオマーカー毎に、心不全患者(CHF)、健常個体(Con)およびAMI患者(AMI)に由来する5〜10マイクロリットルの血漿を用いた。先ずアフィニティークロマトグラフィーにより微小胞を単離し、続いてリガンドに特異的な抗体を用いてELISAを行うことにより、微小胞AまたはBのいずれかにおけるBNP、Flt−1、TIMP−1、CD9およびANPの相対レベルを決定した。Flt−1およびCD9は、膜結合型タンパク質であるが、BNP、TIMP−1およびANPは、内腔タンパク質である。
図7を参照されたい。
食中毒を起こした個体由来の血漿を、発症中及び発症3週間後に上述通りに解析した。健常個体から3週間置いて採取した2種の血漿試料を対照とした。
(材料と方法)
図9を参照されたい。
本技術は、単離された微小胞における膜タンパク質および内腔タンパク質の両方に関して定量的にアッセイすることができる。本出願人らは、膜タンパク質および内腔タンパク質の両方を検出することができる(図7)。膜タンパク質および内腔タンパク質の両方を検出するための方法を図8において模式的に描写する。
アネキシンV(AV)またはコレラ毒素B鎖(CTB)結合微小胞いずれかにおけるバイオマーカー毎に(下表E1およびE2を参照)、子癇前症なし(対照)および臨床的に診断された子癇前症あり(子癇前症)の第三期妊婦由来の5〜10マイクロリットルの血漿を得た。
同一の血漿微小胞または異なる微小胞のいずれかにおいて2種のタンパク質を組み合わせて用いると、これらのマーカーの診断力は、大幅に改善される(図10)。
Claims (18)
- 細胞、組織、器官または生物の状態をモニタリングする方法であって、前記細胞、組織、器官または生物に由来するマイクロ粒子の試料について、
(a)GM1ガングリオシドを含む、好ましくはコレラ毒素B(CTB)と結合するマイクロ粒子における選択されたポリペプチド(「GM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチド」)の、
(b)露出したホスファチジルセリンを含む、好ましくはアネキシンVと結合するマイクロ粒子における前記選択されたポリペプチド(「アネキシンVマイクロ粒子ポリペプチド」)
に対する比を確定するステップを含み、このように確定された前記(b)に対する(a)の比(「アネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比」)が、前記細胞、組織、器官または生物の状態を示す方法。 - 前記ポリペプチドが、テトラスパニンタンパク質(例えば、GenBank受託番号NP_001760.1を有するCD9、GenBank受託番号NP_004347.1を有するCD81、GenBank受託番号NP_001771.1を有するCD63)、Rab GTPase(例えば、GenBank受託番号NP_004153.2を有するRab5a、GenBank受託番号NP_002859.1を有するRab5bおよびGenBank受託番号NP_004574.2を有するRab5c、GenBank受託番号NP_004571.2を有するRab−27aおよびGenBank受託番号NP_004154.2を有するRab−27b、GenBank受託番号NP_006852.1を有するRab35)、LAMP(例えば、GenBank受託番号NP_005552.3を有するLamp1およびGenBank受託番号NP_002285.1を有するLamp2)、カベオリン(例えば、GenBank受託番号NP_001744.2を有するカベオリン1およびGenBank受託番号NP_001224.1を有するカベオリン2)、GenBank受託番号NP_001121620.1を有するトランスフェリン受容体(TRFC)、GenBank受託番号NP_001070145.1を有するクラスリン軽鎖A(CLTA)、GenBank受託番号NP_001825.1を有するクラスリン軽鎖B(CLTB)、GenBank受託番号NP_004850.1を有するクラスリン重鎖1(CLTC)、GenBank受託番号NP_006283.1を有するTsg101、GenBank受託番号NP_037506.2を有するAlix、GenBank受託番号NP_000593.1を有するPAI−1、GenBank受託番号NP_002623.2を有するPLGF、GenBank受託番号NP_001029124.1を有するプロカルシトニン、GenBank受託番号NP_006263.1を有するS−100b、GenBank受託番号NP_001129071.1を有するTGFベータ2(TGFB2)、GenBank受託番号NP_003245.1を有するTIMP1からなる群から選択され、好ましくは、前記ポリペプチドが、GenBank受託番号NP_001760.1を有するCD9を含む請求項1に記載の方法。
- 例えばコレラ毒素サブユニットB(CTB)と結合する前記試料におけるマイクロ粒子を選択することにより、GM1ガングリオシドを含む前記試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含む、または例えばアネキシンVと結合する前記試料におけるマイクロ粒子を選択することにより、露出したホスファチジルセリンを含む前記試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含む請求項1または2に記載の方法。
- 好ましくはステップ(a)の前に、例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより、マイクロ粒子をサイズにより選択するステップをさらに含む、またはそれぞれ前記細胞、組織、器官もしくは生物の状態を示す複数の選択されたポリペプチド種についてのアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比を複数含むプロファイルを確定するステップを含む請求項1、2または3に記載の方法。
- 前記細胞、組織、器官または生物の状態が、心血管疾患状態を含み、前記ポリペプチドがCD9を含み、前記アネキシンV CD9マイクロ粒子ポリペプチドに対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子CD9ポリペプチドの比が、健常状態と比較して心血管疾患状態においてより高い請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞、組織、器官または生物の状態が、慢性心不全(CHF)疾患状態を含み、前記ポリペプチドがCD9を含み、前記アネキシンV CD9マイクロ粒子ポリペプチドに対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子CD9ポリペプチドの比が、健常状態と比較して慢性心不全(CHF)疾患状態においてより高い請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞、組織、器官または生物の状態が、急性心筋虚血(AMI)疾患状態を含み、前記ポリペプチドがCD9を含み、前記アネキシンV CD9マイクロ粒子ポリペプチドに対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子CD9ポリペプチドの比が、健常状態と比較して急性心筋虚血(AMI)疾患状態においてより高い請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞、組織、器官または生物の状態が、子癇前症状態を含み、前記ポリペプチドが、PAI−1、PLGF、プロカルシトニン、S100b、TGFβおよびTIMP−1のうち1種またはこれらの組み合わせを含み(組み合わせが用いられる場合、前記組み合わせは、好ましくは、PAI1およびPLGF、PAI1およびプロカルシトニン、PAI1およびS100b、PAI1およびTGFベータ2、PAI1およびTIMP1、PLGFおよびプロカルシトニン、PLGFおよびS100b、PLGFおよびTGFベータ2、PLGFおよびTIMP1、プロカルシトニンおよびS100b、プロカルシトニンおよびTGFベータ2、プロカルシトニンおよびTIMP1、S100bおよびTGFベータ2、S100bおよびTIMP1ならびにTGFベータ2またはTIMP1である)、前記アネキシンVマイクロ粒子ポリペプチド/組み合わせに対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチド/組み合わせの比が、健常状態と比較して子癇前症状態においてより高い請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- (a)前記マイクロ粒子が、CD9+マイクロ粒子を含む、
(b)前記マイクロ粒子が、微小胞、エキソソーム、エクトソームもしくはアポトーシス小体を含む、
(c)前記細胞、組織、器官もしくは生物の状態が、生理学的状態、分化状態、発生状態もしくは代謝状態もしくは病理学的状態、例えば、疾患状態、ヒト疾患状態、食中毒状態、糖尿病状態、免疫障害状態、神経変性障害状態、発癌性状態、癌性状態もしくは腫瘍状態を含む、
(d)前記細胞、組織、器官もしくは生物の状態が、病的である状態、予後不良の状態、病からの回復の状態、予後良好の状態もしくは健常状態を含む、
(e)前記試料が、尿、血液、涙、唾液、気管支肺胞洗浄液、腫瘍浸出液、精巣上体液、羊水および乳汁からなる群から選択される、または
(f)以上のいずれかの組み合わせである請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 2以上の試料の間の前記選択されたポリペプチドのレベル、濃度または量を正規化するステップをさらに含み、前記正規化が、好ましくは、BNP、CD9および/またはTIMP−1ポリペプチドを参照して行われる請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- (a)細胞、組織、器官または生物の状態の変化を検出するための方法であって、前記細胞、組織、器官または生物の、アネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比(または係る比を含むプロファイル)の変化を検出するステップを含み、前記変化が、前記細胞、組織、器官または生物の状態の変化を示す方法、
(b)細胞、組織、器官または生物が、特定の状態にあることを確定するための方法であって、前記方法が、前記細胞、組織、器官または生物の、アネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比(または前記比を含むプロファイル)を、前記特定の状態にあることが分かっている細胞、組織、器官または生物の、アネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比(または係る比を含むプロファイル)と比較するステップを含む方法、
(c)細胞、組織、器官または生物における疾患を検出する方法であって、前記細胞、組織、器官または生物に由来する試料または前記細胞、組織、器官または生物の試料を得るステップと、前記試料において請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法を行うステップと、これにより得られた前記アネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比を、罹患した細胞、組織、器官もしくは生物のものであるか、罹患した細胞、組織、器官もしくは生物に由来することが分かっている試料のアネキシンVマイクロ粒子ポリペプチドに対するGM1ガングリオシドマイクロ粒子ポリペプチドの比と比較するステップとを含む方法、あるいは
(d)細胞、組織、器官または生物における疾患の治療または予防の方法であって、(c)に従って細胞、組織、器官または生物における疾患を検出するステップと、前記疾患のための治療を前記細胞、組織、器官または生物に施すステップとを含む方法。 - マイクロ粒子を含有する試料を処理する方法であって、
(a)GM1ガングリオシドを含む前記試料におけるマイクロ粒子を選択するステップ、および/または
(b)露出したホスファチジルセリンを含む前記試料におけるマイクロ粒子を選択するステップ
を含む方法。 - ステップ(a)が、コレラ毒素サブユニットB(CTB)と結合する前記試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含む、もしくはステップ(b)が、アネキシンVと結合する前記試料におけるマイクロ粒子を選択するステップを含む、またはその両方である、請求項12に記載の方法。
- (a)例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより、マイクロ粒子をサイズにより選択するステップをさらに含む、
(b)前記マイクロ粒子が、CD9+マイクロ粒子を含む、
(c)前記試料が、尿、血液、涙、唾液、気管支肺胞洗浄液、腫瘍浸出液、精巣上体液、羊水および乳汁からなる群から選択される、または
(d)前記マイクロ粒子が、微小胞、エキソソーム、エクトソームもしくはアポトーシス小体を含む請求項12または13に記載の方法。 - マイクロ粒子を含有する試料を分画するための方法であって、(a)マイクロ粒子のアネキシンV細画分もしくはマイクロ粒子のCTB結合細画分またはその両方を選択するステップ、あるいは(b)請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法を行うステップを含む方法。
- 分画されたマイクロ粒子試料において、膜タンパク質もしくは内腔タンパク質またはその両方を検出および/または定量化するステップをさらに含む請求項15に記載の方法。
- (a)試料における実質的に全てのマイクロ粒子が、コレラ毒素B(CTB)と結合することができるが、アネキシンVと結合することができない、または
(b)試料における実質的に全てのマイクロ粒子が、アネキシンVと結合することができるが、コレラ毒素B(CTB)と結合することができない、精製されたマイクロ粒子試料。 - 実質的に、添付の図面の図1〜10を参照しつつ明細書中に記載される通りの、および前記図面に示される通りの方法または精製された試料。
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